COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV V Tests P/N: HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent TILSIGTET BRUG COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 (v2.0) er en in vitro nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af hepatitis B-virus (HBV) DNA i humant plasma med COBAS AmpliPrep-instrumentet til automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til automatisk amplifikation og detektion. Denne test er beregnet som hjælp i behandlingen af patienter med kronisk HBV-infektion, der modtager anti-viral behandling. Analysen kan bruges til at måle HBV DNA-koncentrationer ved baseline og i løbet af behandlingen som hjælpe til vurdering af respons på behandling. Resultaterne af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 skal fortolkes på baggrund af alle relevante kliniske og laboratoriemæssige undersøgelser. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 er ikke beregnet til brug ved screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af HBV eller som diagnostisk analyse til konfirmering af HBV-infektioner. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Hepatitis B-virus (HBV) er et af flere vira, der er årsag til viral hepatitis. Mere end to milliarder mennesker i verden er smittet med HBV, og mere end 350 millioner af disse er kroniske smittebærere 1,2. Kroniske bærere har en stor risiko for at udvikle længerevarende infektionskomplikationer, herunder kronisk hepatitis, leverbetændelse og cirrhose og hepatocellulært karcinom 3,4,5. Der anvendes normalt serologiske markører som diagnostiske og/eller prognostiske indikatorer for akut eller kronisk HBV-infektion. Den mest almindelige markør for HBV-infektion er tilstedeværelsen af HBV-overfladeantigen (HBsAg). Selvom bærere kan cleare HBsAg og udvikle antistoffer mod HBsAg, er der fortsat en risiko for alvorlige leverkomplikationer senere i livet 6,7. HBV e-antigen (HBeAg) bruges normalt som sekundær markør for at angive aktiv HBV-replikation, der er forbundet med progressiv leversygdom. Hvis HBeAg ikke cleares, synes risikoen for at få kronisk leversygdom at øges 8,9. HBV-stammevarianter kan enten producere HBeAg, som ikke kan påvises i serum, eller stammen kan miste evnen til at producere HBeAg, selvom der er en aktiv infektion til stede 10. Derfor kan anvendeligheden af denne markør til monitorering af sygdomsforløbet være begrænset 11. Evnen til at påvise HBV DNA i serum har vist sig at udgøre en prognostisk værdi for resultatet af akutte og kroniske HBV-infektioner Metoden gør det muligt at påvise HBV DNA efter HBsAg-clearance 16 eller påvise HBV ved mangel på serologiske markører 17. Der er dog endnu ikke fastlagt et forhold mellem serologiske markører og HBV DNA-koncentrationer. Effektiviteten af antivirusbehandling af patienter med HBV kan også vurderes ved hjælp af serologiske markører eller ved at måle leverenzymfunktionen. Den mest direkte og pålidelige måling af viral replikation anses dog for at være kvantificering af viral HBV DNA i serum eller plasma 14, Et hurtigt og vedvarende fald i HBV DNAkoncentrationen hos patienter, der behandles med alfa-interferon, lamivudin eller ganciclovir eller adefovir dipivoxil, har vist sig at være en prædiktiv faktor for et vellykket behandlingsresultat 11, Monitorering af HBV DNA-koncentrationer kan forudsige udviklingen af lamivudin-resistens 26. En kvantitativ test til måling af HBV DNA er derfor et værdifuldt værktøj, der kan bruges sammen med andre serologiske markører ved behandlingen af HBV-infektioner. Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1 Doc Rev. 6.0

2 HBV DNA i plasma kan kvantificeres ved nukleinsyreamplifikation, f.eks. PCR (Polymerase Chain Reaction) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 bruger PCR-metoden til at opnå maksimal sensitivitet og et dynamisk interval for den kvantitative påvisning af HBV DNA i EDTA som antikoagulerende middel. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 er en nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af hepatitis B-virus (HBV) DNA i humant plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 er baseret på to hovedprocesser: (1) prøveforberedelse for at isolere HBV DNA og (2) samtidig PCRamplifikation 27 af target-dna og påvisning af spaltede dobbeltmærkede oligonukleotide detektionsprober, der er specifikke for target. Med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 kan der foretages automatisk prøveforberedelse efterfulgt af automatisk PCR-amplifikation og påvisning af HBV target-dna og HBV-kvantificeringsstandard (QS) DNA. Master Mix-reagenset indeholder to primere og prober, der er specifikke for HBV DNA og HBV QS DNA'et. Master Mix-reagenset er udviklet med henblik på at sikre en ækvivalent kvantificering af HBV-genotyperne A til H. Påvisningen af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targetspecifikke og QS-specifikke dobbeltmærkede oligonukleotide prober, der tillader en uafhængig identifikation af HBV-amplikon og HBV QS-amplikon. Kvantificeringen af viralt HBV DNA udføres ved hjælp af HBV QS. Den kompenserer for virkningen af hæmning og fungerer som kontrol for forberedelsen og amplifikationsprocessen for at give mulighed for en mere nøjagtig kvantificering af HBV DNA i hver prøve. HBV-kvantificeringsstandarden er en ikkesmitsom DNA-konstruktion, der indeholder HBV-sekvenser med de samme primerbindingsregioner som HBV DNA-target og en unik probebindingsregion, der gør det muligt at skelne HBV QS-amplikonet fra HBV-amplikonet. HBV QS tilsættes til hver prøve med et kendt kopiantal, hvorefter der udføres prøveforberedelse, samtidig PCR-amplifikation og påvisning af spaltede dobbeltmærkede detektionsprober. COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet beregner HBV DNA-koncentrationen i testprøverne ved at sammenligne HBV-signalet med HBV QS-signalet for hver prøve og kontrol. Valg af target Udvælgelsen af DNA-targetsekvensen til HBV afhænger af identifikationen af de regioner i HBV-genomet, der udviser den højeste sekvenskonservering blandt alle HBV-genotyperne. Der anvendes generisk siliciumbaseret prøveforberedelse til at opfange HBV DNA'et og HBV QS DNA'et, og definerede oligonukleotider anvendes som primere ved amplifikationen af HBV DNA og HBV QS DNA. En targetspecifik og en QS-specifik dobbeltmærket oligonukleotid probe tillader en uafhængig identifikation af HBV-amplikon og HBV QS-amplikon. Dermed er udvælgelsen af primere og den dobbeltmærkede oligonukleotidprobe afgørende for testens evne til at amplificere og påvise alle HBV-genotyper. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 bruger tre amplifikationsprimere til PCR. En signalgenererende dobbeltmærket probe hybridiseres til antisense-strengen og spaltes af Z05 DNApolymerase under forlængelse af primerne. Amplikonet af genotyperne A-F består af en sekvens med 145 nukleotider. Genotype G-amplikonet består imidlertid af en sekvens med 181 nukleotider. En indsættelse af 36 baser i den enkeltstrengede bedst konserverede præ-core/core-region i HBV-genomet resulterer i et større amplikon for genotype G DA 2 Doc Rev. 6.0

3 Forberedelse af prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 anvender automatisk prøveforberedelse på COBAS AmpliPrep-instrumentet ved en generisk siliciumbaseret capture-teknik. Proceduren behandler 500 μl plasma eller serum. HBV-viruspartiklerne lyseres under inkubation ved forhøjet temperatur med en protease- og kaotropisk lysis/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne HBV DNA fra DNaser i plasma og serum. Et kendt antal HBV QS DNA-molekyler tilsættes til hver enkelt prøve samtidigt med lysisreagenset og magnetiske glaspartikler. Derefter inkuberes blandingen, og HBV DNA'et og HBV QS DNA'et bindes til glaspartiklernes overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved vask af de magnetiske partikler. Efter separation af beads og udførelse af vasketrinene elueres de adsorberede nukleinsyrer ved en forhøjet temperatur med en vandig opløsning. De behandlede prøver, der indeholder de magnetiske glaspartikler samt det frigivne HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard DNA, tilsættes til amplifikationsblandingen og overføres til COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. PCR-amplifikation PCR-amplifikationsreaktionen udføres med det termostabile rekombinante enzym Thermus specie Z05 DNA-polymerase (Z05). Ved tilstedeværelse af mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 både revers transskriptase- og DNA-polymerase-aktivitet 32, 33. Dermed kan både revers transskription og PCR-amplifikation foregå samtidig med real-time påvisning af amplikonet. Behandlede prøver tilsættes til amplifikationsblandingen i amplikationsrørene (K-tubes), hvor PCRamplifikationen foregår. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp'er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridintrifosfater forlænger Z05 DNA-polymerase de bundne primere og danner en DNA-streng. Amplifikation af target Thermo cycleren i COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet opvarmer reaktionsblandingen for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og blotlægge de specifikke primertargetsekvenser i det cirkulære HBV DNA-genom og HBV QS DNA'et. Når blandingen afkøler, binder primerne sig til target-dna'et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp'er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridin (i stedet for deoxythymidin), forlænger den termostabile Thermus specie Z05 DNA-polymerase (Z05) sig i de bundne primeres retning langs targetskabelonen og producerer en dobbeltstrenget DNA-sekvens, der kaldes et amplikon. COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon- DNA fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HBV-genomet. Hele HBV-genomet amplificeres ikke. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af targetnukleinsyren fra prøven opnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 34, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat som et af dntp'erne i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna'et. Desuden vil alle ikke-specifikke produkter, der dannes efter den første aktivering af Master Mix ved hjælp af mangan, blive ødelagt af AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA'et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet forbliver inaktivt i længere tid, når det udsættes for temperaturer over 55ºC, dvs. under thermo cyclerprocessen, og derfor ødelægges target-amplikonet, der dannes under amplifikation, ikke DA 3 Doc Rev. 6.0

4 Påvisning af PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 benytter real-time 27,28 PCR-teknologi. Anvendelsen af dobbeltfluorescerende prober gør det muligt at foretage real-time påvisning af PCR-produktopbygningen ved at overvåge emissionsintensiteten i de fluorescerende rapportfarvestoffer, der frigives under amplifikationen. Proberne består af HBV- og HBV QS-specifikke oligonukleotidprober, der er mærket med et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 mærkes HBV- og HBV QS-proberne med forskellige fluorescerende rapportfarvestoffer. Når proberne er intakte, reduceres rapportfluorescensen af den tætte afstand til quencherfarvestoffet på grund af Förster-energioverførselseffekten. Under PCR-reaktionen hybridiseres proben til en targetsekvens og spaltes af 5' 3'-nukleaseaktiviteten i den termostabile Z05 DNA-polymerase. Når rapport- og quencherfarvestofferne frigives og separeres, stopper quenching-effekten, og rapportfarvestoffets fluorescensaktivitet øges. Amplifikationen af HBV DNA og HBV QS DNA måles uafhængigt ved forskellige bølgelængder. Denne proces gentages et bestemt antal gange, og hver cyklus øger effektivt emissionsintensiteten i det individuelle rapportfarvestof, hvilket giver mulighed for en uafhængig identifikation af HBV- og HBV QS DNA. Den PCR-cyklus, hvor en vækstkurve starter sin eksponentielle vækst, står i forhold til mængden af udgangsmateriale ved begyndelsen af PCR-reaktionen. Grundprincipper for kvantificering i COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 giver kvantitative resultater over et meget bredt dynamisk område, idet monitoreringen af amplikonet foregår under amplifikationens eksponentielle fase. Jo højere HBV-titeren er for en prøve, jo tidligere stiger rapportfarvestoffets fluorescens for HBV-proben til over startniveauet (se figur 1). Da mængden af HBV QS DNA er konstant i alle prøver, bør rapportstoffets fluorescens for HBV QS-proben optræde i samme cyklus for alle prøver (se figur 2). I prøver, hvor QS-fluorescensen påvirkes, justeres koncentrationen tilsvarende. Tilstedeværelsen af de specifikke fluorescerende signaler rapporteres som en kritisk grænseværdi (Ct). Ct-værdien defineres som det delcyklusnummer, hvor fluorescensen i rapportfarvestoffet overstiger en foruddefineret grænse (det tildelte fluorescensniveau), og starter en eksponentiel vækstfase for dette signal (se figur 3). En højere Ct-værdi angiver en lavere titer af det oprindelige HBV-targetmateriale. En fordobling af titerværdien korrelerer med et fald på 1 Ct for target-hbv DNA'et, mens en 10-dobling af titerværdien korrelerer med et fald på 3,3 Ct. Figur 1 viser targetvækstkurverne for en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Når viruskoncentrationen øges, skifter vækstkurverne til tidligere cyklusser. Vækstkurven helt til venstre svarer derfor til det højeste virale titerniveau, mens kurven helt til højre svarer til det laveste virale titerniveau. Figur 1 Targetvækstkurverne for en virusfortyndingsserie over et 5-Log 10 -interval 9,00 8,00 7,00 Normaliseret fluorescens 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Højeste titer Laveste titer -1, Cyklusnummer DA 4 Doc Rev. 6.0

5 Figur 2 viser kvantificeringsstandardens vækstkurver for prøver fra en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Mængden af kvantificeringsstandard, der tilsættes til hver prøve, er konstant for alle reaktioner. Kvantificeringsstandardens Ct-værdi er den samme, uafhængig af den virale titer. Figur 2 Kvantificeringsstandardens vækstkurver for en virusfortyndingsserie over et 5-Log 10 -interval 35,00 Normaliseret fluorescens 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Laveste titer Højeste titer -5, Cyklusnummer Figur 3 viser et eksempel på, hvordan fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve. Delcyklusnummeret (Ct) beregnes for det sted, hvor fluorescenssignalet krydser det tildelte fluorescensniveau. Figur 3 Fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve 1 0,9 Normaliseret fluorescens 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Tildelt fluorescensniveau Ct-værdi = 27,1 0,1 0-0,1-0, Cyklusnummer DA 5 Doc Rev. 6.0

6 HBV DNA-kvantificering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 kvantificerer viralt HBV DNA ved hjælp af en ekstra targetsekvens (HBV-kvantificeringsstandard), der tilsættes til hver testprøve med en kendt koncentration. HBV QS er en ikke-smitsom DNA-konstruktion, der indeholder fragmenter af HBV-sekvenser med primerbindingsregioner, som er identiske med dem i HBV-targetsekvensen. HBV QS indeholder HBVprimerbindingsregioner og genererer et amplifikationsprodukt af samme længde og basesammensætning som HBV-target-DNA'et. Detektionsprobebindingsregionen for HBV QS er ændret, så den skelner mellem HBV QS-amplikon og HBV-targetamplikon. Under PCR-reaktionens annealingfase på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet belyses prøverne og exciteres af filtreret lys, og der indsamles filtrerede emissionsfluorescensdata for hver prøve. Aflæsningerne fra hver prøve korrigeres derefter for instrumentudsving. Fluorescensaflæsningerne sendes af instrumentet til AMPLILINK-softwaren og gemmes i en database. Der foretages præ-check for at afgøre, om datasættene for HBV DNA og HBV QS DNA er gyldige, og der genereres markeringer, hvis dataene falder uden for de angivne grænser. Når alle præ-check er udført og godkendt, behandles fluorescensaflæsningerne for at generere Ct-værdier for HBV DNA'et og HBV QS DNA'et. De lotspecifikke kalibreringskonstanter, der følger med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0, bruges til at beregne titerværdien for prøverne og kontrollerne, baseret på Ct-værdierne for HBV DNA'et og HBV QS DNA'et. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 er baseret på WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29, og titerresultaterne angives i internationale enheder (IU/ml). REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV2 CS1 (HBV-reagenskassette med magnetiske glaspartikler) Magnetiske glaspartikler 93% isopropanol Xi 93% (w/w) isopropanol HBV V test 1 x 72 test 1 x 7,0 ml Lokalirriterende F 93% (w/w) isopropanol Meget brandfarlig HBV2 CS2 (HBV-lysisreagenskassette) Natriumcitratdihydrat 42,5% guanidinthiocyanat < 5% polydocanol 0,9% dithiothreitol Xn 42,5% (w/w) guanidinthiocyanat 1 x 72 test 1 x 78 ml Sundhedsskadelig N < 5% (w/w) polydocanol Farligt for miljøet DA 6 Doc Rev. 6.0

7 HBV2 CS3 HBV-multireagenskassette, der indeholder: Pase (proteinaseopløsning) Trisbuffer < 0,05% EDTA Kalciumklorid Kalciumacetat 7,8% proteinase Glycerol Xn 7,8% (w/w) proteinase 1 x 72 test 1 x 3,8 ml Sundhedsskadelig EB, v2.0 (elueringsbuffer, v2.0) Tris-base-buffer 0,2% methylparaben HBV2 CS4 HBV-testspecifik reagenskassette, der indeholder: HBV QS, v2.0 (HBV-kvantificeringsstandard, v2.0) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) < 0,001% ikke-smitsomt, lineariseret, dobbeltstrengetplasmid-dna, der indeholder en insert med HBV-primerbindingssekvenser og en unik probebindingsregion 0,05% natriumazid HBV MMX, v2.0 (HBV Master Mix, v2.0) Tricinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroxid 0,09% natriumazid Glycerol < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,003% upstream- og downstream-hbv-primere < 0,003% oligonukleotid aptamer < 0,003% fluorescensmærkede oligonukleotide prober, der er specifikke for HBV og HBV-kvantificeringsstandarden < 0,05% Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobielt) HBV Mn 2+ (HBV-manganopløsning) < 0,5% manganacetat Iseddikesyre 0,09% natriumazid 1 x 8,1 ml 1 x 72 test 1 x 3,6 ml 1 x 3,4 ml 1 x 19,8 ml DA 7 Doc Rev. 6.0

8 HBV H(+)C, v2.0 (HBV høj positiv kontrol, v2.0) < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder 0,1% ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 1,0 ml Lokalirriterende R36/38: Irriterer øjnene og huden. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontrol, v2.0) < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder 0,1% ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 1,0 ml Lokalirriterende R36/38: Irriterer øjnene og huden. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. CTM ( ) C [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder 0,1% ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 1,0 ml Lokalirriterende R36/38: Irriterer øjnene og huden. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. HBV H(+)C, v2.0 Clip (HBV høj positiv kontrol, v2.0, barkodeclip) HBV L(+)C, v2.0 Clip (HBV lav positiv kontrol, v2.0, barkodeclip) HBV ( ) C Clip (HBV negativ kontrol, barkodeclip) 1 x 6 clips 1 x 6 clips 1 x 6 clips DA 8 Doc Rev. 6.0

9 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -vaskereagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -vaskereagens) Natriumcitratdihydrat < 0,1% N-methylisothiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er beregnet til brug med humant serum eller plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå bakterie- og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra kontrolflaskerne. F. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-fri pipettespidser. G. Kontroller fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes. H. Reagenskassetter eller kontroller fra forskellige kit må ikke blandes. I. Der må ikke ombyttes, blandes, fjernes eller indsættes flasker i COBAS AmpliPrep-kassetterne. J. Reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. K. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. L. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (MSDS) hos Roche. M. Prøver og kontroller skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og CLSI-dokument M29-A3 36. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% opløsning af natriumhypoklorit. N. FORSIGTIG: CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 indeholder humant plasma, der stammer fra humant blod. Kildematerialet er ved test fundet ikke-reaktivt for tilstedeværelsen af hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod HIV-1/2 og HCV samt HIV p24-antigen. Test af negativt humant plasma ved PCR-metoder påviste ikke forekomst af HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer humant blod, kan overføre smitstoffer. Alt materiale, der stammer fra mennesker, skal derfor betragtes som potentielt smittefarligt. CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og i CLSI-dokument M29-A3 36. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand DA 9 Doc Rev. 6.0

10 O. HBV QS, v2.0, HBV Mn 2+ og HBV MMX, v2.0 indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazidholdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. P. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. Q. HBV2 CS2 og flydende affald fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, der indeholder guanidinthiocyanat, må ikke komme i kontakt med opløsninger med natriumhypoklorit (blegemiddel). Denne blanding kan danne en meget giftig gas. R. Ved bortskaffelse af brugte COBAS AmpliPrep-SPU'er (Specimen Processing Units), der indeholder guanidinthiocyanat, skal enhver kontakt med natriumhypokloritopløsning (blegemiddel) undgås. Denne blanding kan danne en meget giftig gas. KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. B. HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 opbevares ved 2-8ºC. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til den angivne udløbsdato. Disse reagenser kan i åbnet tilstand holde sig i 63 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 kan anvendes op til 64 timer i alt på COBAS AmpliPrepinstrumentet. Reagenser skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. C. HBV H(+)C, v2.0; HBV L(+)C, v2.0 og CTM ( ) C opbevares ved 2-8ºC. Kontrollerne kan holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning skal ubrugt materiale kasseres. D. Barkodeclips [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip og HBV ( ) C Clip] opbevares ved 2-30 C. E. PG WR opbevares ved 2-30 C. PG WR kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Disse reagenser kan i åbnet tilstand holde sig i 28 dage ved 2-30 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. MEDFØLGENDE MATERIALER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV V2.0 HBV2 CS1 (HBV-reagenskassette med magnetiske glaspartikler) HBV2 CS2 (HBV-lysisreagenskassette) HBV2 CS3 (HBV-multireagenskassette) HBV2 CS4 (HBV-testspecifik reagenskassette) HBV H(+)C, v2.0 (HBV høj positiv kontrol, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontrol, v2.0) DA 10 Doc Rev. 6.0

11 CTM ( ) C [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] HBV H(+)C, v2.0 Clip (HBV høj positiv kontrol, v2.0, barkodeclip) HBV L(+)C, v2.0 Clip (HBV lav positiv kontrol, v2.0, barkodeclip) HBV ( ) C Clip (HBV negativ kontrol, barkodeclip) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -vaskereagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -vaskereagens) NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software COBAS AmpliPrep-instrument COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrument Valgfrit: Dockingstation Valgfrit: cobas p 630-instrumentet AMPLILINK-software, Version 3.2 Series eller 3.3 Series Datastation til AMPLILINK-softwaren, med printer AMPLILINK-software v3.2 eller v3.3 Series-manualer: Instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug med COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller cobas p 630-instrumentet og AMPLILINK-software, version 3.2 og 3.3 series Instrumentmanualen til COBAS TaqMan -analyseinstrumentet (samt valgfri dockingstation) til brug med applikationsmanualen til AMPLILINK-software, Version 3.2 og 3.3 series Instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til brug med applikationsmanualen til AMPLILINK-software, version 3.2 og 3.3 series Applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet og COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet samt COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller Applikationsmanualen til AMPLILINK-software Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet samt cobas p 630-instrumentet Valgfrit: Brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet, Software Version DA 11 Doc Rev. 6.0

12 Engangsmaterialer Prøvebehandlingsenheder: SPU'er Input-S-tubes (S-tubes) med barkodeclips Racks med K-tips K-tube, æske med 12 x 96 ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Prøverack (SK 24-rack) Reagensrack SPU-rack K-carrier K-carrier-transportør K-carrier-rack Pipetter med aerosolbarriere- eller positive DNase-frie displaceringsspidser (kapacitet 1000 μl)* Beskyttelseshandsker, uden talkum Vortex-mixer * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive DNase-fri displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Bemærk! Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. Denne test er kun valideret til brug med humant serum eller plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Test af andre prøvetyper kan medføre unøjagtige resultater. A. Indsamling af prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 er kun beregnet til plasma- eller serumprøver. Blod skal indsamles i SST -rør (Serum Separation Tubes) eller i sterile rør ved hjælp af EDTA (lavendelblå top) som antikoagulerende middel. Fuldblod opbevares ved 2-25 C i højst 24 timer. Plasma eller serum separeres fra fuldblod inden 24 timer efter indsamling ved centrifugering ved x g i 20 minutter ved stuetemperatur (15-30 C). Plasmaet eller serummet overføres til et sterilt polypropylenrør. Figur 4 og 5 viser data for undersøgelser af prøveholdbarhed udført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v DA 12 Doc Rev. 6.0

13 Figur 4 Holdbarhed af HBV i fuldblod (indsamlet i EDTA-plasmarør) 3,0 Log 10 -titer (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 2-8 C <1 time C, 24 timer 2-8 C, 24 timer 3,0 Figur 5 Holdbarhed af HBV i fuldblod (indsamlet i SST-rør) Log 10 -titer (IU/mL) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 2-8 C <1 time C, 24 timer 2-8 C, 24 timer B. Transport af prøver Transport af fuldblod, plasma eller serum skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 37. Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og centrifugeres inden for 24 timer efter prøvetagningen. Serum eller plasma kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C DA 13 Doc Rev. 6.0

14 C. Opbevaring af prøver Plasma- eller serumprøver kan opbevares ved C i op til 3 dage, ved 2-8 C i op til 7 dage eller nedfrosset ved -20 C til -80 C i mindst 6 uger. Det anbefales at opbevare prøverne i afmålte mængder à μl i sterile, 2,0 ml polypropylenrør med skruelåg (f.eks. Sarstedt ). Figur 6 og 7 viser data for undersøgelser af prøveholdbarhed udført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. 3,0 Figur 6 Holdbarhed af HBV i EDTA-plasma Log 10 -titer (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 2-8 C, 2 timer C, 3 dage 2-8 C, 7 dage -20 C, 6 uger -70 C, 6 uger 3,0 Figur 7 Holdbarhed af HBV i serum Log 10 -titer (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 2-8 C, 2 timer C, 3 dage 2-8 C, 7 dage -20 C, 6 uger -70 C, 6 uger DA 14 Doc Rev. 6.0

15 Plasma- og serumprøver kan nedfryses og optøs op til fem gange uden tab af HBV DNA. Figur 8 og 9 viser data fra en nedfrysnings-/optøningsundersøgelse udført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. 3,0 Figur 8 HBV-resultater efter op til fem nedfrysninger/optøninger (EDTA-plasma) Log 10 -titer (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 0x frysning/optøning 3x frysning/optøning 5x frysning/optøning 3,0 Figur 9 HBV-resultater efter op til fem nedfrysninger/optøninger (serum) Log 10 -titer (IU/ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Prøve 0x frysning/optøning 3x frysning/optøning 5x frysning/optøning DA 15 Doc Rev. 6.0

16 BRUGSANVISNING Bemærk! Detaljerede oplysninger om betjening, en detaljeret beskrivelse af mulige konfigurationer, udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer, kommentarer samt fejlmeddelelser kan findes i (1) instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug med COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller cobas p 630-instrumentet og AMPLILINK-software, version 3.2 og 3.3 series; (2) instrumentmanualen til COBAS TaqMan -analyseinstrumentet (samt valgfri dockingstation) til brug med applikationsmanualen til AMPLILINK-software, version 3.2 og 3.3 series; (3) instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet til brug med applikationsmanualen til AMPLILINK-software, version 3.2 og 3.3 series; (4) applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan - analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller applikationsmanualen til AMPLILINKsoftware Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet samt cobas p 630-instrumentet; (5) Valgfrit: Brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet, Software Version 2.0. Batch-størrelse Hvert kit indeholder nok reagenser til 72 test, der kan udføres i batches fra 12 til 24 test. Der skal inkluderes mindst én af hver af kontrollerne CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 i hver batch (se afsnittet "Kvalitetskontrol"). Arbejdsgang Kørslen på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet skal startes inden 120 minutter efter færdiggørelsen af prøve- og kontrolforberedelsen. Bemærk! Behandlede prøver og kontroller må ikke nedfryses eller opbevares DA 16 Doc Rev. 6.0

17 Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Hvis der benyttes frosne prøver, skal prøverne anbringes ved stuetemperatur (15-30 C), indtil de er fuldstændig optøede, og hver prøve vortex-mixes i 3-5 sekunder før brug. Hvis kontrollerne opbevares ved 2-8 C, skal de tages ud og tempereres til den omgivende temperatur før brug. Opsætning af COBAS AmpliPrep-instrumentet Del A. Vedligeholdelse og priming A1. COBAS AmpliPrep-instrumentet er klar til brug i standby-tilstand. A2. Tænd for datastationen til AMPLILINK-softwaren (ON). Forbered datastationen på følgende måde: a. Log på Windows XP-operativsystemet. b. Dobbeltklik på ikonet for AMPLILINK-softwaren. c. Log på AMPLILINK-softwaren ved at indtaste bruger-id og adgangskode. A3. Kontroller beholdningen af PG WR på skærmbilledet Status, og foretag udskiftning, hvis det er nødvendigt. A4. Udfør de vedligeholdelsesprocedurer, der er angivet på fanen Due. Systemet primes automatisk af COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del B. Bemærk! Indsættelse af reagenskassetter Alle reagenskassetter skal fjernes fra opbevaringen ved 2-8 C og indsættes i COBAS AmpliPrep-instrumentet, mindst 30 minutter før den første prøve skal behandles, for at blive tempereret til den omgivende temperatur. Reagenserne må ikke tempereres til den omgivende temperatur uden for instrumentet, da der ellers kan dannes kondens på barkodeetiketterne. Hvis der dannes kondens på barkodeetiketterne, må den ikke tørres af. B1. Placer HBV2 CS1 på et reagensrack. Placer HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 på et separat reagensrack. B2. Indsæt det reagensrack, der indeholder HBV2 CS1, i rackposition A i COBAS AmpliPrepinstrumentet. B3. Indsæt det reagensrack, der indeholder HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4, i rackposition B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. (Se tabel 1 for at få flere oplysninger). Del C. Bemærk! Indsættelse af forbrugsartikler Bestem det antal COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, -SPU'er (Sample Processing Units), input-s-tubes (S-tubes), K-tips og K-tubes, der skal bruges. Der skal bruges én SPU, én input-s-tube, én K-tip og én K-tube til hver prøve eller kontrol. Der er flere mulige arbejdsgange for brug af COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Se tabel 1 nedenfor for at få yderligere oplysninger. Afhængigt af den valgte arbejdsgang indsættes det relevante antal reagenskassetteracks, prøveracks med input S-tubes, SPU-racks, K-tip-racks, K-tube-racks og K-carriers på K-carrier-racks i de respektive rackpositioner i COBAS AmpliPrep-instrumentet (se tabel 1 for at få yderligere oplysninger) DA 17 Doc Rev. 6.0

18 C1. Placer SPU'erne i SPU-racket eller -rackene, og indsæt racket eller rackene i positionerne J, K eller L i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C2. Afhængigt af den valgte arbejdsgang indsættes det fulde rack med K-tubes på rackposition M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C3. Indsæt fulde racks med K-tips på rackposition M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C4. I forbindelse med arbejdsgang 3 med brug af COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet indsættes K-carriers på K-carrier-racks i position M & N eller O & P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Tabel 1 Mulige konfigurationer for brug af COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet Arbejdsgang COBAS AmpliPrepinstrument, dockingstation og COBAS TaqMan - analyseinstrument COBAS AmpliPrepinstrument samt COBAS TaqMan - analyseinstrument COBAS AmpliPrepinstrument samt COBAS TaqMan 48- analyseinstrument(-er) Overførselstilstand til COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet Automatisk overførsel af K-carrier Manuel overførsel af K-tubes via prøverack(s) på COBAS TaqMan - analyseinstrumentet Manuel overførsel af K-carrier via K-carrier-racks på COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet Racks, carriers og hjælpematerialer K-tubes i fulde K-tube-racks K-tips i fulde K-tip-racks Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack CS2, CS3, CS4 i kassetterack K-tubes i fulde K-tube-racks K-tips i fulde K-tip-racks Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack CS2, CS3, CS4 i kassetterack Efter udførelse af prøvebehandling: K-tubes på prøveracks (klar til manuel overførsel) K-tubes på prøveracks K-tips i fulde K-tip-racks Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack CS2, CS3, CS4 i kassetterack Tom barkodet K-carrier på K-carrier-rack Efter udførelse af prøvebehandling: K-tubes i K-carrier på K-carrier-racks Position i COBAS AmpliPrepinstrumentet M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som ovenfor (F-H) F - H M - P F - H J - L A B - E M - P Samme som ovenfor (M-P) DA 18 Doc Rev. 6.0

19 Del D. Bestilling og indlæsning af prøver D1. Forbered prøveracks på følgende måde: Sæt en clip med barkodemærkat på alle de prøverackpositioner, hvor der skal placeres en prøve (S-tube). Sæt en af de specifikke clips med barkodemærkat for kontrollerne [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] på hver prøverackposition, hvor der skal placeres kontroller (S-tubes). CTM ( ) C skal anbringes i prøverackpositionen efter den sidste kliniske prøve eller positive kontrol [HBV L(+)C, v2.0 eller HBV H(+)C, v2.0] i hvert batch med 12 til 24 test. Clipsene med barkodemærkater skal have det samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrolflaskerne i kittet. Sørg for at tilknytte den rigtige kontrol til positionen med den tilhørende kontrolbarkodeclip. Placer en input-s-tube på hver position, der indeholder en clip med barkodemærkat. D2. Opret ved hjælp af AMPLILINK-softwaren prøveordrer for hver prøve og kontrol på fanen Sample i vinduet Orders. Vælg den relevante testfil, og afslut ved at gemme. D3. Tilknyt prøve- og kontrolordrer til prøverackpositioner på fanen Sample Rack i vinduet Orders. Prøveracknummeret skal være til racket, der blev forberedt i trin D1. D4. Udskriv rapporten Sample Rack Order, og brug den som arbejdsark. D5. Forbered prøve- og kontrolracks i det angivne område for tilføjelse af prøver og kontroller på følgende måde: Bland hver prøve og kontrol [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i 3 til 5 sekunder på vortex-mixer. Undgå at kontaminere handsker ved håndtering af prøver og kontroller. D6. Overfør 650 μl af hver prøve og kontrol [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] til den relevante barkodemærkede input-s-tube ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriereeller DNase-fri positiv displaceringsspids. Undgå at overføre partikler og/eller fibrinclots fra den oprindelige prøve til input-s-tuben. Prøver og kontroller skal overføres til de rørpositioner, der er tildelt og registreret på arbejdsarket under trin D4. Clipsene med barkodemærkater skal have det samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrolflaskerne i kittet. Sørg for at tilknytte den rigtige kontrol til positionen med den relevante kontrolbarkodeclip. Undgå at kontaminere den øverste del af S-tubes med prøver eller kontroller. D7. Se brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet ved brug af cobas p 630-instrumentet til prøveforberedelse. D8. Til arbejdsgangene 1 og 2 indsættes prøveracks med input S-tubes i rackpositionerne F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. D9. Til arbejdsgangen 3 med brug af COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet indsættes prøveracks med input S-tubes og K-tubes (én til hver input S-tube, indsat i den rigtige position ved siden af input-s-tubes) i positionerne F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del E. Start af kørsel på COBAS AmpliPrep-instrumentet E1. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjælp af AMPLILINK-softwaren DA 19 Doc Rev. 6.0

20 Del F. Afslutning af kørslen på COBAS AmpliPrep-instrumentet og overførsel til COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet (kun til arbejdsgangene 2 og 3) F1. Kontroller for markeringer eller fejlmeddelelser. F2. Fjern de behandlede prøver og kontroller fra COBAS AmpliPrep-instrumentet fra prøverackene (for COBAS TaqMan -analyseinstrumentet uden dockingstation) eller K-carrier-rackene (for COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet), afhængigt af den valgte arbejdsgang (se del G for at få yderligere oplysninger). F3. Fjern de brugte materialer fra COBAS AmpliPrep-instrumentet. Bemærk! De behandlede prøver og kontroller må ikke udsættes for lys efter fuldførelsen af prøve- og kontrolforberedelsen. Amplifikation og detektion Opsætning af COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrument Kørslen på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet skal startes inden 120 minutter efter færdiggørelsen af prøve- og kontrolforberedelsen. Bemærk! Del G. Behandlede prøver og kontroller må ikke nedfryses eller opbevares. Indsættelse af behandlede prøver G1. Udfør de relevante trin for at overføre K-tubes til COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet, alt efter den valgte arbejdsgang. Arbejdsgang 1: Automatisk overførsel af K-carrier via dockingstationen til COBAS TaqMan -analyseinstrumentet. Dette kræver ikke indgreb fra brugeren. Arbejdsgang 2: Manuel overførsel af K-tubes i prøveracks på COBAS TaqMan - analyseinstrumentet Arbejdsgang 3: Manuel overførsel af K-carrier på K-carrier-racks til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Manuel overførsel af K-carriers til COBAS TaqMan 48 -analyseinstrumentet ved hjælp af K-carriertransportøren. Del H. Start af kørsel på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet H1. Start COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet med en af nedenstående indstillinger, alt efter den valgte arbejdsgang: Arbejdsgang 1: Kræver ikke indgreb fra brugeren. Arbejdsgang 2: Automatisk start af COBAS TaqMan -analyseinstrumentet efter indsættelse af prøveracks. Arbejdsgang 3: Fyld K-carrieren med tomme K-tubes, hvis den indeholder færre end 6 K-tubes. Vejledning til opfyldningen vises af AMPLILINK-softwaren. Åbn dækslet til thermo cycleren, indsæt K-carrieren, og luk låget. Start kørslen på COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet DA 20 Doc Rev. 6.0

21 Del I. Afslutning af kørsel på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet I1. Udskriv resultatrapporten, når kørslen på COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet er fuldført. Kontroller, om der er markeringer eller fejlmeddelelser i resultatrapporten. Prøver med markeringer og kommentarer skal fortolkes som beskrevet i afsnittet Resultater. Gem dataene, når resultaterne er godkendt. I2. Fjern de brugte K-tubes fra COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. RESULTATER COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet beregner automatisk HBV DNAkoncentrationen for prøverne og kontrollerne. HBV DNA-koncentrationen angives i internationale enheder (IU)/ml. Omregningsfaktoren mellem HBV-kopier/ml og HBV IU/ml er 5,82 kopier/iu ved anvendelse af WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29. Resultaterne kan om nødvendigt omregnes manuelt til kopier/ml ved hjælp af følgende omregningsmetode: HBV DNA-koncentration i IU/ml x 5,82 kopier/iu = HBV DNA i kopier/ml Eksempel: 1,23E+04 IU/ml x 5,82 kopier/iu = 7,16E+04 kopier/ml Bemærk! Bemærk! Det analytiske måleinterval for analytværdier, der kan måles direkte på en prøve uden fortynding ved hjælp af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0, er 20 til 1,7E+08 IU/ml. Det klinisk brugbare interval for analytværdier, der kan måles direkte på en prøve med en maksimal fortynding på 1:10 ved hjælp af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0, er 20 til 1,7E+09 IU/ml. AMPLILINK-software: Bestemmer cyklusgrænseværdien (Ct) for HBV DNA'et og HBV QS DNA'et. Bestemmer HBV DNA-koncentrationen på baggrund af Ct-værdierne for HBV DNA'et og HBV QS DNA'et og de lotspecifikke kalibreringskoefficienter, der er angivet på kassettebarkoderne. Angiver, at de beregnede IU/ml-titere for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 ligger inden for de tildelte intervaller. Validering af batch AMPLILINK version 3.2 Series Kontroller resultatvinduet i AMPLILINK-softwaren eller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at batchen er gyldig. For kontrolordrer foretages en kontrol for at bestemme om IU/ml-værdien for kontrollen er inden for det angivne interval. Hvis IU/ml-værdien for kontrollen er uden for intervallet, generes en markering ("Flag") for at angive, at kontrollen ikke lykkedes. Batchen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for kontrollerne [HBV L(+)C, v2.0, HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Batchen er ikke gyldig, hvis der vises nogen af følgende markeringer for HBV-kontrollerne: DA 21 Doc Rev. 6.0

22 Negativ kontrol Markering ("Flag") Resultat Fortolkning _N_NC_INVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller et "gyldigt" resultat, der ikke er negativt for HBV-target HBV lav positiv kontrol, v2.0 Markering ("Flag") Resultat Fortolkning _L_LPCINVALID < 2.00E+01 IU/mL Kontrollen er under intervallet _L_LPCINVALID Target Not Detected Kontrollen er under intervallet _L_LPCINVALID En numerisk titer, X.XXE+XX IU/mL Kontrollen er uden for intervallet _L_LPCINVALID > 1.70E+08 IU/mL Kontrollen er over intervallet _L_LPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat HBV høj positiv kontrol, v2.0 Markering ("Flag") Resultat Fortolkning _H_HPCINVALID < 2.00E+01 IU/mL Kontrollen er under intervallet _H_HPCINVALID Target Not Detected Kontrollen er under intervallet _H_HPCINVALID En numerisk titer, X.XXE+XX IU/mL Kontrollen er uden for intervallet _H_HPCINVALID > 1.70E+08 IU/mL Kontrollen er over intervallet _H_HPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat Hvis batchen er ugyldig, skal hele batchen gentages, herunder prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion. Validering af batch AMPLILINK version 3.3 Series Kontroller resultatvinduet i AMPLILINK-softwaren eller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at batchen er gyldig. For kontrolordrer foretages en kontrol for at bestemme om IU/ml-værdien for kontrollen er inden for det angivne interval. Hvis IU/ml-værdien for kontrollen er uden for intervallet, genereres en markering ("Flag") for at angive, at kontrollen ikke lykkedes. Batchen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for kontrollerne [HBV L(+)C, v2.0, HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Batchen er ikke gyldig, hvis der vises nogen af følgende markeringer for HBV-kontrollerne: Negativ kontrol: Markering ("Flag") Resultat Fortolkning NC_INVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller et "gyldigt" resultat, der ikke er negativt for HBV-target DA 22 Doc Rev. 6.0

23 HBV lav positiv kontrol, v2.0: Markering ("Flag") Resultat Fortolkning LPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller en kontrol uden for intervallet HBV høj positiv kontrol, v2.0: Markering ("Flag") Resultat Fortolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller en kontrol uden for intervallet Hvis batchen er ugyldig, skal hele batchen gentages, herunder prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion. Fortolkning af resultater For at finde ud af, om batchen er gyldig, skal det for hver enkelt prøve kontrolleres, om der er markeringer eller kommentarer på udskriften. Resultaterne skal fortolkes på følgende måde: En gyldig batch kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, alt efter om der er genereret markeringer og/eller kommentarer for de individuelle prøver. Prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: Titerresultat Target Not Detected <2.00E+01 IU/mL 2.00E+01 IU/mL og 1.70E+08 IU/mL Fortolkning Resultaterne skal rapporteres som "HBV DNA ikke påvist". De beregnede IU/ml er under detektionsgrænsen for analysen. Resultaterne skal rapporteres som "HBV DNA påvist, mindre end 20 HBV DNA IU/ml". Beregnede resultater, der er større end eller lig med 20 IU/ml og mindre end eller lig med 1,70E+08 IU/ml, er inden for det lineære interval for analysen. > 1.70E+08 IU/mL De beregnede IU/ml er over analyseintervallet. Resultaterne skal rapporteres som "større end 1,70E+08 HBV DNA IU/ml". Hvis der ønskes kvantitative resultater, skal den oprindelige prøve fortyndes med HBVnegativt humant serum eller EDTA-plasma, afhængigt af matrixen for den oprindelige prøve, og testen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. Bemærk! Bemærk! Bemærk! Prøver, der er over analyseintervallet, som frembringer et ugyldigt resultat med markeringen "QS_INVALID" må ikke rapporteres som > 1.70E+08 IU/mL. Den oprindelige prøve skal fortyndes med HBV-negativt humant EDTA-plasma, og testen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. Titerresultat "Failed". Fortolkning: Prøven er ikke behandlet korrekt under prøveforberedelsen på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Titerresultat "Invalid". Fortolkning: Et ugyldigt resultat DA 23 Doc Rev. 6.0

24 KVALITETSKONTROL Der skal inkluderes én COBAS TaqMan negativ kontrol, én HBV lav positiv kontrol v2.0 og én HBV høj positiv kontrol v2.0 i hver testbatch. Batchen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for kontrollerne [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Der er ingen krav med hensyn til positive kontrollers placering [HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] på prøveracket. CTM ( ) C skal dog anbringes i prøverackpositionen efter den sidste kliniske prøve eller positive kontrol [HBV L(+)C, v2.0 eller HBV H(+)C, v2.0] i hvert batch med 12 til 24 test. Kontroller batchudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at batchen er gyldig. Negativ kontrol CTM ( ) C skal give resultatet "Target Not Detected". Hvis CTM ( ) C markeres som ugyldig, er hele batchen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis CTM ( ) C konstant er ugyldig i flere batches, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. Positive kontroller De tildelte titerintervaller for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 er angivet på barkoderne på reagenskassetterne til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. HBV DNA IU/ml for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 skal ligge inden for de tildelte intervaller. Hvis én eller flere af de positive kontroller markeres som ugyldig, er hele batchen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis HBV DNA-titeren for én af eller begge de positive kontroller konstant er uden for intervallerne i flere batches, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. PROCEDUREBEGRÆNSNINGER 1. Denne test er kun valideret til brug med humant serum eller plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Test af andre prøvetyper kan medføre unøjagtige resultater. 2. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning, transport, opbevaring og behandling. 3. Tilstedeværelsen af AmpErase-enzym i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Master Mix, v2.0 reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra HBV-positive kontroller og kliniske prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 4. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. 5. Dette produkt må kun anvendes med COBAS AmpliPrep-instrumentet og COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. 6. Selvom de er sjældne, kan mutationer i den bedst konserverede region i virusgenomet, som er dækket af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0-primere og/eller -prober, medføre underkvantificering, eller at virus ikke detekteres. 7. Påvisningen af HBV DNA er afhængig af det antal viruspartikler, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøvetagningsmetoder og patientfaktorer (dvs. alder, forekomst af symptomer og/eller infektionsstadiet). 8. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at kvantificere teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden DA 24 Doc Rev. 6.0

25 INTERFERERENDE STOFFER Det er påvist, at høje koncentrationer af triglycerider, bilirubin og albumin i prøver ikke påvirker kvantificeringen af HBV DNA med denne test. Det er påvist, at høje koncentrationer af hæmoglobin i prøver med op til en koncentration på 250 mg/dl ikke påvirker kvantificeringen af HBV DNA med denne test. Der er påvist, at følgende stofforbindelser, der blev testet 3 gange det højeste plasmaniveau (C max ), ikke påvirker kvantificeringen af HBV DNA med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0: Nukleotid DNA-polymerasehæmmere Tenofovir Adefovir dipivoxil Telbivudin HIV-proteasehæmmere Indinavir Saquinavir Ritonavir Amprenavir Lopinavir/Ritonavir Immunmodulatorer Interferon alfa-2a Ribavirin Interferon alfa-2b Peginterferon alfa-2a Peginterferon alfa-2a + ribavirin Interferon alfa-2b + ribavirin Peginterferon alfa-2b Nukleosid revers transskriptase og DNA-polymerasehæmmere Lamivudin Zidovudin Stavudin Abacavir Didanosin Entecavir Ikke-nukleosid HIV-revers transskriptasehæmmere Nevirapin Efavirenz HIV-fusionshæmmere Enfurvitid Antidepressiva Paroxetin HCl Fluxetin Sertralin Forbindelser til behandling af herpesvira Ganciclovir Valganciclovir HCl Acyclovir DA 25 Doc Rev. 6.0

26 EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE A. Detektionsgrænsen for WHO's internationale standard Detektionsgrænsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev bestemt for HBV DNA i forskellige fortyndinger ved hjælp af WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29, genotype A i HBV-negativt humant EDTAplasma eller serum. Der blev analyseret tre fortyndingsserier for hver matrix. Der blev i alt analyseret 72 bestemmelser pr. koncentration for hver matrixtype. Den HBV DNA-koncentration i EDTA-plasma, der kan påvises med en positivitetsfrekvens på mere end 95%, bestemt ved PROBIT-analyse, er 9 IU/ml for EDTA-plasma (se tabel 2) og 19 IU/ml for serum (se tabel 3). Tabel 2 Detektionsgrænse i EDTA-plasma for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 ved brug af WHO International Standard Nominelt input Antal bestemmelser Antal positive Positivitetsfrekvens (HBV DNA IU/ml) % % % % 2, % PROBIT 95% hit rate 9 IU/ml (95%-konfidensinterval: 6,8-12,1 IU/ml) Tabel 3 Detektionsgrænse i serum for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 ved brug af WHO International Standard Nominelt input Antal bestemmelser Antal positive Positivitetsfrekvens (HBV DNA IU/ml) % % % % 2, % PROBIT 95% hit rate 19 IU/ml (95%-konfidensinterval: 11,0-107,1 IU/ml) B. Detektionsgrænse ved brug af kliniske prøver på tværs af alle genotyper Desuden blev serielle fortyndinger af kliniske prøver i HBV-negativt humant EDTA-plasma eller serum, der repræsenterer genotype A-F og H samt to kvantificerede oprensede plasmid-dna'er, en for genotype G og en for en præ-core-mutant, analyseret med to kitlotnumre af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0-reagenser. Der blev testet 24 bestemmelser pr. niveau, genotype, matrix og kitlot. Den koncentration af HBV DNA, der kan påvises med en hit rate på mere end 95 %, bestemt ved PROBITanalyse, er 16,4 IU/ml i alt for begge matricer og alle genotyper (se tabel 4) DA 26 Doc Rev. 6.0

27 Tabel 4 Detektionsgrænse i EDTA-plasma og serum for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 ved brug af genotype A-H og præ-core-mutant Genotype Matrix 95 % PROBIThitratekoncentration Lot 1 95 % PROBIThitratekoncentration Lot 2 95 % PROBITkonfidensinterval A Plasma 10,6 <5* Serum 10,4 5,5 B Plasma 5,6 5,3 Serum 5,8 16,4 Plasma 5,8 5,8 C Serum 14,8 10,9 D Plasma 5,9 10,4 Serum 5,6 9,8 Plasma 13,1 6,1 E Serum 6,3 15,7 Plasma 4,9 5,8 F Serum 6,0 5,9 Plasma 12,3 5,9 G Serum 5,8 11,6 Plasma 9,8 5,5 H Serum 11,6 11,2 Præ- Plasma 10,4 11,2 core- mutant Serum 5,8 12,2 95 % PROBIThitratekoncentration (maks.) 10,6 4,6 37,7 16,4 12,0 28,6 14,8 10,4 28,7 10,4 7,0 24,1 15,7 10,7 33,4 6,0 ** 12,3 8,6 24,3 11,6 6,9 30,3 12,2 9,1 22,2 * Der kunne ikke bestemmes et PROBIT-analyse- og 95 %-konfidensinterval pga. 100 % hit rate ved alle koncentrationsniveauer for lot 2 ** Der kunne ikke beregnes et 95 %-konfidensinterval af PROBIT-analysen pga. 100 % hit rate for alle testede fortyndingsniveauer Bemærk: Stamkoncentrationer for alle testede prøver blev bestemt via kalibratorrubricering (ISO 11095:1996) ved hjælp af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. For at undgå en potentiel bias blev koncentrationerne af de kliniske genotypeprøver A-F og H kontrolleret ved hjælp af én eller flere af følgende test: Abbott RealTime HBV-analysen, Siemens VERSANT HBV DNA 3.0-analysen og COBAS TaqMan HBV Test til brug med High Pure-systemet. De observerede titre viste en maksimumafvigelse i ved kvantificering på 0,3 Log 10. Koncentrationerne for de to plasmider, der omfatter targetregioner for genotype G og præ-core-mutanten, blev kontrolleret ved hjælp af PicoGreen -metoden, og den tildelte titers nøjagtighed blev vist i et dedikeret sammenlignelighedsundersøgelse DA 27 Doc Rev. 6.0

28 C. Præcision Præcisionen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev bestemt ved at analysere serielle fortyndinger af kliniske HBV-prøver (genotype A) i HBV-negativt humant EDTA-plasma og serum. Tildelingen af titre for de kliniske prøver (stamkoncentrationer) blev udført med en metode, der sikrer sporbarhed til WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29. Der blev udført 15 kørsler pr. matrix, som hver bestod af 6 fortyndingsniveauer og 3 bestemmelser ved hver koncentration. Hele proceduren for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev udført for hver prøve, herunder prøveforberedelse, amplifikation og detektion. Den angivne præcision repræsenterer derfor alle aspekter af testproceduren. Undersøgelsen blev foretaget for tre reagenslotnumre af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. Resultaterne er vist i tabel 5 (EDTA-plasma) og tabel 6 (serum). Tabel 5 Præcision af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (EDTA-plasmaprøver) Lot 1 Lot 2 Lot 3 Titer Samlet Samlet SD Samlet Samlet SD Samlet Samlet SD (IU/ml) CV i % i log CV i % i log CV i % i log 1,00E , , ,11 1,00E , , ,09 1,00E , , ,06 1,00E ,04 8 0, ,06 1,00E , , ,05 1,00E , , ,08 Tabel 6 Præcision af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (serumprøver) Lot 1 Lot 2 Lot 3 Titer Samlet Samlet SD Samlet Samlet SD Samlet Samlet SD (IU/ml) CV i % i log CV i % i log CV i % i log 1,00E , , ,13 1,00E , , ,08 1,00E , , ,06 1,00E , , ,05 1,00E , , ,05 1,00E , , , DA 28 Doc Rev. 6.0

29 D. Lineært interval Som vist i figur 10 og 11 gav COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 et lineært respons fra 20 (Log 10 = 1,30) HBV DNA IU/ml til 1,7E+08 (Log 10 = 8,24) HBV DNA IU/ml i både EDTA-plasma og serum. Evalueringen blev udført i overensstemmelse med CLSI-retningslinjen EP6-A med to lotnumre af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0-reagenser og serielle fortyninger af HBV DNA (+) EDTA-plasma- eller serumprøver med høj titer. Der blev testet 13 koncentrationer af EDTA-plasma og 12 koncentrationer af serum med 10 bestemmelser pr. koncentration. Figur 10 Linearitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 i EDTA-plasmaprøver 10 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-Tests, v2.0-resultater Log 10 (HBV-DNA IU/ml) y = 1,0183x - 0,0182 R 2 = 0, Gennemsnit Nominel koncentration Log 10 (HBV-DNA IU/ml) Figur 11 Linearitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 i serumprøver 9 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-Tests, v2.0-resultater Log 10 (HBV-DNA IU/ml) y = 1,0202x - 0,1142 R 2 = 0, Gennemsnit Nominel koncentration Log 10 (HBV-DNA IU/ml) DA 29 Doc Rev. 6.0

30 E. Kvantificering af genotype-titer Der er blevet foreslået 8 genotypekategorier for HBV på baggrund af nukleotiddivergens i genomet på mere end 8% 38, 39, 40. Disse genotyper angives med store bogstaver fra A til H. HBV-genotyperne har en karakteristisk geografisk fordeling 41. Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 på HBV-genotyper blev evalueret ved at analysere 25 oprensede, lineariserede og kvantificerede plasmid DNA'er, der indeholdt repræsentative sekvensinserts fra HBV-genotyperne A-H samt den mest forekommende præ-core-mutant (se tabel 7). Tildelingen af de nominelle koncentrationer af plasmidopløsningern blev udført ved hjælp af PicoGreen-metoden. Hvert plasmid-dna blev fortyndet til nominelle koncentrationer på ca. 3,00E+03, 3,00E+05 og 3,00E+07 PicoGreen kopier/ml i både EDTA-plasma og serum. Koncentrationerne (IU/ml) blev derefter bestemt med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 ved hjælp af to reagenslot, og resultaterne for alle de testede plasmider blev sammenlignet. Evalueringen af alle 25 plasmider, der blev analyseret med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 udviser samme kvantificering for alle plasmider og genotyper for EDTA-plasma og serum. Tabel 7 Test af inklusivitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Testet DNA-plasmidtype Plasmidangivelse Genotype Oprindelsesland for prøve p8423-c1 Indien p1115-c1 Burundi A p3952-c1 Cameroun p4199-c2 Norge p1764-c1 Kina p1767-c1 Kina p3958-c1 B Østlige Asien p830-c1 Society Island p3982-c1 Vietnam p1786-c1 Kina C p Bangladesh p3872-c1 Iran p1103-c1 Tunesien p3953-c2 Nordafrika D p18-c1 Sverige p Sverige p4244-c1 Danmark p3217-c1 Senegal E p3963-c2 Nigeria p9203-c1 Colombia p479-c1 F Venezuela p1009-c1 Spanien p G USA pefhbv20 H Nicaragua pitmut1896 Præ-Core-mutant Italien Derudover blev der vist inklusivitet over det lineære interval for 8 af disse plasmider, der repræsenterede alle genotyper (figur 12 og 13). For hvert plasmid blev der testet tre koncentrationsniveauer for EDTAplasma og serum med 10 bestemmelser pr. koncentration DA 30 Doc Rev. 6.0

31 Figur 12 Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 på HBV-genotype A-H i EDTA-plasma 0,4 0,3 Afvigelse Log 10 (HBV-DNA IU/ml) 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2 Genotype A Genotype B Genotype C Genotype D Genotype E Genotype F Genotype G Genotype H +/- 0,3 log -0,3-0,4 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 Nominel koncentration Log 10 (HBV-DNA IU/ml) Figur 13 Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 på HBV-genotype A-H i serum 0,4 0,3 Afvigelse Log 10 (HBV-DNA IU/ml) 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2 Genotype A Genotype B Genotype C Genotype D Genotype E Genotype F Genotype G Genotype H +/- 0,3 log -0,3-0,4 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 Nominel koncentration Log 10 (HBV-DNA IU/ml) F. Klinisk specificitet Den kliniske specificitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev bestemt ved at analysere HBV-negativt EDTA-plasma fra bloddonorer. Der blev i alt analyseret 647 individuelle EDTAplasmaprøver og 649 serumprøver. Resultaterne for alle prøver var negative for HBV DNA. På baggrund af disse resultater er specificiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v % med et konfidensgrænse på 99,54% DA 31 Doc Rev. 6.0

32 G. Krydsreaktivitet Den analytiske specificitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev evalueret ved at tilsætte dyrkede organismer (vira, bakterier og gær) eller DNA (HTLV-2, 2,5E+07 cp/pcr) til HBV-negativt humant EDTA-plasma (se tabel 8). Ingen af ikke-hbv-organismerne blev testet positive for HBV DNA. Tabel 8 Analytisk specificitet i prøver Virus Adenovirus, type 5 Cytomegalovirus Epstein Barr-virus Human herpesvirus, type 6 Herpes simplexvirus, type 1 Herpes simplexvirus, type 2 Human T-celle lymfotrofisk virus, type 1 Human T-celle lymfotrofisk virus, type 2 Influenza A Hepatitis A-virus Hepatitis C-virus HIV-1 Bakterie Staphylococcus aureus Propionibacterium acnes Gær Candida albicans H. Korrelation for EDTA-plasma og serum Korrelationen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev bestemt ved at analysere HBV-positive matchede kliniske EDTA-plasma- og serumprøver. Der blev analyseret 279 matchede sæt af prøver fra HBV-smittede patienter. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0-resultaterne udviste høj korrelation mellem EDTA-plasma- og serumprøver (figur 14). Figur 14 Korrelation for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 på EDTA-plasma- og serumprøver fra HBV-smittede patienter (n=279) y = 0,9834x + 0,0073 R 2 = 0,9915 Serumprøve (log 10 -titer) EDTA-plasmaprøve (log 10 -titer) DA 32 Doc Rev. 6.0

33 I. Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 sammenlignet med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev sammenlignet med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test 30 ved at analyseret HBV-positive ( 54 IU/ml) kliniske prøver. Der blev analyseret overskydende EDTA-plasmaprøver fra rutinemæssig diagnosticering på to eksterne laboratorier. Prøvetitrene blev spredt over det dynamiske område i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0. Der blev foretaget en lineær regressionsanalyse på 275 gyldige prøver (143 blev testet på ét laboratorium, og 132 på et andet) (figur 15). Figur 15 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen på EDTA-plasma- og serumprøver fra HBV-smittede patienter (n=275) 9,00 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-Test, v2.0 Log 10 HBV DNA-titer 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 y = 0,9958x + 0,0443 R 2 = 0,9743 0,00 0,00 1.,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-Test Log 10 HBV DNA-titer DA 33 Doc Rev. 6.0

34 J. Metodekorrelation Performance for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 blev sammenlignet med COBAS TaqMan HBV Test til brug med High Pure-systemet (HPS HBV, figur 16 og 17), COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test (COBAS AMPLICOR HBV, figur 18 og 19) og VERSANT HBV DNA 3.0 Assay (figur 20 og 21) ved at foretage regressionsanalyse af ufortyndede klinisk karakteriserede prøver fra patienter smittet med HBV. Prøverne blev leveret af Teragenix (Fort Lauderdale, Florida, USA). Regressionsanalysen blev udført for serum og EDTA-plasmaprøver, der gav resultater inden for det lineære interval. Figur 16 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og COBAS TaqMan HBV Test til brug med High Pure-systemet på EDTA-plasmaprøver fra HBV-smittede patienter (n=146) 10,0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Plasmaprøve (log 10 -titer) 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,974 * X + 0,107 R 2 = 0,964 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 HBV, High Pure-system Plasmaprøve (log 10 -titer) DA 34 Doc Rev. 6.0

35 Figur 17 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og COBAS TaqMan HBV Test til brug med High Pure-systemet på serumprøver fra HBV-smittede patienter (n=142) 10 9 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Serumprøve (log 10 -titer) Y = 0,983 * X + 0,046 r 2 = 0, High Pure-system Serumprøve (log 10 -titer) DA 35 Doc Rev. 6.0

36 Figur 18 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test på EDTA-plasmaprøver fra HBV-smittede patienter (n=143) 5,0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Plasmaprøve (log 10 -titer) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Y = 0,899 * X + 0,546 R 2 = 0,872 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 COBAS AMPLICOR HBV Plasmaprøve (log 10 -titer) DA 36 Doc Rev. 6.0

37 Figur 19 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test på serumprøver fra HBV-smittede patienter (n=154) 6 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Serumprøve (log 10 -titer) Y = 0,911 * X + 0,461 R 2 = 0, COBAS AMPLICOR HBV Serumprøve (log 10 -titer) DA 37 Doc Rev. 6.0

38 Figur 20 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og VERSANT HBV DNA 3.0 Assay på EDTA-plasmaprøver fra HBV-smittede patienter (n=138) 8,0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Plasmaprøve (log 10 -titer) 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,892 * X + 0,260 R 2 = 0,810 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 VERSANT HBV DNA 3.0 Assay Plasmaprøve (log 10 -titer) DA 38 Doc Rev. 6.0

39 Figur 21 Korrelation mellem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 og VERSANT HBV DNA 3.0 Assay på serumprøver fra HBV-smittede patienter (n=138) 8 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 Serumprøve (log 10 -titer) Y = 0,913 * X + 0,125 R 2 = 0, VERSANT HBV DNA 3.0 Assay Serumprøve (log 10 -titer) DA 39 Doc Rev. 6.0

40 REFERENCER 1. Lee, W Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337: Beasley, R.P Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer. 61: Wong, D.H.K., Cheung, A.M., O'Rourke, K., et al Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 119: Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look promising. British Medical Journal. 319: McMahon, B.J Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are they really "off the hook"? Hepatology. 28: Huo, T., Wu, J., Lee, P. et al Sero-clearance of hepatitis B surface antigen in chronic carriers does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28: Niederau, C., Heintges, T., Lange, S. et al Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334: Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G. et al Long term outcome of hepatitis B e antigen-positive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26: Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15: Hoofnagle, J.H Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and recommendations. Hepatology. 11:S100-S Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J. et al Hepatitis B virus DNA in serum from patients with acute hepatitis B. Hepatology. 5: Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F. et al The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24: Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M. et. al Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus carriers. American Journal of Gastroenterology. 92: Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R. et al Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology. 21: Mason, A.L., Xu, L., Guo, L. et al Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27: Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T. et al Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology. 58: Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G. et al Natural course and response to interferon of chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10: Saracco, G., Mazzella, G., Rosina, F. et al A controlled trial of human lymphoblastoid interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10: Perrillo, R., Schiff, R., Davis, G. et al A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 323: Perez, V., Tanno, H., Villamil, F. et al Recombinant interferon alfa-2b following prednisone withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M. et al Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology. 25: Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V. et al The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 30: DA 40 Doc Rev. 6.0

41 24. Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K., and Papakonstantinou, A Oral ganciclovir treatment in chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31: Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G. et al Adefovir Dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348: Puchhammer-Stockl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J. et al Monitoring the virus load can predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181: Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10: Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M Real time quantitative PCR. Genome Research 6: Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A., and the WHO Collaborative Study Group An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 80: Hochberger, S., Althof, D., Gallegos de Schrott, R., Nachbaur, N., Röck, H. and Leying, H Fully automated quantitation of Hepatitis B virus (HBV) DNA in human plasma by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan System. Journal of Clinical Virology 35: Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, Fried M, Schinazi RF, Rossau R A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. Journal of General Virology 81: Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H. and Myers, T.M Amplification of RNA: Hightemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase. PCR Primer, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press: Section Meng, Q., Wong, C., Rangachari, A. et al Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. Journal of Clinical Microbiology. 39: Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 38. Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal of General Virology 69: Norder H, Courouce AM, Coursaget P, Echevarria JM, Leef S-D, Mushahwar IK, Robertson BH, Locarnini S, Magnius LO Genetic Diversity of Hepatitis B Virus Strains Derived Worldwide: Genotypes, Subgenotypes, and HBsAG Subtypes. Intervirology 47: Schaefer S Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol 13(1): Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Courouce AM, Mushahwar IK, Magnius LO Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74: DA 41 Doc Rev. 6.0

42 Oplysninger om dokumentrevision Doc Rev /2010 I afsnittet BRUGSANVISNING er formuleringen "ved 2-8 C" slettet i bemærkningen om opbevaring af behandlede prøver og kontroller, fordi behandlede prøver ikke kan opbevares. I afsnittet BRUGSANVISNING og afsnittet KVALITETSKONTROL er der tilføjet en vejledning om placering af den negative kontrol i slutningen af prøveracket. I afsnittet RESULTATER er sætningen "Ct-værdien for HBV er over analyseintervallet, eller der er ikke opnået en Ct-værdi for HBV." slettet for titerresultaterne "Target Not Detected" i tabellen "Fortolkning af resultater" med henblik på tydeliggørelse. I afsnittet INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER er y-akseskalaerne i figur 4 til 9 blevet harmoniseret. I afsnittet EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE er et datapunkt i figur 17 blevet rettet. I afsnittet EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE er navnene på akserne i figur 14 blevet rettet. Kontakt din lokale Roche-repræsentant for at få svar på eventuelle spørgsmål. Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Et medlem af Roche-gruppen Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Straße 116 Roche Diagnostics S.p.A Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, Distribuidor em Portugal: E Sant Cugat del Vallès Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Barcelona, Spain Estrada Nacional, Amadora, Portugal Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier Roche Diagnostica Brasil Ltda. H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Av. Engenheiro Billings, 1729 (For Technical Assistance call: Jaguaré, Building 10 Pour toute assistance technique, São Paulo, SP Brazil appeler le: ) DA 42 Doc Rev. 6.0

43 ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, COBAS, AMPLIPREP, HIGH PURE, TAQMAN og COBAS P er varemærker, der tilhører Roche. ARMORED RNA er en patenteret teknologi, der er udviklet i et samarbejde mellem Ambion, Inc. og Cenetron Diagnostics, LLC. USA-patenter nr , nr , nr , nr , nr og andre afventende patenter. ARMORED RNA er et varemærke, der tilhører Ambion og Cenetron. MICROSOFT og WINDOWS er varemærker, der tilhører Microsoft Corporation i USA og/eller andre lande. PROCLIN er et varemærke, der tilhører Rohm and Haas Company. SST er et varemærke, der tilhører Becton Dickinson and Co. VERSANT er et varemærke, der tilhører Bayer Corporation. Cyaninfarvestofferne i dette produkt er patenteret af GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er kun givet i licens til Roche med henblik på inkorporering i forskningskomponenter og in vitro diagnostik-kit. Enhver brug af sådanne kit til andre formål end forskning eller in vitro diagnostik kræver underlicenser fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA. Visse komponenter i dette produkt er underlagt et eller flere amerikanske patenter og deres udenlandske tilsvarende udstedt til Isis Pharmaceuticals og givet i licens til Roche Molecular Systems, Inc. Teknikken til forebyggelse af asmitning er omfattet af US Patent nr og tilsvarende udenlandske patenter, der tilhører Life Technologies, Inc., og givet i licens til Roche Molecular Systems, Inc Roche Molecular Systems, Inc. Alle rettigheder forbeholdes. 12/2010 ( ENGL) Doc Rev DA 43 Doc Rev. 6.0