COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

Transkript

1 COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: TILSIGTET BRUG COBAS TaqMan HBV-testen, der er beregnet til brug med High Pure-systemet (HPS), er en in vitro nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af Hepatitis B-virus (HBV) DNA i humant serum eller plasma ved hjælp af High Pure System Viral Nucleic Acid-kittet til manuel prøveforberedelse og COBAS TaqMan 48 Analyzer til automatisk amplifikation og detektion. COBAS TaqMan HBV-testen er ikke beregnet til brug ved screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af HBV eller som diagnostisk analyse til konfirmering af HBV-infektioner. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Hepatitis B-virus (HBV) er et af flere vira, der er årsag til viral hepatitis. Mere end to milliarder mennesker i verden er smittet med HBV, og mere end 350 millioner af disse er kroniske smittebærere 1. Kroniske bærere har en stor risiko for at udvikle længerevarende infektionskomplikationer, herunder kronisk hepatitis, cirrhose og hepatocellulært karcinom 2,3,4. Der anvendes normalt serologiske markører som diagnostiske og/eller prognostiske indikatorer for akut eller kronisk HBV-infektion. Den mest almindelige markør for HBVinfektion er tilstedeværelsen af HBV-overfladeantigen (HBsAg). Selvom bærere kan cleare HBsAg og udvikle antistoffer mod HBsAg, er der fortsat en risiko for alvorlige leverkomplikationer senere i livet 5,6. HBV e-antigen (HBeAg) bruges normalt som en sekundær markør for at angive aktiv HBVreplikation, der er forbundet med progressiv leversygdom. Hvis HBeAg ikke cleares, synes risikoen for at få kronisk leversygdom at øges 7,8. HBV-stammevarianter kan enten producere HBsAg, som ikke kan påvises i serum, eller stammen kan miste evnen til at producere HBeAg, selvom der er en aktiv infektion til stede 9. Derfor kan anvendeligheden af denne markør til monitorering af sygdomsforløbet være begrænset 10. Evnen til at påvise HBV DNA i serum har vist sig at udgøre en prognostisk værdi for resultatet af akutte og kroniske HBV-infektioner 11,12,13,14. Metoden gør det muligt at påvise HBV DNA efter HBsAgclearance 15 eller detektion af HBV ved mangel på serologiske markører 16. Der er dog endnu ikke fastlagt et forhold mellem serologiske markører og HBV DNA-koncentrationer. Effektiviteten af antivirusbehandling af patienter med HBV kan også vurderes ved hjælp af serologiske markører eller ved at måle leverenzymfunktionen. Den mest direkte og pålidelige måling af viral replikation anses dog for at være kvantificering af viral HBV DNA i serum eller plasma 13,17,18,19. Et hurtigt og vedvarende fald i HBV DNAkoncentrationen hos patienter, der behandles med alfa-interferon, lamivudin eller ganciclovir, har vist sig at være en prædiktiv faktor for et vellykket behandlingsresultat 10,20,21,22,23,24. Monitorering af HBV DNAkoncentrationer kan forudsige udviklingen af lamivudin-resistens 25. En kvantitativ test til målingen af HBV DNA er derfor et værdifuldt værktøj, der kan bruges sammen med andre serologiske markører ved behandlingen af HBV-infektioner. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN COBAS TaqMan HBV-testen er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse for at opnå HBV DNA. (2) Automatisk PCR-amplifikation af target-dna et ved hjælp af HBV-specifikke komplementære primere og detektion af spaltede dobbeltfluorescerende, farvemærkede oligonukleotide detektionsprober, der tillader kvantificering af det amplificerede HBV-target (amplikon) og HBV-kvantificeringsstandard-DNA, som behandles, amplificeres og detekteres samtidigt med prøven. Master Mix-reagenset indeholder to primere og prober, der er specifikke for HBV DNA og HBVkvantificeringsstandard-DNA et. Master Mix-reagenset er udviklet med henblik på at sikre en ækvivalent kvantificering af HBV-genotyperne A-G. Detektionen af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targets - pecifikke og kvantificeringsstandard-specifikke dobbeltmærkede oligonukleotide prober, der tillader en uafhængig identifikation af HBV-amplikonet og HBV-kvantificeringsstandard-amplikonet. Kvantificeringen af viralt HBV RNA udføres ved hjælp af HBV-kvantificeringsstandarden. HBV-kvantificerings - standarden er et ikke-smitsomt lineariseret plasmid, der indeholder de samme primerbindingssteder som HBV target-dna og en unik probebindingsregion, der gør det muligt at skelne HBV-kvantificeringsstandard- Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1

2 amplikon fra HBV-targetamplikon. HBV-kvantificeringsstandarden er indarbejdet i hver enkelt prøve og kontrol med et kendt kopiantal og udføres gennem prøveforberedelse, PCR-amplifikation og detektion sammen med HBV-target. COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner HBV DNA-titeren i testprøven ved at sammenligne HBV-signalet med HBV-kvantificeringsstandardsignalet for hver prøve og kontrol. HBVkvantificeringsstandarden kompenserer for virkningen af hæmning, og kontrollerne kompenserer for forberedelsen og amplifikationsprocessen for at give mulighed for nøjagtig kvantificering af HBV DNA et i hver enkelt prøve. Forberedelse af prøver COBAS TaqMan HBV-testen isoleres HBV DNA fra plasma- og serumprøver via en generisk, manuel prøveforberedelse, der er baseret på nukleinsyrebinding til glasfibre. HBV-viruspartiklerne lyseres under inkubation ved en forhøjet temperatur med en protease- og kaotropisk lysis/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne HBV DNA fra DNaser i plasma og serum. Et kendt antal HBVkvantificeringsstandard-DNA-molekyler tilsættes til hver enkelt prøve samtidigt med lysisreagenset. Efter - følgende tilsættes isopropanol til lysis-blandingen, som derefter centrifugeres igennem en kolonne med en glasfiberfilterindsats. Under centrifugeringen bindes HBV DNA et og HBV-kvantificeringsstandard- DNA et til glasfiberfilterets overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved centrifugering. De adsorberede nukleinsyrer vaskes og elueres med en vandig opløsning. Engangsmaterialerne giver mulighed for en parallel behandling af 12 prøver eller et andet antal deleligt med 12. Den behandlede prøve, der indeholder HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard-DNA, tilsættes til amplifikations/detektionsblandingen. Derefter amplificeres og detekteres HBV-target-DNA og HBVkvantificeringsstandard-DNA på COBAS TaqMan 48 Analyzer ved hjælp af de amplifikations- og detektionsreagenser, der følger med testkittet. PCR-amplifikation Valg af target Udvælgelsen af DNA-targetsekvensen til HBV afhænger af identifikationen af de regioner i HBV-genomet, der udviser den højeste sekvenskonservering blandt alle genotyperne. Tilsvarende er udvælgelsen af primerne og proben afgørende for testens evne til at påvise alle de klinisk relevante HBV-genotyper. En region i det delvist enkeltstrengede, cirkulære DNA-genom i HBV har vist sig at have den højeste konservering af DNA-sekvenser blandt genotyperne. COBAS TaqMan HBV-testen bruger PCRamplifikationsprimere, der definerer en sekvens i den bedst konserverede præ-core/core-region af HBVgenomet. Targetamplifikation Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplikationsrørene (K-tubes), hvor PCRamplifikationen foregår. Thermo cycleren i COBAS TaqMan 48 Analyzer opvarmer reaktions blandingen for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og blotlægge de specifikke primertargetsekvenser i det cirkulære HBV DNA-genom og HBV-kvantificeringsstandard-DNA. Når blandingen afkøler, bindes primerne til target- DNA et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridin (i stedet for deoxythymidin), forlænger den termostabile Thermus specie Z05 DNA-polymerase (Z05) de bundne primere langs targetskabelonen og producerer en dobbeltstrenget DNA-sekvens, der kaldes et amplikon. COBAS TaqMan 48 Analyzer gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS TaqMan 48 Analyzer. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HBV-genomet. Hele HBV-genomet amplificeres ikke. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i COBAS TaqMan HBV-testen ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 26, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat som et af dntp erne i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplikon, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. Desuden vil ethvert ikke-specifikt produkt, der dannes efter den første aktivering af Master Mix ved hjælp af manganese, blive ødelagt af AmpEraseenzymet og derved forbedre sensitiviteten og specificiteten. AmpErase-enzymet, der findes i Master Mixreagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges det targetamplikon, der dannes under amplifikationen, ikke DA 2

3 Detektion af PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS TaqMan HBV-testen benytter real time 27,28 -PCR-teknologi. Anvendelsen af dobbeltfluorescerende prober gør det muligt af foretage real-time detektion af PCR-produktopbygningen ved at overvåge emissionsintensiteten i det fluorescerende rapportfarvestoffer, der frigives under amplifikationen. Proberne består af HBV- og HBV-kvantificeringsstandard-specifikke oligonukleotider, der er mærket med et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. I COBAS TaqMan HBV-testen mærkes HBV- og HBVkvantificeringsstandard-proberne med forskellige fluorescerende rapportfarvestoffer. Når de dobbeltfluorescerende, farvemærkede prober er intakte, reduceres rapportfluorescensen af den tætte afstand til quencher-farvestoffet på grund af Förster-energioverførselseffekten. Under PCR-reaktionen hybridiseres proben til en targetsekvens og spaltes af 5' 3'-nukleaseaktiviteten i den termostabile Z05 DNA-polymerase. Når rapport- og quencherfarvestofferne frigives og separeres, stopper quenching-effekten, og rapportfarvestoffets fluorescensaktivitet øges. Amplifikationen af HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard- DNA måles uafhængigt ved forskellige bølgelængder. Denne proces gentages et bestemt antal gange, og hver cyklus øger effektivt emissionsintensiteten i det individuelle rapportfarvestof, hvilket giver mulighed for en uafhængig identifikation af HBV DNA og HBV-kvantificeringsstandard-DNA. Styrken af disse signaler står i forhold til mængden af startmateriale ved begyndelsen af PCR-reaktionen. Grundprincipper for kvantificering i COBAS TaqMan HBV-testen COBAS TaqMan HBV-testen giver nøjagtige kvantitative resultater over et meget bredt dynamisk område, idet monitoreringen af amplikonet foregår under amplifikationens eksponentielle fase. Jo højere HBV-titeren er for en prøve, jo tidligere stiger rapportfarvestoffets fluorescens for HBV-proben til over startniveauet (se Figur 1). Da mængden af HBV-kvantificeringsstandard (QS) DNA er konstant i alle prøver, bør rapportstoffets fluorescens i HBV QS-proben optræde ved samme cyklus for alle prøver (se Figur 2). I tilfælde, hvor amplifikationen og detektionen af QS påvirkes af inhibering eller en dårlig prøvegenfinding, forsinkes fluorescensen, hvilket gør det muligt at foretage en tilsvarende justering af den beregnede HBV-target-DNAtiter. Tilstedeværelsen af det specifikke fluorescerende signal rapporteres som en kritisk grænseværdi (Ct). Ct-værdien defineres som det delcyklusnummer, hvor fluorescensen i rapportfarvestoffet overstiger en foruddefineret grænse (det tildelte fluorescensniveau), og starter på en eksponentiel vækstfase af dette signal (se Figur 3). En højere Ct-værdi angiver en lavere titer af det oprindelige HBV-target-DNA. En fordobling af titerværdien korrelerer med et fald på 1 Ct for target-hbv DNA et, mens en 10-dobling af titerværdien korrelerer med et fald på 3,3 Ct. Figur 1 viser target-vækstkurverne for en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Når virus - koncentrationen øges, skifter vækstkurverne til tidligere cyklusser. Vækstkurven helt til venstre svarer derfor til det højeste virale titerniveau, mens kurven helt til højre svarer til det laveste virale titerniveau. Figur 1 9,00 8,00 7,00 6,00 Normaliseret fluorescens 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Højeste titer Laveste titer -1, Cyklusnummer DA 3

4 Figur 2 viser kvantificeringsstandardens vækstkurver for prøver fra en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Mængden af kvantificeringsstandard, der tilsættes til hver prøve, er konstant for alle reaktioner. Kvantificeringsstandardens Ct-værdi er den samme, uafhængig af den virale titer. Figur 2 35,00 30,00 Laveste titer 25,00 Normaliseret fluorescens 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Højeste titer -5, Cyklusnummer Figur 3 viser et eksempel på, hvordan fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve. Delcyklusnummeret (Ct) beregnes for det sted, hvor fluorescenssignalet krydser det tildelte fluorescensniveau. Figur 3 1 0,9 Normaliseret fluorescens 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Tildelt fluorescensniveau Ct-værdi = 27,1-0, Cyklusnummer HBV DNA-kvantificering COBAS TaqMan HBV-testen kvantificerer viralt HBV DNA ved hjælp af en ekstra targetsekvens (HBVkvantificeringsstandard), der tilsættes til hver testprøve med en kendt koncentration. HBV-kvantifi - ceringsstandard er en ikke-smitsom lineariseret DNA-konstruktion, der indeholder fragmenter af HBV-sekvenser med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i HBV-targetsekvensen. HBV-kvantifi - ceringsstandarden genererer desuden et amplifikationsprodukt af samme længde og basesammensætning som HBV-target-DNA et. Detektionsprobebindingsregionen for HBV-kvantificerings standarden er ændret, så den skelner mellem HBV-kvantificeringsstandard-amplikon og HBV-targetamplikon. Under PCR-reaktionens annealingfase på COBAS TaqMan 48 Analyzeret belyses prøverne og exciteres af filtreret lys, og der indsamles filtrerede emmisionsfluorescensdata for hver prøve. Aflæsningerne fra hver prøve korrigeres derefter for instrumentudsving. Fluorescensaflæsningerne sendes af instrumentet DA 4

5 til AMPLILINK Software og gemmes i en database. Der foretages præ-check for at afgøre, om datasættene for HBV DNA- og HBV-kvantificeringsstandard-DNA er valide, og der genereres markeringer, hvis dataene falder uden for de angivne grænser. Når alle præ-check er udført og godkendt, behandles fluorescensaflæsningerne for at generere Ct-værdier for HBV DNA et og HBV-kvantificeringsstandard- DNA et. De lotspecifikke kalibreringskonstanter, der følger med COBAS TaqMan HBV-testen, bruges til at beregne titerværdien for prøverne og kontrollerne, baseret på Ct-værdierne for HBV DNA- og HBVkvantificeringsstandard-DNA. COBAS TaqMan HBV-testen er baseret på WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/746 29, og titerresultaterne angives i internationale enheder (IU/ml). REAGENSER High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 test (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (lysis-/bindingsbuffer) Tris 50% (w/w) guanidin-hcl < 1% carbamid 19% (w/w) triton X-100 CAR 2 x 2 mg (RNA, frysetørret) PK 2 x 100 mg (proteinase K, frysetørret) 64% (w/w) proteinase K, frysetørret IRB 1 x 33 ml (Inhibitor Removal-buffer) Tris 65% guanidin-hcl (tilsæt 20 ml ethanol) WASH 1 x 20 ml (vaskebuffer) Tris NaCl (tilsæt 80 ml ethanol) ELB 1 x 30 ml (elueringsbuffer) RS 4 af hver (High Pure System Viral Nucleic Acid Rack-sæt) Lysis-rack Filter Tube-rack med monteret Waste-rack Elueringsrack Cover-rack WR 8 af hver (High Pure System Viral Nucleic Acid Waste-rack) DA 5

6 COBAS TaqMan HBV Test 48 test (P/N: ) Prøveforberedels- og kontrolreagenser HBV HPS HBV QS 2 x 1,0 ml (COBAS TaqMan HBV-kvantificeringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder et insert. DNA-insertet indeholder HBV-primerbindingssekvenser og en unik probebindingsregion. Amaranth-farve < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) 0,05% natriumazid HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [HBV høj (+)-kontrol] < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser. Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [HBV lav (+)-kontrol] < 0,001% lineariseret dobbeltstrenget plasmid-dna, der indeholder HBV-sekvenser. Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel Amplifikations- og detektionsreagenser HBV MMX 2 x 24 test (COBAS TaqMan HBV Master Mix) 2 x 1,4 ml Tricinbuffer Kaliumhydroxid Kaliumacetat Glycerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% upstream- og downstream-primere til præ-core/coreregionen af HBV < 0,001% fluorescensmærkede oligonukleotide prober, der er specifikke for HBV og HBV-kvantificeringsstandarden < 0,001% oligonukleotid Aptamer < 0,05% Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) 0,09% natriumazid CTM Mn 2+ 2 x 24 test (COBAS TaqMan -manganopløsning) 2 x 1,0 ml < 1,2% manganacetat Iseddikesyre 0,09% natriumazid DA 6

7 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er beregnet til brug med humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA og humant serum. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend egnede beskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå bakterie- og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. F. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespidser. G. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes sammen. H. Reagenser fra forskellige kit må ikke blandes. I. Reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. J. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. K. Der kan rekvireres sikkerhedsdatablade (SDS) ved henvendelse til dit lokale Roche-kontor. L. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 og CLSIdokument M29-A3 31. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natrium - hypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypokloritopløsning. M. FORSIGTIGT! CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C indeholder humant plasma, der stammer fra humant blod. Udgangsmaterialet er ved hjælp af FDA-godkendte test, fundet ikke-reaktivt for tilstedeværelsen af hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod HIV-1/2 og HCV samt HIV p24-antigen. Test af negativ humant plasma ved hjælp af PCR-metoder påviste ikke forekomst af HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer fra humant blod, kan overføre smitstoffer. Derfor skal alt materiale, der stammer fra mennesker, behandles som potentielt smittefarligt. CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 og CLSI-dokument M29-A3 31. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. N. HBV MMX, HBV QS og CTM Mn 2+ indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. O. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse DA 7

8 reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING Prøveforberedelsesreagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid-reagenserne opbevares ved C efter modtagelse. B. Elueringsbuffer (ELB) og lysis-/bindingsbuffer (LYS) opbevares ved C. Efter åbning opbevares ELB og LYS ved C. Efter åbning skal ELB og LYS bruges inden 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. C. Efter tilsætning af elueringsbuffer (ELB) for at rekonstituere carrier-rna og proteinase K skal eventuelt ubrugt rekonstitueret carrier-rna (CAR) og ubrugt rekonstitueret proteinase K (PK) opbevares ved -15 til -25 C. Efter rekonstitution af carrier-rna og proteinase K skal de bruges inden 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. D. Efter tilsætning af ethanol, skal Inhibitor Removal-buffer (IRB) og vaskebuffer (WASH) opbevares ved C. Disse arbejdsreagenser kan holde sig i 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. E. Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen [Lysis-/bindingsbuffer med carrier-rna, proteinase K og HBV QS] skal anvendes straks efter forberedelsen. Eventuelt resterende materiale skal kasseres. Amplifikations- og detektionsreagenser A. Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. B. HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning for at fjerne en afmålt mængde til en batch-størrelse på 12 prøver skal det resterende HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C. Efter åbning kan HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS og CTM Mn 2+ holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Efter åbning skal evt. ubrugt CTM ( ) C kasseres. C. Arbejds-Master Mix (forberedes ved at tilsætte CTM Mn 2+ til HBV MMX) skal opbevares ved 2-8 C på et mørkt sted. De forberedte prøver og kontroller skal tilsættes inden 2 timer efter forberedelsen af arbejds-master Mix. D. De behandlede prøver og kontroller kan holde sig i op til 3 timer ved C, op til 24 timer ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C i op til 1 uge. E. Amplifikationen skal startes senest 3 timer efter, de behandlede prøver og kontroller er tilsat til arbejds-master Mix DA 8

9 MEDFØLGENDE MATERIALER Prøveforberedelsesreagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: ) LYS (lysis-/bindingsbuffer) CAR (carrier-rna) PK (proteinase K) IRB (Inhibitor Removal-buffer) WASH (vaskebuffer) ELB (elueringsbuffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid Rack-sæt) WR (High Pure System Viral Nucleic Acid Waste-rack) Amplifikations- og detektionsreagenser B. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS (P/N: ) HBV QS (HBV-kvantificeringsstandard) HBV H(+)C [HBV høj (+) kontrol] HBV L(+)C [HBV lav (+) kontrol] CTM ( ) C [COBAS TaqMan -negativ kontrol (humant plasma)] HBV MMX (COBAS TaqMan HBV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan -manganopløsning) NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software COBAS TaqMan 48 Analyzer AMPLILINK Software, version 3.3- eller version 3.4-serien Kontrolenhed til AMPLILINK Software Vejledninger til instrument og software: - Instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48 Analyzer til brug med AMPLILINK Software, version 3.3 og 3.4 series - Applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.3 til brug med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller - Applikationsmanual til AMPLILINK Software, version 3.4-serien Testdefinitionsfil (TDF). Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilen på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Capper til K-tubes (P/N: ) Capping tool til K-tray (P/N: ) DA 9

10 K-carrier til COBAS TaqMan 48 Analyzer (P/N: ) K-tray-carrier (P/N: ) K-carrier-holder (P/N: ) K-carrier-transportør (P/N: ) Forbrugsartikler K-tubes, æske med 12 x 96 (P/N: ) K-trays, æske med 24 stk. (P/N: ) Krav til centrifuge Sigma 4-15C Benchtop-centrifuge eller tilsvarende microwell-pladecentrifuge, der kan yde 4600 x g centrifugering Swing-out-rotor til Sigma-centrifuge P/N: (inkluderer 2 beholdere P/N: og 2 pladeholdere P/N: 17978) eller tilsvarende ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Isopropanol (> 99%), der opfylder ACS-specifikationerne, eller bedre Ethanol (96-100%), der opfylder ACS-specifikationerne eller bedre Justerbare pipetter*: (kapacitet 250 µl og 1000 µl) med aerosolbarriere- eller DNase-frie "positive displacement"-spidser Pipette-værktøj: Drummond (P/N: ) eller tilsvarende Vandbad, indstillet til 50 C (± 2 C) Tørvarmeblok, indstillet til 70 C (± 2 C) Sterile, serologiske engangspipetter: 5, 10 og 25 ml Sterile, koniske polypropylenrør, 15 ml og 50 ml: Corning (P/N: og P/N: ) eller tilsvarende Sterile 2,0 ml mikrocentrifugerør: Sarstedt (P/N: ) eller tilsvarende Vortex-mixer Racks til rør Engangshandsker, uden talkum Kalibrerede termometre til vandbad og tørvarmeblok * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller DNase-frie "positive displacement"-spidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Håndter alle prøver og kontroller som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver COBAS TaqMan HBV-testen er kun beregnet til serum- eller plasmaprøver. Blod skal indsamles i BD SST-rør (Serum Separation Tubes) eller i rør med EDTA (lavendelblå top) som antikoagulerende middel. Fuldblod opbevares ved 2-25 C i højst 1 dag. Brugen af EDTA-plasma eller serum vil give omtrent de samme testresultater. Figur 4 viser effekten af matrixtypen på HBV DNA-resultater fra patientprøver DA 10

11 Figur 4 Sammenligning af EDTA-plasma- og serumprøvetyper 12,00 10,00 Plasmaprøver Gennemsnitligt resultat (Log HBV DNA IU/ml, n=2) 10 8,00 6,00 4,00 2,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Serumprøver Gennemsnitligt resultat (Log 10 HBV DNA IU/ml, n = 2) Serum eller plasma separeres fra fuldblod inden 1 dag efter prøvetagning ved centrifugering ved x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet eller serummet overføres til et sterilt polypropylen-rør. Figur 5 viser data fra disse prøvetagningsundersøgelser. Figur 5 Holdbarhed af HBV i fuldblod med EDTA som antikoagulerende middel eller i SST-rør før separation i plasma eller serum Gennemsnitligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 Prøve-id < 1 time C 6 timer C 24 timer C 48 timer C 72 timer C < 1 time 2-8 C 6 timer 2-8 C 24 timer 2-8 C 48 timer 2-8 C 72 timer 2-8 C B. Transport af prøver Transport af fuldblod, serum eller plasma skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 32. Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og behandles inden for 1 dag efter prøvetagningen. Serum eller plasma kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. C. Opbevaring af prøver Serum- eller plasmaprøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 3 dage, ved 2-8 C i op til 7 dage eller nedfrosset ved -20 C til -80 C i mindst 6 uger. Det anbefales, at prøverne opbevares i afmålte mængder a µl i sterile, 2,0 ml polypropylenrør med skruelåg (f.eks. Sarstedt P/N: ). Figur 6 viser data fra disse prøveopbevaringsundersøgelser DA 11

12 Figur 6 Holdbarhed af HBV i EDTA-plasma eller serum Gennemsnitligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 Tid 0 1 dag RT 3 dage RT 5 dage RT 7 dage RT 1 dag 2-8 C 3 dage 2-8 C 5 dage 2-8 C 7 dage 2-8 C 6 uger -80 C Serum- og plasmaprøver kan nedfryses og optøs op til fem gange uden tab af HBV DNA. Figur 7 viser dataene fra disse nedfrysnings- og optøningsundersøgelser. Figur 7 HBV-resultater efter op til fem nedfrysninger/optøninger 4,5 Prøve-id Gennemsnitligt resultat Log HBV DNA (UI/ml n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 Kontrol 1 N-O 2 N-O 3 N-O 4 N-O 5 N-O 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Serum-1 Serum-2 Prøve-id BRUGSANVISNING Bemærk! For at få en detaljeret brugsanvisning, vejledning i udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer, kommentarer og fejlmeddelelser henvises til: (1) instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48 Analyzer til brug med AMPLILINK Software, version 3.3- og 3.4-serien; (2) applikationsmanualen til AMPLILINK Software, version 3.3-serien til brug med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller (3) applikationsmanualen til AMPLILINK Software, version 3.4-serien. Bemærk! Alle amplifikations- og detektionsreagenser skal have opnået den omgivende temperatur før brug. Hvis de opbevares ved 2-8 C, skal de tages ud mindst 30 minutter før brug. Bemærk! Serum- og plasmaprøver skal tempereres til den omgivende temperatur minutter før brug. Bemærk! Brug pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement"-spidser, når dette er angivet. Vær yderst omhyggelig for at undgå kontaminering DA 12

13 Kørselsstørrelse: Hvert kit indeholder reagenser til fire kørsler af 12 tests, der kan udføres separat eller samtidig. Hver testkørsel skal inkludere mindst én replikat af hver af kontrollerne CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C med op til 24 prøver og kontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Amplifikations- og detektionsreagenserne er pakket i flasker til 24 test. Den mest effektive anvendelse af reagenser, prøver og kontroller opnås ved at behandle dem i batches, der kan multipliceres med 12. Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Hvis der benyttes frosne serum- eller plasmaprøver, skal prøverne placeres ved stuetemperatur, indtil de er fuldstændig optøede, og blandes på vortex-mixer i 5-10 sekunder før brug. Bemærk! Fortsæt først, når reagenserne har opnået den omgivende temperatur. Forvarm varmeblokken/varmeblokkene til 70 C (± 2 C) og vandbadet til 50 C (± 2 C), før oprensningsreaktionerne startes. A. Reagensforberedelse Bemærk! Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen forberedes først, når alle prøver og kontroller er tempereret ved den omgivende lufttemperatur i minutter. 1. Inhibitor Removal-bufferen forberedes ved at pipettere 20 ml % ethanol til Inhibitor Removalbuffer (IRB). Bland ved at vende røret 5-10 gange. Der er nok rekonstitueret Inhibitor Removalbuffer til 48 test. 2. Vaskebufferen forberedes ved at pipettere 80 ml % ethanol til vaskebufferen (WASH). Bland ved at vende røret 5-10 gange. Der er nok rekonstitueret vaskebuffer til 48 test. 3. Forvarm elueringsbufferen (ELB) til 70 C (± 2 C) i et 2,0 ml mikrocentrifugerør med skruelåg. Der kan bruges flere rør. Elueringsvolumen pr. prøve er 75 µl. Forvarm den mængde, der er angivet i tabellen nedenfor, i overensstemmelse med antallet af test. Antal replikater Reagenser Elueringsbuffer (ml) 2,0 4,0 4. Tilsæt med en pipette den mængde isopropanol, der er angivet i tabellen nedenfor, i overensstemmelse med antallet af test i et rent, sterilt rør. Antal replikater Reagenser Isopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipettér 0,5 ml elueringsbuffer (ELB) til carrier-rna et (CAR). Sæt proppen i, vend røret om, og bland på vortex-mixer, indtil alt carrier-rna et er opløst. Det rekonstituerede carrier-rna er nok til 24 test. Ubrugt rekonstitueret carrier-rna kan opbevares ved -15 til -25 C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. 6. Pipettér 5,0 ml elueringsbuffer (ELB) til proteinase K (PK). Sæt proppen i, vend røret om, og bland på vortex-mixer, indtil alt proteinase K er opløst. Den rekonstituerede proteinase K er nok til 24 test. Ubrugt rekonstitueret proteinase K kan opbevares ved -15 til -25 C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. 7. Lysis-/bindingsarbejdsopløsningen forberedes på følgende måde ved at pipettere de mængder, der er angivet i nedenstående tabel, i overensstemmelse med det antal prøver og kontroller, der skal behandles: Antal replikater Reagenser Lysis-/bindingsbuffer (ml) 7,0 14,0 Carrier-RNA (µl) HBV QS (µl) Proteinase K (ml) 1,4 2,8 Bemærk! Mængden af HBV QS er specifik for COBAS TaqMan HBV-testen DA 13

14 Bemærk! Hvis der anvendes rekonstitueret carrier-rna eller proteinase K, skal det optøs til stuetemperatur og vendes flere gange før brug. Tilsæt den angivne mængde lysis-/bindingsbuffer til et rent, sterilt 50 ml rør. Tilsæt den angivne mængde rekonstitueret carrier-rna til røret med lysis-/bindingsbufferen. Bland HBV QS på vortex-mixer i 3-5 sekunder, og tilsæt den angivne mængde HBV QS til røret med lysis-/bindingsbufferen og det rekonstituerede carrier-rna. Sæt låg på røret, og bland ved at vende røret gange. Bland IKKE på vortex-mixer. Blanding på vortex-mixer vil danne bobler i opløsningen. Tilsæt den angivne mængde rekonstitueret proteinase K til røret med lysis-/bindingsbufferen. Sæt låg på røret, og bland ved at vende røret gange. Bland IKKE på vortex-mixer. Blanding på vortex-mixer vil danne bobler i opløsningen. Start med at afpipettere lysis-/ bindingsarbejdsopløsningen straks straks efter tilsætningen og blandingen af proteinase K og lysis-/ bindingsbufferen. Ubrugt lysis-/bindingsbuffer (LYS) kan opbevares ved C i op til 30 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Ubrugt lysis-/bindingsarbejdsopløsning skal kasseres. B. Prøve- og kontrolklargøring Bemærk! Det anbefales at bruge justerbare pipetter med aerosolbarrierespidser til denne procedure. Bemærk! Der kan benyttes en doseringspipette med sterile kombinationsspidser af passende størrelse til trin 1, 14, 16, 19 og 22. Der skal dog udvises ekstra forsigtighed for at undgå reagensspild og krydskontaminering. Bemærk! Undgå spild af lysis-/bindingsarbejdsopløsning, prøve, kontrol og isopropanol på forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene under hele proceduren. Bemærk! Brug handsker, der sidder stramt og passer til brugerens hænder. Skift handsker ofte, men især efter håndtering af positive kontroller og åbning af fulde lysisrackrør. Lågenes inderside må på intet tidspunkt berøres (f.eks. under åbning og lukning). Bemærk! Ved håndtering af kitkontroller og kliniske prøver, indsættes den negative kontrol, før der fortsættes til den positive kitkontrol. 1. Pipettér 625 µl lysis-/bindingsarbejdsopløsning til hver brønd i lysisracket (I, transparent). Undgå at dryppe i forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene. Skub forsigtigt lågene ned til lukket position. Aktiver ikke lukkemekanismen. 2. Pipettér forsigtigt 500 µl prøve eller kontrol i den relevante brønd ved at åbne én brønd ad gangen. Undgå at dryppe i forseglingsområdet mellem brønd og låg ved kanten af brøndene. Skub, efter hver prøve eller kontrol er tilsat, låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt henover midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 3. Efter tilsætningen af alle prøver og kontroller blandes det fyldte lysisrack på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Undgå voldsom blanding på vortex-mixeren. Bekræft visuelt, at alle brønde er blandet grundigt på vortexmixeren. 4. Placér forsigtigt lysisrackene i et forvarmet vandbad ved 50 C (± 2 C), og undgå stænk. Inkuber lysisracket i 10 minutter. Under inkubationen skal lysisracket være nedsænket i vandet uden at flyde. Sørg for, at lysisrackets øvre overfladeareal mellem brøndene forbliver tørt under inkubationen. Tør forsigtigt lysisrackets top og bund af, når det er taget op af vandbadet. 5. Lysisracket centrifugeres i sekunder ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Centrifugen når muligvis ikke op på den indstillede hastighed. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 6. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og pipettér 250 µl isopropanol i hver brønd. Skub efter tilsætning låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. Bemærk! Mængden af isopropanol er specifik for hver COBAS TaqMan Test. 7. Bekræft visuelt, at alle racks er forsvarligt lukket. Bland prøverne ved at vende racket tre gange, og bland derefter racket på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Undgå voldsom blanding på vortexmixeren. Bekræft visuelt, at alle brønde er blandet grundigt på vortex-mixeren. 8. Lysisracket centrifugeres i sekunder ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Centrifugen når muligvis ikke op på den indstillede hastighed. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes DA 14

15 9. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og overfør 750 µl af prøve- eller kontrolblandingen til de tilsvarende brønde på Filter Tube-racket (II, gult) med det monterede Waste-rack (hvidt). Skub, efter hver prøve- eller kontrolblanding er tilsat, låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 10. Når alle prøver eller kontroller er tilsat, centrifugeres Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 11. Åbn én brønd ad gangen, tryk forsigtigt på snap-fit-hængslet for at frigøre lukkemekanismen, og løft låget af brønden og overfør den resterende prøve- eller kontrolblanding til de tilsvarende brønde på Filter Tube-racket. Luk, efter hver prøve- eller kontrolblanding er tilsat, brøndens låg fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen. Kasser lysisracket korrekt. 12. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 13. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Waste-racket. Indsæt et nyt Waste-rack, og sæt Filter Tube-racket på plads. 14. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 400 µl Inhibitor Removal-buffer (IRB) ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af Inhibitor Removal-buffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 15. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 16. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 700 µl vaskebuffer (WASH) ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af vaskebuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 17. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 2 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 18. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Waste-racket. Indsæt et nyt Waste-rack, og sæt Filter Tube-racket på plads. 19. Åbn alle låg på Filter Tube-racket med gripperne, og pipettér 700 µl vaskebuffer ned langs siden i hver brønd. Siderne på brønden må ikke berøres. Skub efter tilsætning af vaskebuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 20. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 3 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 21. Fjern Filter Tube-racket fra Waste-racket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Placer Filter Tube-racket på elueringsracket (IIIA, blåt), og sæt Filter Tube-racket fast på elueringsracket. Kasser Waste-racket korrekt. 22. Åbn alle låg på Filter Tube-racket, og pipettér 75 µl af den forvarmede elueringsbuffer (ELB) i midten af hvert filter uden at berøre filteret. Bemærk! Elueringsbufferen må ikke tilsættes ved at afpipettere ned langs brøndens sider. Skub efter tilsætning af elueringsbuffer til alle brønde låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så lågene lukkes til. 23. Inkuber elueringsracket ved stuetemperatur i mindst 3 minutter efter tilsætning af elueringsbuffer til den sidste brønd, skub låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så brønden lukkes til. 24. Centrifuger Filter Tube-rackenheden i 3 minutter ved 4600 x g i microwell-pladecentrifugen. Bekræft visuelt, at der ikke er opstået lækage, ved at kontrollere væskeniveauet i hver brønd. Hvis der observeres lækage, må der ikke fortsættes. 25. Fjern Filter Tube-racket fra elueringsracket ved at trykke på begge snaplåse på øverste side af Filter Tube-racket. Kasser Filter Tube-racket korrekt DA 15

16 26. Placer Cover-racket (IIIB, blåt) på elueringsracket (IIIA, blåt) Tryk det ned på elueringsracket, så det klikker på plads. Skub låget fra hængslet og forsigtigt nedad, fortsæt med at trykke forsigtigt hen over midten af låget, og aktivér lukkemekanismen, så alle lågene lukkes til. 27. De behandlede prøver og kontroller bruges direkte til PCR. Brug 50 µl af de behandlede prøver og kontroller til amplifikation. Tilsæt de behandlede prøver og kontroller til arbejds-master Mix inden 3 timer efter, at prøve- og kontrolforberedelsen er fuldført. Hvis de behandlede prøver og kontroller ikke kan anvendes inden 3 timer efter forberedelsen, kan de opbevares ved 2-8 C i op til 24 timer i det tildækkede elueringsrack eller nedfrosset ved -20 C i op til 1 uge i sterile 2,0 ml polypropylen - rør med skruelåg (f.eks. Sarstedt P/N: ). Amplificer de behandlede prøver og kontroller inden 3 timer efter, at prøverne og kontrollerne er tilsat arbejds-master Mix. Amplifikation og detektion Bemærk! K-carriers/K-tray-carrier og K-carrier-/K-tray-carrier-holdere skal tørres med en fnugfri klud, der er fugtet med en 70% isopropanolopløsning. C. Reagensforberedelse Bemærk! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), arbejds-master Mix (arbejds-mmx) og arbejds-master Mix plus behandlede prøver og kontroller er lysfølsomme. Disse reagenser skal beskyttes mod lys. Bemærk! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX) og COBAS TaqMan -mangan- opløsning (CTM Mn 2+ ) skal tempereres ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter før forberedelsen af arbejds-master Mix. Bemærk! Arbejds-MMX skal forberedes, når prøve- og kontrolforberedelsen er fuldført. Bemærk! Arbejds-MMX skal bruges inden 2 timer efter forberedelsen. Bemærk! Når de behandlede prøver og kontroller er tilsat arbejds-master Mix, skal ampli - fikationen påbegyndes inden 3 timer. 1. Temperer én flaske med HBV MMX og én flaske med CTM Mn 2+ ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter. 2. Placer en K-carrier/K-tray-carrier i en K-carrier-/K-tray-carrier-holder. 3. Anbring nye K-tubes eller en ny K-tray i K-carrieren/K-tray-carrieren uden at berøre siderne på K-tubes. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. Det er ikke nødvendigt at afbalancere thermo cycleren, når der bruges en K-tray. 4. Fjern lågene på K-tubes ved hjælp af capperen til K-tubes, hvis det er relevant. Placer lågene i parkeringspositionsholderen til K-tubes. 5. Forbered arbejds-mmx på følgende måde: Til 24 test tilsættes 191 µl CTM Mn 2+ til én flaske med HBV MMX. Sæt låg på flasken, og bland ved at vende flasken 10 gange. Bland ikke arbejds-mmx på vortex-mixer. Beskyt arbejds-mmx mod lys, og brug det inden 2 timer. Til 12 test fjernes 660 µl HBV MMX, som placeres i et 2 ml rør. Tilsæt 90 µl CTM Mn 2+ til 2 ml røret med HBV MMX, sæt låg på røret, og bland grundigt ved at vende det 10 gange. Beskyt arbejds-mmx mod lys, og brug det inden 2 timer. Resten af det ubrugte HBV MMX og CTM Mn 2+ opbevares i de oprindelige flasker ved 2-8 C. Efter åbning kan HBV MMX og CTM Mn 2+ opbevares ved 2-8 C i 30 dage eller inden udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Bemærk! Mængden af CTM Mn 2+ er specifik for COBAS TaqMan HBV Test. 6. Tilsæt 50 µl arbejds-mmx til hver K-tube eller K-tray-brønd. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller blev opbevaret nedfrosset før amplifikationen, skal de optøs ved stuetemperatur, før der fortsættes til trin Tilsæt 50 µl af hver af de behandlede prøver og kontroller til den relevante K-tube eller de relevante K-tray-brønde med arbejds-mmx ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement-spids. Bland forsigtigt hver prøve eller kontrol ved at afsuge og afpipettere tre gange uden at danne bobler. 8. Gentag trin 7 for hver behandlet prøve eller behandlet kontrol, indtil de alle er blevet overført til K-tubes eller K-tray-brønde. Brug en ny spids til hver prøve og kontrol. Inspicer manuelt for at kontrollere, om der er bobler, og fjern dem om nødvendigt. Sæt låg på K-tubes eller K-tray ved hjælp af et Capper til K-tubes/Capping tool til K-tray. Kontroller manuelt, at der er tilsat de korrekte mængder. 9. Amplifikationen skal startes senest 3 timer, efter de behandlede prøver og kontroller er tilsat K-tubes/K-tray med arbejds-mmx DA 16

17 D. Indsættelse af reagenser i og betjening af COBAS TaqMan 48 Analyzer 1. Tænd for computerarbejdsstationen, og log på Microsoft Windows-operativsystemet ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 2. Tænd for COBAS TaqMan 48 Analyzer. Kontroller, at instrumentet initialiseres og er klar til brug. Hvis der fra tidligere kørsler stadig er placeret K-carriers eller K-tray-carriers i en af thermo cyclerne, skal de fjernes ved hjælp af K-carrier-transportøren. 3. Åbn AMPLILINK Software på computeren. Log på ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 4. Klik på ikonet Orders for at oprette K-carrier- eller K-tray-carrier-ordrer for de prøver, der skal analyseres. Vælg fanen Sample, klik derefter på knappen New, og indtast ordrenummeret for en prøve ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Vælg testdefinitions - filen for COBAS TaqMan HBV-testen. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Gentag processen for hver prøve. Klik på knappen Save. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. 5. Indtast kvalitetskontroloplysninger ved at vælge fanen Quality Control i vinduet Orders. Klik på knappen New, og indtast oplysningerne fra COBAS TaqMan HBV Test Controls Value-kortet, der følger med kittet, ved hjælp af tastaturet, eller indlæs dem ved hjælp af barkodescanneren. Indtast lotnummer, udløbsdato, intervaller for Low (+)- og High (+)-kontroller samt lotspecifikke kalibreringskoefficienter for COBAS TaqMan HBV Test i de angivne felter. Klik på OK. 6. Tildel et K-carrier-/K-tray-nummer til kørslen ved at klikke på fanen K-Carrier i vinduet Orders. Klik på New i vinduet K-Carrier. Indtast K-carrier-/K-tray-nummeret fra barkoden på K-carrieren/ K-trayet i cellen til højre for K-Carrier ID ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Marker afkrydsningsfeltet K-Tray under feltet K-Carrier ID, hvis der bruges en K-tray. Vælg testdefinitionsfilen til COBAS TaqMan HBV-testen på testpanelet i nederste del af vinduet. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. Bemærk! Resultaterne fra en tidligere kørsel med det samme K-carrier-id skal godkendes. 7. Marker den første række i kolonnen Type (T) i arbejdslisten (Worklist). Fremhæv dette felt for at få adgang til rullemenuen, og vælg derefter den ønskede kontroltype. Dobbeltklik derefter på prøveid-feltet for den samme række. Vinduet LookUp Control åbnes med de tilgængelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilsvarende kalibrerings- og kontrolværdier i oplysningsruden nederst til højre. Gentag processen for de ønskede kontroller. 8. Dobbeltklik på den første position (række) for at indtaste prøverne i arbejdslisten Worklist. Vinduet Lookup Sample med de tildelte prøveordrer åbnes. Brug tasterne Skift + pil, hvis mere end ét ordrenummer ønskes markeret. Kontrollér, at alle ordrer er tildelt testdefinitionsfilen for COBAS TaqMan HBV-testen. Se navnet på og versionen af testdefinitionsfilerne på oplysningskortet til produktet, som fulgte med kittet. 9. Klik på Save for at gemme K-carrier-/K-tray-carrier-ordretildelingen. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 rør, skal positionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. Det er ikke nødvendigt at afbalancere thermo cycleren, når der bruges en K-tray. E. Amplifikation og detektion 1. Vælg ikonet Systems under fanen System. Klik på Open for at åbne thermo cycleren. Når låget til thermo cycleren er helt åbent, og meddelelsen Ready to Load vises i vinduet Systems, skal låget til thermo cycleren løftes op og holdes åbent. Overfør K-carrieren/K-tray-carrieren med de(t) tillukkede K-tubes/K-tray med arbejds-master Mix samt prøver og kontroller til thermo cycleren ved hjælp af K-carrier-/K-tray-carrier-transportøren. Luk låget til thermo cycleren. 2. Klik på Start i vinduet Systems under ikonet TC for at lukke låget på thermo cycleren og starte kørslen. 3. COBAS TaqMan 48 Analyzer udfører automatisk amplifikation og detektion DA 17

18 RESULTATER Beregning af resultater COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner automatisk HBV DNA-titeren for prøven eller kontrollen. HBV DNA-titeren angives i internationale enheder (IU)/ml. Omregningsfaktoren mellem HBV-kopier/ml og HBV-internationale enheder/ml er 5,82 kopier/iu ved anvendelse af WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/ COBAS TaqMan 48 Analyzer: Bestemmer cyklusgrænseværdien (Ct) for HBV DNA et og HBV-kvantificeringsstandard-DNA et. Bestemmer HBV DNA-titeren på baggrund af Ct-værdierne for HBV DNA et og HBVkvantificeringsstandard-DNA et og de lotspecifikke kalibreringskoefficienter. Angiver, at de beregnede IU/ml-titere for HBV L(+)C og HBV H(+)C ligger inden for de tildelte intervaller. Validering af kørsel AMPLILINK Software, version 3.3- eller version 3.4-serien Kontroller resultatvinduet i AMPLILINK Software eller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er valid. Kørslen er valid, hvis der ikke vises markeringer for COBAS TaqMan HBV-kontroller. Kørslen er ikke valid, hvis der vises nogen af følgende markeringer for COBAS TaqMan HBVkontrollerne: Negativ kontrol: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning Et invalidt resultat eller et NC_INVALID Invalid validt resultat, der ikke er negativt for HBV-target HBV lav positiv kontrol: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning Et invalidt resultat eller en kontroll LPCINVALID Invalid uden for intervallet HBV høj positiv kontrol: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning Et invalidt resultat eller en kontroll HPCINVALID Invalid uden for intervallet Hvis kørslen er invalid, skal hele kørslen gentages, herunder prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion. Fortolkning af resultater: Hvis kørslen er valid, skal det for hver enkelt prøve kontrolleres, om der er markeringer eller kommentarer på resultatudskriften. Resultaterne skal fortolkes på følgende måde: En valid kørsel kan inkludere både valide og invalide prøveresultater afhængigt af, om der er genereret markeringer og/eller kommentarer for de enkelte prøver DA 18

19 Prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: Kommentar Årsag Ct-værdien for HBV er over analyseintervallet, eller der er ikke opnået en Target Not Detected Ct-værdi for HBV. Disse resultater skal rapporteres som HBV DNA ikke påvist. < 6.00E+00 IU/mL De beregnede IU/ml er under analyseintervallet. Resultaterne skal rapporteres som HBV DNA påvist, mindre end 6 HBV DNA IU/ml. 6.00E+00 IU/mL og De beregnede resultater i IU/ml er under den nedre grænse for testens < 2.90E+01 IU/mL lineære interval. Disse resultater har en høj variationsgrad og kan derfor ikke betragtes som nøjagtige. Resultaterne bør fortolkes med forsigtighed. 2.90E+01 IU/mL og Beregnede resultater, der er større end eller lig med 29 IU/ml og mindre end 1.10E+08 IU/mL eller lig med 1,10E+08 IU/ml, er inden for det lineære interval for analysen. De beregnede IU/ml er over analyseintervallet. Resultaterne skal rapporteres som mere end 1,10E+08 HBV DNA IU/ml. Hvis der ønskes kvantitative > 1.10E+08 IU/mL resultater, skal den oprindelige prøve fortyndes med HBV-negativt humant plasma eller serum, afhængigt af matrixen for den oprindelige prøve, og testen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. Bemærk! Prøver, der er over analyseintervallet, som frembringer et invalidt resultat med markeringen "QS_INVALID" må ikke rapporteres som > 1.10E+08 IU/ml. Hvis der ønskes kvantitative resultater, skal den oprindelige prøve fortyndes med HBV-negativt humant plasma eller serum, afhængigt af matrixen for den oprindelige prøve, og testen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. KVALITETSKONTROL Der skal inkluderes en replikat af hver af kontrollerne CTM ( ) C, HBV L(+)C og HBV H(+)C i hver testkørsel bestående af op til 24 prøver og kontroller. Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra interne kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed til at udføre testen korrekt. Der er ikke noget krav til kontrollernes position i K-carrieren/K-trayet. Kontroller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er valid. Negativ kontrol CTM ( ) C skal give resultatet Target Not Detected, dvs. Ct-værdien for HBV DNA et er over grænsen for analysen, eller der blev ikke opnået en Ct-værdi for HBV DNA, men en valid Ct-værdi for HBVkvantificeringsstandard-DNA et. Hvis CTM ( ) C ikke opfylder dette kriterium, er hele kørslen invalid. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis CTM ( ) C konstant er invalid, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. Positive kontroller Det tildelte interval for kontrollerne HBV L(+)C og HBV H(+)C er specifikt for hvert kontrollot og er angivet på COBAS TaqMan HBV Test Controls Value-kortet, der følger med kittet. Disse intervaller indlæses/indtastes i kontrolenheden for AMPLILINK Software. HBV DNA IU/ml for begge kontrollerne HBV L(+)C og HBV H(+)C skal ligge inden for det interval, der er angivet på COBAS TaqMan HBV Test Controls Value-kortet, der følger med kittet. Hvis én af eller begge positive kontroller ikke opfylder kriterierne, er hele kørslen invalid. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis den beregnede HBV DNA-titer for én af eller begge de positive kontroller konstant er uden for det tildelte interval, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp DA 19

20 FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE 1. Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet er det uhyre vigtigt at bevare renheden af reagenser og amplifikationsblandinger i kittet. Renheden af alle reagenser skal undersøges nøje. Kasser alle suspekte reagenser. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Denne test er kun valideret til brug med humant serum eller humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Test af andre prøvetyper kan resultere i ukorrekte resultater, falsknegative eller falsk-positive resultater. 2. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning, transport, opbevaring og behandling. 3. Tilstedeværelsen af AmpErase-enzym i COBAS TaqMan HBV Master Mix reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra HBV-positive kontroller og kliniske prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 4. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. 5. Dette produkt må kun anvendes med COBAS TaqMan 48 Analyzer. 6. Påvisningen af HBV DNA er afhængig af det antal viruspartikler, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøvetagningsmetoder og patientfaktorer (dvs. alder, forekomst af symptomer og/eller infektionsstadiet). 7. Mutationer i den bedst konserverede region af virusgenomer, som er dækket af testens primere og/eller probe kan i sjældne tilfælde resultere i underkvantificering af eller manglende evne til at detektere virussen. 8. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metode - korrelationsundersøgelser i laboratoriet for at kvantificere teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden DA 20

21 INTERFERERENDE STOFFER Det er påvist, at høje koncentrationer af lipider, bilirubin, albumin og hæmoglobin i prøver ikke påvirker kvantificeringen af HBV DNA med denne test. Det er påvist, at følgende stofforbindelser ikke påvirker kvantificeringen af HBV DNA med denne test. Nukleotid DNA-polymeraseinhibitorer Adefovir dipivoxil Tenofovirdisoproxilfumarat HIV-protease-inhibitorer Indinavir Ritonavir Nelfinavir Saquinavir Amprenavir Lopinavir/Ritonavir Immunmodulatorer Interferon alfa-2a Interferon alfa-2b CMV-behandlingsforbindelser Ganciclovir Valganciclovir-hydroklorid Acyclovir Valaciclovir-hydroklorid Nukleosid revers transkriptase- og DNA-polymeraseinhibitorer Lamivudin Zidovudin Zalcitabin Stavudin Abacavir Ikke-nukleosid HIV-revers transkriptaseinhibitorer Nevirapin Efavirenz HIV-fusionsinhibitor Enfuvirtid DA 21

22 EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE Beskrivelse af undersøgelse Detektionsgrænsen for COBAS TaqMan HBV-testen er bestemt ved at analysere serielle fortyndinger af kliniske HBV-prøver (genotype A og D) i HBV-negativt humant EDTA-plasma og serum. Præcisionen og lineariteten for COBAS TaqMan HBV-testen er bestemt ved kun at analysere serielle fortyndinger af kliniske HBV-prøver (genotype A og D) i HBV-negativt humant EDTA-plasma og serum. HBVkoncentrationen i de kliniske prøver i kopier/ml er bestemt for fortyndinger inden for analyseintervallet ved hjælp af COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen og derefter multipliceret med fortyndings - faktoren. Koncentrationen i fortyndingerne er omregnet til IU/ml ved hjælp af omregningsfaktoren for WHO s internationale standard for omregning af HBV DNA enheder/ml til kopier/ml ved hjælp af COBAS AMPLICOR HBV MONITOR- og COBAS TaqMan HBV-testen. A. Detektionsgrænse Undersøgelserne, der er beskrevet nedenfor, viser, at COBAS TaqMan HBV-testen kan påvise HBV DNA i EDTA-plasma og serum ved koncentrationer ned til 5,9 IU/ml med en positivitetsfrekvens på mere end 95%. Den HBV DNA-koncentration i EDTA-plasma og serum, der kan påvises med en positivitetsfrekvens på mere end 95%, bestemt ved Probit-analyse, er henholdsvis 4,8 IU/ml og 6,7 IU/ml. Tabel 1 Detektionsgrænse i EDTA-plasma for COBAS TaqMan HBV-testen Nominelt tilført Antal replikater Antal positive Positivitetsfrekvens (HBV DNA IU/ml) 12, % 8, % 6, % 3, % 1, % 0, % 0, % Probit 95% hit rate 4,8 IU/ml [95%-konfidensinterval på 3,1-9,9 IU/ml] Tabel 2 Detektionsgrænse i serum for COBAS TaqMan HBV-testen Nominelt tilført Antal replikater Antal positive Positivitetsfrekvens (HBV DNA IU/ml) 12, % 8, % 6, % 3, % 1, % 0, % 0, % Probit 95% hit rate 6,7 IU/ml [95%-konfidensinterval på 4,7-11,1 IU/ml] DA 22

23 B. Præcision Intraseriel kørsel, interseriel kørsel og samlet præcision blev evalueret i overensstemmelse med de metoder, der er defineret i CLSI-retningslinje EP5-A, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices 33. Denne procedure tillader både bestemmelse af præcisionen under kørslen samt den samlede præcision ved udførelsen af en undersøgelse foretaget af flere brugere over flere dage. Der blev dagligt udført en kørsel bestående af 3 replikater af hver prøve i 15 dage. Hele proceduren for COBAS TaqMan HBV-testen blev udført for hver prøve, herunder prøveforberedelse, amplifikation og detektion. Den præcision, der er vist her, repræsenterer derfor alle aspekter af testproceduren. Undersøgelsen blev udført for tre lotnumre af COBAS TaqMan HBV-testreagenser, og de kombinerede resultater vises i Tabel 3 (HBV DNA IU/ml) og Tabel 4 (HBV DNA log 10 IU/ml). Tabel 3 Præcision for COBAS TaqMan HBV-testen (i IU/ml) Prøve Gennemsnitlig HBV 1,07E8 5,33E7 1,04E7 8,52E5 9,28E4 1,21E DNA- titer (IU/ml) CV for intraseriel kørsel 19% 10% 12% 7% 14% 16% 14% 22% 27% 50% CV for interseriel kørsel 11% 14% 12% 14% 16% 18% 18% 26% 17% 22% CV i alt 23% 17% 17% 16% 22% 24% 22% 34% 32% 54% Antal replikater i alt Tabel 4 Præcision for COBAS TaqMan HBV-testen (i log 10 IU/ml) Prøve Gennemsnitlig HBV DNA-titer 8,02 7,72 7,01 5,92 4,94 4,06 3,07 2,03 1,67 1,05 (log 10 IU/ml) Intraseriel kørsel 0,07 0,04 0,05 0,03 0,21 0,18 0,06 0,09 0,11 0,59 Standardafvigelse Interseriel kørsel 0,05 0,06 0,05 0,06 0,07 0,07 0,08 0,10 0,07 0,00 Standardafvigelse Standardafvigelse 0,08 0,07 0,07 0,07 0,22 0,19 0,10 0,13 0,13 0,59 I alt DA 23

24 C. Lineært interval Som vist i Figur 8 gav COBAS TaqMan HBV-testen et lineært respons fra 29 (log 10 = 1,46) HBV DNA IU/ml til mindst 1,10E8 (log 10 = 8,04) HBV DNA IU/ml. Undersøgelsen blev udført ved hjælp af tre lotnumre af COBAS TaqMan HBV-testreagenser med replikater pr. niveau. Figur 8 Linearitet for COBAS TaqMan HBV-testen High Pure System Viral Nucleic Acid Kit / COBAS TaqMan HBV Test Resultat Log 10 (HBV DNA IU/ml) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 y = 1,0124x - 0,2358 R 2 = 0,9989 Fejlmarkeringer = 1 standardafvigelse -1,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 Nominel koncentration Log 10 (HBV DNA IU/ml) D. Inklusivitet Der er blevet foreslået 7 genotypekategorier for HBV på baggrund af nukleotiddivergens i genomet på mere end 8% 34,35. Disse genotyper angives med store bogstaver fra A til G. HBV-genotyperne har en karakteristisk geografisk fordeling 36. COBAS TaqMan HBV-testens performance på HBV-genotyper blev evalueret ved at analysere 22 oprensede, lineariserede og kvantificerede plasmid DNA er, der indeholdt repræsentative sekvensinsert fra HBV-genotyperne A-G (Tabel 5). Derudover blev der testet et plasmid, som repræsenterede den almindelige præ-core-mutation G:A ved nukleotidposition Hvert DNA-plasmid blev fortyndet til koncentrationer på 15, ,5E5 og 1,5E8 kopier/pcr. Hver fortynding blev co-amplificeret med QS DNA og analyseret i tredobbelt bestemmelse med COBAS TaqMan HBV-testen. Titrene for alle plasmider blev sammenlignet med titeren i et kontrol-dna-plasmid (pc). COBAS TaqMan HBV-testen gav de samme resultater for alle 23 DNA-plasmider (se Figur 9). Kopiantallet for alle genotyper og præ-core-mutationen stemte overens med hinanden og kontrol-dnaplasmidet DA 24

25 Tabel 5 COBAS TaqMan HBV-testen Test af inklusivitet - Testet DNA-plasmidtype Plasmid-angivelse Genotype Oprindelsesland for prøve p8423-c1 A Indien p1115-c1 A Burundi p3952-c1 A Cameroun p4199-c2 A Norge p1764-c1 B Kina p1767-c1 B Kina p3958-c1 B Østlige Asien p830-c1 B Societe Island p3982-c1 B Vietnam p1786-c1 C Kina p C Bangladesh p3872-c1 D Iran p1103-c1 D Tunesien p3953-c2 D Nordafrika p18-c1 D Sverige p D Sverige p4244-c1 D Danmark p3217-c1 E Senegal p3963-c2 E Nigeria p9203-c1 F Colombia p479-c1 F Venezuela p1009-c1 F Spanien p G USA pit1896 Præ-Core Italien DA 25

26 Figur 9 COBAS TaqMan HBV-testens performance for HBV-genotype A-G samt en præ-core-mutant Gennemsnitlig Log HBV DNA-kopier/PCR 10 (n=3) 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 A B C D E F G Kontrol Plasmid Præ-Core-mutant E. Klinisk specificitet Den kliniske specificitet for COBAS TaqMan HBV-testen blev bestemt ved at analysere HBV-negativt serum og EDTA-plasma fra bloddonorer. Der blev foretaget analyser på i alt 220 prøver (110 individuelle EDTA-plasmaprøver og 110 serumprøver), der var ikke-reaktive for HBsAg og anti-hbc. Alle prøverne var negative for HBV DNA. På baggrund af disse resultater er den kliniske specificitet for COBAS TaqMan HBV-testen 100%. F. Analytisk specificitet Den analytiske specificitet for COBAS TaqMan HBV-testen blev evalueret ved at tilsætte dyrket virus i HBV-negativt humant EDTA-plasma eller ved at analysere prøver fra smittede patienter (angivet i Tabel 6). Ingen af de testede ikke-hbv DNA- eller RNA-vira var positive for HBV DNA. Tabel 6 Analytisk specificitet i prøver Virus tilsat til plasma Prøver fra smittede patienter (n) Adenovirus, type 7 Patienter smittet med cytomegalovirus (2) Cytomegalovirus AD-169 Patienter smittet med Epstein Barr-virus (2) Epstein-Barr-virus (RAJI -Burkitts Patienter smittet med hepatitis A-virus (2) lymfomceller) Hepatitis A-virus PA 21 Patienter smittet med hepatitis C-virus, genotype 4 (1) Herpes simplex, type 1, MacIntyre Patienter smittet med hepatitis C-virus, genotype 6a (1) Herpes simplex type 2, MS Patienter smittet med HIV-1 (2) HTLV-1-celler Influenza A-virus A/Hong Kong/8/68 Influenza B-virus B/R75 Varicella-zoster (Ellen) West Nile-virus DA 26

27 G. Performance sammenlignet med COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen Performance for COBAS TaqMan HBV-testen og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen blev sammenlignet ved at analysere serum- og plasmaprøver fra HBV-smittede personer. Prøverne blev leveret af Teragenix (Fort Lauderdale, FL) og Serologicals Corporation (Norcross, GA). Der blev analyseret i alt 65 prøver i dobbeltbestemmelse i begge test, og middelresultaterne blev sammenlignet. Prøver, der gav resultater over det lineære interval, blev fortyndet før analysen, og resultaterne blev multipliceret med fortyndingsfaktoren for at opnå titeren i den oprindelige prøve. Titrene i IU/ml, der blev opnået med COBAS TaqMan HBV-testen, blev omregnet til kopier/ml ved multiplikation med omregningsfaktoren på 5,82 HBV DNA-kopier/IU. Der blev foretaget en lineær regressionsanalyse på de prøver, der indeholdt mindst 500 kopier/ml med begge test. Resultaterne, der blev opnået med COBAS TaqMan HBV- og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen, korrelerede meget nøje, som det fremgår af Figur 10. Figur 10 Korrelation mellem COBAS TaqMan HBV-testen og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen for plasma- og serumprøver fra HBV-smittede patienter 10,0 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit / COBAS TaqMan HBV Test Gennemsnitlig Log HBV DNA-kopier/ml 10 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 y = 0,9327x + 0,4855 R 2 = 0,977 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test Gennemsnitlig Log HBV DNA-kopier/ml DA 27

28 REFERENCER 1. Lee. W Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337: Beasley, R.P Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer. 61: Wong, D.H.K., Cheung, A.M., Orourke, K., et al Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 119: Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look promising. British Medical Journal. 319: McMahon, B.J Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are they really off the hook? Hepatology. 28: Huo, T., Wu, J., Lee, P., et al Sero-clearance of hepatitis b surface antigen in chronic carriers does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28: Niederau, C., Heintges, T., Lange, S., et al Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334: Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G., et al Long term outcome of hepatitis B e antigenpositive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26: Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15: Hoofnagle, J.H Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and recommendations. Hepatology. 11:S100-S Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J., et al Hepatitis B virus DNA in serum from patients with acute hepatitis B. Hepatology. 5: Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F., et al The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24: Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M., et. al Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus carriers. American Journal of Gastroenterology. 92: Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R., et al Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology. 21: Mason, A.L., Xu, L., Guo, L., et al Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27: Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T., et al Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology. 58: Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G., et al Natural course and response to interferon of chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10: Saracco, G., Mazella, G., Rosina, F., et al A controlled trial of human lymphoblastoid interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10: Perillo, R., Schiff, R., Davis, G., et al A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 323: Perez, V., Tanno, H., Villamil, F., et al Recombinant interferon alfa-2b following prednisone withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M., et al Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology. 25: Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V., et al The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 30: DA 28

29 23. Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K. and Papakonstantinou, A Oral ganciclovir treatment in chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31: Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G., et al Adefovir dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348: Puchhammer-Stöckl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J., et al Monitoring the virus load can predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181: Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10: Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K. and Williams, P.M Real time quantitative PCR. Genome Research 6: Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A. and the WHO Collaborative Study Group An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 80: Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 33. CLSI. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guidelines. CLSI Document EP5-A Wayne, PA: CLSI, Okamoto, H., Tsuda, F., Sakugawa, H., Sastrosowignjo, R.I., Imai, M., Miyakawa, Y. and Mayumi, M Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal of General Virology 69: Norder, H., Hammas, B., Löfdahl, S., Couroucé, A.M. and Magnius, L.O Comparison of the amino acid sequences of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains. Journal of General Virology 73: Norder, H., Hammas, B., Lee, S.-D., Bile, K., Couroucé, A.M., Mushahwar, I.K. and Magnius, L.O Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74: DA 29

30 Oplysninger om dokumentrevision Doc Rev /2014 Doc Rev / /2015 Tilføjede R- og S-sætninger under faresymbolerne. Fjernet Alle rettigheder forbeholdes fra meddelelsen om ophavsret. Opdaterede beskrivelser af siden med harmoniserede symboler sidst i pakningsindlægget. Fjernet ROCHE fra oversigten over varemærker. Kontakt den lokale Roche-repræsentant, hvis du har spørgsmål. Fjernet faresymboler, signalord og koder fra afsnittet REAGENSER. Tilføjet GTIN-symbol og beskrivelse til harmoniseret symbolside. Afsnittet Varemærker og patenter er opdateret til udelukkende at indeholde reference til en onlineressource. Kontakt den lokale Roche-repræsentant ved eventuelle spørgsmål. Opdateret AMPLILINK-versioner, manualer, terminologi og operativsystemer. Kontakt den lokale Roche-repræsentant ved eventuelle spørgsmål DA 30

31 " High Pure System Viral Nucleic Acid Kit er produceret for: Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA COBAS TaqMan HBV Test er produceret af: Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Strasse 116 Roche Diagnostics S.p.A Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Distribuidor em Portugal: Avda. Generalitat, Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. E Sant Cugat del Vallès Estrada Nacional, Barcelona, Spain Amadora, Portugal Roche Diagnostics Roche Diagnostica Brasil Ltda. 201, boulevard Armand-Frappier Av. Engenheiro Billings, 1729 H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Jaguaré, Building 10 (For Technical Assistance call: São Paulo, SP Brazil Pour toute assistance technique, appeler le: ) Varemærker og patenter Se Roche Molecular Systems, Inc. 06/2015 ( ENGL) DA 31

32 Følgende symboler er nu i anvendelse på etiketter til Roche PCR diagnostiske produkter. Hjælpesoftware Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik SW Autoriseret repræsentant i EF Nedre grænse for tildelt interval Stregkodedataark Producent Lotnummer Opbevares mørkt Biologisk fare Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Katalognummer Temperaturbegrænsning Se brugsanvisning Testdefinitionsfil TDF Kittets indhold Øvre grænse for tildelt interval Distribueret af Holdbar til Kun til evaluering af IVD-performance Global Trade Item Number Dette produkt overholder kravene i det europæiske direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik. Teknisk kundesupport i USA DA 32