Opgave 1 november 2004

Transkript

1 Opgave 1 november 2004 Nedenfor er vist nukleotidsekvensen af cdna kodende for eif2α genet fra mus. Serin nummer 51 (S51) kan fosfoyleres af en eller flere eif2α kinaser. For at undersøge den biologiske effekt af eif2α fosforylering ønskes fremstillet en mutant hvor aminosyre S51 er udskiftet med alanin (A). 5 atgccggggc taagttgtag attttatcaa cacaaatttc ctgaggtgga agatgtagtg atggtgaatg taagatccat tgctgaaatg ggggcctatg tcagcttgtt ggaatataat aacattgaag gcatgattct tcttagtgaa ttatcgagac gacgtatccg ttctataaac aaactgatcc gaattggcag aaatgaatgt gttgttgtca ttagagtgga taaagaaaaa ggatatatag atttgtcaaa aagaagagtt tctccagagg aagcaatcaa atgtgaggac aaattcacaa aatccaaaac tgtttatagc attcttcgcc atgttgctga ggtattagaa tataccaagg atgagcagct ggagagcctg ttccagagga ctgcctgggt cttcgatgac aagtacaaga gacctggata cggtgcctac gatgctttta agcatgcagt ctcagaccca tctatcttgg atagtttaga tttgaatgaa gatgaaagag aagtactcat taataatatc aataggcgtt tgaccccaca agcggtcaaa attcgagcag atattgaagt agcttgctat ggttatgaag gcattgatgc tgtaaaagaa gccctgaggg caggtttgaa ttgttctaca gaaaccatgc ccatcaagat taatctaata gctccaccca ggtatgtgat gacaacaacg accctggaga ggacagaagg cctgtctgtc ctcaatcagg ctatggcagt tatcaaagag aagatcgagg agaagagggg cgtcttcaat gttcagatgg agcccaaagt ggtcacagat acagatgaga ctgaacttgc aaggcagctg gaacggctgg agagagaaaa tgcagaagtg gatggagatg atgatgcaga agaaatggaa gccaaagctg aagattaa 3 Figur 1: Den proteinkodende del af cdna sekvensen for eif2α fra mus. Kodon for serin 51(tcg) er angivet med fed skrift. Spm. A: Beskriv, hvorledes du ville fremstille en eif2α cdna sekvens, hvor kodon 51 er ændret fra at kode for serin til at kode for alanin. Sekvens og orientering af eventuelt anvendte oligonukleotider skal angives. Serin 51 er kodet af exon 2 i musens eif2α gen. I forbindelse med fremstilling af en transgen mus hvor eif2α genets serin 51 er ændret til alanin ønskes fremskaffet en genomisk klon indeholdende exon2 samt flankerende regioner.

2 Spm. B: Beskriv, hvorledes du med adgang til en probe, der er specifik for exon 2 i det humane eif2α gen, vil klone et DNA fragment, der indeholder musens exon 2 samt flankerende sekvenser. Ud fra den opnåede genomiske muse-klon indeholdende exon 2 samt flankerende regioner blev der fremstillet en vektor til brug ved udskiftning af serin 51 med alanin i musens eif2α gen. Strukturen af dette plasmid er vist i Figur 2. Figur 2: A, strukturen i musens genom omkring eif2α lokus. Exon 2 er angivet som en kasse medens intronsekvens er angivet som en linje. Afstanden mellem forskellige restriktionssites er angivet i kb; positionen af to PCR primere er angivet med pile. B, Strukturen af plasmid til ændring af kodon 51 i musens eif2α gen. Exon 2 er angivet som en kasse, medens intronsekvens er angivet som en linje. Lokalisering af enkelte genkendelsessekvenser for restriktionsenzymer er angivet (P, PstI; M, MscI; H, HindIII; K, KpnI). Neo, et neomycin resistensgen inklusiv promotor. Sorte pile i neomycin kassetten angiver genkendelsessites (loxp sites) for Cre rekombinasen; HSV-TK, thymidinkinasegen inklusiv promotor fra herpes simplex virus. Lokaliseringen af en probe er angivet med en sort kasse. Spm. C: Beskriv, hvorledes du ville anvende vektoren i Figur 2 til at fremstille en embryonal stamcelle linje, der producerer et eif2α protein hvor serin 51 er udskiftet med alanin.

3 Spm. D: Beskriv, hvorledes du ved hjælp af den i Figur 2 viste probe ville identificere embryonale stamceller som potentielt har den ønskede genotype. Herunder hvorledes den potentielt rigtige genotype kan skelnes fra vild typens og forkerte genotyper. Når der er fundet en embryonal stamcellelinje, der har den korrekte genotype, transficeres den med et plasmid der udtrykker Cre rekombinasen. Derved fjernes Neo kasetten. Spm. E: Diskuter kort, hvad du mener kunne være rationalet bag ønsket om at fremstille en transgen mus, hvor Neo kasetten ( neomycin resistensgen inklusiv promotor) er fjernet. Ved udskiftning af kodon for S51 i eif2α med en alanin kodon genereres der et MscI restriktionssite. Spm. F: Beskriv, hvorledes du ved hjælp af de to i Figur 2 angivne primere og MscI restriktionssitet kan verificere at de embryonale stamceller indeholder den rigtige mutation i eif2α genet. I vertebrater fører fosforylering af eif2α til øget ekspression af transkriptionsfaktoren ATF4 og transkriptionsfaktoren CHOP, Figur 3. To af de kinaser der er involveret i eif2α fosforylering i vertebrater er Perk og Gcn2. Data i Figur 3 viser western blots af celleekstrakter fra vild type celler samt fra Perk-/- og Gcn2 -/- der har været dyrket i tilstedeværelse af Thapsigargin eller i fravær af leucin. Thapsigargin interfererer med proteinfoldning i Endoplasmisk Reticulum.

4 Figur 3: Western blot af proteinekstrakt fra vild type celler (wild type), Perk -/- celler (celler homozygote for Perk-) eller Gcn2-/- celler (celler homozygote for Gcn2-) med anti-atf4-antistoffer, anti-chop-antistoffer eller anti-eif2α-antistoffer. UT, ubehandlede celler; Tg, celler dyrket i tilstedeværelse af Thapsigargin i 1, 2 eller 4 timer; - Leu, celler dyrket i medium uden leucin i 1, 2 eller 4 timer. Spm. G: Hvad viser data i Figur 3 om relationerne mellem Perk, Gcn2, ATF4, CHOP og eif2α? For at undersøge regulering af ATF4 ekspressionen blev der udført et forsøg hvor vildtype celler blev behandlet eller ikke-behandlet med transkriptionsinhibitoren Actinomycin D fem minutter før cellerne blev tilsat Thapsigargin eller blev sultet for leucin. Data i Figur 4 viser resultatet af et western blot på celleekstrakter fra celler høstet før og efter Thapsigargin tilsætning eller leucin sult.

5 Figur 4: Vild type celler blev enten tilsat Actinomycin D (+ Act D) eller ej (- ActD) til tiden t = 0 timer. Til tiden t = 5 minutter blev der tilsat Thapsigargin til nogle celler medens andre blev sultet for leucin og nogle blev hverken sultet (-) eller tilsat Thapsigargin (-). For de leucin sultede og de Thapsigargin behandlede celler blev der til tiden t = 0.5, 1.0, 1.5 og 2.0 timer høstet celler og fremstillet et proteinekstrakt, som blev brugt til fremstilling af de viste western blots (immunoblot) med anti-atf4-antistof, anti-chop-antistof eller anti-eif2α-antistof. Fra de samme celler blev der fremstillet RNA som blev brugt til det viste northern blot. Spm. H: Hvad viser data i Figur 4 omkring regulering af ATF4 og CHOP? For at undersøge ATF4 s rolle i produktion af CHOP transkriptionsfaktoren blev de i Figur 5 viste plasmider transficeret i embryonale fibroblast celler fra mus. Transficerede celler der var ubehandlet eller behandlet med Thapsigargin blev farvet med et kernespecifikt farvestof, anti-chop-antistof koblet med et fluorescerende farvestof og anti-cd2-antistof. Resultatet er vist i Figur 5.

6 Figur 5: Strukturen af ATF4 mrna, de to blå pile angiver udstrækningen af to små åbne læserammer før den åbne læseramme, der koder for ATF4. Strukturen af ATF4:CD2 og ATF4- mut:cd2, pile angiver transkriptionsstartsites for ATF4 henholdsvis CD2. Det ATF4 mrna, der genereres fra ATF4:CD2 og ATF4-mut:CD2, indeholder begge de to åbne læserammer, der er angivet for ATF4-mRNA. Embryonale fibroblastceller fra mus blev transient transficeret med enten ATF4:CD2 eller ATF4-mut:CD2 plasmidet. ATF4:CD2 plasmidet udtrykker vildtype ATF4 genet samt også CD2 genet, hvis proteinprodukt er lokaliseret i plasmamembranen. ATF4-mut:CD2 plasmidet udtrykker en afkortet del af ATF4 proteinet, der mangler sit transkriptionsaktiverende domæne. Cellekerner er farvet med et farvestof, der giver en blå farve. CD2 proteinet og CHOP proteinet er visualiseret med fluorescerende antistoffer og ses som en grøn henholdsvis rød farve. UT, angiver at cellerne ikke er behandlet med Thapsigagin. Tg angiver at cellerne er behandlet med Thapsigargin. Spm. I: Diskuter, hvorfor det kun er nogle af cellerne i Figur 5 der er grønne.

7 Spm. J: Hvad viser data i Figur 5 omkring relationerne mellem ATF4 og CHOP?