DNA-smeltetemperaturbestemmelse

Transkript

1 DA-smeltetemperaturbestemmelse DA-smeltetemperaturbestemmelse Introduktion Smeltetemperaturen af oligonucleotider kan være en meget interessant størrelse at kende. Hvis man f.eks. ønsker at amplificerer (lave mange kopier af) sit DA ved Polymerase Chain Reaction [PCR] kan det være praktisk at vide, ved hvilken temperatur de to DA-kæder smelter (går fra hinanden). år man skal sammenligne stabiliteten af forskellige hybridiserede oligonucleotider (= to komplementære, enkeltstrengede oligonucleotider, der har dannet en duplex) bestemmer man den såkaldte smeltetemperatur, T m, hvor 50% er smeltet. I modsætning til en rigtig DA-duplex, der under biologiske forhold ikke splitter totalt men kun i bidder (under replikation og transscription), så kan den proces der sker, når man opvarmer en oligonucleotid duplex, betragtes som en all-or-none proces, dvs. enten er alle baser bundet til hinanden, eller også er duplexen fuldstændig adskilt. Det betyder, at den thermodynamiske beskrivelse af processen bliver meget simplere, da processen nu kan betragtes, som en simpel ligevægt mellem to monomerer, M 1 og M 2 og en dimer, D: M 1 + M 2 D (1) Dette giver anledning til en temperaturafhængig dissociationskonstant, K D : K D = [ M ] [ ] 1 M 2 [ D] (2) Styrken af duplex dannelsen stammer bl.a. fra hydrogenbindinger mellem DA baserne. (se figur) DA-baserne binder parvis: Adenine [A] Thymine [T] og Guanine [G] Cytosine [C] H O R O H H H R R R O H O Adenine Thymine Guanine Cytosine Som man kan se af figuren kan G-C danne en hydrogenbinding mere end A-T, hvorfor G-C bindinger er stærkere end A-T. Men hvis dette var alt der bestemte bindingsstyrken, ville man nemt kunne regne sig frem til en smeltetemperatur. Sandheden er at sekvensen af nucleotidbaser påvirker bindingsstyrken og dermed smeltetemperaturen. En vigtig årsag er stacking effekten, hvor π- elektronerne af aromatiske baser stablet parallelt ovenpå hinanden vekselvirker. Version 1a,

2 DA-smeltetemperaturbestemmelse Fig. 1 illustrerer en typisk DA-DA oligonucleotid smeltekurve, som er baseret på måling af UVabsorptionen ved λ = 260 nm som funktion af temperaturen. Der er to måder at bestemme T m på ud fra de eksperimentelle data: enten som illustreret i figuren, ved at finde de to (lineære) basislinier og korrigere de eksperimentelle med dem, eller som muligt med mere moderne softwarepakker ved at Version 1a,

3 DA-smeltetemperaturbestemmelse finde maksimum for den 1. afledede af den eksperimentelle, Abs vs. T kurve. I denne øvelse vil vi benytte den sidste metode ved at benytte programmet Grafit. Her benyttes oligonucleotiderne 5 -CAA AAA AAG-3 og 5 -CTT TTT TTG-3. Den anvendte koncentration af monomerene er i hvert enkelt forsøg ens og betegnes med C. Spm. 1.: Hvad er sammenhængen mellem C, [D], [M 1 ] og [M 2 ]? Spm. 2: Hvis I kikker på figur 1a (side 2), hvad er så X og hvad er Y? Smeltetemperaturen, [T m ], der er afhængig af C, defineres som den temperatur, hvor præcis halvdelen af monomererne findes på monomerform og den anden halvdel på duplexform. (Som illustreret i figuren på side 2) Spm. 3: Udled et udtryk for dissociationskonstanten ved T m [ K D(Tm) ] vha. C, når der er tale om oligonucleotider med samme totalkoncentration, som i denne øvelse. Ændringen i K D som funktion af temperaturen stammer fra G s temperaturafhængighed: δg G H = (lign.5.11 Atkins s. 126) (3) δt p T Spm. 4: Udled, ved hjælp af lign. (3) og antagelsen at H er konstant i temperatur intervallet: o o H S Ln( C / 2) = + (4) RT R Denne øvelse har til formål at bestemme de thermodynamiske parametre for smelteprocessen af oligonucleotiderne 5 -CAA AAA AAG-3 og 5 -CTT TTT TTG-3. Da selve målingen af T m for en enkelt koncentration af en duplex tager ca. 2 timer, kan I ikke nå at bestemme T m for mere en enkelt koncentration, men I vil få udleveret rådata for 3 andre koncentrationer, som andre har målt. Hvilken koncentration, I skal måle på, snakker I med jeres instruktor om. Bestemmelsen af T m er baseret på måling af UV-absorptionen ved λ = 260 nm som funktion af temperaturen. Måledata antages at repræsentere ligevægtstilstande. Spm. 5: Hvilke dele af nucleotiderne absorberer ved λ = 260 nm? Metoden er baseret på, at absorptionskoefficienterne, ε 260, er forskellige for monomere og duplex bundne oligonucleotider. Hvorfor denne forskel i A 260 forekommer, vil vi ikke her diskutere, men overlade til Kemi V-SI eller måske Kemi-V-BF. Spm. 6: Hvorfor tager en måling 2 timer og ikke ½ time? Version 1a,

4 DA-smeltetemperaturbestemmelse Experimentelt 1. dag, samtidig med Enzymkinetik øvelsen, udføres selve målingerne. lokale C203, dvs. på 2. sal i C-bygningen. Der udleveres fire opløsninger, der indeholder henholdsvis 20, 15, 10 og 5 µm af hver af de to komplementære DA-oligonucleotider: 5 CAA AAA AAG3 monomer og 5 CTT TTT TTG3 - monomer i 10 mm phosphat puffer ph 7, 1 M acl, 0.1 mm EDTA Der skal måles smeltekurve for en af disse opløsninger i cuvetter med et totalt volumen på 1.5 ml med pufferopløsning som reference. Thermostatenheden programmeres til at give følgende temperaturændringer: 10 min ved 20.0 o C (S-01 på kurven) til temperaturligevægt fra starten, dernæst opvarmning 0.5 o C/min. til temperaturen er 70.0 o C (S-02 på kurven), endelig hurtig afkøling til 20.0 o C (S-03 på kurven) Temperatur / o C S-02 S S-01 Temperaturprogrammet C Tid /minutter Selve programmeringen foregår på følgende måde: På displayet skal der nederst stå End, når man begynder. 1. Tryk på FUC, displayet viser nu C Hold FUC nede ca. 2 sek. (til beep høres). Displayet viser nu S.SEet nederst og temperaturen blinker. Temperaturen indstilles med pileknapperne til 20.0 o C. 3. Tryk på FUC, displayet viser nu S-01 nederst, og tiden blinker. Tidsformatet er TT.MM. Tiden sættes til 10 min, altså Version 1a,

5 DA-smeltetemperaturbestemmelse 4. Tryk på FUC, displayet viser nu S-01 nederst, og temperaturen blinker. Temperaturen indstilles med pileknapper på 20.0 o C. 5. Tryk på FUC, displayet viser nu S-02 nederst, og tiden blinker. Tiden sættes til altså 1 time og 40 min. = 100 min. 6. Tryk på FUC, displayet viser nu S-02 nederst, og temperaturen blinker. Temperaturen indstilles med pileknapperne på 70.0 o C. 7. Tryk på FUC, displayet viser nu S-03 nederst, og tiden blinker. Tiden sættes til altså 10 min. 8. Tryk på FUC, displayet viser nu S-03 nederst, og temperaturen blinker. Temperaturen indstilles med pileknapperne på 20.0 o C. 9. Tryk på FUC, displayet viser nu S-04 nederst, og tiden blinker. Tiden sættes til Det svarer til at programmet er slut. 10. Tryk på FUC, displayet viser nu rep nederst, og tallet blinker. Tallet (antallet af programgennemløb) indstilles med pileknapperne Tryk på FUC, displayet viser nu C-01 nederst, samt den aktuelle temperatur. Thermostatenheden er nu klar til at køre programmet. På computeren indlæses programmet Lambda2 (Start Programs PE Applications Lambda 2).Tryk på fanebladet TD (time drive). Vælg metoden DA.MTD. Bølgelængden λ skal være nm. Totaltiden er 120 min. ( min. jf. programmeringen af thermostatenheden). Der skal opsamles data hvert halve minut, så time interval = t = 30.0 sek. Autosave skal være O. I Method Info kan man anføre fx hvilken koncentration af oligoen, eksperimentet drejer sig om. Tryk på fanebladet Sample. Her kan Sample Identity angives, den valgte koncentration, hold nr. og navne skal anføres. I menuen i toppen vælges Utilities Configuration. Her angives, at data skal opsamles på en floppydisk: A:\Mappenavn (fx hold nr. eller dato). HUSK at sætte floppydisken i computeren og at sikre jer at den ikke er skrivebeskyttet. Def. Spec. Form. skal være ASCII. Som User anføres egne initaler. Tryk på SETUP i menuen i toppen, så er programmet klart. Til forsøget benyttes to kvartscuvetter (med låg) med en lysgang på ½ cm. Berør aldrig de blanke sider (det er dem, lyset skal passere) med fingrene. Version 1a,

6 DA-smeltetemperaturbestemmelse Fyld de to cuvetter (1.5 ml) med pufferopløsning vha. en pipette. Anbring de to fyldte kuvetter i spektrophotometerets cuvetteholdere sammen med hjælpeholderne (hakket skal vende opad). I programmet trykkes nu på knappen Autozero. Programmet vil nu nulstille de forskelle, der måtte være mellem de to cuvetter. Cuvetten i den thermostaterede holder tages op og tømmes ved hjælp af pumpen. HUSK at suge cuvetten så tør som mulig. Fyld ca. 1.5 ml af den valgte DA-oligonucleotid blanding i en cuvette og anbring den i spektrophotometeret. Den anden cuvette (med pufferopløsningen) er reference. Tryk på START-knappen i programmet. Der kommer nu et vindue frem, hvor der skal trykkes på OK for at starte programmet på computeren. Tryk SAMTIDIGT på FUC-knappen på thermostatenheden og OK på computeren. Så kører eksperimentet de næste to timer. Mens eksperimentet kører, arbejdes med enzymkinetik øvelsen. LÆS VEJLEDIGE GODT IGEEM TIL ÆSTE GAG!! Version 1a,

7 DA-smeltetemperaturbestemmelse Databehandling. 2. dag udføres beregninger og spørgsmålene diskuteres med instruktor. lokale C203, dvs. på 2. sal i C-bygningen. Jeres eget datasæt plus tre udleverede datasæt for smeltekurver ved de koncentrationer I ikke selv har målt, danner grundlag for beregningerne. De eksperimentelle data findes i *.td-filer. Filerne indeholder i de første 87 linjer en del irrelevant information (i forhold til rådataene). Filerne åbnes i Word og disse linjer slettes. Herefter kopieres data over i programmet Grafit. Det enkleste er at øse dataene (tid i minutter, absorbans) ind. Så anvender man sammenhængen mellem tid og temperatur fra programmeringen af thermostatenheden til at konstruere de relevante absorbans vs. temperatur datakolonner. Alle rådata er optaget med samme tid vs. temperatur program, og med samme t-værdi. Slet de irrelevante data, så dataene fra o C (både T og Abs) bliver tilbage. Minut data omregnes til o C ved flg. tre oprationer: Træk 10 fra, divider med 2 og læg til sidst 20 til. T m for den pågældende koncentration bestemmes ved at beregne den 1. afledede. Manipulate Derivate. Har man bestemt den 1. afledede, svarer T m til maximum, dvs. til det stejleste sted på Abs vs. T kurven. Lav en graf af den 1. afledede og find T m ved hjælp af curseren. år man har T m -værdierne for de forskellig koncentrationer, C, kan de thermodynamiske størrelser bestemmmes, jf. spm. 4. Brug Grafit til at fitte log C mod 1/T m K -1. Bestem H o og S o for duplexdannelsen. Version 1a,

8 DA-smeltetemperaturbestemmelse Sammenligning med andre værdier Da DA og oligonucleotider har været et centralt emne i forskningen i 50 år (det er i år 50 år siden dobbelthelixstrukturen blev publiceret), er der arbejdet meget på at kunne beregne T m samt H o og S o ud fra en kendt sekvens. Det viser sig, at de nærmeste naboer i π-stacken har stor betydning. edenstående tabel giver anvisning på, hvordan H o og S o (og dermed T m ) kan beregnes for duplexdannnelse for givne oligonucleotider og deres komplementære. Table 1: earest-eighbor Thermodynamic Parameters for Watson-Crick Base Pair Formation in 1 M acl a propagation H (kcal/mol) S (eu) G 37 (kcal/mol) sequence Data og tekst taget fra: AA/TT = TT/AA -7.9 ± ± ± 0.01 AT/TA -7.2 ± ± ± 0.04 H.T. Allawi, J. TA/AT -7.2 ± ± ± 0.06 SantaLucia, CA/GT = TG/AC -8.5 ± ± ± 0.06 Thermodynamics and GT/CA = AC/TG -8.4 ± ± ± 0.04 MR of Internal G T CT/GA =AG/TC -7.8 ± ± ± 0.03 GA/CT = TC/AG Mismatches in DA, -8.2 ± ± ± 0.03 CG/GC ± ± ± 0.05 Biochemistry, 36 GC/CG -9.8 ± ± ± 0.03 (1997) GG/CC -8.0 ± ± ± 0.04 Init. w. term. C-G b 0.1 ± ± ± 0.05 Init. w. term. A-T b 2.3 ± ± ± 0.05 Symmetry corr a Errors are resempling standard deviations (see text). b See text for how to apply the initiation parameters Two parameters are introduced: initiation with terminal G-C and initiation with terminal A-T (Table 1). A duplex with two terminal G-C pairs would use total initiation ) 2 (initiation with terminal G-C). A duplex with one terminal G-C and one terminal A-T would use total initiation = (initiation with terminal G-C) + (initiation with terminal A-T). A duplex with two terminal A-T pairs would use total initiation = 2 (initiation with terminal A-T). Exempel: 5 -GGAATT-3 3 -CCTTAA-5 H o = Σ H o (naboer) + H o (init) = H o (GG/CC)+ H o (GA/CT)+ H o (AA/TT)+ H o (AT/TA)+ H o (TT/AA) + H o (C-G-init)+ H o (A-T-init) = (-8.2) + (-7.9) + (-7.2) + (-7.9) = kcal/mol Spm. 7: Hvad er værdierne af H o og S o for den i øvelsen anvendte sekvens, når man benytter dataene i ovenstående tabel? Der findes på internettet adskillige hjemmesider, hvor både T m og H o og S o kan beregnes for givne sekvenser under standardbetingelser. Spm. 8: Hvad er f.eks. forudsigelserne for T m og H o og S o for den i øvelsen anvendte oligonucleotid på hjemmesiderne, og Og hvad er grundlaget for deres estimater? Spm. 9: Hvordan forholder disse værdier sig til dem, I har bestemt eksperimentelt og i spm. 7? Version 1a,