LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument

Transkript

1 LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. LightCycler MRSA Advanced Test LC MRSA 96 Tests P/N: LightCycler Advanced Lysis Kit LYS ADV 96 Tests P/N: TILSIGTET BRUG LightCycler MRSA Advanced-testen er en kvalitativ in vitro-diagnostisk test til direkte bestemmelse af nasal kolonisering med methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) som hjælp ved forebyggelse og kontrol af MRSA-infektioner i sundhedssektoren. Testen udføres på LightCycler 2.0-instrumentet med nasale podeprøver fra patienter med mistanke om kolonisering, benytter podeekstrahering og mekanisk lysis til prøveforberedelse efterfulgt af PCR til amplifikation af MRSA DNA samt fluorescerende targetspecifikke hybridiseringsprober til detektion af det amplificerede DNA. LightCycler MRSA Advanced-testen er ikke beregnet til at diagnosticere MRSA-infektioner eller at fungere som hjælp til eller monitorering af behandling af MRSA-infektioner. Ledsagende dyrkninger er nødvendige for at genfinde organismer til epidemisk typebestemmelse eller med henblik på yderligere følsomhedstestning. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Staphylococcus aureus er et opportunistisk patogen, der bæres som kommensal organisme på huden og i næsen hos ca. 30 % af den normale befolkning med potentiale til at medføre et bredt spektrum af sygdomme, der er dødelige inden for 30 dage efter infektion i ca. 34 % af tilfældene 1, 2. Staphylococcus aureus kan hurtigt tilpasse sig det selektive pres fra behandlinger med antibiotika, hvilket har medført fremkomst og spredning af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)-stammer. meca-genet er placeret på et stort mobilt genetisk element, kaldet SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) og er skyld i resistens over for methicillin samt andre β-lactam antibiotika. meca-genet koder for et ændret penicillinbindende protein, PBP2a eller PBP2', som har en meget lav affinitet over for alle β-lactam antibiotika, hvilket tillader, at der sker normal syntese af peptidoglycan-laget, selv ved forekomst af disse antibiotika 3. Adskillige MRSA-stammer er opstået og har spredt sig i hele verden, og SCCmec er overtaget af forskellige afstamninger af methicillinsensitiv Staphylococcus aureus 4. Til dato er syv SCCmec-typer (I VII) blevet identificeret, og flere varianter af SCCmec-typerne er blevet beskrevet 4. Infektioner forbundet med sundhedspleje, der skyldes MRSA, er i den senere tid blevet et alvorligt problem for hospitaler i hele verden på grund af høj forekomst af infektion, dødelighed og store omkostninger til behandling 5-8. Derudover har samfundserhvervede MRSA-infektioner (CA-MRSA) spredt sig i de seneste år 9, hvilket har bidraget til infektioner på hospitaler 10, 11 og understreget behovet for omfattende programmer til infektionskontrol. I 2008 blev anbefalinger fra offentliggjorte retningslinjer fra flere statslige, faglige og offentlige sundhedsorganisationer samlet for at hjælpe hospitalerne med at prioritere og implementere forebyggelsestiltag med hensyn til overførsel af MRSA 12. Alle programmer til forebyggelse af MRSAoverførsel skal indeholde et antal nøglestrategier, herunder aktiv kontrolscreening, håndhygiejne, patientkarantæne og andre aktiviteter til forebyggelse af overførsel. Real-time PCR-detektion af MRSA reducerer tiden til detektion væsentligt (mindre end 2 timer i laboratoriet) sammenlignet med almindelige dyrkningstest og forbedrer derved effektiviteten af kontrol og håndteringsstrategier. Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1 Doc Rev. 6.0

2 PRINCIPPER FOR PROCEDUREN Detektion af MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen er baseret på 3 hovedprocesser: Prøveforberedelse ved hjælp af mekanisk lysis af bakteriecellevæggene PCR-amplifikation af target-dna og detektion ved hjælp af specifikke hybridiseringsprober Automatisk resultatgenerering efter smeltepunktsanalyse Forberedelse af prøver Den mekaniske lysis af de nasale podeprøver udføres ved hjælp af LightCycler Advanced Lysis-kittet og MagNA Lyser-instrumentet. Hovederne på podepindene klippes ned i lysisrørene og opvarmes for at inaktivere alle bakterier. Lysisrørene overføres derefter til MagNA Lyser-instrumentet, hvor der foregår mekanisk lyse af bakteriecellevæggene, hvilket resulterer i ubehandlede lysatpræparater. Efter et kort centrifugeringstrin for at udskille glasbeads og vatfibre, udføres PCR-analyse af den behandlede prøve ved hjælp af LightCycler MRSA Advanced-testen og LightCycler 2.0-instrumentet. PCR-amplifikation Valg af mål Primerne og proberne i LightCycler MRSA Advanced-testen detekterer en sekvens, der indikerer integrationen af SCCmec-kassetten i Staphylococcus aureus-kromosomet, hvilket angiver forekomst af MRSA DNA. Amplifikation De behandlede prøver og amplifikationsblandingen indeholdende hot-start Taq-polymerase overføres til LightCycler -kapillærrør (20 μl), hvori PCR-amplifikationen foregår. Hver LightCycler MRSA Advancedtestreaktion indeholder en intern kontrol, som er udviklet til at kontrollere for hæmning af prøver samt monitorere reagensintegriteten. AmpErase-enzymet (uracil-n-glycosylase), der findes i LightCycler MRSA Advanced-testen, genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Eftersom amplikoner, der dannes med LightCycler MRSA Advanced-testen, indeholder deoxyuridin, elimineres potentielle amplikonkontaminerende stoffer fra tidligere kørsler under et forlænget opvarmningstrin, før PCR-amplifikationen startes. En targetsekvens i et plasmid amplificeres samtidigt i den positive kontrol. Den positive kontrol er tiltænkt monitorering af reagensfejl og medtages i hver kørsel. Hver kørsel indeholder desuden en negativ kontrol, der bruges til at detektere MRSA DNA-kontaminering af reagenserne eller det omgivende miljø. Specifik detektion af PCR-produkter ved hjælp af hybridiseringsprober MRSA- og intern kontrol-amplikoner detekteres ved fluorescens ved hjælp af et specifikt hybridiseringsprobepar. Proberne fastgøres til en specifik intern sekvens i det amplificerede fragment og placeres tæt ved hinanden. Ved excitation udsender de bundne prober et fluorescenssignal ved en bestemt bølgelængde ved hjælp af en proces, der kaldes FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Det udsendte lys måles af LightCycler 2.0-instrumentet. MRSA- eller de intern kontrol-specifikke amplikoner detekteres parallelt i to forskellige detektionskanaler og kan derved skelnes fra hinanden. Efter fuldførelse af real-time PCR-processen udfører LightCycler 2.0-instrumentet automatisk en smeltepunktsanalyse. Enkeltstrengede DNA-amplikoner med bundne hybridiseringsprober udsættes for øgede temperaturer. Når PCR-produkterne når en bestemt temperatur, smelter en af de to bundne hybridiseringsprober af, hvilket medfører et fald i fluorescenssignalet. Faldet i fluorescenssignalet optræder ved en bestemt temperatur og medfører smeltepunktstoppe, som bruges til at identificere og skelne mellem MRSA- og IC-specifikke amplikoner. Automatisk resultatgenerering efter smeltepunktsanalyse Når der er udført en visuel identifikation af smeltepunktstoppene ved hjælp af T M -søjler i LightCycler - softwaren, overføres testresultaterne til et specielt fortolkningsværktøj (Micro Analysis Software), og der genereres en rapport med IVD-resultaterne DA 2 Doc Rev. 6.0

3 REAGENSER LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced Lysis-kit (P/N: ) LYS (lysisreagens) Trisbuffer EDTA < 15 % siliciumbeads 0,09 % natriumazid LYS ADV 96 test 96 x 0,6 ml LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: ) MRSA RXNMX (MRSA-reaktionsmix) Trisbuffer < 0,1 % magnesiumklorid Kaliumklorid < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp 0,19 % octylglucosid 0,03 % bovint serumalbumin (fra pattedyr) < 0,1 % FastStart Taq DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobielt) 0,09 % natriumazid MRSA DETMX (MRSA-detektionsmix) 0,05 % Brij 35-opløsning Trisbuffer < 0,01 % EDTA < 0,01 % MRSA-primere < 0,01 % fluorescensmærkede oligonukleotide prober, der er specifikke for MRSA og MRSA-intern kontrol 0,09 % natriumazid 0,001 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende MRSA-primerbindingssekvenser og et unikt probebindingsområde MRSA (+) C (MRSA-positiv kontrol) Trisbuffer < 0,01 % EDTA 0,002 % Poly ra RNA (syntetisk) 0,09 % natriumazid < 0,001 % ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende MRSA-sekvenser LC MRSA 96 test 3 x 0,352 ml 3 x 0,176 ml 1 x 0,176 ml DA 3 Doc Rev. 6.0

4 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. B. Denne test er kun til brug med nasale podeprøver. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå bakteriekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipettespidser. F. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker med det samme lotnummer må ikke blandes. G. Reagenser fra forskellige kitlot må ikke blandes. H. Reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. I. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. J. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (MSDS) hos Roche. K. Prøver og kontroller skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 13 og CLSI-dokument M29-A3 14. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. L. LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazidholdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. M. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. N. Kontaminering fra positive kontroller og positive prøver kan undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. LightCycler Advanced Lysis-kittet (LYS) skal opbevares stående ved 15 til 25 C efter modtagelse. B. LightCycler MRSA Advanced-testkittet (MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C) skal opbevares ved 15 til 25 C efter modtagelse. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning skal det resterende MRSA RXNMX og MRSA DETMX opbevares ved 15 til 25 C i op til 30 dage. MRSA RXNMX og MRSA DETMX kan tåle op til 5 nedfrysninger/optøninger. C. Efter åbning skal det resterende MRSA (+) C opbevares ved 15 til 25 C eller ved 2 til 8 C i op til 30 dage. MRSA (+) C kan tåle op til 22 nedfrysninger/optøninger. D. MRSA DETMX skal beskyttes mod lys DA 4 Doc Rev. 6.0

5 E. Arbejds-Master Mix (forberedes ved tilsætning af MRSA RXNMX og MRSA DETMX) skal nyfremstilles og anvendes inden for 24 timer efter forberedelsen. Hvis arbejds-master Mix ikke anvendes straks efter forberedelsen, skal arbejds-master Mix opbevares et mørkt sted ved 2 til 8 C i op til 24 timer. F. Behandlede prøver og negative kontroller, der er forberedt fra Liquid Stuart-podepinde og Amiesgelpodepinde (med eller uden kul), kan holde sig i op til 1 dag ved 15 til 25 C eller op til 5 dage ved 2 til 8 C eller op til 12 måneder ved -15 til -25 C. G. Amplifikationen skal startes straks efter tilsætningen af de behandlede prøver og kontroller til arbejds-master Mix. Hvis dette ikke er muligt, skal de fyldte kapillærrør opbevares et mørkt sted i højst 3 timer ved 2 til 8 C. MEDFØLGENDE MATERIALER A. LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced Lysis-kit (P/N: ) LYS (lysisreagens) B. LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: ) MRSA RXNMX (MRSA-reaktionsmix) MRSA DETMX (MRSA-detektionsmix) MRSA (+) C (MRSA-positiv kontrol) LYS ADV LC MRSA NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software LightCycler 2.0-instrument (P/N: ) LightCycler Software 4.1 (P/N: ) eller højere LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.2 CE (P/N: ) eller højere LC-karruselcentrifuge 2.0 [P/N: (230 V) eller P/N: (110 V)] Bemærk! Hvis du allerede har købt en LC-karruselcentrifuge [P/N: (230 V) eller P/N: (115 V)], kræves der også et LightCycler Carousel 2.0-rotorsæt [P/N: ]. Eller en almindelig benchtop-mikrocentrifuge med en rotor til 2,0 ml-rør og LCcentrifugeadaptere [P/N: ] MagNA Lyser-instrument [P/N: (230 V) eller (110 V)] Valgfri barkodelæser [P/N: ] Reagenser og engangsmaterialer LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: ) LightCycler -kapillærrør, 20 μl (P/N: ) DA 5 Doc Rev. 6.0

6 ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER BD CultureSwab Liquid Stuart (BD P/N: eller ) eller Copan Venturi Transystem Liquid Stuart (Copan Italia International P/N: 141C eller 139C); eller BD CultureSwab plus Amies-gel uden kul (BD P/N: eller ) eller Copan Venturi Transystem plus Amies-gel uden kul (Copan Italia International P/N: 108C eller 134C); eller BD CultureSwab plus Amies-gel med kul (BD P/N: eller ) eller Copan Venturi Transystem plus Amies-gel med kul (Copan Italia International P/N: 114C eller 136C) Beskyttelseshandsker, uden talkum Gazebind Ethanol (70 %) Justerbare pipetter*: (kapacitet: 10 μl, 100 μl og 1000 μl) med sterile, DNase-fri, filterblokerede eller positive displaceringsmikropipettespidser Tørvarmeblok, indstillet til 95 C (± 2 C): VWR (P/N: ) eller tilsvarende med 2,0 ml rørblok: VWR (P/N: ) Mikrocentrifuge, der kan yde x g med rotor til 2,0 ml rør med skruelåg: (P/N: Eppendorf, model 5417C) eller tilsvarende Sterile 1,5 ml silikoniserede polypropylenmikrocentrifugerør: (P/N: Eppendorf, ordrenr ) eller tilsvarende Vortex-mixer: Fisher (P/N: ) eller tilsvarende Valgfrit værktøj til mikrorør: VWR (P/N: ) eller Rainin (P/N: PJ-4A) eller tilsvarende * Pipetter må højst afvige 3 % fra den angivne mængde. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver 1. Fugt podepinden med to dråber (ca. 50 μl) sterilt saltvand, eller brug den tør. 2. Indfør forsigtigt podepinden ca. 1,3 cm ind i næseboret (begge hoveder på podepinden samtidigt, hvis der er tale om dobbelthovede podepinde), og roter mod slimhinden fem gange, mens der trykkes let på ydersiden af næsen (for at sikre, at hovederne på podepinden kommer i kontakt med indersiden af næsen). 3. Indfør den samme podepind i det andet næsebor, og gentag proceduren. 4. Anbring podepinden i den tilhørende beholder, og påsæt en etiket med de relevante oplysninger DA 6 Doc Rev. 6.0

7 B. Transport og opbevaring af prøver Transport af prøver skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 15. Prøverne kan transporteres ved 15 til 25 C. Prøverne kan opbevares, før de behandles (herunder den tid, der skal bruges til transport), som angivet nedenfor. Prøver, der tages med Liquid Stuart-podepinde, kan holde sig i op til 5 dage ved 15 til 25 C i op til 5 dage ved 2 til 8 C i op til 1 måned ved -15 til -25 C Prøver, der er taget med Amies-gelpodepinde med eller uden kul, kan holde sig i op til 4 dage ved 15 til 22 C (ved 25 C var der en hit rate på 95 % på dag 6). BRUGSANVISNING Instrumentforberedelse A. Installation af Micro Analysis Software (MAS) Kontroller ved installation af opdateringer, om der følger yderligere oplysninger med produktet. 1. Log på som administrator via LightCycler -kontrolenheden. 2. Indsæt cd'en med LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.2 CE (eller nyere) i cd-drevet på LightCycler -kontrolenheden. Start installationen af MAS ved at dobbeltklikke på filen setup.exe på cd'en. 3. Ved første installation: a. Hvis Microsoft Data Access Components 2.8 ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af MAS-installationen. Microsoft Data Access Components 2.8 skal installeres. Ellers kan MAS ikke køre korrekt. b. Hvis Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af MAS-installationen. Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) skal installeres. Ellers kan MAS ikke køre korrekt. c. Hvis Microsoft Windows Installer 3.1 ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af MAS-installationen. Microsoft Windows Installer 3.1 skal installeres. Ellers kan MAS ikke køre korrekt. d. Hvis Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af MAS-installationen. Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer skal installeres. Ellers kan MAS ikke køre korrekt. e. Hvis Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) ikke er installeret i forvejen, bliver du bedt om at installere det ved begyndelsen af MAS-installationen. Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) skal installeres. Ellers kan MAS ikke køre korrekt. 4. Bekræft med <Yes>, hvis du bliver bedt om at genstarte. Bemærk! Cd'en med LightCycler genstartsprocessen. MRSA Advanced Software Set må ikke fjernes under 5. Følg instruktionerne i installationsguiden efter genstart. Tryk på <Next> for at starte installationen af MAS. 6. Vælg <Just Me>, hvis der kun skal arbejde én bruger på LightCycler -kontrolenheden, eller vælg <Everyone>, hvis flere brugere skal benytte LightCycler -kontrolenheden DA 7 Doc Rev. 6.0

8 7. Klik på <Close> i vinduet <Installation Complete> for at bekræfte, at MAS-installationen lykkedes. 8. Datamapper for *.ixo- og *.pdf-filer oprettes automatisk (<C:\Export to MAS>, <C:\Export to MAS\ColorCompensations> og <C:\Export to MAS\Macros>). B. Installation og eksport af LightCycler MRSA Advanced Macros 1. Installér *.lckit-makroerne LightCycler MRSA Advanced MCC Macro v1.0 (MRSA MCC_ A_1.0.Ickit) eller nyere og LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 (MRSA_ _1.0.Ickit) eller nyere fra cd'en med LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.2 CE (eller nyere). 2. Se kapitlet Kørsel af Roche-makroer i brugerhåndbog A til LightCycler 2.0-instrumentet. 3. Eksportér begge makroer til <C:\Export to MAS\Macros>. Når du bliver bedt om at gemme filen, skal du vælge *.ixo som filtype og undlade at ændre det oprindelige makronavn. C. Bekræftelse af installationen af Micro Analysis Software (MAS) 1. Kopiér følgende proof-filer fra cd'en med LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.2 CE (eller nyere) til mappen <C:\Export to MAS> (gem ikke filerne i undermapperne). a. MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo eller nyere b. MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.pdf eller nyere 2. Kopiér følgende color compensation-filer fra cd'en med LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.2 CE (eller nyere) til mappen <C:\Export to MAS\ColorCompensations>. a. MRSA_CCE_ ixo b. MRSA_CCO_ ixo 3. Dobbeltklik på MAS-ikonet på skrivebordet, hvis MAS ikke allerede er åben, og tryk på <Load>. 4. Markér filen MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo (eller nyere) i mappen <C:\Export to MAS>. 5. Indtast oplysninger om lotnummer, udløbsdato og laboratorium i de relevante felter i vinduet MRSA Configuration Settings. Advanced Lysis-kit Lot No 11A00000 Expiration Date MRSA Advanced Test Lot No 23A00000 Expiration Date Personlige oplysninger Lab Info Roche Lab 6. Vælg rapporttypen <MRSA Combined>, og fortsæt med <OK>. Filen analyseres automatisk, og dataene vises. 7. Udskriv rapporten DA 8 Doc Rev. 6.0

9 8. Find frem til mappen <C:\Export to MAS>, og åbn og udskriv MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.pdf (eller nyere). 9. Kontrollér, at den udskrevne MAS-rapport og udskrevne PDF-rapport indeholder de samme resultater. Kontakt den lokale Roche-forhandler for at få teknisk hjælp, hvis dette ikke er tilfældet. D. Fjernelse af Micro Analysis Software (MAS) 1. Log på som administrator via LightCycler -kontrolenheden. 2. Klik på <Start> på proceslinjen på LightCycler -kontrolenheden. 3. Vælg <Start> / <Control Panel> / <Add/Remove Programs> nederst til venstre på skrivebordet i Windows. 4. Der vises en liste over de programmer, der er installeret i øjeblikket. Klik på <MAS>. 5. Vælg <Remove>, og bekræft ved at klikke på <Yes>. Bemærk! MRSA Advanced Software Set-cd'en indeholder funktioner til at fjerne og reparere programmet. Fjernelsesfunktionen kan bruges i stedet for den beskrevne procedure ovenfor. Reparationsfunktionen kan bruges til at gendanne beskadigede eller manglende filer i Micro Analysis Software. E. Color compensation-forsøg ved hjælp af LightCycler Multicolor Compensation Set til brug med LightCycler 2.0-instrumentet Udfør følgende trin for at oprette en ny eller erstatte en udløbet color compensation-fil. 1. Optø flaske 1, 2, 3 og 5, bland forsigtigt, og centrifuger kortvarigt. 2. Forbered en 3-gange fortynding af flaske 2 ved at blande følgende: a. 10 μl af opløsningen i flaske 2 b. 20 μl buffer fra et rør med LYS uden at overføre glasbeads 3. Afpipetter 10 μl af hver komponent i et separat LightCycler -kapillærrør (20 μl). a. Kapillærrør 1: Flaske 1 b. Kapillærrør 2: Fortyndingstrin E2 c. Kapillærrør 3: Flaske 3 d. Kapillærrør 4: Flaske 5 Bemærk! Kasser opløsningen i flaske 2, når kørslen er fuldført. 4. Afpipetter 10 μl buffer fra et rør med LYS (uden at overføre glasbeads) i hvert kapillærrør for at opnå en samlet mængde på 20 μl. 5. Luk hvert kapillærrør med et låg ved hjælp af Capping Tool. 6. Centrifuger kapillærrørene ved hjælp af LC Carousel Centrifuge 2.0 eller en standardcentrifuge og centrifugeadaptere. Rørene skal anbringes i følgende positioner i karrusellen: a. Karruselposition 1: CCB (flaske 1) b. Karruselposition 2: CC530 (flaske 2) c. Karruselposition 3: CC610 (flaske 3) d. Karruselposition 4: CC670 (flaske 5) Bemærk! Mængden, der bruges til hvert kapillærrør, må ikke reduceres DA 9 Doc Rev. 6.0

10 7. Overfør LightCycler -prøvekarrusellen til LightCycler 2.0-instrumentet. Hvis der benyttes en normal centrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler -prøvekarrusellen i den rækkefølge, der er angivet i trin E6. Bemærk! Rækkefølgen af reagenserne i karrusellen må ikke ændres. 8. Start og gem color compensation-forsøget (CCE). a. Anvendes LightCycler MRSA Advanced MCC-makroen, henvises til kapitlet Kørsel af Roche-makroer i brugerhåndbog A til LightCycler 2.0-instrumentet. Bemærk! Undgå at bruge feltet <assay lot number>. Hvis analyselotnummeret skal tilføjes til forsøget, skal oplysningerne indtastes i det respektive felt i prøveeditoren. b. Gem kørslen ved hjælp af følgende obligatoriske navnekonvention for color compensation-forsøget: MRSA_CCE_ÅÅMMDD-xx, hvor Å=år, M=måned, D=dag, og xx=kørselsnummer. c. Når kørslen er færdig, oprettes der automatisk en LightCycler -rapport, som kan udskrives. 9. Validering af kørsel Rapporten indikerer ikke, om color compensation-forsøget lykkedes. Color compensation-forsøgets succes fastslås kun ved anvendelse af det color compensation-objekt, der blev genereret fra color compensation-forsøget til den første MRSA Advanced-kørsel. a. Hvis LightCycler Software-rapporten (LCS) for color compensation-forsøget indeholder flaget <User Developed or Modified Test Method>, er color compensationforsøget ugyldigt. Gentag color compensation-forsøget (fra trin E1). b. Hvis LCS-rapporten for color compensation-forsøget ikke indeholder et flag, kan du gå videre til næste trin. 10. Opret en color compensation-fil (CCO). a. Aktivér Color Compensation Analysis Mode, og tryk på knappen <save CC object>. b. Opret et kort, entydigt navn ved hjælp af den obligatoriske navnekonvention for color compensation-objekter: MRSA_CCO_ÅÅMMDD-xx, hvor Å=år, M=måned, D=dag, og xx=kørselsnummer. c. Denne fil bruges til yderligere analyse af analyserne med LightCycler MRSA Advanced-testen. 11. Eksportér både color compensation-forsøget og color compensation-objektfilerne til <C:\Export to MAS\ColorCompensations>. Når du bliver bedt om at gemme filen, skal du vælge *.ixo som filtype og undlade at ændre de oprindelige filnavne. Prøve- og kontrolforberedelse A. Prøveforberedelse 1. Mærk ét LYS-rør for hver patientprøve. Bemærk! Undgå at mærke rørene på toppen af låget. 2. Fjern podepinden fra transportbeholderen. 3. Anbring et enkelt hoved fra podepinden i et LYS-rør. Bemærk! Hvis der anvendes en enkelthovedet podepind, kan der udføres en direkte dyrkning ved at stryge podepinden på pladen, inden du placerer den i LYS-røret DA 10 Doc Rev. 6.0

11 4. Hold podepinden i stilken tæt på rørkanten, løft podepinden nogle få millimeter fra bunden, og bøj stilken mod rørkanten for at knække den. Bemærk! Brug gaze til at minimere risikoen for kontaminering, når podepinden knækkes. Brug ny gaze for hver podepind. 5. Luk låget på LYS-røret tæt. B. Forberedelse af negativ kontrol Bemærk! NC'en skal forberedes samtidigt med de prøver, der skal testes. 1. Mærk ét LYS-rør for negativ kontrol. Bemærk! Undgå at mærke rørene på toppen af låget. 2. Anbring en steril podepind i den tilhørende transportbeholder. Se Andre nødvendige, men ikke medfølgende materialer for at få vist en liste over anbefalede podepinde. 3. Inkubér ved stuetemperatur i mindst 1 minut. 4. Fjern podepinden fra transportbeholderen. 5. Anbring et enkelt hoved fra podepinden i et LYS-rør. 6. Hold podepinden i stilken tæt på rørkanten, løft podepinden nogle få millimeter fra bunden, og bøj stilken mod rørkanten for at knække den. Bemærk! Brug ny gaze til at minimere risikoen for kontaminering, når podepinden knækkes. 7. Luk låget på LYS-røret tæt. C. Behandling af prøver og kontroller 1. Opvarm prøverne og den negative kontrol ved 95 ± 2 C i 2 minutter i en tørvarmeblok. 2. Lysér prøverne og den negative kontrol i MagNA Lyser-instrumentet i 70 sekunder ved o/min. Se brugerhåndbogen til MagNA Lyser-instrumentet for at få nærmere oplysninger. 3. Centrifuger prøverne og den negative kontrol ved x g ved stuetemperatur i 1 minut. Bemærk! Behandlede prøver og negative kontroller, der er forberedt fra Liquid Stuart-podepinde og Amies-gelpodepinde (med eller uden kul), kan holde sig i op til 1 dag ved 15 til 25 C eller op til 5 dage ved 2 til 8 C eller op til 12 måneder ved -15 til -25 C. Reagensforberedelse 1. Optø MRSA RXNMX og MRSA DETMX samt MRSA (+) C ved stuetemperatur. Kontroller, at reagenserne er optøet helt før brug. 2. Bland MRSA RXNMX og MRSA DETMX samt MRSA (+) C på vortex-mixer i 3-5 sekunder, og centrifuger kortvarigt for at samle materiale i bunden af røret. 3. Forbered arbejds-master Mix til det antal prøver og kontroller, der skal testes, i et sterilt, silikoniseret polypropylenmikrocentrifugerør (brug tabel 1 som vejledning). Hver kørsel skal indeholde mindst én prøve, en positiv kontrol og en negativ kontrol. Bemærk! De anbefalede mængder omfatter 2 reaktioner til den negative kontrol og den positive kontrol samt en ekstra mængde for at kompensere for dødvolumen og lette pipetteringen fra mixerrøret til LC-kapillærrørene. Bemærk! Brug værktøjet til mikrorør (VWR P/N eller Rainin P/N PJ-4A) eller tilsvarende for at lette åbningen af MRSA RXNMX og MRSA DETMX, hvis det er nødvendigt DA 11 Doc Rev. 6.0

12 Tabel 1 Forberedelse af arbejds-master Mix Antal prøver Mængde af MRSA RXNMX (μl) Mængde af MRSA DETMX (μl) Mængde i alt (μl)* *Omfatter mængder til NC, MRSA (+) C samt dødvolumen. 4. Bland arbejds-master Mix på vortex-mixer i 3-5 sekunder, og centrifuger kortvarigt for at samle materiale i bunden af røret. Arbejds-Master Mix skal nyfremstilles hver dag. Kasser ubrugt arbejds- Master Mix inden for 24 timer efter forberedelsen DA 12 Doc Rev. 6.0

13 Forberedelse af behandlede prøver og kontroller 1. Anbring det nødvendige antal LightCycler -kapillærrør i LC-karrusellen eller i centrifugeadapterne. Der skal bruges ét (1) kapillærrør til PC'en (position 1), 1 kapillærrør til den behandlede NC (position 2) og 1 kapillærrør til hver behandlet prøve (position 3 og derover). Bemærk! Håndter LightCycler -kapillærrørene ved hjælp af kapillærrørets reservoirdel. 2. Afpipetter 15 μl arbejds-master Mix i hvert kapillærrørsreservoir. 3. Afpipetter 5 μl klar supernatant fra hver behandlet prøve i kapillærrør nr. 3 og derover. Skift pipettespids efter hver prøve. 4. Afpipetter 5 μl af den behandlede negative kontrol i kapillærrør nr. 2. Bemærk! Behandlede prøver og negative kontroller, der er forberedt fra Liquid Stuart-podepinde og Amies-gelpodepinde (med eller uden kul), kan holde sig i op til 1 dag ved 15 til 25 C eller op til 5 dage ved 2 til 8 C eller op til 12 måneder ved -15 til -25 C. Hvis der benyttes frosne behandlede prøver, skal de optøs ved stuetemperatur, blandes på vortex-mixer i 10 sek. og derefter centrifugeres ved x g ved stuetemperatur i 1 minut. 5. Afpipetter 5 μl af den optøede MRSA (+) C i kapillærrør nr Luk hvert kapillærrør med et låg ved hjælp af Capping Tool. 7. Centrifuger kapillærrørene i LC Carousel Centrifuge 2.0, eller brug en standardcentrifuge og centrifugeadaptere. 8. Overfør LightCycler -prøvekarrusellen til LightCycler 2.0-instrumentet. Bemærk! Hvis der benyttes en normal centrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler - prøvekarrusellen i den rækkefølge, der er angivet i trin 1. Bemærk! Amplifikationen skal startes straks efter tilsætningen af de behandlede prøver og kontroller til arbejds-master Mix. Hvis dette ikke er muligt, kan de fyldte kapillærrør opbevares i højst 3 timer, beskyttet mod lys, ved 2 til 8 C. Indsættelse og betjening af LightCycler 2.0-instrumentet 1. Log på LightCycler -softwaren. 2. Start LightCycler MRSA Advanced Macro (se kapitlet Kørsel af Roche-makroer i brugerhåndbog A til LightCycler 2.0-instrumentet for at få yderligere oplysninger). Bemærk! Undgå at bruge feltet <assay lot number>. MAS vil anmode om reagensoplysninger, inden resultatanalyseprocessen startes (analyselotnummeret kan også indsættes i det relevante felt af prøveeditoren i LightCycler -softwaren). 3. Giv kørslen et navn ved hjælp af en entydig identifikator. 4. Reducer standardindsættelseslisten til det antal prøver, der skal testes. Start proceduren fra trin 2, hvis der utilsigtet slettes for mange prøvepositioner. 5. Scan prøvernes barkodemærkater, eller indtast prøvenavnene i prøvenavnefeltet, eller brug standardindstillingerne. Feltet <Run Note> kan bruges til indtastning af data, hvis det er nødvendigt. Bemærk! Standardnavnet for den positive og negative kontrol må ikke ændres. 6. Følg instruktionerne på skærmen, og start LightCycler MRSA Advanced-testkørslen DA 13 Doc Rev. 6.0

14 RESULTATER Identifikation af top og automatisk resultatanalyse: Bemærk! Dataanalysen må ikke startes, mens en LightCycler -kørsel er i gang. Manuel T M Calling kræver manuel betjening i to automatisk valgte T M Calling-moduler. Modulerne Absolute Quantification bruges ikke til analysen af denne test. I smeltepunktsvinduet vises alle kurver for de valgte grafer. T M -søjlen for hvert analysemodul er foruddefineret i LightCycler MRSA Advanced-makroen. Det er muligt at vælge eller fravælge en T M -søjle uden at generere en markering. Baseline for hvert analysemodul er foruddefineret i LightCycler MRSA Advanced-makroen i overensstemmelse med nedenstående tabel og må ikke fravælges eller ændres. Hvis den ændres ved et uheld, skal de korrekte værdier indtastes fra tabel 2. Tabel 2 Baseline-værdier CH 610 CH 670 Baseline-værdi 0,085 0,100 Toppe defineres som maksima over baseline. Fremspring er ikke toppe. Eksempler på toppe for en typisk positiv kontrol (graf 1, kanal 610) og intern kontrol (graf 2, kanal 670) samt top med fremspring (graf 3): Graf 1 Graf DA 14 Doc Rev. 6.0

15 Graf 3 Justering af T M -søjler: 1. Efter kørslen er fuldført, viser forsøgsguiden meddelelsen <Analyses have been created>. 2. Flyt meddelelsesvinduet til bunden af skærmen for at kunne se T M - og baseline-værdierne (tryk ikke på <Finish>). 3. Klik på analysemodulet T M Calling 610. Der vises en oversigt over alle positioner. 4. Reducér størrelsen af vinduet med grafvisningen ved at skubbe venstre håndtag i det pågældende vindue mod højre. Kolonnerne Baseline, TM1 og Height1 bliver herefter synlige. Bemærk! Hvis der vælges mere end én position, vises indstillingerne for det først valgte kapillærrør. Bemærk! Ændringer af søjlerne påvirker alle de aktiverede og valgte kapillærrør. 5. Klik på positionen for den positive kontrol (#PC#) for at markere den. 6. Hvis T M -søjlen ikke befinder sig ved topmaksima (over baseline), skal den flyttes til topmaksima for at fokusere på de angivne T M -områder (se tabel 3). 7. Hvis der ikke er nogen toppe over baseline, efterlades T M -søjlen på standardpositionen. Kontroller, at søjlerne ikke markerer hældninger for nuværende toppe (f.eks. uden for det angivne T M -område). 8. Kontroller, at værdierne vises i kolonnerne TM1 og Height1 for den pågældende prøve (alle værdier). Hvis der ikke observeres nogen værdier (tomt område), skal T M -søjlen anbringes ved topmaksima. Værdierne vises nu i kolonnerne TM1 og Height1. Tabel 3 Angivne T M -områder MRSA (CH 610) Intern kontrol (CH 670) Lav T M ( C) Høj T M ( C) 57,00 62,00 57,00 62,00 Bemærk! For prøver uden toppe (f.eks. den negative kontrol) skaleres automatisk til den højeste baggrundsværdi. I dette tilfælde vises den foruddefinerede baseline muligvis ikke. Hvis du ønsker at gøre baseline synlig, skal du vælge denne kapillærrørsposition sammen med den positive kontrol. Bemærk! Markerede toppe uden for det angivne T M -område rapporteres i MAS-rapporten DA 15 Doc Rev. 6.0

16 9. Fortsæt med detektionen af toppe som beskrevet i trin 5-8 ovenfor for alle de resterende positioner (kontroller og prøver). 10. Klik på analysemodulet T M Calling Fortsæt med detektionen af toppe som beskrevet i trin 4-8 ovenfor for alle positioner (kontroller og prøver). Afslut T M Calling: 1. Flyt vinduet med forsøgsguiden tilbage til midten af skærmen, og tryk på <Finish>. 2. Der genereres automatisk en LightCycler -rapport, som kan udskrives. 3. Forsøget gemmes automatisk. Bemærk! Hvis der foretages ændringer i felterne med prøvenavne i LightCycler -softwaren, efter der er gemt, skal brugeren opdatere databasen ved at markere og klikke på ikonerne Abs Quant 610 og Abs Quant 670 og derefter gemme filen igen. 4. Eksporter *.ixo-filen ved at klikke på <File> \ <Export> til mappen <C:\Export to MAS>. Automatisk resultatgenerering ved hjælp af Micro Analysis Software (MAS): 1. Dobbeltklik på MAS-ikonet på computerens skrivebord, og tryk på <Start>. 2. Vælg det MRSA Advanced-forsøg, der skal analyseres, i mappen <C:\Export to MAS>, og indlæs *.ixo-filen. 3. Scan eller indtast oplysningerne om lotnummer og udløbsdato, der fulgte med Advanced Lysiskittet og LightCycler MRSA Advanced-testen. 4. Indtast personlige oplysninger (f.eks. brugerens navn), hvis det ønskes. Bemærk! De oplysninger, der sidst blev indtastet i MAS, bruges fremover. 5. Vælg et relevant rapportformat (tabelformet, grupperet eller kombineret). 6. *.ixo-filen for MRSA Advanced-forsøget analyseres automatisk, og dataene vises i det valgte rapportformat. 7. Udskriv MAS-rapporten og/eller eksporter som *.pdf. Bemærk! MAS-rapporten viser IVD-resultater. Derfor har den forrang i forhold til angivne oplysninger i den generiske LightCycler -rapport (LCS-rapport) DA 16 Doc Rev. 6.0

17 FORTOLKNING AF RESULTATER 1. Resultaterne beregnes af LightCycler -softwaren ud fra de målte fluorescenssignaler og indbyggede beregningsalgoritmer og præsenteres ved hjælp af Micro Analysis Software (MAS). 2. Kørsel, kontrol og prøvevalideringer udføres automatisk af MAS. Bemærk! Der genereres muligvis markeringer og kommentarer for RUN STATUS, CONTROLS STATUS og SAMPLE STATUS. Brugeren skal kontrollere MAS-rapportudskriften for markeringer eller kommentarer i alle felter. Bemærk! Et negativt resultat i LightCycler MRSA Advanced-testen udelukker ikke tilstedeværelsen af MRSA-nasal kolonisering. 3. Hvis kørslen er gyldig, fortolkes resultaterne på følgende måde: CH 610- resultat (MRSA) POSITIV CH 670- resultat (IC) POSITIV eller NEGATIV MRSAresultat Kommentar DETECTED - NEGATIV NEGATIV INVALID IC not detected NEGATIV POSITIV NOT DETECTED - Fortolkning Prøven er positiv for MRSA DNA. Antaget MRSA-nasal kolonisering. Ugyldigt resultat. Gentag PCR-proceduren med optøet behandlet prøvemateriale eller en ny prøve. Hvis den stadig er ugyldig, skal du angive, at resultatet er ugyldigt. Kontakt det lokale Roche-kontor MRSA DNA ikke detekteret. MRSA-nasal kolonisering er ikke sandsynlig. Yderligere kommentarer for positiv kontrol, negativ kontrol og prøveresultater kan rapporteres af MAS: Kommentar Peak(s) outside Target T M range Peak(s) outside IC T M range Fortolkning Der er detekteret amplikoner uden for det angivne MRSA T M -område. Der er detekteret amplikoner uden for det angivne IC T M -område. Hvis kommentaren Peak(s) outside Target T M range rapporteres af MAS for et prøveresultat, som er enten Not Detected / Valid eller Invalid / Invalid (i hhv. kolonnerne MRSA Result og Status i MASrapporten), skal prøven antages at være positiv MRSA DNA. Indsaml en ny prøve (eller benyt overskydende prøvemateriale fra en dobbelthovedet podepind), og test igen ved brug af en alternativ procedure, f.eks. dyrkning, for at bestemme patientens nasale kolonisering. Prøveresultater, som er Detected / Valid (i hhv. kolonnerne MRSA Result og Status i MAS-rapporten), og for hvilke MAS viser Peak(s) outside Target T M range, skal fortolkes som positive for MRSA DNA (formodet MRSA-nasal kolonisering). Forekomsten af disse kommentarer i statuslinjen Controls Status i MAS-rapporten ændrer ikke Controls Status- eller Run Status-fortolkningen, der genereres af MAS og vises i MAS-rapporten DA 17 Doc Rev. 6.0

18 4. MAS viser muligvis følgende markeringer: Markering ( Flag ) Invalid macro version User Developed or Modified Test Method Lysis Kit expired MRSA Test expired Kommentarer Fortolkning Status Afhjælpning File could not be loaded CCO expired on YYMMDD 1 - INVALID CCO NAME MULTIPLE CCO USED Der er anvendt en forkert makro. De vigtige parametre i *.ixo-filerne for CCE og/eller CCO og/eller MRSA Advanced er forskellige fra *.ixoreferencefilerne for MRSA Advancedmakroer. Mulige årsager er beskrevet i brugerhåndbogen til LightCycler 2.0- instrumentet (f.eks. ændring af standardindstillinger for makroen). LightCycler Advanced Lysis-kittet er udløbet. LightCycler MRSA Advanced-testen er udløbet. Color Compensation-filen er ældre end 6 måneder. Color Compensation-filen er ikke navngivet korrekt. Der er anvendt forskellige color compensation-filer i analysemodulerne. Run INVALID Run INVALID Run INVALID Run INVALID Run INVALID Run INVALID Run INVALID Gentag LightCycler - kørslen. Kontroller den korrekte makro i LightCycler -softwaren og/eller MRSA Advanced Software Set. Se forslaget til afhjælpning for den respektive markering, hvis der vises yderligere markeringer. Gentag forsøget, hvis der ikke vises yderligere markeringer. Kontakt den lokale Rocheforhandler, hvis en markering vises konstant. Gentag LightCycler - kørslen med ikke-udløbne reagenser. Gentag LightCycler - kørslen med ikke-udløbne reagenser. Forbered en ny farvekompensationskørsel, og opret et nyt farvekompensationsobjekt. Forbered en ny LightCycler -kørsel, og opret et nyt farvekompensationsobjekt. Forbered en ny farvekompensationskørsel, og opret et nyt farvekompensationsobjekt ved at følge navnekonventionen, der er angivet i dette dokument. Forbered en ny LightCycler -kørsel, og opret et nyt farvekompensationsobjekt med et korrekt navn. Åbn *.ixo-filen for MRSAforsøget i LightCycler - softwaren, og vælg det korrekte farvekompensationsobjekt. Gem forsøget, og eksportér det igen DA 18 Doc Rev. 6.0

19 Markering ( Flag ) NO CCO USED INVALID LCS VERSION INVALID BASELINE INVALID NC INVALID PC INVALID NC NAME INVALID PC NAME Kommentarer Fortolkning Status Afhjælpning NC: Target peak(s) detected NC: IC not detected PC: PC not detected - - Der mangler en eller flere color compensation-filer i analysemodulerne. Der er anvendt en forkert version af LightCycler - softwaren til proceduren. Baseline-værdierne er muligvis ændret ved et uheld. Der blev detekteret amplikon/amplikoner i MRSA T M -området af den negative kontrol. Der blev ikke detekteret nogen IC i den negative kontrol. Intet MRSA-target fundet i den positive kontrol Standardnavnet for den negative kontrol er ændret. Standardnavnet for den positive kontrol er ændret. 1 MAS udsender en advarsel 30 dage, før reagenset udløber. Run INVALID Run INVALID Run INVALID Controls INVALID Controls INVALID Controls INVALID Controls INVALID Åbn *.ixo-filen for MRSAforsøget i LightCycler - softwaren, og vælg den korrekte farvekompensationsfil. Gem forsøget, og eksportér det igen. Åbn LightCycler - softwaren, og se efter det korrekte versionsnummer. Åbn *.ixo-filen for MRSAforsøget i LightCycler - softwaren, og ret baselineværdierne i overensstemmelse med tabel 2. Gem forsøget, og eksportér det igen. Se afsnittet Kvalitetskontrol. Se afsnittet Kvalitetskontrol. Åbn *.ixo-filen for MRSAforsøget i LightCycler - softwaren, og indtast #NC#. Gem forsøget, og eksportér det igen. Åbn *.ixo-filen for MRSAforsøget i LightCycler - softwaren, og indtast #PC#. Gem forsøget, og eksportér det igen DA 19 Doc Rev. 6.0

20 5. MAS viser muligvis følgende meddelelser: Meddelelse Fortolkning Status Afhjælpning Eksportér makrofilen fra Makrofil < > mangler Macro file < > Interpretation LightCycler -softwaren til i <C:\Export to was not found aborted mappen <C:\Export to MAS\ MAS\Macros> Macros> igen. CCExperiment file < > was not found CCObject < > file was not found Error in Color Compensation Experiment/Object / MRSA Experiment / or MD5 Hash code Modified test method in <.> CCE-fil < > mangler i <C:\Export to MAS\ ColorCompensations> CCO-fil < > mangler i <C:\Export to MAS\ ColorCompensations> Fejl under kontrol af ixo-filens integritet. Registrering af ændret parameter Interpretation aborted Interpretation aborted Interpretation aborted Run INVALID Eksportér farvekompensationsfilen fra LightCycler -softwaren til mappen <C:\Export to MAS\ ColorCompensations> igen. Eksportér farvekompensationsobjektfilen fra LightCycler -softwaren til mappen <C:\Export to MAS\ColorCompensations> igen. Eksportér forsøgsfilen samt farvekompensations- og makrofilerne fra LightCycler -softwaren igen. Kontakt Roche Service, hvis denne meddelelse vises konstant. Se User Developed or Modified Test Method KVALITETSKONTROL 1. Hver LightCycler MRSA Advanced-reaktion indeholder en intern kontrol (IC). IC'en er udviklet til at kontrollere, om der er hæmning af prøver, samt monitorere reagensintegriteten. a. Intern kontrol (IC) Den interne kontrol (IC) skal være fundet positiv i alle MRSA-negative prøver samt i den negative kontrol (NC). Hvis IC'en er negativ i en negativ prøve, er prøven ugyldig, og PCRproceduren med nyligt optøede, behandlede prøver skal gentages. Hvis IC'en er negativ i NC'en, er hele kørslen ugyldig og skal gentages med frosne, behandlede prøver eller nye prøver. Rapportér det ugyldige resultat, og kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel med frosne, behandlede prøver stadig er ugyldig. IC-resultatet ignoreres i MRSA-positive prøver og i en gyldig positiv kontrol, eftersom MRSA-amplifikationen muligvis vil konkurrere med denne kontrol. 2. Der skal behandles mindst 1 positiv kontrol og 1 negativ kontrol med hver kørsel. Den positive kontrol er tiltænkt monitorering af reagensfejl. NC'en bruges til at detektere MRSA DNA-kontaminering af reagenserne eller det omgivende miljø. Amplifikationsreagenser indeholder et enzym, der forhindrer kontaminering med MRSA-amplikoner. LightCycler -softwaren tildeler automatisk positionen af begge kontroller i instrumentet. a. Negativ kontrol (NC) Den negative kontrol skal være negativ, mens den interne kontrol skal være positiv. Hvis NC'en ikke opfylder disse kriterier, er hele kørslen ugyldig og skal gentages med frosne, behandlede prøver eller nye prøver. Kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel stadig er ugyldig DA 20 Doc Rev. 6.0

21 b. Positiv kontrol (PC) PC'en skal være positiv (med IC enten positiv eller negativ). Hvis PC'en ikke opfylder dette kriterium, er hele kørslen ugyldig og skal gentages med frosne, behandlede prøver eller nye prøver. Kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel stadig er ugyldig. Der genereres muligvis markeringer og kommentarer af Micro Analysis Software (MAS). Brugeren skal kontrollere kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er gyldig. Kontrol Negativ kontrol Positiv kontrol CH 610- resultat (MRSA) CH 670- resultat (IC) Fortolkning NEGATIV POSITIV Kørslen er gyldig. Ingen handling. POSITIV NEGATIV POSITIV NEGATIV POSITIV eller NEGATIV NEGATIV POSITIV eller NEGATIV POSITIV eller NEGATIV Kørslen er ugyldig. Kør nye prøver. Kørslen er ugyldig. Gentag kørslen med frosne, behandlede prøver (eller nye prøver). Kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel med frosne, behandlede prøver stadig er ugyldig. Kørslen er gyldig. Ingen handling. Kørslen er ugyldig. Gentag kørslen med frosne, behandlede prøver (eller nye prøver). Kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel med frosne, behandlede prøver stadig er ugyldig. Bemærk! Hvis den negative kontrol (NC) eller MRSA (+) C til LightCycler MRSA Advancedtesten konstant er ugyldig, er LightCycler Multicolor Compensation-filen muligvis forkert. Gentag farvekompensationsforsøget, eller kontakt den lokale Rocheforhandler for at få teknisk hjælp. Ekstern positiv kontrol (EPC) MicroBioLogics KWIK-STIK MRSA-positiv kontrol (P/N: 0158ROCHE) kan bruges til undervisning, kvalitetssikringsanalyse og ekstern kvalitetskontrol af LightCycler MRSA Advanced-testen. En MRSAstamme, der repræsenterer RE2-typer, bruges til denne eksterne positive kontrol. MRSA-stammer, der repræsenterer RE3- og RE7-typer, kan, hvis de er tilgængelige, bruges som yderligere eksterne positive kontroller for at monitorere analyseprimere og prober, der ikke direkte kontrolleres i analysen. Eksterne kontroller kan bruges i overensstemmelse med retningslinjerne fra lokale, nationale og regionale akkrediteringsorganisationer. Følg trinene i KWIK-STIK -pakningsindlægget til podeprøveforberedelse, men anbring ikke podepinden i dyrkningsmediet. Følg instruktionerne for prøveforberedelse og testning af podepinden i pakningsindlægget til LightCycler MRSA Advanced-testen, når podepinden er mættet med det hydrerede materiale. EPC'en skal være positiv (med IC enten positiv eller negativ). Hvis EPC ikke opfylder dette kriterium, er hele MagNA Lyser-kørslen ugyldig og skal gentages med nye prøver. Kontakt den lokale Roche-forhandler, hvis den gentagne kørsel stadig er ugyldig. Bemærk! Til dato er syv SCCmec-typer (I VII) blevet identificeret, og flere varianter af SCCmectyperne er blevet beskrevet 4. LightCycler MRSA Advanced-testen er baseret på et selvstændigt detektionssystem, der kan detektere MRSA-stammer med forskellige molekylære sekvenser i nærheden af RE-samlingen (Right Extremity) af SCCmeckassetten med orfx-genet. De RE-typer, der er blevet registreret af LightCycler MRSA-testen, omfatter RE2, RE3 og RE7. Derudover har sekvensanalyse af type RE1 vist 100 % homologi mellem de primer- og probepar, der anvendes i LightCycler 2.0 MRSA Advanced-testen DA 21 Doc Rev. 6.0

22 FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE 1. Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Dette produkt må kun anvendes sammen med LightCycler 2.0-instrumentet. 2. Denne test er kun valideret til brug med humane nasalprøver. 3. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning (antal organismer i prøven), transport, opbevaring og behandling. 4. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, der er oplært i de relevante teknikker. 5. Et positivt resultat i en LightCycler MRSA Advanced-test indikerer ikke tilstedeværelsen af levedygtigt MRSA. Det skaber dog en formodning om tilstedeværelsen af MRSA. Derfor indikerer et positivt resultat ikke nødvendigvis manglende interventionsudryddelse, da der stadig kan være ikke-levedygtigt DNA. Et negativt resultat, der følger efter et tidligere positivt testresultat, indikerer muligvis eller muligvis ikke, at det er udryddet. 6. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastlægge teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. 7. Tilstedeværelsen af AmpErase-enzym i LightCycler MRSA Advanced-reaktionsmix reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra MRSA (+) C og kliniske prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 8. Registreringen af MRSA i lav koncentration (dvs CFU pr. podepind) ved tilstedeværelse af methicillin-modtageligt Staphylococcus aureus (MSSA) i en koncentration, der er større end 10E4 CFU pr. podepind, er ikke blevet etableret og er derfor fortsat ukendt. 9. Selvom de er sjældne, kan mutationer eller polymorfier i regionen i bakteriegenomet, som er dækket af LightCycler MRSA Advanced-testens primere og/eller probe, hæmme registreringen. Sjældne former for MSSA-stammer, der bærer en genetisk variant af SCCmec-kassetten, kan føre til positive resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen. 10. Som ved alle PCR-baserede in vitro-diagnosticeringer kan ekstremt lave målniveauer under LOD for analysen registreres, men det er ikke altid muligt at reproducere resultaterne (se afsnittet Reproducerbarhed for at få flere oplysninger). 11. Overførsler eller krydskontaminering kan opstå ved MRSA-koncentrationer, der er højere end (>) 10E5 CFU pr. podepind DA 22 Doc Rev. 6.0

23 Interfererende stoffer Stoffer, der kan påvirke detektionen af MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen og potentielt generere ugyldige resultater, omfatter blod og store mængder nasal sekret/mucus. Der blev fundet blod på nasalpoden for 20/1.620 (1,2 %) prøver. Ingen af dem havde ugyldige resultater på grund af IC-fejl. Følgende eksogene stoffer (se tabel 4), som er komponenter i dekongestanter og stoffer, der bruges til at afhjælpe tørhed og/eller irritation i næsen, har vist sig ikke at interferere med detektionen af MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen. Tabel 4 Eksogene stoffer testet med LightCycler MRSA Advanced-testen Handelsnavn Aktivt stof InfectoPyoderm Mupirocin 20 mg/g (antibiotikum) Turixin Mupirocinkalcium 21,5 mg/g (antibiotikum) Bepanthen næsesalve Dexpanthenol 50 mg/g (provitamin B5) Accumed 12-timers næsespray Oxymetazolinhydroklorid 0,05 % (dekongestant) Otriven Xylometazolin 0,1 % (dekongestant) Forventede værdier I det kliniske forsøg med LightCycler MRSA Advanced-testen blev der indsamlet nasale podeprøver fra kvalificerede personer på fem forskellige steder i USA. Undersøgelsesgruppen blev opdelt i personer på ikke-intensive behandlingssteder på hospitaler (1.007, 71,8 %), intensive behandlingssteder på hospitaler (67, 4,8 %) plejehjem/udvidede plejesteder (255, 18,2 %) og medicinsk personale (73, 5,2 %). Det samlede antal positive MRSA-prøver ved direkte kromogendyrkning var 187 (13,3 %). Tabel 5 sammenfatter antallet og procentdelen af positive og negative tilfælde ved direkte kromogendyrkning inddelt efter undersøgelsesgrupper. Gruppe Ikke-intensive behandlingssteder, hospital Tabel 5 Forventede værdier for MRSA i forskellige grupperinger Positiv N (%) Negativ N (%) Samlet N (%) 74 (7,3 %) 933 (92,7 %) (71,8 %) Intensive behandlingssteder, hospital 3 (4,5 %) 64 (95,5 %) 67 (4,8 %) Plejehjem/udvidede plejesteder 109 (42,7 %) 146 (57,3 %) 255 (18,2 %) Medicinsk personale 1 (1,4 %) 72 (98,6 %) 73 (5,2 %) I alt 187 (13,3 %) (86,7 %) DA 23 Doc Rev. 6.0

24 EGENSKABER FOR PERFORMANCE KLINISK PERFORMANCE Resultaterne af LightCycler MRSA Advanced-testen blev fastlagt i en prospektiv undersøgelse på fem institutioner ved at sammenligne LightCycler MRSA Advanced-testen med en anden FDA-godkendt nukleinsyreamplifikationstest, direkte kromogendyrkning og bouillondyrkning (den mest følsomme dyrkningsmetode). Emnerne omfattede personer og medicinsk personale, der var udsat for risiko for nasal kolonisering. Hver enkelt person kunne kun deltage i undersøgelsen én gang. Personer, der havde modtaget systemiske eller topisk-nasale antibiotika, som bruges til behandling af nasal kolonisering med MRSA fra prøvetagningsdatoen og op til en uge før deltagelsen i undersøgelsen, som var under 2 år, og/eller som havde kontraindikation ift. indsamling af nasale podeprøver, blev udelukket fra undersøgelsen. Der blev indsamlet en dobbelthovedet podepind fra hver forsøgsperson. Et hoved fra podepinden blev strøget direkte på et udsnit af en kromogen-agarplade med cefoxitin og derefter behandlet i overensstemmelse med pakningsindlægget til prøver med LightCycler MRSA Advanced-testen. De resterende udsnit af kromogen-agarpladen blev strøget ved hjælp af en steril løkke. Det andet hoved fra podepinden blev strøget direkte på en separat kromogenplade med cefoxitin og derefter behandlet til prøven med den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest (i overensstemmelse med pakningsindlægget). Derefter blev det andet hoved fra podepinden overført til Trypticase Soy Broth og inkuberet i 48 timer ved C og derefter efterdyrket på en kromogenplade med cefoxitin (bouillondyrkning). Kromogendyrkningspladerne blev inkuberet ved C i timer. Formodede MRSA-kolonier fra alle dyrkningsplader blev bekræftet ved hjælp af koagulasetest og gramfarvning, hvis de blev fundet efter timers inkubation. Hvert deltagende sted udførte alle test. Resultaterne af LightCycler MRSA Advanced-testen blev beregnet i forhold til resultaterne af den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest, direkte kromogendyrkning og bouillondyrkning. Prøver, der dyrkede MRSA ved direkte kromogendyrkning via hovedet fra podepind A og/eller podepind B blev betragtet som MRSA-positive, medmindre andet er angivet. Samlet blev der indsamlet nasale podeprøver fra personer på fem steder i USA, og de blev testet ved hjælp af LightCycler MRSA Advanced-testen. Ud af de prøver var prøver kvalificeret til at blive medtaget i den statistiske analyse 1. Det samlede antal positive MRSA-prøver ved direkte kromogendyrkning var 187 (13,3 %). I alt var 2 kørsler (1,7 %) ud af de 117 LightCycler -kørsler, der blev udført i undersøgelsen, ugyldige på grund af afvigelser i forhold til undersøgelsesprotokollen. 10 (0,6 %) ud af de nasale podeprøver, der blev taget i LightCycler MRSA Advanced-testen, gav ugyldige resultater på grund af interne kontrolfejl efter den første test, og 7 ud af (0,4 %) prøver var stadig ugyldige på grund af interne kontrolfejl efter gentagelsen af testen. Resultaterne, som blev indsamlet som nasale podeprøver fra kvalificerede forsøgspersoner, der blev testet for MRSA ved hjælp af LightCycler MRSA Advanced-testen i sammenligning med henholdsvis direkte kromogendyrkning, den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest og bouillondyrkning, er vist i tabel 6, 7 og 8. Tabel 6 omfatter evaluerbare prøver, som havde gyldige resultater i LightCycler MRSA Advanced-testen og den direkte kromogendyrkning. Tabel 7 omfatter prøver med gyldige resultater i LightCycler MRSA Advanced-testen og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest, som desuden havde overensstemmende direkte kromogendyrkningsresultater fra podepind A og B. Tabel 8 omfatter evaluerbare prøver, som havde gyldige resultater i LightCycler MRSA Advancedtesten og i bouillondyrkningen prøver kunne ikke evalueres til statistisk analyse: 36 personer opfyldte ikke tilmeldingskriterierne for undersøgelsen, 153 prøver blev ikke taget i overensstemmelse med undersøgelsesprotokollen, 22 prøver var ugyldige på grund af eksterne kontrolfejl, og 7 prøver var ugyldige på grund af interne kontrolfejl. Ved gentagelse af testen var disse 7 prøver stadig ugyldige på grund af interne kontrolfejl DA 24 Doc Rev. 6.0

25 Tabel 6 Sammenligning mellem LightCycler MRSA Advanced-test og direkte kromogendyrkning Direkte kromogendyrkning LightCycler MRSA Advanced Test Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 95,2 % (91,1 %, 97,8 %) Negativ procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 96,4 % (95,2 %, 97,4 %) Bemærk! Denne oversigtstabel omfatter evaluerbare prøver, som havde gyldige resultater i LightCycler MRSA Advancedtesten og direkte kromogendyrkning. Ud af de 178 prøver med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogendyrkning var den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest positiv for 175 prøver og negativ for 3 prøver. For de 44 prøver, der var positive for LightCycler MRSA Advanced-testen og negative for direkte kromogendyrkning, var den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest positiv for 25 prøver og negativ for 19 prøver. For de 9 prøver, der var negative for LightCycler MRSA Advanced-testen og positive for direkte kromogendyrkning, var den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest positiv for 4 prøver og negativ for 5 prøver. Ud af de prøver med negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogendyrkning var den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest positiv for 76 prøver, negativ for prøver og manglende/ugyldig for 4 prøver DA 25 Doc Rev. 6.0

26 Tabel 7 Sammenligning mellem LightCycler MRSA Advanced-test og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest Den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest LightCycler MRSA Advanced Test Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 71,7 % (65,9 %, 77,0 %) Negativ procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 98,2 % (97,2 %, 98,9 %) Bemærk! Denne oversigtstabel omfatter prøver med gyldige resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest, der desuden havde afvigende resultater for den direkte kromogendyrkning fra podepind A og B. Ud af de 195 prøver med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den anden FDAgodkendte nukleinsyreamplifikationstest var den direkte kromogendyrkning positiv for 171 prøver og negativ for 24 prøver (MRSA blev bekræftet i 20 af disse 24 prøver fra uoverensstemmelsesanalysen). For de 20 prøver, der var positive for LightCycler MRSA Advanced-testen og negative for den anden FDAgodkendte nukleinsyreamplifikationstest, var direkte kromogendyrkning positiv for 1 prøve og negativ for 19 prøver (MRSA blev bekræftet i 10 af disse 19 prøver fra uoverensstemmelsesanalysen). For de 77 prøver, der var negative for LightCycler MRSA Advanced-testen og positive for den anden FDAgodkendte nukleinsyreamplifikationstest, var direkte kromogendyrkning positiv for 1 prøve og negativ for 76 prøver (MRSA blev bekræftet i 13 af disse 76 prøver fra uoverensstemmelsesanalysen). Ud af de prøver med negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest var direkte kromogendyrkning positiv for 4 prøver (MRSA blev bekræftet i alle 4 prøver fra uoverensstemmelsesanalysen) og negativ for prøver DA 26 Doc Rev. 6.0

27 Tabel 8 Sammenligning mellem LightCycler MRSA Advanced-test med bouillondyrkning Bouillondyrkning LightCycler MRSA Advanced Test Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 89,8 % (84,8 %, 93,5 %) Negativ procent-overensstemmelse (eksakt 95 %-konfidensinterval) 96,8 % (95,6 %, 97,7 %) Bemærk! I alt er 1.395/1.402 evaluerbare prøver, der havde gyldige resultater for LightCycler MRSA Advancedtesten og bouillondyrkningen, medtaget i denne oversigtstabel. Bouillondyrkningsresultaterne manglede/var ugyldige for 7/1.402 evaluerbare prøver. I tabel 9 vises en oversigt over resultater for kvalificerede forsøgspersoner (en nasal podeprøve pr. patient), som er testet for MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen, en anden FDA-godkendt nukleinsyreamplifikationstest og direkte dyrkning. Tabel 9 Sammenligning mellem LightCycler MRSA Advanced-test og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest og direkte dyrkning LightCycler MRSA Advanced Test Direkte dyrkning Anden nukleinsyreamplifikationstest Positiv Negativ I alt Positiv Positiv Positiv Negativ Negativ Positiv Negativ Negativ I alt I alt Bemærk! Kun evaluerbare prøver, der bidrog med gyldige resultater i LightCycler MRSA Advanced-testen, samt resultaterne af den anden nukleinsyreamplifikationstest og afvigende resultater for direkte dyrkning er medtaget i denne oversigtstabel DA 27 Doc Rev. 6.0

28 Uoverensstemmelsesanalyse Yderligere undersøgelser (dvs. test for meca-overført oxacillinresistens ved hjælp af metoden cefoxitin disk diffusion, fem- og meca-specifik PCR og sekvensering af SCCmec-områder) blev udført på alle prøver, der viste afvigende resultater mellem direkte kromogendyrkning (prøver, der kun viste afvigende resultater i podepind A og B), og LightCycler MRSA Advanced-testen eller mellem direkte kromogendyrkning (prøver, der kun viste afvigende resultater i podepind A og B) og den anden FDA-godkendte nukleinsyreamplifikationstest. Uoverensstemmelsesanalysen bekræftede tilstedeværelsen af MRSA i 30 ud af 44 prøver, hvor LightCycler MRSA Advanced-testen viste et positivt resultat, men den direkte kromogendyrkning var negativ. Tilstedeværelsen af MRSA blev bekræftet i 4 ud af 9 prøver, hvor LightCycler MRSA Advanced-testen viste et negativt resultat, men den direkte kromogendyrkning var positiv. Tilstedeværelsen af MRSA blev bekræftet i 13 ud af 76 prøver, hvor den anden FDAgodkendte nukleinsyreamplifikationstest viste et positivt resultat, men LightCycler MRSA Advanced-testen og den direkte kromogendyrkning viste et negativt resultat. EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE A. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet for LightCycler MRSA Advanced-testen blev bestemt ved hjælp af 3 MRSAstammer, som repræsenterede de tre RE-typer, som denne analyse er rettet mod (højre ekstremitet af SCCmec/orfX-samlingen, (RE) type 2, 3 og 7). Dyrkninger fra disse stammer blev kvantificeret, fortyndet til værdier i området fra 100 til 400 CFU (colony forming units) pr. podepind og absorberet af podepinde, der tidligere blev neddyppet i forskellige transportmedier. Alle fortyndinger i nærheden af LOD-værdien blev testet i mindst 30 bestemmelser. Den opnåede detektionsgrænse for hver testet stammetype og podepindtype repræsenterer det laveste antal CFU/podepind, hvorved der opnås et positivt resultat med mindst 95 % konfidens. Resultaterne indikerer, at LightCycler MRSA Advanced-testen vil give et positivt resultat med 95 %-konfidensinterval for en podepind, der kan rumme 240 CFU. Tabel 10 Detektion af MRSA i forskellige transportmedier Podepindtyper CFU/podepind Liquid Stuart-transportmedie 240 Amies-gel uden transportmiddel indeholdende kul 240 Amies-gel med transportmiddel indeholdende kul DA 28 Doc Rev. 6.0

29 B. Analytisk specificitet Inklusivitet Performance for LightCycler MRSA Advanced-testen ved 137 veldefinerede MRSA-isolater, der er repræsentative for epidemiologiske kloner i USA, er vist i tabel 11. Stammerne blev indsamlet via NARSAprogrammet (Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus), der støttes under NIAID/NIH-kontraktnr. HHSN C og af kliniske laboratorier. Alle stammer blev testet som dyrkninger ved en koncentration på 10E5 cfu/ml. Alle isolater undtagen en enkelt blev testet positive med LightCycler MRSA Advanced-testen (99,3 %). Tabel 11 MRSA-isolater repræsentative for epidemiologiske kloner indsamlet fra NARSA-programmet (Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus Aureus) og veldefinerede isolater fra kliniske laboratorier USA-type Antal testede isolater Isolater med positive resultater ved brug af LightCycler MRSA Advanced-testen * Kan ikke angives/ 5 5 ukendt I alt (99,3 %) *Ud af de 54 testede stammer af typen USA 100 var en stamme (NRS642) negativ ved brug af LightCycler MRSA Advanced-testen. Eksklusivitet LightCycler MRSA Advanced-testens specificitet blev evalueret ved at teste for krydsreaktivitet med patogene mikroorganismer og kontaminerende stoffer, der kan forekomme i den normale nasale mikroflora. De testede arter bestod af 13 virale, 66 bakterielle og 7 svampearter som beskrevet i tabel 12. Mikroorganismerne blev testet som kulturer i koncentrationer på 10E6 til 10E7 cfu/ml eller som genomiske DNAforberedelser i koncentrationer på 10 pg/pcr. Derudover blev humant DNA testet i en koncentration på 5 ng/reaktion. Det humane DNA og alle de testede arter var negative for MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen DA 29 Doc Rev. 6.0

30 Tabel 12 Arter testet for krydsreaktivitet med LightCycler MRSA Advanced-testen Arter Staphylococcus aureus (MSSA) Haemophilus influenzae Staphylococcus cohnii ssp. cohnii Haemophilus parainfluenzae Staphylococcus epidermidis Herpes simplex-virus 1 Staphylococcus haemolyticus Humant DNA Staphylococcus hominis Influenza A (H1N1), A (H3N2) Staphylococcus intermedius Influenza B Staphylococcus lugdunensis Issatchenkia orientalis (Candida krusei) Staphylococcus pseudointermedius Klebsiella pneumoniae ssp,ozeanae Staphylococcus saprophyticus Kocuria kristinae Staphylococcus schleiferi ssp. coagulans Kytococcus schroeteri Staphylococcus sciuri Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii Staphylococcus simulans Legionella pneumophila Staphylococcus warneri Metapneumovirus Staphylococcus xylosus Microbacterium testaceum Acinetobacter baumannii Micrococcus luteus Actinobacillus actinomycetemcomitans Moraxella catarrhalis Actinomyces odontolyticus Morganella morganii Adenovirus 7A Mycobacterium avium Aerococcus urinaeequi Mycoplasma pneumoniae Aspergillus fumigatus Mycoplasma salivarium Bacteroides fragilis Neisseria meningitidis Bacteroides uniformis Oerskovia jenensis Bacteroides vulgatus Parainfluenza 1 Bordetella bronchioseptica Parainfluenza 2 Bordetella parapertussis Parainfluenza 3 Bordetella pertussis Parvimonas micra (Peptostreptococcus micros) Burkholderia cepacia Peptostreptococcus stomatis Candida albicans Peptostreptococcus anaerobius Candida glabrata Planococcus maritimus Candida parapsilosis Proteus mirabilis Candida tropicalis Proteus vulgaris Citrobacter freundii Pseudomonas putida Coronavirus Pseudomonas aeruginosa Corynebacterium glutamicum Respiratorisk syncytialvirus (RSV A, B og A2) Corynebacterium amycolatum Rhinovirus Corynebacterium jeikeium Rhodococcus equi Cryptococcus neoformans Rothia mucilaginosa Eikenella corrodens SARS Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae Enterococcus faecium Streptococcus pneumoniae Enterovirus Streptococcus pyogenes Escherichia coli Streptococcus viridans Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus) Veillonella atypica Haemophilus aphrophilus Der blev observeret et fravær af krydsreaktivitet på 100 % af de testede organismer. Desuden blev 117 isolater af methicillinresistente koagulasenegative staphylococci, 104 isolater af methicillinsensitive koagulasenegative staphylococci samt 100 isolater af methicillinsensitiv Staphylococcus aureus, der blev indsamlet fra forskellige europæiske kliniske centre, testet ved koncentrationer på 10E4 til 10E5 CFU/reaktion. Alle andre stammer blev testet negative med LightCycler MRSA Advanced-testen DA 30 Doc Rev. 6.0

31 Reproducerbarhed Et panel af prøver med forskellige koncentrationer af MRSA og methicillin-sensitivt Staphylococcus epidermidis (MSSE) blev testet. To brugere på hvert af de 3 laboratorier udførte en kørsel om dagen i 5 dage på tre reagenslotnumre (4 prøver x 3 bestemmelser x 5 dage x 3 laboratorier x 3 lotnumre x 2 brugere). Der blev anvendt et panel med 12 medlemmer sammensat af prøver med methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA)-streng ATCC fortyndet til de koncentrationer, der er vist i tabel 13. Den methicillinsensitive Staphylococcus epidermidis (MSSE) ATCC-streng blev inkluderet i hvert panelmedlem på et konstant niveau for at opnå en passende prøvematrix. Panelet inkluderede et negativt medlem under LOD (20 CFU/podepind forventes at give en positivitetsfrekvens på mellem 30 og 70 %), svagt positiv (300 CFU/podepind) og positiv (800 CFU/podepind). Det negative panelmedlem gav negative resultater fra den laveste værdi på 99 % op til 100 %, positivitetsfrekvensen for panelmedlemmet under LOD lå i intervallet mellem den laveste værdi på 42 % op til 47 %, positivitetsfrekvensen for det svagt positive panelmedlem lå i intervallet fra den laveste værdi på 99 % op til 100 %, og positivitetsfrekvensen for det positive panelmedlem lå i intervallet fra den laveste værdi på 99 % op til 100 % afhængigt af laboratoriet. Tabel 13 Oversigt over reproducerbarhedsresultater MRSA CFU/ podepind Prøvetype T M Gennemsnit ( C) Ikke tilgængelig 0 Negativ 20* 300 Under LOD Svagt positiv T M Standardafvigelse T M CV (%) Lot Ikke tilgængelig Ikke tilgænge lig 59,56 0,22 0,4 59,48 0,20 0,3 800 Positiv 59,43 0,21 0,3 Lot til lot Sted til sted Dag til dag Antal/ antal testet % Sted Antal/ antal testet % Dag Antal/ antal testet 1 90/ % 1 90/ % 1 53/54** 98 % 2 90/ % 2 89/90** 99 % 2 54/ % 3 89/90** 99 % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % 1 52/90 58 % 1 38/90 42 % 1 25/54 46 % 2 30/90 33 % 2 41/90 46 % 2 26/54 48 % 3 39/90 43 % 3 42/90 47 % 3 22/54 41 % 4 25/54 46 % 5 23/54 43 % 1 90/ % 1 89/90 99 % 1 53/54 98 % 2 89/90 99 % 2 90/ % 2 54/ % 3 90/ % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % 1 90/ % 1 90/ % 1 53/54** 98 % 2 90/ % 2 89/90** 99 % 2 54/ % 3 89/90** 99 % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % Bemærk! *Koncentration, der producerer ca. 30 til 70 % positive resultater. **Der skete tilsyneladende en ombytning mellem en positiv og en negativ prøve, der var placeret ved siden af hinanden i samme kørsel. Hvis disse prøver udelades fra analyseresultaterne fra lot til lot, fra laboratorium til laboratorium og fra dag til dag, ville reproducerbarheden være 100 %. Overførsel/krydskontaminering Der blev udført en analytisk undersøgelse for at evaluere potentialet for krydskontaminering mellem meget koncentrerede MRSA-prøver og negative MRSA-prøver, der blev behandlet parallelt gennem hele arbejdsgangen for LightCycler MRSA Advanced-testen. For hver af de fem fuldførte kørsler udført af to brugere (herunder prøveforberedelsesarbejdsgangen) blev 15 podepinde beriget med 3,3 x 10E5 CFU af typen MRSA RE2, mens 15 podepinde ikke blev beriget. Der blev skiftet mellem meget positive og meget negative podepinde gennem prøveforberedelsen og PCR-forberedelsen, og de blev derefter placeret i LightCycler 2.0-instrumentet til PCR-test. Der blev ikke observeret nogen falsk-positive resultater som følge af krydskontaminering ved test med en koncentration på 3,3 x 10E5 CFU/podepind. % DA 31 Doc Rev. 6.0

32 REFERENCER 1. Kuehnert MJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, JID 2006; 193: Wyllie DH, et al. Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in Oxfordshire, : cohort study. BMJ. 2006; 333 (7562): Pinho MG, Filipe SR, de Lencastre H, Tomasz A Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2A in Staphylococcus aureus. : J Bacteriol Nov; 183(22): Berglund C, Ito T, et al. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec in a methicillinresistant Staphylococcus aureus strain isolated in Sweden. Antimicrob Agents Chemother 2008 Oct; 52(10): Cosgrove SE, et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-Resistant and Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia:A Meta-analysis. CID 2003:36, Engemann JJ, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis. 2003; 36(5): Abramson MA, et al. Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infect Control Hosp Epidemiol. 1999; 20(6): Muto CA, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003; 24(5): Association for Professionals in Infection Control & Epidemiology, Inc (APIC). National prevalence study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S. healthcare facilities. Executive summary. June 25, Klevens RM, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 2007; 298(15): Witte W. Nosocomial and community MRSA infections. EH ONLINE. Accessed November 7, Calfee DP, et al. Strategies to prevent transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in acute care hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008; 29(suppl 1):S62 S Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3. Wayne, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 51 st Edition DA 32 Doc Rev. 6.0

33 Oplysninger om dokumentrevision Doc Rev /2012 Opdateret adresse for producenten og den autoriserede repræsentant. Beskrivelserne af de harmoniserede symboler er blevet opdateret, og oversættelserne er fjernet. "Et medlem af Roche-gruppen" er fjernet. Kontakt den lokale Roche-repræsentant, hvis du har spørgsmål DA 33 Doc Rev. 6.0

34 LightCycler Advanced Lysis-kittet og LightCycler MRSA Advanced-testen er fremstillet af: Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal LIGHTCYCLER, FASTSTART, MAGNA LYSER, MRSA ADVANCED, LC og AMPERASE er varemærker, der tilhører Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemærke, der tilhører Roche. BD CULTURESWAB er et varemærke, der tilhører Becton, Dickinson and Company. BEPANTHEN er et varemærke, der tilhører Bayer Healthcare. BRIJ er et varemærke, der tilhører Croda International, PLC. COPAN TRANSYSTEM er et varemærke, der tilhører Copan Diagnostics, Inc. INFECTOPYODERM er et varemærke, der tilhører Infectopharm GmbH. KWIK-STIK er et varemærke, der tilhører MicroBioLogics, Inc. MICROSOFT, WINDOWS, VISUAL STUDIO og SQL SERVER er varemærker, der tilhører Microsoft. OTRIVEN er et varemærke, der tilhører Novartis. TURIXIN er et varemærke, der tilhører GlaxoSmithKline. Cyaninfarvestofferne i dette produkt er patenteret af GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er kun givet i licens til Roche med henblik på inkorporering i forskningskomponenter og kits til in vitro-diagnostik. Enhver brug af sådanne kits til andre formål end forskning eller in vitro-diagnostik kræver underlicenser fra GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA. Copyright 2012, Roche Molecular Systems, Inc. Alle rettigheder forbeholdes. 12/2012 ( ENGL) Doc Rev DA 34 Doc Rev. 6.0

35 Følgende symboler er nu i anvendelse på etiketter til Roche PCR diagnostiske produkter. SW Hjælpesoftware Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Autoriseret repræsentant i EF Nedre grænse for tildelt interval Stregkodedataark Producent Lotnummer Opbevares mørkt Biologisk fare Tilstrækkelig til Katalognummer Temperaturbegrænsning Se brugsanvisning Testdefinitionsfil TDF Indhold i pakning Øvre grænse for tildelt interval Distribueret af Holdbar til Kun til evaluering af IVD-performance Dette produkt overholder kravene i det europæiske direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik. Teknisk kundesupport i USA DA 35 Doc Rev. 6.0