PATENT Int. Cl. C 12 k 7/00 Kl. 30h 6

Transkript

1 PATENT Int. Cl. C 12 k 7/00 Kl. 30h 6 Ansøgning nr. 4863/65 Indleveret den 22. september 1965 Fremlagt den 4.december 1967 DANMARK DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET KØBENHAVN Patentbeskrivelsen offentliggjort den 22.apri Fortrinsret påberåbt fra den 22.september 1964 nr (USA) Diamond Laboratories, Inc., Des Moines, Iowa, USA. Fuldmægtig under sagens behandling: Firmaet Ch a s. Hud e, København. Fremgangsmåde til dyrkning af overførbar gastroenteritis virus. Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til dyrkning af overførbar gastroenteritis virus i dyrevævskulturer. OverfØrbar gastroenteritis er en meget smitsom og udbredt svinesygdom, der forårsager alvorlige Økonomiske tab. Den kan angribe svin af alle racer og alle aldre, men forårsager kun omfattende tab som følge af dødelighed hos meget unge svin. Den blev først beskrevet af Doyle og Hutchings i 1946 (J.A.V.M.A., bind 108: ). Det har været praksis at fodre søer med smitsomme tarmdele fra inficerede svin tre eller flere uger, før de skal fare. Som følge heraf overføres passiv immunitet til pattegrisene. Denne praksis er imidlertid ikke god, fordi den tjener til at sprede sygdommen yderligere. Hidtil har det ikke været muligt konsekvent at føre det virale stof over i vævskultur og kontrollere overførbar gastroenteritis ved at immunisere dyrene med vævskulturvacciner. Talrige forsøg på at isolere og serieformere overførbar gastroenteritis virus har været mislykkede. Den foreliggende opfindelse, hvorefter overførbar gastroenteritis virus kan formeres i vævskulturer og en vaccine fremstilles deraf, er den første af sin art og derfor et betydeligt fremskridt. Formålet med opfindelsen er at angive en hidtil ukendt fremgangsmåde til dyrkning af overførbar gastroenteritis virus i dyrevævskulturer, således at der kan fås væsker med virus i meget ren og Svækket

2 2 form, som er egnede til vaccination af dyr, således at disse og deres afkom immuniseres. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man poder virulent gastroenteritis virus i en første dyrevævskultur og lader virusen vokse deri i en periode på 6-24 timer, fortrinsvis 8-12 timer, og overfører viruspartiklerne fra denne kultur til andre vævskulturer og fortsætter inkubationen, overrgrin2; og inkubationen af virusen fra en v=kultur til en anden med mellemrum på 6-24 timer, til der er dannet væsker, som har et højt indhold af virus i st.-erkt renset og sv.e.*- -ket form fri for større mængder cellerester. Virusen kan formeres i vævskulturer af væv fra dyr af oksefamilien, svinefamilien, hundefamilien (f.eks. hund eller ræv), kattefamilien (f.eks. kat), frittefamilien, farefamilien og andre dyrefamilier. Formeringen kan ske i samme væv eller andet væv end det, der anvendes til -den 'første passage. Fortrinsvis anvendes nyrevæv til fremstilling af vævskulturerne, omend det vil forstås, at andre væv oc,så kan anvendes. Efter den sidste inkubation fremstilles en vaccine ved at høste den virusholdige kultur, idet der fortrinsvis tilsættes et stabiliseringsmiddel og derefter inkuberes vaccinen for fuldstændig at inaktivere virusen. Vaccinen kan oplagres som en væske, eller den kan fryses, f.eks. kan den frysetørres. Den inaktiverede overførb,re gastroenteritis vaccine anvendes til at immunisere søer og deres pattegrise mod overførbar pastroenteritis ved at injicere soen, før den skal fare, med vaccinen for at stimulere produktionen af antistoffer, som beskytter soen og samtidig overføres til mælken og derved beskytter pattegrisene. Søerne kan injiceres intramuskulært eller subkutant. Medmindre andet er an!:prt, er alle dele og procenter efter rum- Eksempel -1. Den oprindelige udgangsvirus fremkom fra pattegrise inficeret med overførbar gastroenteritis. Tarmstykker fra inficerede svin blev befrifor deres slimhinde. Slimhinden blev så opblandet med en pufret saltopløsning, suppleret med hesteserum og homogeniseret. Den pufrede saltopløsning var sammensat af 16 g KH2PO4, 34 g Na2 HPO4 og 8,5 dele NaC1 i 1000 ml vandig opløsning. En rumfangsdel hesteserum blev sat til 9 dele af saltopløsningen. 1 Del slimhinde blev sat til 4 rumfangsdele af den fuldstændige saltopløsning. Denne pufrede saltopløsning er helt forskellig fra Hankis afbalancerede saltopløsning og andre saltopløsninger, der traditionelt anvendes til næringsvæsker til vævskulturer.

3 3 Homogenatet blev centrifugeret og ført gennem et Seitz filter for at gøre det bakteriologisk sterilt. Alle de ovennævnte operationer blev udført ved 0 til 4 C. Filtratet blev så sat til forskellige vævskultursystemer enten som monolag eller suspension, der var fremstillet på almindeligt anvendte måder. Det almindeligt anvendte medium var 9 til 9,5 rumfangsdele af Hank's afbalancerede saltopløsning (Hanks, J. Cell Comp. Physical, bind 31, side , 1948) og 0,5 til 1 rumfangsdel inaktiveret hesteserum. Andre medier, der er tilfredsstillende til dyrkning af inficerede kulturer, omfatter (a) Earles BSS plus 5-10% hesteserum og (b) Morgans Medium 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., bind 73, side 1-8, 1959) suppleret med 5-10% hesteserum.eventuelt kan laktalbuminhydrolysat i en endelig koncentration på 0,5% sættes til ovennævnte medier. Ved formering og svækkelse af virusen ifølge den foreliggende opfindelse kan'anvendes ethvert ugiftigt flydende næringsmedium til vævskultur. I de følgende eksempler var det anvendte medium 9 dele af Hank's afbalancerede saltopløsning og 1 del inaktiveret hesteserum (efter rumfang). ph-værdien af mediet blev indstillet på 7,2 til 7,6 og kulturerne inkuberet ved 35 til 38 C. Seriepassage af overførbar gastroenteritis virus i vævskulturer blev udført med mellemrum på 24 timer eller mindre, hyppigst med 6 til 14 timers mellemrum, ved at pode friske vævskulturer med samlede fortyndede væsker fra den forudgående passage. Indhøstede og samlede væsker blev også oralt podet på pattegrise ved hver femte passage for at kontrollere tilstedeværelsen eller overlevelsen af virusen. OverfØrbar gastroenteritis virus, der var virulent for pattegrise, var tilstede i titere på mindst 10-5 efter 5 til 15 passager. Dyrkning af overførbar gastroenteritis virus i vævskultur er blevet udført udfra forskellige svin inficeret med sygdommen. I hvert tilfælde blev tilstedeværelsen af virus påvist ved oral podning af pattegrise, som udviklede kliniske symptomer på sygdommen og døde. Desuden blev tilstedeværelsen af virus påvist ved elektronmikroskopisk undersøgelse af vævskulturvæsker. Viruspartikler iagttaget i vævskulturvæsker var identiske med viruspartikler isoleret af tarmslimhindeekstrakter fra inficerede pattegrise. Elektronmikroskopisk identifikation af denne virus som overførbar gastroenteritis blev udført efter 5., 10., 15. og 40. vævskulturpassage. På de højere passageniveauer (20 til 40) blev virulensen af virusen for pattegrise progressivt mindre, indtil den blev gjort avirulent. Det har vist sig, at vævskulturteknikken ifølge opfindelsen giver

4 4 et højt udbytte af virus fra væv af svin, får, kvæg, hunde, fritter og katte. Andre dyrevæv kan også anvendes for at understøtte overførbar gastroenteritis virusvækst. Fremstilling af vaccine af væv fra andet end svinefamilien, især hundefamilien f.eks. hunde og ræve, eliminerer uønskede vira, der angriber svin. Hundevira, der kan findes i det dyrkede hundevæv, eller hundevævsceller, der anvendes ved den foreliggende fremgangsmåde, er ikke patogene for svin og inficerer derfor ikke svin, som får administreret den fra hund stammende vaccine fremstillet ifølge opfindelsen. Virusen fremstillet ifølge opfindelsen kan fortyndes efter styrke, eller der kan tilsættes stabiliseringsmidler eller andre ugiftige stoffer. Til brug som vaccine kan virusen tørres, f.eks. ved frysetørring, eller den kan fremstilles i væskeform. Administration af vaccinerne fremstillet ifølge opfindelsen er kun praktisk til svin, der kan frembringe beskyttende antistoffer. Da pattegrise er immunologisk umodne på det tidspunkt, hvor de er mest følsomme for overførbar gastroenteritis, kan de ikke vaccineres med godt resultat. Pattegrise kan imidlertid bibringes immunitet ved at injicere vaccinen i søer før pattegrisenes fødsel. Pattegrise, der patter vaccinerede søer, er immune overfor overførbar gastroenteritis. - : Eksempel 2. Filtratet blev fremstillet som i eksempel 1, og overførbar gastroenteritis virus blev formeret efter den ovenfor beskrevne fremgangsmåde under anvendelse af 9 dele af Hank's afbalancerede saltopløsning og 1 del inaktiveret hesteserum. Virusholdige væsker fra 10. til 12. vævskulturpassage blev fortyndet 1 til 20 og podet i standard Povitsky flasker indeholdende et monolag af hundenyreceller. Flaskerne blev inkuberet ved 37 C i 10 timer, på hvilket tidspunkt der ikke blev iagttaget nogen stor cytopatisk virkning, Monolagene blev afsondret i væskerne ved frysning og tøning. Identitet af virusindhold i væskerne blev bestemt ved oral podning af 1 ml doser fra hver serie tidobbelt fortyndet i pattegrise, som man havde i individuelle isolerede bur. Der blev iagttaget virussmitsomhedstitere på mindst Når man ønsker at fremstille en inaktiveret vaccine, forenes den virusholdige kultur med et stabiliserende opløsningsmiddel og inkuberes ved 25 C fortrinsvis i 5 dage. Efter inkubation kan vaccinen frysetørres, eller den kan lagres ved lav temperatur, f.eks. 41 C eller -35 o C. Inaktivering af virusen blev bekræftet, når oral administration af 10 ml af væsken ikke frem., bragte overførbar gastroenteritis hos pattegrise. Eksempel 3. Effektiviteten af vacciner fremstillet i eksempel 2 blev undersøgt

5 ved intramuskulær podning af søer i de sidste seks uger af deres drægtighedsperiode. Alle søer var fra specielle patogenfrie besætninger og var fra gårde, som ikke havde haft overførbar gastroenteritis i mere end 20 år. 48 Timer efter fødslen blev 2-3 svin (kontrol) fra hvert kuld fjernet fra soen til et isoleret kvarter. Disse kontrolgrise, som ikke fik noget somælk i to dage og derfor var følsomme for overførbar gastroenteritis, og alle grisene, der blev hos soen, blev i en alder af 4 dage udsat oralt for 1000 smitsomme doser af overførbar gastroenteritis. Grise født af en ikke vaccineret so (kontrol) blev også udsat for smitte, og resultaterne er anført i tabel 1. Tabel 1. Immunisering af søer med inaktiveret overførbar gastroenteritis virus fra vævskultur. Resultater af smitteforsøg Antal grise døde Antal grise med efter smitte / sygdomssymptomer/ Pode- totalt antal totalt antal smit smittede tede So mate- Antal nr. x riale Vaccinations- dage so (ml) dage før fa- var syg Grise Isolere- Grise Isolerering hos so de grise hos so de grise /5 2/ 2 0/5.2/ /5 2/2 0/5 2/ /4 2/2 0/4 2/ /5 3/3 0/5 3/3 5 0 Kontrol so 2 6/6 2/2 6/6 2/ /6 2/2 6/6 2/ /4 2/2 4/4 2/ /3 1/1 3/3 1/ og /9 2/2 0/9 2/ Kontrol so 6 9/9 2/2 9/9 2/2 x Søer 1 og 2 fik ikke tørret vaccine. Søer 3, 4,6,7,8 og 9 fik tørret vaccine og rekonstitueret vaccine. xx Tilstedeværelse af overførbar gastroenteritis virus bekræftet i andre svin ved oral podning af bakteriologisk sterile tarmekstrakter fra disse svin. Søer, der var vaccineret med 2 eller 4 ml inaktiveret overførbar gastroenteritis vaccine før faringen, overførte til deres pattegrise en

6 6 passiv immunitet overfor overførbar gastroenteritis. Grise (kontrol), der blev overført fra soen til isolering og udsat for smitte to dage senere med 1000 smitsomme doser af overførbar gastroenteritis, udviklede i almindelighed vandig diarrhå og opkastning på 24 til 48 timer og døde 4 til 5 dage efter smitten. Eksperimentelt inficerede immune grise, der pattede hos den vaccinerede so, udviste ingen symptomer på overførbar gastroenteritis, sålænge de kunne få mælk fra soen. I nogle tilfælde udviklede soen, der ikke var eksperimentelt inficeret, en let feber, diarrhå og svigtende mælkeudvikling i en eller to dage. Som følge heraf kunne grisene ikke få mælk fra denne so og udviklede derfor diarrhå. Genoptagelse af mælkeudviklingen hos soen bevirkede, at grisene med diarrhå blev raske igen. Andre forsøgsdata har bekræftet disse iagttagelser, at en stadig tilførsel af somælk til grisene er nødvendig for at beskytte mod overførbar gastroenteritis. Fortrinsvis skal vaccinationen bestå af mindst en 2 ml dosis administreret indenfor seks uger før faringen. Ikke vaccinerede søer bibragte på den anden side ikke deres pattegrise immunitet overfor overførbar gastroenteritis. Disse grise udviklede vandig diarrhå og opkastning på 24 til 48 timer og døde indenfor 6-7 dage efter smitten. Vaccinen var også et effektivt immuniseringsmiddel for søer. Ikke vaccinerede søer udviklede alvorligere symptomer på overførbar gastroenteritis end vaccinerede søer. Eksempel 4. Væsker indeholdende overførbar gastroenteritis virus formeret som beskrevet i eksempel 2 i 40 passager på hundenyrer blev forenet med et stabiliserende opløsningsmiddel i et forhold på 50% væske til 50% stabiliseringsmiddel og frysetørret. Vaccinens avirulens blev undersøgt ved flere orale podninger af en mængde svarende til 5 eller 10 ml ufortyndet vævskulturvæske på pattegrise. Der blev ikke iagttaget symptomer på overførbar gastroenteritis i iagttagelsesperioden på 10 dage til 2 uger efter podningen. Tilstedeværelsen af overførbar gastroenteritis virus blev bekræftet ved elektronmikroskopisk undersøgelse af væskerne. Eksempel 5. Effektiviteten af svækket vaccine fremstillet ved eksempel 4 blev undersøgt ved intramuskulær podning af søer 17 eller 34 dage før faringen. Disse resultater er vist i tabel 2.

7 7 Tabel 2. Immunisering af søer med svækket overførbar gastroenteritis virus fra vævskultur. Resultater af smitteforsøg Antal grise døde Antal grise med efter smitte / sygdomssymptototalt antal mer / totalt an- Pode- smittede tal smittede mate- Antal So riale Vaccinations-,dage so Grise Isolere- Grise Isolerenr. (ml) dage før faring var syg hos so de grise hos so de grise, /6 2/2 1/6 2/ /4 2/2 0/4 2/2 5 0 Kontrol so 2 6/6 2/2 6/6 2/2 Svækket overførbar gastroenteritis vaccine immuniserer effektivt søer (aktivt) og deres pattegrise (passivt). Kontrolgrise, der blev fjernet fra soen og udsat for smitte 48 timer senere med 1000 smitsomme doser af overførbar gastroenteritis, udviklede typiske symptomer på sygdommen og døde. Ingen af de immune grise, der pattede hos de vaccinerede søer, døde, omend en enkelt havde vandig diarrhå i en dag. Den ikke vaccinerede so var følsom for overførbar gastroenteritis og overførte ikke immunitet overfor sygdommen til sine pattegrise. P a t e n t k r a v. Fremgangsmåde til dyrkning af overførbar gastroenteritis virus i dyrevævskultur,kendetegnet ved, at man poder virulent gastroenteritis virus i en første dyrevævskultur og lad er virusen vokse deri i en periode på 6-24 timer, fortrinsvis 8-12 timer, og overfører viruspartiklerne fra denne kultur til andre vævskulturer og fortsætter inkubationen, overføringen og inkubationen af virusen fra en vævskultur til en anden med mellemrum på 6-24 timer, til der er dannet væsker, som har et højt indhold af virus i stærkt renset og svækket form fri for større mængder cellerester. Fremdragne publikationer: Tysk patent nr