Antibiotikaresistente bakterier i spildevand Undersøgelse af spredning fra Rigshospitalet til Renseanlæg Lynetten Lynettefællesskabet I/S Rapport Marts 2012
This report has bred under the DHI Business Management System certified by DNV to comply with ISO 9001: Quality Management System Godkendt af: 13-03-2012 X Approved by Signed by: Ulf Nielsen
Antibiotikaresistente bakterier i spildevand Undersøgelse af spredning fra Rigshospitalet til Renseanlæg Lynetten Klient Klientens repræsentant Lynettefællesskabet I/S Kim Rindel Projekt nr. 11520009 Klassifikation Tilhører klienten Forfattere Christine Anna Hastrup Claus Jørgensen Jette Wille Lentz Fredskilde Ulf Nielsen i
i
INDHOLDSFORTEGNELSE 1 BAGGRUND... 1 2 FORMÅL... 2 3 MÅLEPROGRAM... 3 3.1 Prøvetagningsprogram... 3 3.1.1 Rigshospitalet... 3 3.1.2 Renseanlæg Lynetten... 4 3.2 Analyseprogram... 5 3.2.1 Tabletmetoden... 7 3.2.2 E-Test (Epsilometer Test)... 7 3.2.3 MALDI-TOF-MS... 7 3.2.4 Ribotypning... 7 4 RESULTATER OG DISKUSSION... 9 4.1 Forekomst af bakterier og resistens... 9 4.2 E. coli ribotyper og resistensmønstre... 11 4.3 Klebsiella ribotyper og resistensmønstre... 14 5 KONKLUSION... 16 6 ANBEFALINGER... 17 7 REFERENCER... 18 BILAG A... 23 BILAG B... 25 BILAG C... 27 BILAG D... 29 BILAG E... 31 BILAG F... 33 i DHI
ii DHI
1 BAGGRUND Der har været et stigende forbrug af antibiotika i Danmark siden starten af 00 erne (Statens Serum Institut, 2010). Et stigende antibiotikaforbrug medfører øget antibiotikaresistens. Tidligere undersøgelser og måleprogrammer har vist, at antibiotikaresistente bakterier forekommer i hospitalsspildevand, på renseanlæg, og i vandmiljøet (Lynettefællesskabet, 2004; Lynettefællesskabet, 2007; Miljøstyrelsen, 2002). Hvis mennesker eksponeres for spildevand, er der en risiko for at blive inficeret. Hvis der er tale om infektion med antibiotikaresistente patogene bakterier, kan behandlingen besværliggøres eller i særligt uheldige tilfælde umuliggøres. Baggrunden for dette projekt er et ønske om at undersøge spredningen af hospitalsspecifik antibiotikaresistens til kloakker, renseanlæg og vandmiljø med henblik på at forbedre datagrundlaget for at vurdere risikoen for at blive inficeret med antibiotikaresistente bakterier. I Danmark bliver 10 % af humane antibiotika anvendt på hospitaler (Statens Serum Institut, 2010). Der forekommer multiresistente bakterier på hospitalerne. Hospitalernes antibiotikaforbrug giver samtidig et øget selektionspres, hvor væksten af følsomme bakterier hæmmes, og væksten af modstandsdygtige bakterier fremmes. Dette kan medføre, at antibiotikaresistente bakterier har en fordel over for mere følsomme bakterier i spildevand med antibiotika. For at undersøge, om antibiotikaresistens kan spores direkte tilbage til specifikke hospitaler, er Rigshospitalet valgt som case. Infektionshygiejnisk Enhed (IHE) på Rigshospitalet har opbygget en databank med ribotyper (rrna-profiler) af alle multiresistente E. coli og Klebsiella, som er identificeret på Rigshospitalet siden 2005. E. coli eller Klebsiella betegnes som multiresistent, hvis den er resistent over for to af følgende tre antibiotika: Gentamicin, cefuroxim og ciprofloxacin. Endvidere omfatter databanken profilerne for de identificerede vancomycin-resistente enterokokker (VRE). Ved sammenligning af ribotyper af antibiotikaresistente bakterier fundet i Rigshospitalets spildevand, på Renseanlæg Lynetten og i Øresund med ribotyperne i IHE s databank vil det være muligt at vurdere, om den nedstrøms målte antibiotikaresistens kan spores tilbage til Rigshospitalet. Nærværende projekt vil dermed bidrage til mere viden omkring sammenhængen mellem hospitalerne og antibiotikaresistens i vandmiljøet. 1
2 FORMÅL Formålet med undersøgelsen er at screene for spredningen af hospitalsspecifik antibiotikaresistens fra hospitaler til renseanlæg og vandmiljø. Der arbejdes konkret med Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten, som Rigshospitalet afleder til. Samtidig undersøges forekomsten af vancomycin-resistente enterokokker på renseanlæg og i vandmiljø. Herunder er det formålet at: udtage prøver fra henholdsvis Rigshospitalet, Renseanlæg Lynetten og Øresund identificere og isolere antibiotikaresistente bakterier fra de tre lokaliteter anvende ribotypning til kortlægning af rrna-profiler af de fundne antibiotikaresistente bakterier sammenligne rrna-profilerne af de fundne antibiotikaresistente bakterier med rrna-profiler i Rigshospitalets databank for at afklare, om de fundne antibiotikaresistente bakterier kan spores tilbage til Rigshospitalet. 2
3 MÅLEPROGRAM 3.1 Prøvetagningsprogram Der er taget prøver fra følgende tre lokaliteter: Rigshospitalet Renseanlæg Lynetten Kongedybet i Øresund 3.1.1 Rigshospitalet Der blev udtaget spildevandsprøver fra Rigshospitalet tirsdag den 30. august 2011 mellem kl. 10.00 og kl. 10.30. Prøverne blev taget i brønden på personaleparkeringspladsen langs Blegdamsvej (markeret med en stjerne på Figur 3-1). Figur 3-1 Kort over Rigshospitalets område, hvor prøvetagningsbrønden er markeret med en stjerne. Bygninger, der afleder spildevand til prøvetagningsbrønden, er markeret med pile til prøvetagningsbrønden. Det originale billede er udlånt af Rigshospitalet. Pumper, der afleder regn- og drænvand til prøvetagningsbrønden, blev standset under prøvetagningen. Det forventes dermed, at prøverne udelukkende består af sanitært spildevand. Fordelingen af spildevand, der afledes til prøvetagningsbrønden, er ifølge teknisk personale på Rigshospitalet estimeret til ca. 90% fra centralbygningen, sydbygningen og mellembygningen og ca. 10 % fra epidemi- og infektionsafdelingen (stiplet linje). Der blev udtaget ialt ca. 30 liter spildevand. Spildevandet blev efter prøvetagning sammenblandet i forholdet 90:10, jf. ovenstående. Figur 3-2 viser prøvetagningsbrønden. 3
Figur 3-2 Billede af prøvetagningsbrønden ved Rigshospitalet med prøvetagningsudstyr. 3.1.2 Renseanlæg Lynetten Der blev udtaget tre prøver fra Renseanlæg Lynetten: Én fra indløbet, én fra indløbet til biologisk rensning og én fra udløbet. Vand fra indløbet til biologisk rensning er primært renset, men ikke biologisk renset, og i tilfælde af højt flow med overløb vil vandet fra indløbet til biologisk rensning være sammenligneligt med overløbsvandet, da overløb sker efter primær rensning. Prøverne blev taget som flowproportionelle døgnprøver fra kl. 9 den 29. august 2011 til kl. 9 den 30. august 2011. Hver prøve blev taget i en PE-dunk med et volumen på 5 liter. Prøverne blev opbevaret på køl. Der var flere kraftige regnbyger i Københavnsområdet i prøvetagningsperioden. 3.1.3 Kongedybet, Øresund Sedimentprøver blev indsamlet i Kongedybet i Øresund tæt på udløbet fra Renseanlæg Lynetten. Indsamlingen fandt sted den 29. august 2011. Sedimentet blev indsamlet fra en RHIB (Rigid-Hulled Inflatable Boat) ved brug af en grab i 6,8 meters dybe. Punktet, hvor sedimentet blev indsamlet, har koordinaterne N55º41.761 E012º38.890. Dette punkt er cirka 200 meter fra udløbet fra Lynetten. Muslingerne blev indsamlet i en 10-liters plastspand ca. 50 meter fra punktet, hvor sedimentet blev indsamlet. Efter indsamling blev muslingerne transporteret til DHIs laboratorier i plastspanden, hvorefter muslingerne blev renset og skallerne fjernet. 4
Figur 3-3 Kort over København og Kongedybet i Øresund (Eniro/Krak, 2011). Prøvetagningsstedet for sediment og muslinger er markeret med rødt. 3.2 Analyseprogram Analyser blev udført i DHIs laboratorier samt på IHEs laboratorier på Rigshospitalet. Resistensbestemmelserne omfattede tre typer af testbakterier: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og enterokokker. Protokoller for bestemmelserne fremgår af Bilag A-C. Der blev i alt analyseret for resistens over for fem antiobiotika. Tabel 3-1 er en oversigt over antibiotika og testbakterier anvendt i analyserne. Tabel 3-1 Antibiotika og tilhørende anvendelsesområder samt testbakterier og anvendte breakpoints for hvert antibiotikum Antibiotikum Anvendelse Testbakterie(r) Ciprofloxacin Cefuroxim Gentamicin Meropenem Hospitaler og primærsektor Hospitaler Hospitaler Hospitaler E. coli og Klebsiella E. coli og Klebsiella E. coli og Klebsiella E. coli og Klebsiella Breakpoint [µg/ml] 1 Vancomycin Hospitaler Enterokokker 4 1. (EUCAST, 2011) For spildevandsprøverne fra Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten blev der testet for resistens for alle tre typer testbakterier. Bestemmelse af suspekte E. coli blev gennemført ved spredning af spildevandsprøven i triplikat på Oxoid Brilliance agar, der er en selektiv agar for coliforme bakterier. Alle violette kolonier blev talt som suspekte E. coli, idet der ikke blev gennemført yderligere verifikation af de enkelte kolonier. Brilliance agaren var enten uden antibiotika eller med antibiotika, henholdsvis ciprofloxacin (1 mg/l), gentamicin (4 1 8 4 8 5
mg/l) og cefuroxim (8 mg/l). De angivne koncentrationer af ciprofloxacin, gentamicin og cefuroxim er breakpoints, og bakteriekolonier dyrket ved eller over denne antibiotikakoncentration må anses for at være resistente (EUCAST, 2011). For bestemmelse af suspekte Klebsiella blev der spredt spildevandsprøve i enkelt udsæd på blodagar og i dobbelt udsæd på HiCrome TM agar, en selektiv agar for Klebsiella. For begge typer agar blev der lavet plader uden antibiotika samt plader med Ciprofloxacin (1 mg/l), Gentamicin (4 mg/l) og Cefuroxim (8 mg/l) tilsat agaren. Alle lilla-mangenta røde kolonier blev talt som suspekte Klebsiella. Violet: E. coli Pink: coliform Blå: Ej coliform eller E. coli Figur 3-4 Billede af E. coli, coliforme og ikke coliforme bakterier dyrket på Oxoid Brilliance agar. Foto: DHI. For at teste for multiresistens blev der udvalgt fem E. coli og Klebsiella fra hver plade med henholdsvis ciprofloxacin, gentamicin og cefuroxim. De udvalgte kolonier blev overført til nye agarplader, en plade pr. koloni. Kolonierne blev testet for Ciprofloxacin-, Gentamicin-, Cefuroxim- og Meropenemresistens ved tabletmetoden. MALDI- TOF-MS blev brugt til artsbestemmelse. Udvalgte isolater blev ribotypet og E-testet. For bestemmelse af suspekte Enterokokker blev der spredt prøve i duplikat på Slanezt agar uden antibiotika samt på agar med Vancomycin (4 mg/l). Der blev testet for Vancomycinresistens ved tabletmetoden, og artsbestemmelse blev gennemført med MALDI-TOF-MS. Udvalgte isolater blev ribotypet og E-testet. For muslingeprøverne blev muslingekødet blendet i et våd vægt:volumen forhold på 1:10. Bakterier blev dyrket i MacConkey bouillon uden antibiotika samt med henholdsvis Ciprofloxacin (1 mg/l), Gentamicin (4 mg/l) og Cefuroxim (8 mg/l). Samme procedure blev fulgt for sedimentprøverne. 6
3.2.1 Tabletmetoden Tabletmetoden bruges til bestemmelse af resistens over for forskellige antibiotika. Tabletmetoden er baseret på diffusion af antibiotika i agar. Resultaterne af tabletmetoden er for hvert antibiotikum enten følsom, intermediær eller resistent. Hvis resultatet er følsom, betyder det, at bakterien ikke har nogen påviste resistensmekanismer mod det pågældende antibiotikum. I medicinsk forstand betyder følsom, at antibiotikummet forventes at have virkning ved standarddosis. Hvis resultatet er intermediær, betyder det, at bakterien har nedsat følsomhed over for det pågældende antibiotikum. Medicinsk kan dette betyde, at stoffet evt. kræver en højere dosering, eller at stoffet opkoncentreres på infektionsstedet. Hvis resultatet er resistent, betyder det, at bakterien har en til flere resistensmekanismer, som gør, at bakterien ikke påvirkes af det pågældende antibiotikum. Dette bevirker, at en infektion med denne bakterie ikke vil kunne behandles med det pågældende antibiotikum (Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004). 3.2.2 E-Test (Epsilometer Test) E-test bruges til at fastlægge MICkoncentrationen for bakterier. Testen består af en plastikstrip påført antibiotika i stigende koncentration ned langs længden af strippen. Strippen placeres på en agarplade og inkuberes. Der opstår en hæmningszone omkring strippen, som vist på Figur 3-5. MIC (Minimum Inhibition Concentration) værdien aflæses direkte på strippen og angiver den laveste antibiotika koncentration, der skal til for at hæmme bakteriernes vækst (Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004). Figur 3-5 Eksempel på agarplade med E- test (kilde: Wikipedia) 3.2.3 MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS er i dette studie brugt til artsbestemmelse af bakterier baseret på proteiner. Det er en koblet analysemetode bestående af tre dele: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization), TOF (Time of Flight) og MS (Mass Spectrometry). Proteiner fra de bakterier, der ønskes artsbestemt, ekstraheres og indlejres i en matrix. Matrixen beskydes med en laserstråle, hvis energi bevirker, at proteinmolekyler ioniseres. Efterfølgende accelereres proteinmolekylerne i et elektrisk felt. De ioniserede molekylers forskellige masser gør, at forskellige molekyler får forskellige hastigheder, som registreres og danner et spektrum. Spektret er specifikt for den pågældende mikroorganisme, som identificeres ved sammenligning med kendte referencespektre i en database (OUH, 2009). 3.2.4 Ribotypning Ribotypning er en metode, der anvendes til at identificere bakteriestammer. Metoden virker ved, at en bakteriestamme isoleres, og der ekstraheres genomisk DNA. DNA et kappes med et restriktionsenzym og separeres ved gelelektroforese. 16S og 23S rrna bruges som probe. Gelen fotograferes og analyseres digitalt på en computer, hvor billedet sammenlignes med tidligere undersøgte bakterier i en database. Ribotypen er således en slags fingeraftryk, der fortæller om DNA et som koder for rrna. 7
Ribotypning anvendes som fast procedure på Rigshospitalet, udført af Infektionshygiejnisk Enhed, ved udredning af infektionsudbrud samt ved overvågning af særlige bakterietyper i forbindelse med eventuel spredning af infektioner og analyse til sammenligning af resistente bakterier (Infektionshygiejnisk Enhed, 2007). 8
4 RESULTATER OG DISKUSSION 4.1 Forekomst af bakterier og resistens Der blev fundet multiresistente bakterier (resistente for mindst to antibiotika) i spildevandsprøverne, mens de hverken blev fundet i sedimentprøverne eller i muslingerne. De følgende resultater er derfor kun for spildevandsprøverne. Tabel 4-1 viser de fundne koncentrationer af suspekte E. coli, suspekte Klebsiella, suspekte enterokokker og coliforme bakterier i spildevandsprøverne. Tabel 4-1 Total koncentration af suspekte E. coli, suspekte Klebsiella, suspekte enterokokker og coliforme bakterier i spildevandet fra hvert prøvetagningssted samt koncentrationen af hver type bakterie resistent over for udvalgte antibiotika fra hvert prøvetagningssted. Bakterie E. coli Klebsiella Coliforme Prøvetagningssted Enterokokker Total Ciprofloxacin resistente bakterier Cefuroxim resistente bakterier Gentamicin resistente bakterier Vancomycin resistente bakterier [kim/ml] [kim/ml] % [kim/ml] % [kim/ml] % [kim/ml] Rigshospitalet 22.700 7.140 31 1.050 5 1.090 5 - RL tilløb 31.800 1.270 4 1.000 3 1.320 4 - RL tilløb bio 40.100 1.730 4 1.180 3 909 2 - RL udløb 1.550 59 4 55 4 55 4 - Rigshospitalet 39.500 10.200 26 16.000 41 10.000 25 - RL tilløb 69.400 2.270 3 2.180 3 1.070 2 - RL tilløb bio 49.500 1.770 4 1.910 4 1.800 4 - RL udløb 2.880 82 3 64 2 82 3 - Rigshospitalet 50.900 14.500 28 9.460 19 6.270 12 - RL tilløb 89.600 2.720 3 2.820 3 1.729 2 - RL tilløb bio 93.700 2.820 3 2.950 3 1.409 2 - RL udløb 5.500 104 2 105 2 100 2 - Rigshospitalet 39.100 - - - (5) RL tilløb 26.600 - - - (27) RL tilløb bio 1.080 - - - (< 5) RL udløb 2.910 - - - (36) ( ) Kolonier kunne ikke verificeres som enterokokker på IHE Der ses en tendens til, at koncentrationen af total kimtal er lavere i spildevandet fra Rigshospitalet end i tilløbet til Renseanlæg Lynetten, mens den laveste koncentration blev observeret i det rensede spildevand. Renseeffektiviteten over renseanlægget for de målte bakterier ligger omkring 95%. En rensningsgrad på 95% ses ofte, men rensningsgrader på > 99% er ikke udsædvanlige (Erichsen et al., 2006). Der er generelt fundet flere suspekte Klebsiella end suspekte E. coli. Klebsiella og E. coli tilhører begge gruppen af coliforme bakterier. Summen af E. coli og Klebsiella burde derfor være mindre end eller lig med koncentrationen af totale coliforme bakterier. Generelt var der god overensstemmelse, idet niveauerne var ens, som det 9
fremgår af Tabel 4-1. Dog ses det, at for mange af prøverne er summen af suspekte Klebsiella og suspekte E. coli lidt højere end koncentrationen af totale coliforme (13% til 92% højere). Det skyldes, at selektiviteten af de anvendte agar er forskellig, og at man derfor ikke umiddelbart kan sammenligne tallene. Endvidere kan det skyldes, at nogle af de suspekte Klebsiella og de suspekte E. coli ikke var Klebsiella eller E. coli. Det ses også, at der generelt var flere resistente bakterier i spildevandsprøverne fra Rigshospitalet end i prøverne fra Renseanlæg Lynetten. Koncentrationen af resistente bakterier i Renseanlæg Lynettens tilløb og tilløb til biologisk rensning var nogenlunde ens, mens den laveste koncentration blev målt i udløbet. Andelen af resistente bakterier i tilløb og udløb fra Lynetten var 2% til 4%, mens andelen af resistente bakterier var væsentligt højere i spildevandet fra Rigshospitalet (12% til 31%) med undtagelse af cefuroxim og gentamicin resistente suspekte E. coli, hvor kun 5% var resistente. De resistente bakterier, der findes i spildevandet, kommer enten fra inficerede patienter, er dannet i kloakken ved celledeling (vertikal overførsel) eller ved udveksling af genetisk materiale mellem bakterier (horisontal overførsel). Ved en intensiv anvendelse af antibiotika forventes der at ske en selektion af resistente bakterier, så en større andel af patienterne udskiller resistente bakterier til spildevandet. Ved en høj koncentration af antibiotika i spildevandet forventes det, at resistente bakterier vil have en konkurrencemæssig fordel og dermed have en forøget koncentration og procentvis andel. En stor andel af de antibiotika, der anvendes i oplandet til Renseanlæg Lynetten, bliver brugt på Rigshospitalet (se Tabel 4-2). Dette stemmer overens med, at de højeste andele af resistente bakterier blev fundet ved Rigshospitalet. Desuden ses det, at andelen af resistente bakterier generelt var højest for cefuroxim og ciprofloxacin, hvilket stemmer med, at forholdet mellem den beregnede koncentration af antibiotikum i spildevandet set i forhold til breakpoint koncentration var højest for disse. Tabel 4-2 Forbrug og beregnet spildevandskoncentration af de antibiotika, der er anvendt i studiet (DHI 2011). Tabellen viser endvidere antibiotikakoncentrationen i de agar, som er anvendt til tællingerne (breakpoint), samt forholdet mellem beregnet antibiotikakoncentration i spildevandet og forholdet mellem beregnet antibiotikakoncentration (Rigshopitalet og Renseanlæg Lynetten) og koncentration i agar. Antibiotikum Forbrug RH Forbrug RL opland Forbrug RH Konc. spildevand RH Konc. tilløb RL Konc agar *Spildevand (RH)/Agar *Spildevand (RL)/Agar (kg/år) (kg/år) % (µg/l) (µg/l) (µg/l) % % Cefuroxim 156 276 56 646 4,7 8000 8 0,1 Gentamicin 0,9 2,3 38 3,6 0,04 4000 0,1 0,001 Ciprofloxacin 51 184 28 211 3,1 1000 21 0,3 Meropenem 74,7 89 84 310 1,5 *Den beregnede koncentration i spildevandet/koncentrationen i agar benyttet til tælling På baggrund af prøvetagninger er det ikke muligt at vurdere indholdet af multiresistente bakterier opstrøms Rigshospitalet. Det er muligt, at nogle patienter inficeret med multiresistente bakterier på Rigshospitalet forlader hospitalet, mens de stadig bærer multiresistente bakterier. Dette vil medføre, at den multiresistente bakteriestamme både vil være til stede i Rigshospitalets spildevand og i husspildevandet fra patientens hjem. Der blev ikke fundet vancomycin resistente enterokokker i spildevandet. 10
ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem 4.2 E. coli ribotyper og resistensmønstre Tabel 4-3 viser resultaterne af resistensbestemmelser gennemført af IHE af E. coli i spildevandprøverne. Der blev analyseret 15 stammer fra hver af de fire spildevandsprøver. Hver spildevandsprøve blev spredt på tre agarplader tilsat antibiotika, henholdsvis ciprofloxacin, cefuroxim og gentamicin, for at selektere for resistente stammer. Fra hver agarplade blev der udtaget fem E. coli stammer. Hver stamme blev rendyrket på en ny agarplade, og resistens over for ciprofloxacin, cefuroxim, gentamicin og meropenem blev testet ved tabletmetoden. Resultatet F er markeret med grøn skrift og indikerer en følsom stamme, I er markeret med gul skrift og indikerer en intermediær stamme, og R er markeret med rød skrift og indikerer en resistent stamme. Det ses, at de stammer, der er isoleret fra agarplader tilsat ciprofloxacin, alle er bestemt til at være ciprofloxacinresistente. Det samme gælder for cefuroxim. For gentamicin er prøven fra RL tilløb en undtagelse, idet alle stammer er følsomme over for gentamicin. Det formodes, at der er tale om en laboratoriefejl, idet stammer fremdyrket på en agarplade med gentamicin burde være resistente overfor gentamicin. Tabel 4-3 Resistensmønstre for de 15 dyrkede E. coli stammer fra spildevandsprøverne fra henholdsvis Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. F betyder, at stammen er følsom, I betyder intermediær og R betyder resistent. Rigshospitalet RL tilløb RL tilløb bio. RL udløb R F F F R R F F R F F F R R F F Dyrket på plade med ciprofloxacin R F F F R F R F R R F F R R F F R F F F R F F F R R F F R F R R R F F F R F F F R R F F R F F R R F F F R I F F R R F F R F F R F R R F F R F F R R F F R R F F Dyrket på plade med cefuroxim F R R F R R F F F R F F F I F F F R R F R R F F R R R F F R F F R R R F F R F F R R F F R R F F R R R F R R F F F R F F F R F F F F R F F I I F F R R F F F R F Dyrket på plade med gentamicin F I R F F F F F R F R F F I R F F F R F F F F F R F R F F I R F R R R F F F F F F R R F R F R F R R R F F F F F F I R F 11
ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem Der blev fundet 7 multiresistente E. coli stammer med 4 forskellige resistensmønstre på Rigshospitalet, 3 multiresistente E. coli stammer med 3 forskellige resistensmønstre i tilløbet til Lynetten, 11 multiresistente E. coli stammer med 5 forskellige resistensmønstre i tilløbet til biologisk rensning og 7 multiresistente E. coli stammer med 4 forskellige resistensmønstre i udløbet fra Lynetten. 16 multiresistente E. coli stammer blev udvalgt til ribotypning. De ribotypede stammer er markeret med en grå kasse i Tabel 4-3. Resultaterne af ribotypningen af de udvalgte E. coli stammer er vist i Tabel 4-4. Af de 16 ribotypede E. coli stammer var der 10 forskellige ribotyper. 9 af de 10 ribotyper var i forvejen kendt og en del af Rigshospitalets databank, hvilket betyder, at de tidligere er forekommet på Rigshospitalet. Den ene ukendte ribotype blev fundet i tilløbet til biologisk rensning på RL og blev tildelt ribotypenummeret 876-S6. Ribotype 70-S4 blev identificeret i spildevandet fra tilløbet til RL og i tilløbet til biologisk rensning på RL. Selvom ribotypen er den samme, viser Tabel 4-4, at de analyserede E. coli stammer har forskellige resistensmønstre. Ribotype 129-S1 blev identificeret i spildevandsprøverne fra alle fire prøvetagningssteder, henholdsvis Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. Alle fire 129-S1 stammer har forskellige resistensmønstre. Tabel 4-4 Ribotyper for de analyserede multiresistente E. coli fundet i spildevandet fra Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. Resistens over for Ciprofloxacin, Cefuroxim, Gentamicin og meropenem er også vist. F betyder følsom, I betyder intermediær, og R betyder resistent. De ribotyper, der er identificeret fra mere end et prøvetagningssted, er markeret med fed skrift. Prøvetagningssted Ribotype F R R F 70-S3 Rigshospitalet RL tilløb RL tilløb bio F R R F 129-S1 R R R F 163-S2 R R R F 163-S2 R F R F 70-S4 R R F F 70-S4 R R F F 129-S1 R R F F 70-S4 F R R F 125-S2 R F R F 129-S1 R R R F 104-S1 R F R F 876-S6 12
R R F F 71-S2 RL udløb R R R F 129-S1 R R F F 424-S2 R F R F 166-S7 På den ene side indikerer fundet af en multiresistent E. coli ribotype 129-S1 i alle prøverne, at multiresistente E. coli fra Rigshospitalet kan nå Renseanlæg Lynetten og blive udledt, enten gennem renseanlægget eller i forbindelse med en overløbshændelse. På den anden side indikerer forskellene i deres resistensmønstre, at de fundne E. coli type 129-S1 stammer fra forskellige kilder. Ribotypning er baseret på forskelle i den DNA, der koder for de ribosomale subunits 5S, 16S og 23S. Det betyder, at der godt kan være forskelle i den øvrige del af det kromosomale DNA, selvom ribotypen er den samme. Desuden kan samme ribotype bære plasmider med forskellige resistensegenskaber. Derfor kan to stammer af samme ribotype have forskellige resistensmønstre. Det er f.eks. vist for quinolone kromosomalt båret (GyrA) resistens i Clostridium dificile (Carman et al., 2009). Kromosomalt bårne resistensegenskaber ændrer sig ikke over kort tid, da det kræver en mutation. Der kan dog være hurtige fænotypiske ændringer, da den resistente egenskab ikke udtrykkes under alle forhold (se Schreiber, 2011), men det forventes, at dyrkningsforholdene ved resistensbestemmelserne er ensartet, så de fænotypiske ændringer ikke vil blive detekteret med de metoder, der er anvendt i nærværende studie. Kromosomalt bårne resistensegenskaber forventes derfor ikke at ændre sig på den korte tid, der er mellem Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten. Derimod kan plasmidbårne resistensegenskaber ændre sig over relativt kort tid ved horizontal overførsel mellem bakterier. F.eks. beregnede Marcinek et al. (1998), at der skete mellem 10 4 og 10 8 plasmidoverførsler pr. 4 timer i et renseanlæg. Der er derfor sandsynligt, at der sker en ændring af de plasmidbårne resistensegenskaber mellem Rigshospitalet og Renseanlægget. Resistens over for ciprofloxacin, cefuroxim, gentamicin og meroponem kan både være båret kromosomalt og ved plasmider (Schumacher et al., 1996; Suh Yah. 2010; Center for Disease Control, 2010; Cheung et al., 2005; Fujisawa-Kon et al., 1981, Kaufhold & Potgieter, 1993). Det betyder, at resistensmønstrene i princippet godt kan ændre sig på vej ned igennem kloaksystemet ved horisontal overførsel af plasmider. Det er også muligt at samme ribotype har eksisteret på Rigshospitalet med forskellige ribotyper. Ved opslag i Rigshospitalets database kan det ses, at der fra januar 2008 til december 2011 har været identificeret 90 isolater af E. coli ribotype 129-S1. De 90 isolater har et varierende resistensmønster, hvilket tyder på, at det er en klon, der har været længe på Rigshospitalet, eller som muterer hurtigt (Andersen, 2012). Det konkluderes, at der er fundet multiresistente E. coli ribotype 129-S1 ved alle prøvetagningssteder. Da de har forskellige resistensmønstrer, er det sandsynligt, at de E. coli ribotype 129-S1, der er fundet ved Renseanlæg Lynetten, ikke er de samme som de, der er fundet ved Rigshospitalet. Men det kan ikke udelukkes, at det er de samme, da resistensmønstret kan ændre sig på vejen gennem kloaksystemet. 13
ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem 4.3 Klebsiella ribotyper og resistensmønstre Tabel 4-5 viser resistensmønstre for Klebsiella stammer dyrket fra spildevandsprøverne fra Rigshospitalet og indløbet til RL. Der blev ikke isoleret nogle resistente Klebsiella stammer i spildevandet fra indløbet til biologisk rensning på RL eller i udløbet fra RL. Der blev generelt ikke fundet lige så mange multiresistente Klebsiella stammer som resistente E. coli stammer. Der var 10 multiresistente Klebsiella stammer fra spildevandsprøven fra Rigshospitalet med 3 forskellige resistensmønstre. Der var 2 multiresistente Klebsiella stammer fra spildevandet fra tilløbet til RL, og begge stammer havde samme resistensmønster. De multiresistente Klebsiella stammer, der blev udvalgt til ribotypning, er markeret med en grå kasse i Tabel 4-5. Tabel 4-5 Resistensmønstre for de 10 dyrkede Klebsiella stammer fra spildevandsprøven fra Rigshospitalet og de to stammer fra tilløb til RL. Rigshospitalet RL tilløb R R R F R R F F Fra agarplade med ciprofloxacin Fra agarplade med cefuroxim Fra agarplade med gentamicin R R R F R R F F R I R F R R R F R R R F I R R F R R R F R R R F R R R F R R R F Resultaterne af ribotypningen af de udvalgte Klebsiella stammer er vist i Tabel 4-6. Der blev fundet tre ribotyper ialt. To af de tre udvalgte stammer fra Rigshospitalet havde samme ribotype, 876-S1. 14
ciprofloxacin cefuroxim gentamicin meropenem Tabel 4-6 Ribotyper for de analyserede multiresistente Klebsiella fundet i spildevandet fra Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. Resistens over for ciprofloxacin, cefuroxim, gentamicin og meropenem er også vist. F betyder følsom, I betyder intermediær, og R betyder resistent. Prøvetagningssted Ribotype Rigshospitalet R R R F 876-S1 I R R F 876-S1 R R R F 233-S7 RL tilløb R R F F 111-S6 15
5 KONKLUSION Hovedkonklusion af nærværende projekt er, at det ikke kan udelukkes, at de multiresistente bakterier fundet ved Renseanlæg Lynetten stammer fra Rigshospitalet. Konklusionerne kan opdeles baseret på testbakterierne E. coli, Klebsiella og enterokokker. For E. coli blev 16 stammer udvalgt til ribotypning. Samme ribotype, 129-S1, blev fundet ved alle fire prøvetagningssteder, både på Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten. Der er således mulighed for, at resistente bakterier af denne ribotype ved Renseanlæg Lynetten er kommet fra Rigshospitalet. Bakterierne med ribotype 129- S1 fra de fire prøvetagningssteder har dog alle forskellige resistensmønstre, hvilket vil sige, at de er resistente for forskellige antibiotika. Stammerne er således ikke ens, selvom de har samme ribotype. Forskellen i resistensmønstre kan skyldes flere ting. Det er muligt, at bakterierne har fået/tabt resistensegenskaber over for visse antibiotika via overførsel med andre bakterier i kloaksystemet. Det er også muligt, at samme ribotype er forekommet på Rigshospitalet med forskellige resistensmønstre. Der blev udvalgt 4 Klebsiella stammer til ribotypning, tre fra Rigshospitalets spildevand og én fra tilløbet til Renseanlæg Lynetten. Ribotypen fra tilløbet til RL var forskellig fra ribotyperne identificeret i Rigshospitalets spildevand. Der blev ikke fundet vancomycinresistente enterokokker. Dertil kan tilføjes, at det kun er et begrænset antal stammer, der er udvalgt til ribotypning. Det er muligt, at der har været andre ribotyper, som er forekommet ved mere end et af prøvetagningsstederne, men som bare ikke er blevet identificeret. 16
6 ANBEFALINGER For at få mere viden omkring kilder til multiresistente bakterier i oplandet til Renseanlæg Lynetten kræves videre undersøgelser af spildevandet i oplandet til renseanlægget. Metoden med ribotypning af multiresistente stammer kan ikke fastlægge, hvorfra en bestemt bakterie stammer. Metoden kan derimod påvise, at en stamme fundet ved renseanlægget er den samme som en stamme identificeret ved en specifik kilde (i dette tilfælde Rigshospitalet). Resultaterne af nærværende studie har på denne måde vist, at der er en vis sandsynlighed for, at nogle af de multiresistente bakterier fundet ved Renseanlæg Lynetten stammer fra Rigshospitalet. Resultaterne kan dog ikke udelukke, at de multiresistente stammer fundet ved renseanlægget kommer fra andre kilder i oplandet, da indholdet af multiresistente bakterier og deres ribotyper ikke kendes for f.eks. husspildevand. Det videre arbejde med sporing af resistens i oplandet til Renseanlæg Lynetten anbefales at indeholde prøvetagning af spildevand flere steder i oplandet samt efterfølgende ribotypning af fundne multiresistente stammer. Prøver af spildevand taget opstrøms fra Rigshospitalet vil belyse indholdet af multiresistente bakterier og deres ribotyper i spildevand uden påvirkning af et hospital. Sammen med prøver fra Rigshospitalet vil det være muligt at lave en sammenligning, der giver et billede af, om der er visse ribotyper, der primært er hospitalsspecifikke, og om der generelt er stor forskel på indholdet af multiresistente bakterier i hospitalsspildevand og husspildevand. Flere prøver vil gøre det muligt mere nøjagtigt at bedømme, om Rigshospitalet er en betydelig kilde til multiresistente bakterier på Renseanlæg Lynetten. En fremtidig undersøgelse kunne også indeholde prøvetagning og ribotypning af multiresistente bakterier i spildevand fra andre hospitaler i oplandet for at belyse, om de ribotyper, der er kendt fra Rigshospitalet, er specifikke for Rigshospitalet, eller om de er fælles for hospitaler generelt. 17
7 REFERENCER Andersen, L. P., 2012 Personlig kommunikation om tidligere forekomst af ribotyper på Rigshospitalet Carman R. J., Genheimer, C. W., Rafii, F., Park, M., Hiltonsmith, M. F. & Lyerly, D. M., 2009 Diversity of moxifloxacin resistance during a nosocomial outbreak of a predominantly ribotype ARU027 Clostridium difficile diarrhea Anaerobe, 15, s. 244-248 Center for Disease Control, 2010 Laboratory Detection of Imipenem or Meropenem Resistance in Gram-negative Organisms http://www.cdc.gov/hai/settings/lab/lab_imipenem.html#a5 Cheung, T. K. M., Wai Chu, Y., Yu Chu, M., Ha Ma, C., Hung Yung, R. W. & Man Kam, K., 2005 Plasmid-mediated resistance to ciprofloxacin and cefotaxime in clinical isolates of Salmonellsa enterica serotype Enteritidis in Hong Kong Journal of Antimocrobial Chemotherapy, 56, s. 586-589 Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004 Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologis referencegruppe vedrørende antibiotika resistensbestemmelse- Klaringsrapport http://www.dskm.dk/pdf/rapporter/dskm-rapporter/klaringsrapport-rettet.pdf DHI, 2011 Pharmaceuticals Database Eniro/Krak, 2011 Kort over København og Øresund http://map.krak.dk/ Erichsen, A.E., Kaas, H., Dannisøe, J., Mark, O. og Jørgensen, C., 2006 Etablering af badevandsprofiler og varslingssystemer i henhold til EU's nye badevandsdirektiv Miljøprojekt Nr. 1101 EUCAST, 2011 Data from the EUCAST MIC distribution website European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing http://eucast.org Fujisawa-Kon, N., Ike, Y., Shimizu, S. Motohashi, K., Hashimoto, H. & Mitsuhashi, S., 1981 Identification of R plasmids mediating gentamicin resistance from Escherichia coli strains in Japan Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 19(6), s. 1070 Infektionshygiejnisk Enhed, 2007 18
Årsberetning 2007 http://www.rigshospitalet.dk/nr/rdonlyres/d9f7172b-190d-4da0-81b3- E347DE24F197/0/IHE%C3%A5rsberetning2007.pdf Kaufhold, A. & Potgieter, E., 1993 Chromosomally mediated high-level gentamicin resistance in Streptococcus mitis Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(12), s. 2740-2742 Lynettefællesskabet I/S, 2004 Måleprogram- Antibiotikaresistens I spildevand fra et sygehus og et boligområde Samarbejdsprojekt mellem Lynettefællesskabets Miljøgruppe og Statens Serum Institut. Rapport udarbejdet af DHI. Lynettefællesskabet I/S, 2007 Kortlægning og vurdering af spildevand med antibiotika og resistente bakterier fra hospitaler Rapport udarbejdet af DHI. Marcinek, H., Wirth, R., Muscholl-Silberhorn, A. & Gauer, M.,1998 Enterococcus faecalis gene transfer under natural conditions in municipal sewage water treatment plants Applied Environmental Microbiology, 64(2), s. 626-632 Miljøstyrelsen, 2002 Occurrence and fate of antibiotic resistant bacteria in sewage Miljøprojekt Nr. 722 OUH, 2009 Årsrapport 2009 Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Odense Universitetshospital Statens Serum Institut, 2010 Fakta om antibiotikaforbrug: Antibiotikaforbrug i Danmark http://www.ssi.dk/smitteberedskab/om%20overvaagning/antibiotikaforbrug/fakta%20 om%20antibiotikaforbrug.aspx Schreiber, C., 2011 Einträge, Vorkommen, Verbreitung und gesundheitliche Bedeutung antibiotikaresistenter Bakterien in Abwasser und Gewässern Ph.D., Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Schumacher, H., Skibsted, U., Skov, R. & Scheibel, J., 1996 Cefuroxime Resistance in Escherichia coli. Resistance Mechanisms and Prevalence. APMIS- Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 104, s. 531-538 Suh Yah, C., 2010 Plasmid-Encoded Multidrug Resistance: A case study of Salmonella and Shigella from neteric diarrhea sources among humans Biological Research, 43, s. 141-148 19
20
21 B I L A G
22
BILAG A Protokol for bestemmelse af resistens mod ciprofloxacin, gentamicin og cefuroxim hos Escherichia coli og coliforme Definition Suspekte E. coli defineres som violette kolonier på Oxoid Brilliance E. coli/coliform selective agar (CM1046). Coliforme defineres som lyserøde kolonioer på Oxoid Brilliance E. coli/coliform selective agar (CM1046) efter inkubation i 24 timer ved 44 C. Prøvetagning og transport Prøverne er udtaget, og transport er arrangeret af DHI - UAI. Reagenser Trypton-saltvand: Trypton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g Oxoid Brilliance E. coli/coliform selective agar (CM1046) (28.1 g/l) med og uden antibiotika. Natrium-cefuroxim, Sigma-Aldrich C4417-1G. Der opløses 80 mg i 10 ml MQ vand og tilsat 1,00 ml/l agar. Gentamicin opløsning, Sigma-Aldrich G1397-10ML (50 mg/l). Der tilsættes 80 µl/l agar. Ciprofloxacin. Sigma-Aldrich 17850-5G-F. Der afvejes 100 mg/100 ml sterilt MQ-vand med 1 ml 1M HCl og tilsættes 1 ml/l agar. Udførelse Der laves 10-fold fortyndingsrække. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Brilliance uden antibiotika. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Brilliance tilsat ciprofloxacin (1 mg/l), gentamicin (4 mg/l) eller cefuroxim (8 mg/l). Plader inkuberes ved 44 C i 22-26 timer. Aflæsning Alle violette kolonier tælles som suspekte E. coli. Alle pink kolonier tælles som coliforme. Alle tydeligt blå eller farveløse kolonier anses for at være andre end E. coli eller coliforme. Kolonier, der er pink, men med svag blå nuance, tælles som coliforme. Det ene sæt plader sendes til IHE efter tælling. Kontroller E. coli ATCC 25922 er følsom over for ciprofloxacin (MIC < 0,015 mg/l), gentamicin (MIC = 0,1 1 µg/ml) og cefuroxim (MIC = 2 8 µg/ml) og anvendes som positiv kontrol. Spredes også på agar uden antibiotika for substratkontrol. 23
24
BILAG B Protokol for bestemmelse af resistens mod vancomycin hos suspekte enterokokker Definition Suspekte enterokokker defineres som bakterier der ved 44 C ± 0,5 C kan vokse på Slanetz & Bartley Agar (Oxoid) under reduktion af TTC. Prøvetagning og transport Prøverne er udtaget, og transport er arrangeret af DHI - UAI. Reagenser Pepton-saltvand (ISO8199:1988) Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g Vancomycin, Sigma-Aldrich 861987-250mg. Der er opløst 40 mg/10 ml MQ-vand og tilsat 1 ml/l agar. Slanetz & Bartley (Oxoid) agar. Udførelse Der laves 10-fold fortyndingsrække. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Slanezt agar uden antibiotika. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Slanezt agar med vancomycin (4 µg/ml). Plader inkuberes ved 44 C ± 0,5 C i 44 ± 4 timer. Alle kolonier, der vokser frem som røde kolonier, tælles. Der laves ikke verifikation. Andelen af suspekte enterokokker, der vokser på agar med antibiotika, beregnes. Kontroller Enterococcus faecalis ATCC 29212 anvendes som positiv kontrol (MIC 2 6 mg/l). Spredes også på agar uden antibiotika for substratkontrol. 25
26
BILAG C Protokol for bestemmelse af resistens mod ciprofloxacin, gentamicin og cefuroxim hos suspekte Klebsiella Definition Suspekte Klebsiella sp. defineres her som kolonier, der giver purple-magenta farvede kolonier på HiCrome Klebsiella Selective Agar efter inkubation i 24 timer ved 37 C. Prøvetagning og transport Prøverudtagning og transport arrangeres af DHI - UAI. Reagenser: Pepton-saltvand (ISO8199:1988) Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g Natrium-cefuroxim, Sigma-Aldrich C4417-1G. Der er opløst 80 mg i 10 ml MQ vand og tilsat 1,00 ml/l agar. Gentamicin opløsning, Sigma-Aldrich G1397-10ML (50 mg/l). Der tilsættes 80 µl/l agar. Ciprofloxacin. Sigma-Aldrich 17850-5G-F. Der afvejes 100 mg/100 ml sterilt MQ-vand med 1 ml 1M HCl og tilsættes 1 ml/l agar. Udførelse Der lave 10-fold fortyndingsrække. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i dublikat på HiCrome Klebsiella Selective Agar uden antibiotika. Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i dublikat på HiCrome Klebsiella Selective Agar tilsat ciprofloxacin (1 mg/l), gentamicin (4 mg/l) eller cefuroxim (8 mg/l). Plader inkuberes ved 37 C i 22-26 timer. Alle purple-magneta kolonier tælles som suspekte Klebsiella sp. Hvis der er stor usikkerhed om vurdering af positive kolonier, føres et passende udvalg (cirka 5 fra hver prøve uden antibiotikum og 5 fra hver prøve med gentamicin) videre på HiCrome Klebsiella Selective Agar for yderligere verifikation. Klebsiella sp er store fede kolonier. Kontroller Der anvendes ikke kontroller, idet det antages, at antibiotika aktiviteten kontrolleres i forbindelse med undersøgelse af E. coli. Årsagen er, at vi ikke har en kontrolstamme med kendt følsomhed. 27
Analyser, muslingeprøver DHI: Muslingekød blendes 10 % (gwt/vol) og spredes som angivet for spildevandsprøver. Desuden dyrkes op i MacConkey bouillon med og uden antibiotika (ciprofloxacin 1 mg/l, gentamicin 4 mg/l, eller cefuroxim 8 mg/l). Rør sendes til IHE. 28
BILAG D IHEs resultater for enterokokker dyrket på Slanetz agar. 29
30
BILAG E 31
32
BILAG F IHEs resultater for E.coli, Klebsiella og enterokokker i sedimentprøverne fra Kongedybet. 33