Professionsbachelorprojekt, Modul 14 University College Lillebælt. Udarbejdet af Sara Ismail Dallal Studienr.: , SB511

Transkript

1 Sammenligning af Agardiffusionsmetoder for Vancomycin, E-test fra Biomerieux og Vancomycintablet fra Rosco, med en valgt Opsætning af Real time PCR, som Golden Standard, ved Detektion af vana, vanb og vanc hos Vancomycinresistente Enterococcus Comparison of Agar Diffusions Methods for Vancomycin, E-test from Biomerieux and Vancomycin-Tablet from Rosco, and a selected Setup of Real time PCR, as a Golden Standard, for the Detection of vana, vanb and vanc in Vancomycin-Resistant Enterococcus Professionsbachelorprojekt, Modul 14 University College Lillebælt Udarbejdet af Sara Ismail Dallal Studienr.: , SB511 Vejledere: Klinisk vejleder: Sanne Malig, bioanalytikerunderviser, Odense Universitetshospital Teoretisk vejleder: Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser University College Lillebælt Projektet udført i samarbejde med: Asmaa Ismail Dallal & Reem Kazem Projektperiode: 6. oktober 19. december 2014 Antal anslag:

2 Resumé Introduktion Vanomycin er et antibiotikum som Enterococcus har vist stigende resistens overfor siden detektion af vancomycinresistente Enterococcus (VRE) i 1980 erne. Vancomycinresistens udtrykkes i forskellig grad, afhængig af hvilken genotype der er tale om. Der er påvist flere vancomycinresistente gentotyper, såsom vana, vanb og vanc, hvoraf vana og vanb er de mest klinisk relevante. Grænsen for den mindst hæmmende koncentration (MIC) ved VRE er fastsat til 4 mg/l, herved kan identifikationen af nogle vanb Enterococcus-stammer med en MIC-værdi på 4 mg/l blive vanskelig. Det er derfor vigtigt i tilfælde heraf, at der anvendes metoder med høj sensitivitet og specificitet til korrekt identifikation af disse stammer. I denne sammenhæng vil anvendelse af en genotypisk PCR-metode, fx real time PCR, være oplagt. Formål Et tidligere studie har vist uoverensstemmelser mellem E-test og ulden/ ikke ulden fænomenet. Med baggrund heri, ønskes der i nærværende projekt en sammenligning af disse fænotypiske metoder med en valgt opsætning af real time PCR, som golden standard, i forbindelse med detektion af VRE. Materialer og metoder Til opsætning af real time PCR blev 7 kendte kontrolstammer for VRE afprøvet på forskellige assays. Efterfølgende blev 64 Enterococcus-stammer fra blod undersøgt vha. real time PCR. Resultater Der er opnået en sensitivitet og en specificitet på 100 % for E-test og 100 % sensitivitet og 80 % specificitet for ulden/ikke ulden fænomenet ved sammenligning med real time PCR. Konklusion Det nærværende projekt peger på, at der i forbindelse med detektion af VRE rutinediagnostisk er mest hensigtsmæssigt, at udføre real time PCR sammen med den fænotypiske resistensbestemmelse vha. agardiffusionsmetoden ved anvendelse af antibiotikatabletter fra Rosco og ved ampicillinresistens laves E-test fra Biomerieux. Side 1 af 49

3 Forord Det nærværende professionsbachelorprojekt er udarbejdet på modul 14, bioanalytikeruddannelsen University College Lillebælt, i perioden 6. oktober 2014 til 19. december Projektets praktiske del er udført på (KMA), Odense Universitetshospital (OUH). Projektet henvender sig til studerende, undervisere, bioanalytikere, KMA og andre med interesse for det Kliniske Mikrobiologiske speciale. Jeg vil gerne rette en speciel tak til mine medstuderende, Asmaa Ismail Dallal og Reem Kazim, for godt samarbejde under projektets udarbejdelse. Endvidere vil jeg takke min kliniske vejleder Sanne Malig, bioanalytikerunderviser på KMA, OUH, min teoretiske vejleder Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser på University College Lillebælt, for at have været meget behjælpelig med råd og vejledning under projektperioden. Samtidig vil jeg takke Louise Hjelmsted Pedersen, bioanalytikerunderviser på KMA, OUH, Elisa Knudsen, bioanalytiker på KMA, OUH og Silje Vermedal Høgh, molekylærbiolog på KMA, OUH, ligeledes for råd og vejledning under den praktiske del af projektet. Derudover vil jeg takke KMA for at have givet os plads til at udføre det praktiske arbejde. Til slut vil jeg gerne henvende mig med en varm tak til min mor, Samar Omayri, for hendes store støtte specielt under projektperioden og generelt under hele uddannelsesforløbet. Sara Ismail Dallal December 2014 Side 2 af 49

4 Indholdsfortegnelse RESUMÉ... 1 FORORD... 2 INTRODUKTION... 5 Enterococcus... 6 Epidemiologi... 7 Resistens... 7 Resistensmekanismer... 7 β-lactamer og aminoglykosider... 8 Vancomycin... 8 Vancomycinresistente gener... 9 Problemformulering Real time PCR Resistensbestemmelse ved EUCAST agardiffusionsmetoder Rosco E-test Metodiske overvejelser MATERIALER OG METODER Materialer Prøvematerialer Apparatur Utensilier Reagenser Metoder Eksperimentelt arbejde Del 1 Klargøring af stammerne Del 2 Klargøring af DNA Del 3 Real time PCR Litteratursøgning RESULTATER DISKUSSION Opsætning af real time PCR Side 3 af 49

5 Sammenligning af E-test med real time PCR Sammenligning af ulden/ikke ulden fænomenet med real time PCR KONKLUSION PERSPEKTIVERING LITTERATUR BILAG Bilag 1 Svar fra elektronisk spørgeundersøgelse Bilag 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer Bilag 3 Eksempel på et PCR-pladelayout Bilag 4 Tabeller over ct-værdier, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af forskellige assays Bilag 5 Rådata Bilag 6 Udregninger til tabel Bilag 7 ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnået ved undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer vha. real time PCR Side 4 af 49

6 Introduktion Resistensudvikling mod antibakterielle lægemidler, fx Enterococcus resistensudvikling mod vancomycin, er blevet et stigende globalt sundhedsproblem [1]. Selvom antibiotika er essentiel til anvendelse ved behandling af bakterielle infektioner, bliver der påvist mekanismer for bakterieresistens, der kan begrænse behandlingsmulighederne for patienten, hvorfor denne antimikrobielle resistens bliver set som en alvorlig trussel for menneskets helbred [2]. Vanomycin er et antibiotikum som Enterococcus har vist stigende resistens overfor siden detektion af vancomycinresistente Enterococcus (VRE) i 1980 erne [3,4,5,6]. Vancomycin reserveres som sidste mulighed for behandling, når der ses resistens for andre antibiotika, fx ampicillin [2,3,4,5]. Vancomycinresistens i Enterococcus er et udbredt problem i det meste af den vestlige verden, men især i USA [3,6,7], hvor mere end 28 % af nosokomielle Enterococcus-arter er vancomycinresistente [7]. I Europa, er VRE et mindre udbredt problem [6]. I slutningen af 1980 erne er der set de første udbrud af VRE på engelske og franske sygehuse og senere i andre lande [4]. Eksempelvis er der i Skandinavien set ca. 1 % VRE i nosokomielle Enterococcusinfektioner, mens der i lande som Grækenland og Irland er set > 30 %. Endvidere er der i Sverige blevet dokumenteret, at der i perioden sammenlignet med perioden , er sket en firedoblet stigning i infektioner forårsaget af VRE [6]. I 2013 er der i Danmark blevet detekteret 3,4 % vancomycinresistens i Enterococcus faecium og 0,2 % vancomycinresistens i Enterococcus faecalis stammer fra blod [2]. Siden 2005, hvor alle klinisk mikrobiologiske afdelinger (KMA) i Danmark har kunnet sende deres VRE stammer til Referencelaboratoriet for Antibiotikaresistens på Statens Serum Institut (SSI) til bl.a. bestemmelse af vancomycinresistente gener vana, vanb og vanc, er der detekteret et stigende antal VRE, især af van A E. faecium i 2010 og I 2012 har SSI modtaget 54 VRE stammer fra urinvejs-, sår- og blodinfektioner, mens antallet i 2013 er steget til 248 stammer fra infektioner. Derudover er der samme år fundet 168 VRE stammer ved screening af fæces fra patienter uden kliniske symptomer. Ligeledes har langt de fleste af VRE stammer i 2012 og 2013 været af typen vana E. faecium. Stigningen i VRE stammer i 2013 er primært registreret fra hospitaler i Region Hovedstaden, Region Sjælland og Region Midtjylland [2]. Det glykopeptidantibakterielle middel avoparcin, af samme familie som vancomycin, som har været anvendt i landbruget til at fremme produktionsdyrenes vækst, er blevet mistænkt for at være årsagen Side 5 af 49

7 til udvikling af VRE i Europa [3,6,8]. I 1995 blev der i Danmark indført et forbud mod at bruge avoparcin i landbruget og senere også i resten af Europa [8]. Sundhedsvæsenets øgede forbrug af antibiotika er i høj grad medvirkende til resistensudvikling. Den store udfordring ligger i produktionen af nye antibiotika samtidig med en høj accelerende resistensudvikling. Det betyder, at der kan opstå infektioner forårsaget af bakterier, hvor der ikke findes virksomme antibiotika imod, som patienter kan behandles med. Vigtigheden af at holde forbruget af antibiotika på et minimum, for at forhindre bakteriernes resistensudvikling og derved behandlingsdilemmaerne, som kan være forbundet hertil, har givet anledning til indførelse af et overvågningsprogram i Danmark af Danish Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program (DANMAP). Dette program har siden 1995 beskrevet overvågning af antibiotikaforbruget samt forekomsten af antibiotikaresistens hos mennesker og dyr [2,8]. Enterococcus I lang tid er Enterococcus blevet klassificeret under bakterieslægten streptokokker [9], men efter indførelsen af de molekylære metoder, der blev anvendt til detaljerede undersøgelser af mikroorganismer, fik Enterococcus deres egen slægt og derved bekræftet som værende en separat slægt i 1984 [9]. Streptococcus fæcium og Streptococcus fæcalis var de to første streptokokarter, der blev klassificeres som de to nye Enterococcus-arter; E. faecium og E. faecalis [9]. Enterococcus er grampositive fakultative anaerobe kokker [6,9,10,11], der lejres i kæder af forskellige længder, som enkelte celler eller de kan forekomme arrangeret i par [6,9,11]. Efter 24 timers inkubation kan kolonier af Enterococcus på en blodagar plade have en diameter på en størrelse mellem 1-2 mm, mens nogle kolonier kan fremstå mindre [9]. Enterococcus er katalase negativ [9,11] og kan være hæmolytiske, herunder beta- eller alfahæmolytiske, eller nonhæmolytiske. Enterococcus er karakteriseret ved deres robusthed, der bl.a. indebærer, at de har særlig hårdfør overlevelsesevne i organismer og andre miljøer, herunder meget ekstreme kemiske og fysiske forhold. Eksempelvis kan de vokse i 6,5 % saltvand (NaCl), ved et ph på 9,6, ved et bredt temperaturområde fra 10 C til 45 C med en temperaturoptimum for vækst ved C. Endvidere kan de overleve en opvarmning op til 60 C i 30 minutter [6,9,10,11,12]. Derudover kan Enterococcus overleve i lang tid på overflader af fx medicinske udstyr, seng skinner, dørhåndtag mm., og dette er med til at forklare Enterococcuss store forekomst på hospitaler [6]. Side 6 af 49

8 Epidemiologi Enterococcus forekommer i den normale tarmflora i både mennesker og dyr [2,3,6,9,13], og kan medføre alvorlige konsekvenser især for kritisk syge patienter, hvis immunforsvar er svækket [3]. Enterococcus er opportunistiske bakterier [9,13], der kan være skyld i en række forskellige nosokomielle infektioner hos mennesker, såsom urinvejsinfektioner, sårinfektioner, bakteriæmi, endocarditis, meningitis og flere andre [2,4,7,10,12,14]. Infektioner grundet Enterococcus skyldes oftest E. faecalis og E. faecium [3,12,13,15]. Sammenlignet med E. faecalis er E. faecium blevet mere resistens for antibiotika som vancomycin og ampicillin, hvilket hænger sammen med den stigende brug af forskellige antibiotikamidler. Denne stigende tendens i E. faecium s resistensudvikling, som er startet i begyndelsen af 1990 erne i USA og i andre lande i verden, forklarer observationen af E. faecium som den hyppigere årsag til nosokomielle infektioner. Denne ændring og udvikling i de pågældende arters resistens har fået en afgørende klinisk betydning, da behandlingen af patienter inficeret med E. faecium er svær [6]. Resistens Enterococcus overlevelsesevne skyldes deres medfødte og erhvervede resistens overfor mange almen anvendte antibiotika [6,13]. Når bakterien har en medfødt resistens, betyder det, at den mangler strukturer eller metaboliske processer som et antibiotikum kan virke imod, enten ved at udøve baktericid eller bakteriostatisk effekt på bakterien, resulterende i dens død eller hæmning af dens vækst og/eller formering [16]. Erhvervet resistens hos Enterococcus skyldes deres evne til hurtigt at udvikle nye resistensmønstre [4] ved at undergå genetiske forandringer, som kan opstå ved bl.a. sporadiske mutationer, ved overførsel af fremmed genetisk materiale, fx DNA, eller ved horisontal gen udveksling, der kan ske mellem bakterier ved overførsel af transposoner [10,13]. Resistensmekanismer Enterococcus har medfødt resistensmekanismer for lave koncentrationer af β-lactamer, fx penicillin og ampicillin, og aminoglykosider [6,12,15]. Dog har Enterococcus med tiden udviklet større resistens for højere koncentrationer af de sidstnævnte antibiotika [6,12,15]. I de forskellige arter af Enterococcus findes forskellige resistensmekanismer, og nogle arter, fx E. faecium, er mere resistente end andre [15]. Side 7 af 49

9 β-lactamer og aminoglykosider I cellevæggen uden på Enterococcuss cellemembran findes enzymer, som er involveret i dannelsen af peptidoglykan. β-lactamantibiotikum hæmmer disse proteiner ved at binde sig kovalent til dem, heraf betegnelsen penicillin-bindende-protein (PBP). Alle bakterier har PBP, men i varierende typer og antal. Eksempelvis har E. faecalis har PBP4 bundet til cellevæggen og E. faecium har PBP5. Den kovalente binding mellem antibiotikummet og proteinet påvirker syntesen af cellemembranen, hvilket fører til, at bakterien hæmmes eller, i nogle tilfælde, til celledød. Resistensen for β-lactamer skyldes bl.a., at det normale PBP ændres ved at en specifik aminosyre udskiftes, hvor bakterien derved får mindre affinitet for β-lactamantibiotika, eller at der opstår en øget produktion af PBP [10,12]. Aminoglykosiderne er derimod ikke cellevægsaktive midler. De virker ved at indtrænge i bakteriens cellevæg, og derved inhibere syntesen af de ribosomale proteiner. Når bakterien er resistens for et aminoglykosidantibiotikum, kan det antibakterielle middel ikke trænge igennem cellevæggen og der sker derfor ingen optagelse af det [10]. For at opnå mest mulig baktericid effekt, er der tidligere blevet behandlet med en kombination af antibiotika resulterende i en synergistisk effekt. Denne form for behandling har været standard og meget anbefalet [4,12]. Et aminoglykosidantibiotikum, gentamicin, har været anvendt i kombination med et cellevægsaktivt β-lactam middel, fx pencillin, hvorved aminoglykosids optagelse i bakterien er blevet forbedret [17,18]. I dag anvendes ligeledes denne kombination af antibiotika ved svære Enterococcus infektioner [2]. På baggrund af ovennævnte resistensmekanismer, der har vanskeliggjort penicillin- og aminoglykosidbehandling af infektioner forårsaget af Enterococcus, har vancomycin været det klinisk essentielle alternativ for disse antibiotika indtil opdagelsen af VRE forekomst i 1980 erne [4,15]. Detektion af nye erhvervede resistensmønstre for vancomycin i Enterococcus har efterfølgende reduceret behandlingen med dette antibiotikum markant [4]. Vancomycin Vancomycin er et glykopeptidantibiotikum, som er meget aktivt mod grampositive bakterier, herunder Enterococcus [12,13]. Vancomycin er primært blevet anvendt som alternativ for ampicillin i behandling af ampicillin-resistente Enterococcus eller ved behandling af patienter med allergi for β-laktamer [6]. Vancomycin er ligesom β-laktam et celleaktivt middel, og indvirker på bakteriens cellevæg ved at danne tætte komplekser med D-alanyl-D-alanin (D-Ala-D-Ala), som er sidekæder af peptidoglykanforstadierne, der findes på celleoverfladen og har høj affinitet for Side 8 af 49

10 vancomycin. Herved hæmmes cellevægsyntesen resulterende i celledød [1,3,10,12]. Enterococcus s resistens for vancomycin skyldes en enzymatisk modificering af celleoverfladens peptidoglykforstadierne, således at D-alanin bliver erstattet med D-lactat (D-lactat) givende D-ala- D-lac, som binder vancomycin med lavere affinitet [1,3,10]. Vancomycinresistente gener Vancomycinresistens i Enterococcus udtrykkes i forskellig grad, afhængig af hvilken genotype der er tale om. Der er påvist flere vancomycinresistente gentotyper i Enterococcus, fx vana, vanb og vanc, hvoraf vana og vanb er de mest klinisk relevante [4,13,19,20], og er de to mest forekommende typer blandt VRE i verden [7,19]. VanB inddeles yderligere i tre undertyper; vanb1, vanb2 og vanb3, hvor vanb2 er den hyppigst forekommende [19,20]. Ligeledes inddeles vanc i undertyperne vanc1 og vanc2/3 [4]. VanA og vanb resistensmekanismerne er lokaliseret på transposonerne, og kan derfor overføres fra en bakterie til en anden, således at resistensen for vancomycin kan erhverves af nye bakterier. Af den grund har vana og vanb vigtig betydning i kliniske sammenhænge [3,13,20]. VanC er derimod ikke overførebar, da dennes lokalisation findes på kromosomerne [3]. Derfor er Enterococcus gallinarum og Enterococcus casseliflavus, hvis vanc resistensmekanisme er medfødt, mindre problematiske i forhold til overførsel af resistensgener end E. faecalis og E. faecium, som er de to primære arter, der har resistensgenotyperne vana og vanb [3,4,10,15]. Fænotypisk er vana og vanb Enterococcus forskellige ift. den mindst hæmmende koncentration (minimal inhibitory concentration, MIC). Alle Antibiotika har en koncentrationsafhængig effekt, som er udtrykt ved MIC, der angiver den laveste koncentration af et antibiotikum, som kan hæmme væksten af den aktuelle bakterie [13]. VanA Enterococcus er resistente for højere koncentrationer af vancomycin end Enterococcus af vanb typen [13,15,19,20], og dette er angivet ved MICværdiintervaller, der er defineret ved hhv mg/l og 4-64 mg/l [19]. Endvidere er glykopeptidet teicoplanin med til at adskille vana Enterococcus fra vanb Enterococcus yderligere, da vana er resistente for teicoplanin, mens vanb udviser følsomhed overfor dette antibiotikum [3,4,10,15,19,20]. Ifølge European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) er MIC-grænsen for vancomycinsensitive Enterococcus fastsat til 4 mg/l [21], herved kan identifikationen af nogle vanb Enterococcus-stammer med en MIC-værdi på 4 mg/l blive vanskelig. Det er derfor vigtigt i tilfælde heraf, at der anvendes metoder med høj sensitivitet og specificitet til korrekt Side 9 af 49

11 påvisning af disse stammer. I denne sammenhæng vil en genotypisk PCR-metode derfor være oplagt. På nuværende tidspunkt på KMA, Odense Universitetshospital (OUH), detekteres vancomycinresistente Enterococcus rutinediagnostisk ved anvendelse af fænotypiske metoder. Indledningsvis identificeres Enterococcus med Matrix-Assisted Laser DesorptionInization Time of Flight (MALDI-TOF), herefter udføres resistensbestemmelse med agardiffusion efter EUCAST retningslinjer, hvor der anvendes antibiotikatabletter fra Rosco. Vancomycintabletten medtages ikke i resistensbestemmelsen. I tilfælde af, at den pågældende Enterococcus-stamme er resistens for ampicillin, laves resistensbestemmelse for vancomycin med E-test (Biomerieux), som er en undersøgelse af MIC vha. antibiotikakoncentrationsgradient, ligeledes efter EUCAST retningslinjer. Vancomycinresistente Enterococcus-stammer sendes til SSI med henblik på overvågning [22]. Ved anvendelse af de fænotypiske metoder, kan der kun opnås viden om vancomycinresistens hos Enterococcus. Derfor kan det være nødvendigt, at sammenholde disse metoder med en yderligere metode, der specifikt kan påvise, hvilken genotype, der er tale om. Når bakteriers resistens skyldes kendte resistensgener, kan disse påvises ved genotypiske analysemetoder, fx real time Polymerase Chain Reaction (PCR) [13,23]. Et tidligere studie, der er blevet udarbejdet på KMA, OUH, sidste år, hvis formål har været, at sammenligne forskellige fænotypiske metoder til detektion af VRE hos Enterococcus-stammer isoleret fra blod, har vist, at der er uoverensstemmelser mellem E-test for vancomycin og ulden/ ikke ulden fænomenet ved anvendelse af vancomycintablet fra Rosco [24]. Med baggrund heri, ønskes der i nærværende projekt en sammenligning af disse fænotypiske metoder med en valgt opsætning af real time PCR, der i den forbindelse vil fungere som projektets golden standard. I de følgende afsnit vil agardiffusion ved resistensbestemmelsen for vancomycin med E-test fra Biomerieux omtales som E-test metoden, og agardiffusion ved resistensbestemmelsen med vancomycintabletten fra Rosco, hvor bl.a. tablettens kant for ulden/ikke ulden fænomenet kan vurderes, vil omtales som ulden/ikke ulden fænomenet. Problemformulering Hvordan kan real time PCR, efter opsætning heraf, indgå i rutinediagnostikken af vancomycinresistente Enterococcus med vana, vanb og vanc, og hvordan er sensitiviteten og Side 10 af 49

12 specificiteten for E-test og ulden/ikke ulden fænomenet ved detektion af vancomycinresistente Enterococcus overfor real time PCR som golden standard? Real time PCR Real time PCR er en molekylærbiologisk analyse, som anvendes i den molekylærbiologiske rutinediagnostik på KMA. Patogene organismer som bakterier, virus og parasitter indeholder alle det genetiske arvemateriale deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA), som er specifikt for den pågældende organisme, hvorfor det er muligt vha. PCR, at detektere og skelne mellem forskellige organismer [25]. Ved real time PCR indgår tre temperaturafhængige trin; denaturering, annealing (hybridisering) og elongering (DNAsyntese). Denaturering foregår ved ca. 95 C, hvor dobbeltstrenget DNA denatureres og bliver enkeltstrenget. I det næste trin bliver det dobbeltstrengede DNA genskabt vha. to korte syntetisk fremstillede DNA stykker, også kaldet primere, forward- og reverse primer, som binder sig til hver deres enkeltstrengede DNA. Dette annealingsstrin kræver en nedsat temperatur til ca. 54 C. Efterfølgende indledes sidste trin, elongering, hvor DNA-syntesen sker ved 72 C vha. DNA polymerase, der påsætter nukleotider på den komplementære DNA streng, hvorved DNA opformeres [25,26]. Disse tre trin udgør en cyklus og ved real time PCR bliver mængden af PCR produktet kvantificeret efter hver cyklus vha. en TaqMan probe. Proben er en kort oligonukleotid, der udgøres af en kort kæde af nukleotider og er komplementær til target DNA. Proben består af Figur 1 [26] viser DNA polymerasens enzymatisk nedbrydning af TaqMan proben resulterende i fremkomst af et fluorescerende signal. to farvestoffer; i 5 enden sidder et fluorescerende farvestof, reporter, og ved probens 3 ende er hæftet et andet farvestof kaldet quencheren. I annealingstrinnet binder TaqMan proben sig til det komplementære DNA og ved mødet med DNA polymerasen i elongeringstrinnet fjernes proben, der sidder og forhindrer syntesen af DNA. Denne enzymaktivitet resulterer i et fluorescerende signal, der opstår når quencheren frigøres fra det fluorescerende farvestof [27] (figur 1). Vha. en detektor måles det fluorescerende signal løbende, som afspejler hvor meget PCR produkt, der er blevet replikeret under hver eneste cyklus, der er her tale om ligefrem proportionalitet mellem Side 11 af 49

13 fluorescensen og PCR produktet. Resultatet af en real time PCR reaktion afbildes som en amplifikationskurve med antal cyklusser på x-aksen og DNA mængden på y-aksen. På kurven fastsættes en baggrundsværdi kaldet tærskelværdi, som er et punkt på amplifikationskurven, hvor det fluorescerende signal overstiger baggrundssignalet. Den cyklus hvorved tærskelværdien nås, kaldes cycle treshold (ct).[25,26,27] I praksis kan real time PCR analysen forløbe som et FAST PCR program, og dette indebærer, at annealings- og elongeringstrinnet kan kombineres, når temperaturerne i disse trin er tætte på hinanden [13,26]. Resistensbestemmelse ved EUCAST agardiffusionsmetoder Ved anvendelse af de fænotypiske metoder kan bakterier resistensbestemmes enten ved at bestemme hæmningszoner eller ved bestemmelse af MIC ved agardiffusion, hvor et anvendt antibiotikum, fx i form af antibiotikatabletter (Rosco) eller plastik strip (E-test), diffunderer ud i en agarplade.[16] Rosco Ved resistensbestemmelsen påsættes antibiotikatabletter fra Rosco, fx vancomycintabletter, på en inokulumtilsået agarplade. Pladen inkuberes i 24 timer og her vil antibiotikummet diffundere ud i agarmediet, hvorved der kan opstå en hæmningszone, hvis bakterien er sensitiv for det anvendte antibiotikum [16]. Hæmningszonen aflæses ved at måle zonediameteren af den komplette hæmning omkring tabletten [28], og følsomheden vurderes ud fra breakpoints, SIR, som er brydepunkter eller grænseværdier, der kan anvendes som et udtryk for, hvorvidt bakterien er sensitiv (S), intermediær (I) eller resistens (R) [16], og som er fastsat af EUCAST. For vancomycinsensitive bakterier gælder der, at S 12 mm og for vancomycinresistente bakterier gælder der, at R <12 mm [21]. Ifølge EUCAST kan vurdering af vancomycinresistens ikke kun afgøres på baggrund af zonestørrelsen, men også på hæmningszonens kant ved undersøgelse af ulden/ikke ulden fænomenet. Hvis den pågældende bakterie er resistens for vancomycin vil kanten på dens hæmningszone være ulden, dvs. kanten er uskarpt afgrænset, og der kan derfor ses kolonier inde i hæmningszonen. En vancomycinsensitiv bakterie vil derimod have en ikke ulden kant, dvs. en skarp kant [29]. Side 12 af 49

14 E-test E-test er en plastik strip på ca. 50 mm [30,31], og anvendes med henblik på, at bestemme MIC af et givent antibiotikum overfor en bestemt bakterie. E-test er således en kvantitativ metode, der kombinerer agardiffusionsprincippet med fortyndingsmetoden [32]. På oversiden af E-teststrippen aflæses antibiotikakoncentrationsgradient i mg/l på en MIC aflæsningsskala svarende til 15 forskellige dobbeltfortyndinger af MIC. Endvidere er der øverst på strippen angivet en kode for det pågældende antibiotikum, der ønskes testet, fx vancomycin. På undersiden af strippen er der afsat en foruddefineret antibiotikagradient. Ved resistensbestemmelsen lægges E-teststrippen på en inokulumtilsået agarplade, herved vil antibiotika afgives øjeblikkeligt i stigende koncentration op langs strippen, og begynde at diffundere ud i agaren. Efter 24 timers inkubation opstår en elipseformet hæmningszone ved sensitive bakterier, hvor MIC-værdien aflæses ved hæmningszonens skæring med strippens aflæsningsskala [30,31,32,33] (figur 2). De aflæste MICværdier kan efterfølgende ligeledes vurderes på baggrund af breakpoints fastsat af EUCAST. For vancomycinsensitive bakterier gælder der, at S 4 mg/l og for vancomycinresistene bakterier gælder der, at R > 4 mg/l [21]. Metodiske overvejelser Det nærværende bachelorprojekt på KMA, OUH, er en retrospektiv kvantitativ undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer isoleret fra blod og 4 kendte VRE kontrolstammer. Formålet med nærværende projekt er, at detektere tilstedeværelsen af tre vancomycinresistensgener, vana, vanb og vanc, i en kollektion af 64 Enterococcus-stammer isoleret fra blod, samt 4 kendte VRE kontrolstammer for de pågældende gener vha. en opsat real time PCR med henblik på, at sammenligne med de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, som i det tidligere studie [24], er udført på samme 64 Enterococcus-stammer. Figur 2 [34] viser en bakteries hæmningszones skæring med MIC aflæsningsskala ved 1,0 mg/l på oversiden af E-teststrippen. Fra undersiden af strippen er vancomycin diffunderet ud. Projektforsøget blev indledt med en opsætning af real time PCR, hvorved det bedste primerprobesæt (assay), den bedste positive kontrolstamme for hvert af de fire gener, vana, vanb, vanc1 og vanc2/3, samt den bedste interne kontrol blev udvalgt. Hertil blev der bestilt to assays, Side 13 af 49

15 begge indeholdende en forward primer, en reverse primer og en probe for vana, vanb og vanc og et assay for hver af de to interne kontroller, 23S, som er et Enterococcus-specifikt assay, og 16S, der ikke er speciesspecifikt, da det indeholder ribosomale RNA (rrna) gener, som findes i ethvert bakteriegenom [35]. De interne kontroller skal kontrollere, at det undersøgte prøvemateriale indeholder DNA, der kan opformeres, samt at der ikke er for mange hæmmende stoffer til stede. Det ene assay for vana og vanb, begge assays for vanc, vanc1 og vanc2/3, samt 16S assayet blev designet på KMA, OUH vha. et elektronisk blastings program (NCBT primerblast). Disse assays benævnes i nærværende projekt som in-house 1 assays. Det andet assay for hhv. vana og vanb blev valgt fra et studie af Fang H. et al. [36], og 23S assayet blev valgt med udgangspunkt i et studie af Ryu H et al. [35]. I projektet omtales sidstnævnte assays som in-house 2 assays. På trods af, at de forskellige assays havde forskellige primere og prober, kørte selve PCR processen ens. Samtlige assays blev afprøvet på 7 kendte VRE kontrolstammer. På bagrund af de fremkommende ct-værdier ud fra de målte fluorescerende signaler ved real time PCR, blev det bedste assay for vana, vanb og den interne kontrol valgt. Derudover blev 4 kontrolstammer valgt som positive kontroller. I betragtning af, at projektet tager udgangspunkt i kendte gener, er real time PCR en ideel påvisningsmetode, da den i forhold til andre PCR metoder, er mindre tidskrævende, giver mere sensitive og reproducerbare resultater, er mere specifik og har mindre risiko for kontaminering [13,14,23]. Endvidere er real time PCR mere sensitiv og specifik end de konventionelle fænotypiske metoder til detektion af VRE [13,14]. Disse fordele ligger til grund for vores valg af real time PCR som golden standard til sammenligning med E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Tidligere resultater opnået ved hhv. E-test og ulden/ikke ulden metoderne vurderes ud fra behandling med deskriptiv statistik i form af sensitivitets- og specificitetsberegninger med henblik på at sammenligne resultater fra disse fænotypiske metoder med de fremkommende resultater ved real time PCR. Sensitiviteten, dvs. følsomheden, ved en metode angiver, hvor god denne er til at finde de syge personer, og specificiteten, dvs. nøjagtighed, udtrykker metodens evne til at finde de raske personer [37,38]. Overføres dette på det pågældende projektforsøg, fortæller sensitiviteten, hvor god metoden har været til at foretage korrekt diagnose af de vancomycinresistente Enterococcus-stammer (positive), mens specificiteten afspejler metodens evne til at finde de vancomycinsensitive Enterococcus-stammer (negative). Sensitiviteten og specificiteten er defineret ved følgende formler: Side 14 af 49

16 Sensitivitet = Antal sande positive Antal sande positive + antal falske negative 100 % Specificitet = Antal sande negative Antal sande neagtive + antal falske positive 100 % Til beregning af sensitivitet og specificitet er følgende blevet defineret: Sandt positiv (SP) angiver, at der ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet er enighed om resistens med Real time PCR. Falsk positiv (FP) angiver, at den pågældende stamme er resistent ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet, men sensitiv ved real time PCR. Sandt negativ (SN) angiver, at der ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet er enighed om sensitivitet med Real time PCR. Falsk negativ (FN) angiver, at den pågældende stamme er sensitiv ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet, men resistent ved real time PCR. I forbindelse med sammenligning af de fænotypiske metoder i projektet, har det været interessant, at undersøge, hvilke metoder andre Klinisk Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark anvender til detektion af VRE. Til dette formål er der foretaget en elektronisk spørgeundersøgelse via mail (Bilag 1). Materialer og metoder Materialer Prøvematerialer Til opsætning af real time PCR er følgende 7 kendte VRE kontrolstammer samt assays anvendt; 7 VRE kontrolstammer udleveret fra KMA Skejby; E. faecium vanb (N-AST 4), E. faecium vanb2 (N-AST 5), E. faecalis vanb1 (N-AST 9) og fra SSI; E. faecium vana (1) (A ATCC 51559), E. faecium vana (2) (B ), E. gallinarum vanc1 (G ATCC 49573) og E. casseliflavus vanc2 (H ATCC 12755). Side 15 af 49

17 In-house 1 assays: vana-svh forward CAGGAAGTCGAGCCGGAAA, vana-svh reverse GGTCTGCGGGAACGGTTAT og vana-svh probe FAM-AGGCTCTGAAAACGCAGT-MBG vanb-svh forward GGTAACGAGGATGATTTGATTG, vanb-svh reverse CGTGGCTCATCCGGATT og vanb-svh probe VIC-CGGCGAAGTGGATC-MGB vanc1-forward GAAATTGGCTGCGGCATCT, vanc1-reverse TCGCATCACAAGCACCAATC og vanc1-probe FAM-AGGAAATGAGCAATTGA-MGB vanc2/3-forward GATCGGTTGCGGTATTTTGG, vanc2/3-reverse TGAAATGGCGTCACAAGCA og vanc2/3-probe VIC-CAACGACTCTTTGACTGTC-MGB Intern kontrol 16S-forward CCAGAAAGCCACGGCTAACT, 16S-reverse CGCTTGCCACCTACGTATTACC og 16S-probe FAM-CGTGCCAGCAGCC-MGB. In-house 2 assays: vana-forward AGTCAATACTCTGCCCGGTTTC, vana-reverse GCAGCGGCCATCATACG og vana-probe FAM-CGTCATACAGTCGTTATC-MGB vanb-forward TCCGGTCGAGGAACGAAA, vanb-reverse GCCCTCTGCATCCAAGCA og vanb-probe VIC-ACGGCAAAGAAAGTATATC-MGB Intern kontrol 23S-forward AGAAATTCCAAACGAACTTG, 23S-reverse CAGTGCTCTACCTCCATCATT og 23S-probe FAMTGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-BHQ1. Opsætning af real time PCR blev anvendt til undersøgelse af følgende 64 Enterococcus-stammer; 19 E. faecium, 9 E. faealis, 6 Enterococcus durans, 5 Enterococcus avium, 5 E. gallinarum, 5 E. casseliflavus, 4 E. casseliflavus/gallinarum, 3 Enterococcus raffinosus, 2 E. avium/raffinosus, 2 Enterococcus hirae/faecium/durans, 1 Enterococcus hirae/durans/faecium, 1 Enterococcus dispar, 1 Enterococcus gilvus/maldoratus, 1 Enterococcus mundtii og 1 Enterococcus pseudoavium (Bilag 2), med henblik på at sammenligne med de fænotypiske metoder. Apparatur 7500 Fast Real-Time PCR system (rum 2-46) blev anvendt til analyse af prøvematerialerne, 35 C termostat KMA-4 blev anvendt til inkubation af renkulturerne, i køleskab KMA-999 fandtes tubes med sterilt vand, køleskab KMA-49 blev anvendt til opbevaring af tubes med bakterieafkog, mikrocentrifuge KMA-22 (rum 2-71) blev anvendt til centrifugering, automatpipetter blev anvendt i Side 16 af 49

18 forbindelse med fremstilling af Mastermix, Eppendorf Termostat Plus KMA-745 (rum2-71) blev anvendt til kogning af Enterococcus og stopur. Utensilier PCR-plade, pipetter, filterpipettespidser, 1½ ml mikrocentrifugerør, køleblokke, 5 % blodagarplader (SSI), 1μL øjepodenål, tubes og stanniol. Reagenser Sterilt H 2 O (RNase frit vand), TaqMan FAST mastermix 2x indeholdende PCR buffer, dntp mix, TaqMan-polymerase (no AmpErase UNG, Applied Biosystems ), forward og reverse primere (DNA Technology), TaqMan prober (DNA Technology og Applied Biosystems), positiv-, negativog intern kontrol. Apparatur og utensilier er blevet stillet til rådighed af KMA, OUH, og reagenserne er blevet bestilt i samarbejde med KMA, OUH. Metoder Eksperimentelt arbejde Projektets eksperimentelle arbejde er udført på 7 kontrolstammer og 64 Enterococcus-stammer efter følgende fremgangsmåde: Del 1 Klargøring af stammerne Enterococcus-stammer fra frysestik samt kontrolstammer udsås på 5 % blodagarplader. Herefter inkuberes blodagarpladerne ved 35 C i termostaten. Efter 24 timer laves nye renkulturer fra de allerede inkuberede plader. Del 2 Klargøring af DNA Der opslemmes 1-2 enkeltliggende kolonier fra renkulturerne til en tube tilsat 250 μl sterilt vand til opløsningen er uklar. Når kogningsapparatet, Eppendorf Termostat Plus, når en temperatur på 99 C, indsættes blokken med de klargjorte tubes. Efter 10 minutters kogning afkøles tubene og er nu klar til centrifugering, som skal foregå ved rpm i 1 minut. Herefter opbevares tubene på køl. Del 3 Real time PCR 7500 FAST Real-Time PCR apparatet tændes og skal stabilisere sig i 15 minutter. Efterfølgende udfyldes et PCR-pladelayout for resistensgenerne vana, vanb og vanc, der angiver fordelingen af Side 17 af 49

19 prøverne i rørene til PCR apparatet (Bilag 3). Layoutet indtastes i 7500 FAST Real-Time PCR apparatet. Primere og prober skal nu opløses til 100 μm sterilt vand (RNase frit vand). Herefter fremstilles PPmix til hhv. vana, vanb og vanc. 250 μl PP-mix fremstilles af 25 μl forward primer, 25 μl reverse primer, 5 μl probe, 195 μl sterilt vand (RNase frit vand). Reagenserne blandes forsigtigt ved at knipse på røret, som herefter centrifugeres kort vha. mikrocentrifugen, således at reagenserne samles i bunden af røret. Derefter fremstilles Mastermixet også til hhv. vana, vanb og vanc i 1½ ml mikrocentrifugerør. 20 μl Mastermix (pr. reaktion) fremstilles af 12,5 μl TaqMan FAST mastermix 2x, 2,5 μl PP-mix og 5,0 μl sterilt vand (RNase frit vand). Reagenserne blandes forsigtigt ved at knipse på røret, som herefter centrifugeres kort og opbevares på køl indtil anvendelsen. En PCR-plade placeres i en køleblok. Der tilsættes 20 μl Mastermix i bunden af hver brønd i PCR-pladen. Pladen tages op af køleblokken og der kontrolleres om der er samme mængde Mastermix i hvert rør. 5 μl prøve DNAtarget med det genmateriale som ønskes undersøgt (vana, vanb eller vanc) tilsættes til hver brønd i PCR-pladen på nær den negative kontrol, hvori der tilsættes 5 μl sterilt vand (RNase frit vand) i stedet for DNA-target. Pladen tildækkes med stanniol og indsættes i 7500 FAST Real-Time PCR, som er indstillet til at forløbe efter følgende FAST PCR-program; intial denaturering ved 95 C i 20 sekunder, 45 cykler ved denaturering ved 95 C i 3 sekunder efterfulgt af annealingstrinnet kombineret med elongeringstrinnet ved 60 C i 30 sekunder. Efter endt analyse oveføres resultaterne vha. USB-stik til en computer til efterbehandling, hvor treshold fastsættes og der vil herved fremkomme ct-værdier som er et udtryk for DNA-mængden. Litteratursøgning I nærværende projekt er litteratursøgningen foretaget på baggrund af projektets indhold. Heraf er der udtaget nøgleord, som virker relevante og dækkende for fokusområderne i opgaven. Ordne er oversat til engelsk, og brugt som udgangspunkt for søgning af artikler i sundhedsdatabasen Pubmed. Det har været nødvendigt at begrænse søgningen, når der har været mange resultater, med henblik på at udelukke irrelevante artikler. Følgende begrænsninger har været anvendt; med abstract, fri fuld tekst tilgængelig, på engelsk og dansk, publiceret inden for de sidste 5 eller 10 år og fokus på mennesket. Ved fund af relevante artikler, hvor der ikke har været en fuldtekst tilgængelig, er disse blevet bestilt via biblioteket. Nogle artikler er også blevet fundet gennem referencelisterne i andre anvendte artikler. Vurdering af litteraturen er i første omgang sket på baggrund af abstractet og Side 18 af 49

20 derefter dybtgående vurderet ved gennemlæsning. Endvidere er der blevet anvendt fagbøger til basisviden, forskrifter fra afdelingens dokument og kvalitetssystem (Qwalivare), samt litteratur, der tidligere har været anvendt i forbindelse med studiet. Efter første litteratursøgning er der opnået ny viden, og derfor nye søgeord. Disse er blevet brugt til en efterfølgende litteratursøgning, og søgningsprocessen er foregået gennem hele udarbejdelsen af projektet. De anvendte søgeord ved PubMed har været; Enterococcus, vancomycin, vana, vanb, vanc, vancomycinresistant Enterococcus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, resistance mechanisms, detection of vancomycinresistant Enterococcus, PCR, Quantitative real time PCR, DNA, amplification, diagnogstics. Resultater I nærværende projekt er real time PCR opsat på baggrund af in-house 1 og in-house 2 assays. Endvidere er der til opsætningen anvendt 7 kendte VRE kontrolstammer. Herved er følgende resultater i nedenstående tabeller, 1-2, opnået: In-house 1 Assays In-house 2 Assays Kontrolstamme vana vanb vanc1 vanc2/3 vana vanb Middelværdi Middelværdi E. faecium vana (1) 16, ,6 - E. faecium vana (2) 15, ,1 - E. faecium vanb 37,8 22,1 20, ,5 20,4 21,4 20,9 E. faecalis vanb1-19,4 19, ,7 18,1 19,3 18,9 E. faecium vanb2-25,4 25, ,8 24,5 25,4 25,2 E. gallinarum vanc , E. casseliflavus vanc ,3 - - Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 1 viser oversigt over beregnede middelværdier af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, der er opnået ved positive reaktioner mellem 7 VRE kontrolstammer og hhv. in-house 1 assays, vana, vanb, vanc1 og Side 19 af 49

21 vanc2/3, og in-house 2 assays, vana og vanb (Bilag 4). Ved vanb assayene angiver de gråmarkerede felter ct-værdier, og de grønmarkerede felter angiver de valgte assays, samt de valgte kontrolstammer. Negative reaktioner ved kontrolstammerne og ved den negative kontrol er angivet med -. Ved kontrolstammerne indikerer -, at van-genet, der ønskes undersøgt med det pågældende van assay mangler, og ved den negative kontrol angiver - fraværet af van-genet, der er nødvendig til opformering af DNA. Af tabel 1 ses, at der ved anvendelse af in-house 1 vana assay, er middelværdierne på 16,4, 15,4 og 37,8 for E. faecium vana (1), E. faecium vana (2) og E. faecium vanb kontrolstammer. Ved anvendelse af in-house 2 vana assay er middelværdierne for E. faecium vana (1) og E. faecium vana (2) på hhv. 18,6 og 17,1. Desuden viser tabel 1, at der ved anvendelse af in-house 1 vanb assay, er middelværdierne på 21,4, 19,3 og 25,4 for E. faecium vanb, E. faecalis vanb1 og E. faecium vanb2 kontrolstammer. Ved anvendelse af in-house 2 vanb assay er middelværdierne 20,9, 18,9 og 25,2 for E. faecium vanb, E. faecalis vanb1 og E. faecium vanb2. Af tabel 1 ses også, at der ved anvendelse af in-house 1 vanc1 assay, er middelværdien på 21,3 for E. gallinarum vanc1, og ved anvendelse af in-house 1 vanc2/3 assay er der for E. casseliflavus opnået en middelværdi på 21,3. ct-værdier for interne kontroller Kontrolstamme In-house 1 16S In-house 2 23S E. faecium vana (1) 15,5 15,5 17,0 17,0 E. faecium vana (2) 13,8 13,9 15,4 15,5 Negativ kontrol 31,4 31,9-38,6 (Rnase frit vand) E. faecium vanb 16,1 17,5 E. faecalis vanb1 14,7 16,0 E. faecium vanb2 20,7 22,2 E. gallinarum vanc1 14,5 15,7 E. casseliflavus vanc2 15,2 16,3 Negativ kontrol 32,5 - (Rnase frit vand) Tabel 2 viser ct-værdier opnået ved reaktioner mellem 7 VRE kontrolstammer og assays for de interne kontroller 16S og 23S. VanA kontrolstammer er kørt i dobbeltbestemmelser, mens vanb- og vanc Side 20 af 49

22 kontrolstammer er kørt i enkeltbestemmelser. Det grønmarkerede felt angiver det valgte assay som intern kontrol. Negative reaktioner er angivet med -, som indikerer, at der ikke er foregået opformering af DNA. I tabel 2 ses, at der ved anvendelse af in-house 1 16S assay er der opnået ct-værdier ved alle Enterococcus-stammerne og ved de negative kontroller, hvor der ses følgende værdier; 31,4 og 31,9 for E. faecium vana (1) og E. faecium vana (2) i dobbeltbestemmelsen, og 32,5 for samtlige vanb- og vanc stammer. Ligeledes er der opnået ct-værdier ved alle Enterococcus-stammer ved anvendelse af in-house 2 23S assay. Endvidere er der fremkommet en ct-værdi på 38,6 i dobbeltbestemmelsen for vana-stammerne ved den negative kontrol. Sidstnævnte intern kontrol, 23S, er valgt til undersøgelsen af 64 Enterococcus-stammer. I forbindelse med sammenligning af de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, er real time PCR efter opsætning anvendt som golden standard. Beregninger af sensitiviteterne og specificiteterne ved E-test og ulden/ikke ulden fænomenet overfor real time PCR er baseret på de samme 64 Enterococcus-stammer (Bilag 5 og 6). Beregningerne indgår i nedenstående tabeloversigt: Metode Sensitivitet Specificitet E-test 41 % 100 % 100 % 100 % Ulden/ikke-ulden 24 % 100 % 80 % 80 % Tabel 3 viser beregnede sensitiviteter og specificiteter for hhv. E-test og ulden/ikke ulden metoderne. + angiver, at E. casseliflavus og E. gallinarum er medtaget i beregningerne, mens - angiver, at disse stammer er udtaget fra beregningerne. Af tabel 3 ses beregnede sensitiviteter for E-test og ulden/ikke ulden metoderne på hhv. 41 % og 24 % ved medtagelse af E. casseliflavus og E. gallinarum og på 100 %, når sidstnævnte stammer er udtaget fra beregningerne. Af tabel 3 ses ingen ændringer i specificitetsværdierne for E-test og ulden/ikke ulden, som er på hhv. 100 % og 80 %, i beregningerne med og uden E. casseliflavus og E. gallinarum. Diskussion Opsætning af real time PCR Det er en forudsætning, at vælge en fungerende opsætning af real time PCR, for at opnå pålidelige resultater ved anvendelse af denne til detektion af van-generne vana, vanb og vanc i 64 Enterococcus-stammer. Side 21 af 49

23 Til påvisning af vana-genet i Enterococcus-stammer blev in-house 2 vana assayet valgt, og som ud fra tabel 1 ses at have ct-middelværdier på 18,6 og 17,1 for hhv. E. faecium vana (1) og E. faecium vana (2). In-house 1 vana assayet gav lavere ct-middelværdier, 16,4 og 15,4, for samme vana kontrolstammer jf. tabel 1. Dette betyder, at assayet kan forventes, at være hurtigere til at detektere vana-genet, dvs. opformering af det pågældende gen kan ske efter færre cyklusser og tærskelværdien nås herved hurtigere resulterende i lavere ct-værdi. Dog blev in-house 1 vana assayet fravalgt, da dette, som det kan ses i tabel 1, reagerede uspecifikt med en vanb kontrolstamme, E. faecium vanb, resulterende i en ct-middelværdi på 37,8. Derfor kan dette assay s anvendelse til undersøgelse af vana Enterococcus-stammer være problematisk, da de evt. fremkommende positive resultater heraf ikke kan være pålidelige grundet en hertil forbundet risiko for falsk positive resultater. Endvidere blev kontrolstammen E. fæcium vana (2) udvalgt som positiv kontrol til undersøgelse af vana Enterococcus-stammer efterfølgende, fordi den fik en lavere ct-middelværdi på 17,1 end den anden medtagende kontrolstamme E. faecium vana (1) med middelværdi på 18,6 ved reaktion med in-house 2 vana assayet. Til detektion af vanb blev in-house 1 vanb assayet valgt. Sammenlignet med in-house 2 vanb assayet havde begge assays jf. tabel 1 ct-middelværdier, der lå tæt meget på hinanden og dette betyder at assayene umiddelbart vil være lige gode ved anvendelse i forbindelse med detektion af vanb Enterococcus-stammer. Derfor blev valget basseret på differenserne mellem dobbeltbestemmelser på ct-værdierne opnået ved anvendelse af in-house 1 vanb assayet, som ved flest vanb kontrolstammer, E. faecalis vanb1 med ct-værdier på 19,4 og 19,1 og E. faecium vanb2 med ct-værdier på 25,4 og 25,3, var mindre end differenserne mellem dobbeltbestemmelser på inhouse 2 vanb assay s ct-værdier 19,7 og 18,1 for E. faecalis vanb1 og 25,8 og 24,5 for E. faecium vanb2. Derudover blev kontrolstammen E. faecalis vanb1 valgt som positiv kontrol til undersøgelse af vanb Enterococcus-stammer, fordi den som ses i tabel 1 fik lavere ct-værdier end de andre vanb kontrolstammer ved reaktion med in-house 1 vanb assayet. Begge in-house 1 vanc assays, vanc1 og vanc2/3, til detektion af vanc-generne blev valgt. De er specifikke for hver deres stamme, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2. Af tabel 1 ses, at begge assays reagerede korrekt. Som forventede reagerede vanc1 assayet kun med kontrolstammen vanc1, og vanc2/3 assayet havde ligeledes kun bundet specifikt til vanc2 kontrolstammen resulterende i ct-middelværdier på 21,3. Kontrolstammerne E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus Side 22 af 49

24 vanc2 blev begge valgt som positive kontroller til anvendelsen ved detektion af generne vanc1 og vanc2/3 i Enterococcus-stammerne. Ved opsætning af real time PCR blev assays for to interne kontroller medtaget; in-house 1 16S og in-house 2 23S. I betragtning af, at en intern kontrol skal kontrollere om det undersøgte prøvemateriale indeholder DNA-target, der kan opformeres, er kontrollen ikke umiddelbart interessant, når en opsætning afprøves på kendte Enterococcus kontrolstammer som tilfældet i det nærværende projekt. Dog indgik en intern kontrol, 23S, i projektets opsætning, da van-generne, vana, vanb og vanc, i 64 Enterococcus-stammer skulle detekteres efterfølgende. Af tabel 2 ses positive reaktioner i de negative kontroller for vana kontrolstammerne med ctværdier på 31,4 og 31,9 i dobbeltbestemmelsen, og for vanb- og vanc kontrolstammerne med en ctværdi på 32,5 ved anvendelse af in-house 1 16S. En fejlkilde som kontaminering kan forklare de uventede positive reaktioner i de negative kontroller, da ct-værdierne ved disse er høje i forhold til de ct-værdierne opnået ved kontrolstammerne. De negative kontroller kunne have været kontamineret fx i forbindelse med afpipettering med DNA-target eller med PCR-produkter fra tidligere PCR-kørsler eller der kan være tale om kontaminering ved firmaets produktion af 16S assayet s reagenser. In-house 1 16S er derfor fravalgt som intern kontrol til undersøgelse af Enterococcus-stammerne, da problematikken med upålidelige positive resultater, som nævnt tidligere, kan opstå. I den forbindelse tænkes det, at yderligere undersøgelser med 16S muligvis kan afklare problemstillingen omkring de uventede positive reaktioner. Eksempelvis kan 16S afprøves igen. Ved anvendelse af in-house 2 23S blev der ligeledes set en positiv reaktion ved en negativ kontrol for vana kontrolstammerne med en ct-værdi på 38,6 i dobbeltbestemmelsens anden måling, jf. tabel 2. Den positive reaktion kan også skyldes kontaminering pga. den høje ct-værdi. Sammenlignet med in-house 1 16S, er 23S vurderet som værende et bedre assay, da dette ellers havde givet forventede negative reaktioner i den negative kontrols første måling i dobbeltbestemmelsen for vana kontrolstammerne og i den negative kontrol for både vanb- og vanc kontrolstammer. På trods af den ovenstående omtalte positive reaktion som efterfølgende kan give anledning til falsk positive resultater ved undersøgelse af Enterococcus-stammerne, er 23S valgt som intern kontrol, da den vides, at være anvendelig som Enterococcus-specifikt assay [35]. Eksempelvis er der i studiet Ryu H et al. [35] bl.a. undersøgt for specificiteten af 23S PCR-assayet overfor 153 Enterococcus- Side 23 af 49

25 stammer, og ifølge studiet er der fundet ud af, at 23S binder specifikt til alle de medtagende Enterococcus-stammer. Den valgte opsætning af real time PCR blev anvendt til undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer til sammenligning med tidligere resultater [24] opnået på samme stammer ved udførelse af de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. I den forbindelse blev real time PCR anvendt som golden standard. Med baggrund heri, vurderes det, at et antal af kendte VRE på 7, som opsætningen af real time PCR baserede sig på, ikke er tilstrækkelig, da der kræves en meget større population for at opnå mest mulige solide resultater, således at det pågældende studie kan fremstå pålidelig. I et studie af Tripathi A et al. [13], der undersøger den kliniske anvendelse af real time PCR til detektion af VRE overfor andre detektionsmetoder som fænotypiske metoder og andre molekylærbiologiske metoder, herunder E-test og standard PCR, er der medtaget 145 Enterococcusstammer, hvoraf 80 var VRE stammer og 65 var vancomycinsensitive stammer. I et andet studie af Kim TS et al. [14], der også undersøger, hvorvidt real time PCR kan anvendes i kliniske sammenhæng til detektion af vana-genet i VRE i forhold til nogle fænotypiske metoder, er der anvendt 100 stammer indeholdende både VRE og vancomycinsensitive Enterococcus på et antal af hhv. 52 og 48. Sammenlignes nærværende projekts medtagende antal af VRE kontrolstammer på 7 med antallet af VRE anvendt i de nævnte studier i ovenstående, vurderes det, at 7 kontrolstammer for VRE er et utilstrækkeligt antal til opsætning af en golden standard, da sandsynligheden for at opdage evt. uspecifikke reaktioner grundet anvendelse af uspecifikke assays vil være meget lille i forhold til, hvis opsætningen var udført med udgangspunkt i en større population af kendte VRE kontrolstammer, for jo større population, der medtages, jo større bliver sandsynligheden for at opdage forkerte resultater, som den pågældende analysemetode kan risikere at afgive [37]. Til trods for en undersøgt opsætning af real time PCR på kun 7 VRE kontrolstammer, blev denne alligevel anvendt til undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer, fordi de valgte assay fra opsætningen reagerede specifikt med de kendte VRE kontrolstammer, hvorfor de efterfølgende ligeledes kunne forventes at binde specifikt til stammerne med de pågældende target van-gener. Ved den efterfølgende undersøgelse af stammerne blev der ved anvendelse af de valgte assays opnået pålidelige resultater, da assayene reagerede specifikt med de 4 VRE kendte kontroller, E. faecium vana (2), E. faecalis vanb1, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2, der blev udvalgt som positive kontroller. Derudover sås negative reaktioner i de negative kontroller (Bilag 7). Side 24 af 49

26 Så i betragtning af, at den valgte opsætning af real time PCR var anvendelig på trods af et begrænset populationsantal af kendte VRE-stammer, kan det nærværende projekt anbefale KMA, OUH, på længere sigt, at implementere den valgte opsætning af real time PCR til anvendelse i forbindelse med detektion af vancomycinresistens i Enterococcus, således at der ikke behøves, at blive sendt prøver af vancomycinresistente Enterococcus til SSI efter en udført E-test. Dette betyder, at detektion af VRE bliver mindre tidskrævende, og for patienten betyder det, at behandlingen kan sættes hurtigere i gang. Samtidig peger projektet på, at der er nødvendighed for, at der foretages yderligere undersøgelser af en opsætning af real time PCR på en betydelig større population, der både inkluderer vancomycinresistente og vancomycinsensitive Enterococcusstammer. På baggrund af den opsatte real time PCR blev de aktuelle assays, in-house 2 vana, in-house 1 vanb, in-house 1 vanc og vanc2/3 og in-house 2 23S, anvendt til undersøgelse af 64 Enterococcusstammer med henblik på en sammenligning med de fænotypiske metoder hhv. E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Sammenligning af E-test med real time PCR Ved sammenligning af de fænotypiske metoder blev sensitivitet og specificitet for hhv. E-test og ulden/ikke ulden beregnet. Af tabel 3 ses, at det havde haft en stor betydning for sensitiviteten om E. casseliflavus og E. gallinarum var medtaget eller ej. Eksempelvis øges sensitiviteten af E-testen med 59 % fra 41 % til 100 %, når der ses bort fra E. casseliflavus og E. gallinarum i beregningen. Ligeledes ses en markant forbedret sensitivitet for ulden/ikke ulden fænomenet på 76 % fra 24 % til 100 % ved beregningen uden de omtalte stammer. En sensitivitet på 100 % indikerer, at de pågældende fænotypiske metoder er gode til at detektere de vancomycinresistente Enterococcus. Endvidere ses af tabel 3, at det ikke havde haft nogen betydning for begge metoders evne til detektion af vancomycinsensitive bakterier om E. casseliflavus og E. gallinarum indgik eller ej. Specificiteterne på 100 % og 80 % forblev uændret for E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. E. casseliflavus og E. gallinarum har medfødt resistens for vancomycin grundet deres resistensmekanismer for vanc, og ifølge EUCAST skal disse vanc stammer ikke undersøges med MIC- eller agardiffusionsmetoder med henblik på en identifikation, derimod vil anvendelse af bl.a. MALDI-TOF, som er en metode til artsbestemmelse, være tilstrækkelig til denne identifikation og i forhold til et efterfølgende behandlingsvalg [29]. Sammenholdt med nærværende projekts resultater, Side 25 af 49

27 er det ikke korrekt at medtage E. casseliflavus og E. gallinarum ved E-test og ulde/ikke ulden, da stammerne herved forringer sensitiviteten ved metoderne, men for at holde en sensitivitet på 100 %, hvilket er opnået ved begge metoder jf. tabel 3, kan identifikationen af de to VRE alternativt udføres vha. MALDI-TOF, som EUCAST anbefaler. I et studie af Griffin PM et al. [5], der undersøger anvendeligheden af MALDI-TOF i forbindelse med detektion af VRE, er der nået frem til, at MALDI-TOF kan bruges til en artsmæssig identifikation af Enterococcus, hvilket stemmer fint overens med EUCAST s anbefaling, da der er opnået høj sensitivitet og specificitet, på 96,7 % og 98,1 %, ved denne metode. På den anden side, når ovenstående tages i betragtningen, skal det påpeges, at identifikationen af vanc stammerne E. casseliflavus og E. gallinarum foretaget udelukkende med MALDI-TOF skal tages med forbehold. Dette skyldes, at disse stammer kan erhverve et vana-gen [29], hvilket får betydning for valg af behandling for patienten. Det vides om vana Enterococcus, at de udover, at være resistente for vancomycin også udviser resistens for teicoplanin [3,4,10,15,19,20], mens vanc Enterococcus er sensitive overfor dette antibiotikum [39]. Dvs. afhængigt af, hvilken van-type, der bliver påvist, kan den rette behandling vælges. I den sammenhæng tænkes det, at være nødvendigt, at foretage yderligere undersøgelser efterfulgt af MALDI-TOF, fx i form af en fænotypisk resistensbestemmelse, med anvendelse af teicoplanintabletten, som kan udelukke tilstedeværelsen af vana i tilfælde af påvisning af sensitivitet overfor teicoplanin. Endvidere kan detektion af VRE yderligere undersøges med real time PCR, da denne specifikt kan påvise, hvilket van-gen den pågældende Enterococcus-stamme har. På baggrund af ovennævnte problemstilling ved sensitivitetsberegningerne, hvori E. casseliflavus og E. gallinarum indgår, tager den videre diskussion af de fænotypiske metoder udgangspunkt i de beregnede sensitiviteter, hvor disse vanc-stammer ikke er medtaget. Ved E-test er der, som tidligere nævnt, opnået en sensitivitet på 100 %, når denne er holdt op imod real time PCR som golden standard. Dette betyder, at resultater på de 64 Enterococcus-stammer ved E-test har været i overensstemmelse med resultater fra real time PCR på samme stammer, og E-test kan derfor med udgangspunkt i nærværende projekts resultater antages, at være anvendelig til detektion af vancomycinresistens i Enterococcus. På den anden side er anvendeligheden af E-testen ikke optimal, når et specifikt van-gen ved en Enterococcus-stamme ønskes detekteret. Ud fra det faktum, at MIC-grænsen for vancomycinsensitive Enterococcus er fastsat til 4 mg/l [21], kan en specifik identifikation af eksempelvis nogle vanb Enterococcus-stammer fejltolkes. VanB Side 26 af 49

28 Enterococcus, som er resistente for vancomycin ved en lav MIC-værdi på 4 mg/l vil ligge i gråzonen, og kan ved anvendelse af E-test blive identificeret fejlagtigt som værende sensitive i stedet for resistente, hvilket kan føre til fejlbehandling af patienten. I et studie af Schulz JE et al. [32], som bl.a. undersøger E-testen til detektion af high-level vancomycinresistens hos 14 Enterococcus-stammer, heriblandt E. faecalis og E. faecium, sås at detektion af low-level vancomycinresistens hos Enterococcus kan være problematisk. Samtidig skal det understreges, at en population på 14 ikke er tilstrækkelig i forhold til, som tidligere nævnt, at opdage forkerte resultater ved den pågældende analyse, der er annvendt. Anvendelsen af E-test kan ligeledes blive problematisk til identifikation af vanb typer, der har høje MIC-værdier. Identifikationen af high-level vanb tænkes at blive vanskeligt grundet et overlap, der kan opstå ved 16-64mg/L mellem vanb Enterococcus-stammer, hvis MIC-værdiinterval er defineret ved 4-64 mg/l, og vana Enterococcus-stammer med MIC-værdiinterval fra mg/l. Med udgangspunkt i nærværende projekt, hvor kun to vanb-stammer er medtaget, kan der ikke siges noget om, hvor god E-testen er til at identificere van-gener, som ligger i gråzonen, på trods af dens sensitivitet på 100 %, da denne værdi i projektets tilfælde kun udtrykker E-testens evne til generelt at detektere resistens for vancomycin i Enterococcus. Når ovennævnte svagheder ved E-test tages i betragtningen, vurderes det nødvendigt, at anvende en anden metode til detektion af VRE, som fx real time PCR, der er anvendt i projektet, da denne er i stand til specifikt at identificere van-gener. Herved kan en fejlagtig identifikation af van-gener, der ligger i gråzonen, undgås. Dette kan være relevant i forbindelse med valg af behandling for patienten. Ved fund af vanb-gen og ikke vana-gen med real-time PCR, kan teicoplanin anvendes til behandling, da vanb Enterococcus til forskel fra vana Enterococcus, som tidligere nævnt, udviser følsomhed overfor dette antibiotikum [3,4,10,15,19,20]. Ifølge nogle studier [13,14] er der stor enighed om, hvilke andre fordele, der også karakteriserer real time PCR. Studiet af Tripathi A et al. [13] finder ud af, at real time PCR har en sensitivitet og specificitet på 100 % ved undersøgelse af VRE med udgangspunkt i en specifik detektion af vanagenet. Ydermere er studiet nået frem til, at real time PCR er en hurtig detektionsmetode til vangener i Enterococcus, når MIC-værdier er foruddefineret vha. fx E-test. Herved vil disse på hinanden følgende metoder være til gavn, når behandling til infektioner af VRE skal bestemmes. Studiet konkluderer bl.a., at real time PCR er mere præcis og hurtigere end de konventionelle fænotypiske metoder til detektion af VRE. Side 27 af 49

29 I et andet nævnt studie af Kim TS et al. [14], der undersøger den kliniske anvendelse af real time PCR ved detektion af VRE overfor de konventionelle fænotypiske metoder, herunder E-test og diskdiffusion, nås der også frem til, at real time PCR er en bedre metode til at detektere VRE end de fænotypiske metoder, og kan derfor erstatte dem. Sammenlignes ovenstående studier med hinanden i forhold til, hvad de er nået frem til af konklusioner, bemærkes det, at studierne har delte meninger omkring anvendelsen af real time PCR i kliniske sammenhænge. Tripathi A et al. [13] mener, at real time PCR er optimal anvendelig når den kombineres med E-test, mens Kim TS et al. [14] peger på, at real time PCR helt kan erstatte de fænotypiske metoder, dvs. den ville kunne stå alene til detektion af VRE. Når denne uenighed tages i betragtning, tænkes det økonomisk set, at være mest hensigtsmæssigt til rutinediagnostik af vancomycinresistente Enterococcus, at udføre real time PCR sammen med den fænotypiske resistensbestemmelse vha. diskdiffusionsmetoden og E-test, da flest mulige vancomycinsensitive Enterococcus herved identificeres, således, at det ikke bliver nødvendigt, at identificere dem igen ved anvendelse af real time PCR, som er en dyr detektionsmetode. Dennes anvendelse begrænses derfor kun til detektion af VRE. Sammenligning af ulden/ikke ulden fænomenet med real time PCR Som tidligere nævnt blev ulden/ikke ulden fænomenet også sammenlignet med projektets golden standard real time PCR, ligeledes på samme 64 Enterococcus-stammer. De opnåede resultater heraf, der ses i tabel 3, viser, at ulden/ikke ulden har en sensitivitet på 100 %, hvilket indikerer, at metoden har lige så stor evne som E-test til at foretage korrekt diagnose af vancomycinresistente Enterococcus. Med en specificitet på 80 %, kan der på trods af den begrænsede population på 64 stammer i nærværende projekt, siges, at ulden/ikke er en dårlig fænotypisk metode til at detektere de vancomycinsensitive Enterococcus-stammer. Dvs. 20 % af de undersøgte stammer påvises som værende resistente, hvor de reelt er sensitive for vancomycin. Herved er der tale om et problem med falsk positive resultater. Set i bredere perspektiv kan sådanne resultater medføre til fejldiagnosticering og behandling af patienten. Sidstnævnte kan betyde, at patienten kan blive udsat for unødvendig antibiotikabehandling, der kan indebære svære bivirkninger. Dette kan gøre sig gældende ved anvendelse af fx linezolid og daptomycin, som ifølge DANMAP kan anvendes til behandling af VRE [2]. På den anden side er det nødvendigt, at gøre opmærksom på, at der ved ulden/ikke ulden fænomenet er forbundet en risiko for en meget upræcis vurdering af zonekanten, hvis denne foretages af fx studerende eller nyuddannede bioanalytikere, der formodes at have Side 28 af 49

30 beskeden erfaring. Dette kan måske forklare den opnåede specificitet på 80 % ved ulden/ikke ulden fænomenet, som har baseret sig på vurderede resultater af zonekanten udført af studerende. Ifølge EUCAST skal identifikationen af VRE ikke kun baseres på vurdering af ulden/ikke ulden fænomenet, men også ud fra en MIC-bestemmelse, fx i form af E-test, da den pågældende Enterococcus-stamme kan være sensitiv på trods af, at den har en ulden kant, som ellers indikerer, at der kan være tale om resistens [29]. Med baggrund heri og ud fra de opnåede resultater ved sammenligning af E-test og ulden/ikke ulden metoder med real time PCR jf. tabel 3, peger nærværende projekt på, at E-test er den bedste fænotypiske metode til detektion af VRE frem for ulden/ikke ulden fænomenet, samt at vurderingen af ulden/ikke ulden fænomenet ikke kan stå alene. Når der opstår et tilfælde med VRE, udfører KMA, OUH, detektion af disse, som nævnt tidligere, ved resistensbestemmelse med Rosco antibiotikatabletter, og i tilfælde af ampicillinresistens laves efterfølgende en MIC-bestemmelse i form af E-test. Herefter sendes den vancomycinresistente Enterococcus-stamme til SSI. I forbindelse med den fænotypiske bestemmelse af VRE er KMA i dag gået fra at vurdere ulden/ikke ulden fænomenet på zonekanten af vancomycintabletten, da tabletten ikke længere anvendes i resistensbestemmelsen af Enterococcus. Sammenholdes KMA s metodevalg af VRE detektion, hvor der ikke tages højde for ulden/ikke ulden fænomenet, og EUCAST retningslinjer, der understreger, at vurdering af ulden/ikke ulden fænomenet ikke kan stå alene, med projektets resultater, ses, at specificiteten på 80 % for ulden/ikke ulden fænomenet, der er opnået ved sammenligning med real time PCR, bekræfter EUCAST og støtter KMA s fremgangsmåde. Dvs. ulden/ikke ulden fænomenet er ikke tilstrækkelig ved detektion af vancomycinresistens i Enterococcus. Den elektroniske spørgeundersøgelse foretaget på forskellige KMA er i Danmark, der omhandlede, hvilke detektionsmetoder til VRE disse anvender, belyser, at Regionshospitalet Viborg, Hospitalenheden Midtvest, efter nylig foretaget analyse af metoder til VRE påvisning, er gået over til, at anvende diskdiffusion, hvor der tolkes på zonekanten af vancomycintabletten ved vurdering af ulden/ikke ulden fænomenet. Hvis zonekanten er ulden svares den pågældende Enterococcusstamme som resistent og stammen sendes til SSI. Endvidere påpeger afdelingen, at konfirmatorisk MIC-bestemmelse ikke anvendes til påvisning af VRE, da denne metode er mindre følsom end ulden/ikke ulden fænomenet ved diskdiffusion (Bilag 1). Sammenlignes sidstnævnte med projektets resultater er der ingen overensstemmelse, da der i nærværende projekt er beregnet en lige så høj sensitivitet, 100 %, på MIC-bestemmelsen, i form af E-test, som, der er beregnet på ulden/ikke Side 29 af 49

31 ulden fænomenet ved diskdiffusionsmetoden. Når EUCAST s anbefalinger ligeledes inddrages, ses, at KMA Viborg også står i modstrid i forhold til EUCAST, der understreger, at VRE identifikationen ikke kun skal baseres på en vurdering af ulden/ikke fænomenet, men også ud fra MIC-bestemmelsen. Endvidere kan der ud fra alle adspurgte KMA afdelinger ses et gennemgående princip i den videre detektion af VRE, som baserer sig på en molekylærbiologisk diagnostikmetode (Bilag 1). På baggrund af resultaterne i nærværende projekt anbefales det til detektion af VRE rutinediagnostisk på KMA, OUH, at resistensbestemmelsen fortsat udføres med agardiffusionsmetoder ved anvendelse af antibiotikatabeletter fra Rosco og i tilfælde af ampicillinresistens udføres resistensbestemmelsen for vancomycin efterfølgende med E-test fra Biomerieux. Ved påvisning af VRE anvendes real time PCR til en yderligere specifik detektion af de pågældende van-gener. Konklusion I nærværende projekt blev tilstedeværelsen af vancomycinresistens-generne vana, vanb og vanc i en kollektion af 64 Enterococcus-stammer isoleret fra blod detekteret vha. en valgt opsætning af real time PCR bestående af assayene in-house 2 vana, in-house 1 vanb, in-house 1 vanc1 og vanc2/3, in-house 2 23S som intern kontrol og E. faecium vana (2), E. faecalis vanb1, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2, som positive kontroller. Real time PCR med denne valgte opsætning blev anvendt som golden standard ved sammenligning med de fænotypiske metoder, E-test fra Biomerieux og agardiffusion ved anvendelse af vancomycintabletten fra Rosco. Opsætningen af real time PCR bør undersøges med en større kendt population af VRE, da 7 VRE kontrolstammer ikke er tilstrækkelige. Endvidere skal opsætning ligeledes undersøges med en stor kendt population af vancomycinsensitive Enterococcus. Resultater fra real time PCR blev sammenlignet med resultater opnået på samme 64 Enterococcusstammer ved anvendelsen af E-test og ulden/ikke ulden metoderne. E-test gav en sensitivitet og en specificitet på 100 % og ved ulden/ikke ulden blev disse beregnede til hhv. 100 % og 80 %. I begge tilfælde var E. casseliflavus og E. gallinarum udtaget fra beregningerne. Med udgangspunkt i ovennævnte sensitiviteter og specificiteter peger det nærværende projekt på, at E-test er en bedre fænotypisk metode til detektion af VRE end ulden/ikke ulden fænomenet ved diskdiffusionsmetoden, hvor vancomycintabletten fra Rosco var anvendt. Side 30 af 49

32 Grundet E-testens svaghed, der er forbundet med en specifik detektion af van-gener og især gener der ligger i gråzoner, anbefales anvendelsen af den molekylærbiologiske analysemetode real time PCR rutinediagnostisk til detektion af VRE, da denne egner sig specifikt til at påvise van-gener, og derved er forbundet med en mindre risiko for fejldiagnosticering af eksempelvis low-level og high-level vanb Enterococcus. Endvidere peger det nærværende projekt på, at det er mest hensigtsmæssigt i forbindelse med detektion af VRE rutinediagnostisk, at udføre real time PCR sammen med den fænotypiske resistensbestemmelse vha. agardiffusionsmetoden ved anvendelse af antibiotikatabletter fra Rosco, hvor vancomycintabletten ikke medtages. I tilfælde af ampicillinresistens laves resistensbestemmelse for vancomycin med E-test fra Biomerieux. Perspektivering Det er en del af det bioanalytiske arbejde, at kvalitetssikre den pågældende biomedicinske analyse, der arbejdes med, således at der kan opnås pålidelige resultater, som bearbejdes med henblik på, at træffe diagnostiske og behandlingsmæssige beslutninger. Når kvalitetssikring tages i betragtningen, anbefales derfor, at opsætning af real time PCR undersøges med en større population af både kendte VRE stammer, end de 7 medtagende VRE-kontroller, og vancomycinsensitive Enterococcus for at opnå valide data, der skal danne grundlag for evt. yderligere undersøgelser. I kølvandet af nærværende projekt kan det være interessant, at undersøge de medtagende 64 Enterococcus-stammer ligeledes for vancomycinresistens med en anden molekylærbiologisk analysemetode, fx simpel multiplex PCR. Fordelen ved denne PCR metode er, at den kan påvise flere gener samtidig, fx van-generne vana, vanb og vanc, da der anvendes flere primerpar i samme PCR-reaktion [40]. Dette kan effektivisere arbejdsgangen således at detektion af VRE kan foregå hurtigere resulterende i hurtigere diagnosticering og dermed kan patienten komme hurtigere i behandling. I et videre perspektiv kan det også være interessant, at undersøge VRE overfor teicoplanin, der formodes at kunne anvendes diagnostisk ved fx vana og vanb fænotyperne, da vana udviser resistens for både vancomycin og teicoplanin, mens vanb kun er resistens for vancomycin, men sensitiv for teicoplanin [3,4,10,15,19,20]. Side 31 af 49

33 Litteratur 1. Yarlagadda V, Akkapeddi P, Manjunath GB, Haldar J, Membran Active Vancomycin Analogues: A Strategy to Combat Bacterial Resistance, Journal of Medicinal Chemistry, 2014 S Statens Serum Institut, DANMAP rapport, Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark, 2013, [ ], Lokaliseret på: P%202013/DANMAP% ashx S. 6, 10, 13, 14, 85, Bonten MJM, Willems R, Weinstein RA, Vancomycin-resistant enterococci: why are they here, and where do they come from?, The Lancet Infectious Diseases, 2001; 1 S. 314, Kuriyama T, Williams DW, Patel M, Lewis MAO, Jenkins LE, Hill DW, et al., Molecular characterization of clinical and environmental isolates of vancomycin-resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from a teaching hospital in Wales, Journal of Medical Microbiology, 2003 S. 821, Griffin PM, Price GR, Schooneveldt JM, Schlebusch S, Tilse MH, Urbanski T, et al.,use of Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry to identify Vancomycin-Resistant Enterococci and investigate the epidemiology of an outbreak, Journals, ASM.org, 2012 S Arias CA, Barbara EM, The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance, NIH Public Acces Author Manuscript, 2013; 10 (4) S. 1, 2, 3, 7, 8, 9 7. Praharaj I, Sujatha S, Parija SC, Phenotypic & genotypic characterization of vancomycin resistant Enterococcus isolates from clinical specimens, Department of Microbiology, Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical Education & Research, Puducherry, India, 2013 S. 550, 554 Side 32 af 49

34 8. Statens serum institut, Antibiotikaforbrug og resistens, 2012, Sundhedsstyrelsen, [ ], Lokaliseret på: resistens&url=http%3a%2f%2fwww.ssi.dk%2fsmitteberedskab%2fom+overvaagning% 2FAntibiotikaforbrug.aspx%3Fpdf%3D1 9. Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, Manual of clinical microbiology, 10. udgave, 1 volumen, 2011, American Society for Microbiology, Washington DC S. 350, Hollenbek BL, Rice LB, Intrinsic and acquired resistance mechanisms in enterococcus, Landes Bioscience, 2012 S. 421, 423, 425, Murray BE, The Life and Times of the Enterococcus, Clinical Microbiology, 1990; 3 (1) S Shepard BD, Gilmore MS, Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance, Microbes and Infection, Elsevier, 2002 S. 215, 216, Tripathi A, Shukla SK, Singh A, Prasad KN, A new approach of real time polymerase chain reaction in detection of vancomycin-resistant enterococci and its comparison with other methods, Indian Journal of Medical Microbiology, 2013; 31 (1) S. 47, 48, 49, Kim TS, Kwon HL, Song SH, Song KH, Kim HB, Park KU, et al., Real-time PCR surveillance of vana for vancomycin-resistant Enterococcus faecium, Molecular Medicine Reports, 2012 S. 488, 489, Gold HS, Vancomycin-Resistant Enterococci: Mechanisms and Clinical Observations, Antimicrobial Resistance, 2001 S. 210, Klaringsrapport, Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004 S. 6, 7, 9, Soriano F, Greenwood D, Action and interaction of penicillin and gentamicin, Journal of Clinical Pathology, 1979 Side 33 af 49

35 S Woodford N, Livermore DM, Infection caused by Gram-positive bacteria: a review of the global challenge, Journal of infection, 2009; 59 (01) S. S7 19. Werner G, Klare I, Fleige C, Geringer U, Witte W, Just HM, et al., Vancomycin-resistant vanb-type Enterococcus faecium isolates expressing varying levels of vancomycin resistance and being highly prevalent among neonatal patients in single ICU, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 2012 S Mak A, Miller MA, Chong G, Monczak Y, Comparison of PCR and Culture for Screening of Vancomycin-Resistant Enterococci: Highly Disparate Results for vana and vanb, Journal OF Clinical Microbiology, 2009; 47(12) S European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, 2014; Version 4.0 S , OUH, Qwalivare, IRT Enterococcus, version , forskrift, [ ] 23. Mackay IM, Real-time PCR in the microbiology laboratory, Clin Microbiol Infect, 2004 S Thuesen AH, Resistensbestemmelse af Enterococcus med VITEK2 og agardiffusion med Rosco Neo-Sensitabs, Oxoiddisk og E-test, Antimicrobial Susceptibility Testing of Enterococcus with VITEK2 and Agar Diffusion with Rosco Neo-Sensitabs, Oxoid disc and E-test, Professionsbachelorprojekt Modul 14, University College Lillebælt, Dallal S, Real time PCR, Modul 13 Intern klinisk prøve, Bioanalytikeruddannelsen University College Lillebælt, 2014 S Buckingham L, Molecular Diagnostics, Fundamentals, Methods & Clinical Applications, 2. udgave, 2012, F.A. Davis Companys S Side 34 af 49

36 27. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al., Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing, Clinical Microbiology Reviews, 2006 S , , OUH, EUCAST-Aflæs terapeutisk resistens, forskrift, [ ] 29. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance, 2013; Version 1.0 S. 32, Citron DM, Ostovari MI, Karlsson A, Goldstein EJC, Evaluation of the E test for Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (10) S Baker CN, Stocker SA, Culver DH, Thornsberry C, Comparison of the E test to Agar Dilution, Broth Microdilution, and Agar Diffusion Susceptibility Testing Techniques by Using a Special Challenge Set of Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (3) S Schulz JE, Sahm DF, Reliability of the E test for Detection of Ampicillin, Vancomycin, and High-Level Aminoglycoside Resistance in Enterococcus spp., Journal Of Clinical Microbiology, 1993, 31 (12) S. 3336, Schuetz AN, Antimicrobial Resistance and Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Resistance, 2014 S Biomerieux, E-test for on-scale MIC determination Reading Guide, [ ], Lokaliseret på: Ryu H, Henson M, Elk M, Toledo-Hernandez C, Griffith J, Blackwood D, et al., Development of Quantitative PCR Assays Targeting the 16s rrna Genes of Enterococcus Side 35 af 49

37 spp. and Their Application to the Identification of Enterococccus Species in Enviromental Samples, Applied ans Enviromental Microbiology, 2013; 79 (01) S. 198, Fang H, Ohlsson AK, Jiang GX, Ullberg M, Screening for vancomycin-resistant enterococci: an efficient and economical laboratory-developed test, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012 S Bendsen T, Noter i statistisk, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen, , [ ], Lokaliseret på: Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged S, Nissen PH, Lyngbyes laboratoriemedicin, 2. udgave, 2010, Nyt Nordisk Forlag, Arnold Busck S De Moura TM, Cassenego APV, Campos FS, Ribeiro AML, Franco AC, d Azevedo PA, et al., Detection of vanc 1 gene transcription in vancomycin-susceptible Enterococcus faecalis, Mem Inst Oswaldo Cruz, 2013; 108 (4) S Kariyama R, Mitsuhata R, Chow JW, Clewell DB, Kumon H, Simple and Reliable Multiplex PCR Assay for Surveillance Isolates of Vancomycin-Resistant Enterococci, Journal of Clinical Microbiology, 2000; 38 (8) S Side 36 af 49

38 Bilag Bilag 1 Svar fra elektronisk spørgeundersøgelse Spørgsmål, der er sendt ud til KMAer i Danmark: Hej Vi er en bachelor gruppe på KMA, OUH, der undersøger om E-test og ulden/ikke ulden fænomenet kan valideres til detektion af vancomycinresistente Enterococcus ud fra en opsætning af real time PCR. I denne henseende synes vi, at det vil være interessant, at vide, hvordan diverse Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark detekterer vancomycinresistente Enterococcus. Vi håber at høre fra dig/jer og på forhånd mange tak. Venlig Hilsen Reem Kazem, Sara Dallal, Asmaa Dallal, Ditte Bertelsen, Laura Pedersen og Mette Erichsen. Bioanalytikeruddannelsen M14, UCL Blangstedgårdsvej, Odense. Sygehus Bodil Hansen (boh@regionsjaelland.dk) Slagelse/Nykøbing Falster sygehus Helga Schumacher Mikrobiologisk afdeling Midt- Vest Hospitalsenheden Midt Regionshospitalet Viborg Svar Vi laver disc - diffusion med Vanco og hvis zonen er <12 eller zonekanten er uskarp udføres E-test for Vancomycin. Vancomycinreststente enterococcer sendes til SSI til overvågning. På KMA Midt-Vest er vi efter nylig foretaget analyse af metoder til påvisning af VRE gået over til følgende metodologi: Urinanalyser: der anvendes Vitek 2 Alt andet, hvor resistens er indiceret: der anvendes diskdiffusion, hvor man tolker på zonekanten. Er denne ulden svares bakterien som Resistent og isolatet sendes til SSI. Vi laver ikke konfrimatorisk MIC-us. da en sådan er mindre følsom end tolkning af zonekant. Kirsten Inger Paulsen Afsnitsledende bioanalytiker kip@rn.dk I Aalborg undersøger vi først for vancomycin med diskdiffusion (Mueller Hinton agar med tablet fra Rosco). Hvis zonen er diffus eller zonestørrelsen for lille laver vi Etest (BioMerieux). Finder vi stammen resistent sender vi den til SSI til konfirmatorisk test. Side 37 af 49

39 Ålborg Anne Bonde Jensen Bioanalytikerunderviser Region Sjælland Sygehus Syd Klinisk Mikrobiologisk afdeling (3.3.49) Vancomycinresistente Enterokokker (VRE) - Rektalpodning eller fæces 3.3 Udsåning Dag 0: Opformering i opformeringsbouillon (BHI med Vancomycin 4 mg/l og 60 mg/l Aztreonam) Rektalpodning: Slagelse: prøverøret rystes, væsken fra E-swab hældes over i opformeringsboullionen og låget skrues på. Nykøbing F.: Kulpodepinden overføres i opformeringsbouillonen og låget skrues på. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i prøven og prøvemateriale svarende til ca. ærtestørrelse overføres til opformeringsbouillonen. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 1 døgn. 3.4 Aflæsning og sekundær udsåning: Dag 1: Udsåning på chromogen plade (chromid VRE, biomérieux). Rektalpodning: Slagelse: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Nykøbing F.: Ved hjælp af podepinden røres opformeringsbouillonen om og der afsættes materiale i 1. strøg på chromogen plade. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Med en steril podenål foretages en trekantspredning. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 2 døgn. 3.5 Resultatvurdering og svarafgivelse: Marianne Kragh Thomsen, overlæge Dag 2 og 3: Aflæsning 1. Ved manglende vækst efter 2 døgns inkubation svares ud med stempeltekst: "Ingen vækst af Vancomycinresistente Enterokokker (VRE)". 2. Ved vækst af VRE-lignende kolonier (E. faecium: violette, E. faecalis: blågrønlige kolonier) udføres identifikation med MALDI- TOF. 3. Ved førstegangsfund af VRE hos patienten bekræftes resultatet med E-test for vancomycin. Der laves ikke yderligere resistensbestemmelse. 4. Ved vækst af vancomycinresistente enterokokker svares prøven ud med: "Vækst af E. faecium" eller "Vækst af E. faecalis" uden resistensbestemmelse, og med stempeltekst: Vækst af Vancomycinresistente Enterokokker (VRE)". 5. VRE-positive prøver skal flagmarkeres (VRE), fryses, sendes til SSI (Annette Hammerum) og sendes som OBS post til LAB-2 læge. KMA, Skejby undersøger vancomycinresistens hos enterokokker ved diskdiffussion (EUCAST) og real time PCR. Er zonen < 12 mm eller er der Side 38 af 49

40 Aarhus Universitetshospital Tel Fax en ulden zonekant (uanset zonestørrelse) udføre vi PCR. Tabel 1 Svar fra spørgeundersøgelse, der viser, hvilke metoder forskellige KMA er i Danmark anvender til detektion af VRE. Bilag 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr E. faecalis E. faecium E. faecalis E. durans E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. avium E. faecalis E. faecium E. faecium E. faecium E. casseliflavus E. faecium E. avium E. raffinosus E. gallinarum E. gallinarum E. faecalis E. avium E. faecalis E. faecium E. faecium E. raffinosus E. avium E. faecium E. casselflavus E. avium E. faecium E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecium E. faecium E. durans E. casseliflavus Side 39 af 49

41 E. faecium E. faecium E. durans E. gilvus E. faecium E. faecium E. dispar E. casseliflavus E. faecium E. faecalis E. casseliflavus E. casseliflavus E. casseliflavus E. durans E. avium E. casseliflavus E. faecium E. faecalis E. mundtii E. avium E. faecium E. pseudoavium E. gallinarum E. faecalis E. durans E. gallinarum E. durans E. durans E. raffinosus Tabel 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer. Prøve nr. 34 er udgået. Side 40 af 49

42 Bilag 3 Eksempel på et PCR-pladelayout Figur 1 Eksempel på et PCR-pladelayout Bilag 4 Tabeller over ct-værdier, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af forskellige assays In-house 1 vana-assay In-house 2 vana-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) 16,44 16,42 16,43 18,56 18,58 18,57 (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) 15,42 15,35 15,39 17,06 17,13 17,10 (B ) E. faecium vanb 38,11 37,50 37, (N-AST 4) E. faecalis vanb (N-AST 9) E. faecium vanb (N-AST 5) E. gallinarum vanc (G ATCC ) E. casseliflavus vanc (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 3 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vana assays. Side 41 af 49

43 In-house 1 vanb-assay In-house 2 vanb-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) (B ) E. faecium vanb 22,11 20,67 21,39 21,48 20,38 20,93 (N-AST 4) E. faecalis vanb1 19,41 19,13 19,27 19,72 18,10 18,91 (N-AST 9) E. faecium vanb2 25,40 25,29 25,39 25,82 24,48 25,15 (N-AST 5) E. gallinarum vanc (G ATCC ) E. casseliflavus vanc (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 4 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanb assays. In-house 1 vanc1-assay In-house 1 vanc2/3-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) (B ) E. faecium vanb (N-AST 4) E. faecalis vanb (N-AST 9) E. faecium vanb (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 21,48 21,18 21, (G ATCC ) E. casseliflavus vanc ,28 21,36 21,32 (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 5 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanc assays. Til udregning af middelværdien er følgende formel anvendt: x x x x x n n Side 42 af 49

44 Overføres ovenstående på de opnåede resultater fås følgende: ct 1 ct x 2 2 Nedenstående er eksempel på beregning af middelværdi med udgangspunkt i en dobbeltbestemmelse opnået ved anvendelse af vanc1-assay (tabel 5): x 21,48 21,18 21,33 2 Side 43 af 49

45 Bilag 5 Rådata Figur 2 Skemaet viser en oversigt over de indsamlede data fra de samme 64 Enterococcus-stammer analyseret med E-test, ulden/ikke ulden og Real time PCR. Resultaterne fra E-test og ulden/ikke ulden holdes op mod resultaterne fra real time PCR som en golden standard, hvorfra der er bedømt om de er falsk Side 44 af 49

46 negative (FN), sandt negative (SN), sandt positive (SP) eller falsk positive (FP), som ses i de 8 sidste kolonner under tolkning. Dette er gjort for at kunne undersøge E-test og ulden/ikke ulden som anvendes i dagligt brug. U=undetected, der er ikke detekteret et van-gen for den pågældende stamme. Bilag 6 Udregninger til tabel 3 Til udregning af sensitivitet og specificitet er følgende formler anvendt: Sensitivitet = Antal sande positive Antal sande positive + antal falske negative 100 % Specificitet = Antal sande negative Antal sande neagtive + antal falske positive 100 % Følgende skema er brugt som skabelon til at sætte tal ind i, for overblikkets skyld: Metode Resistent Sensitiv I alt Positive SP FP SP + FP Negative FN SN FN + SN I alt SP + FN FP + SN Total E-test Med E. casseliflavus og E. gallinarum: E-test (Med E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive Negative I alt Sensitivitet = *100% 41,17647% 41% Specificitet = *100% 100% 49 0 Ulden/ikke ulden fænomenet Med E. casseliflavus og E. gallinarum: Ulden/ikke ulden fænomenet (Med E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive Negative I alt Sensitivitet = *100% 23,52941% 24% 4 13 Side 45 af 49

47 39 Specificitet = *100% 79,59184% 80% E-test Uden E. casseliflavus og E. gallinarum: E-test (Uden E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive Negative I alt Sensitivitet = *100% 100% Specificitet = *100% 100% 49 0 Ulden/ikke ulden fænomenet Uden E. casseliflavus og E. gallinarum: Ulden/ikke ulden fænomenet (Uden E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive Negative I alt Sensitivitet = *100% 100% Specificitet = *79,59184% 80% Side 46 af 49

48 Bilag 7 ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnået ved undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer vha. real time PCR Side 47 af 49

49 Side 48 af 49

50 Side 49 af 49