artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit håndbog

Januar 2015 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit håndbog 24 (katalognr. 4559263) Version 1 96 (katalognr. 4559265) Kvalitativ in vitro-diagnostik Til anvendelse med Rotor-Gene Q-instrumenter 4559263, 4559265 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R6 1046969DA Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN er den førende producent af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og detektion af indholdet i enhver form for biologisk prøve. Vores avancerede kvalitetsprodukter og -service sikrer vellykkede analyser fra prøvetagning til resultat. QIAGEN sætter standarden i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser MikroRNA-forskning og RNAi Automatisering af prøve- og analyseteknologier Vores mission er at give kunden redskaberne til at opnå stor succes og gennembrud. Læs mere på www.qiagen.com.

Indhold Indhold af kittet 5 Symbolforklaring 5 Opbevaring 6 Anvendelse 6 Anvendelsesbegrænsninger 6 Advarsler og forholdsregler 8 Kvalitetskontrol 8 Indledning 9 Princip 9 Information om patogener 9 Performance-egenskaber 10 Udstyr og reagenser der ikke medfølger 21 Vigtige bemærkninger 22 Generelle forholdsregler 22 Prøvetagning, opbevaring og transport 22 Isolering af DNA 25 Intern kontrol 30 Protokol: PCR- og dataanalyse 33 Fejlfinding 42 Litteratur 45 Bestilling 46 4 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Indhold af kittet artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24) (96) Katalognr. 4559263 4559265 Antal reaktioner 24 96 Blå C. trachomatis Plus RG Master 2 x 12 reaktioner 8 x 12 reaktioner Gul Rød C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol* C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control 400 µl 400 µl 200 µl 200 µl Grøn C. trachomatis Plus RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Hvid Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit håndbog (engelsk) 1 1 * Magnesiumopløsning. Intern kontrol. Symbolforklaring <N> Indeholder reagenser nok til <N> test Anvendes inden Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialenummer Komponenter artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 5

Indhold Nummer Globalt varenummer Temperaturbegrænsninger Producent Læs brugsanvisningen Forsigtig Opbevaring Komponenterne i artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit skal opbevares ved -15 til -30 C og er stabile indtil udløbsdatoen på etiketten. Gentagen optøning og nedfrysning (>2 x) bør undgås, da dette kan reducere analysens sensitivitet. Hvis reagenserne kun skal anvendes med mellemrum, bør de nedfryses i afmålte portioner. Opbevaring ved 2-8 C bør ikke overstige 5 timer. Anvendelse artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit er en in vitro nukleinsyre-amplifikationstest til detektion af C. trachomatis DNA i humant urin, podning (øje, endocervikal eller uretral) eller sædprøver. Dette diagnostiske testkit anvender polymerasekædereaktion (PCR) og er fremstillet til anvendelse med Rotor-Gene Q-instrumenter. Anvendelsesbegrænsninger Alle reagenser må udelukkende anvendes til in vitro-diagnostik. Produktet må kun anvendes af ansatte, der specielt er instrueret og uddannet i de pågældende in vitro-diagnostiske procedurer. Det er nødvendigt at følge brugervejledningen nøje for at få optimale PCRresultater. Vær opmærksom på de udløbsdatoer, der er trykt på alle komponenters æsker og etiketter. Komponenter, der er udløbet, må ikke anvendes. 6 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Selv om det er sjældent, kan mutationer i de stærkt konserverede områder af det virale genom, der dækkes af kittets primere og/eller probe, resultere i underkvantitering eller manglende evne til at detektere tilstedeværelsen af virusset i disse tilfælde. Analysedesignets gyldighed og ydeevne revideres med jævne mellemrum. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 7

Advarsler og forholdsregler Bær altid egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller under arbejdet med kemikalier. Der er flere oplysninger på de relevante Safety Data Sheets (SDS) (sikkerhedsdatablade). Sikkerhedsdatabladene ligger online i et kompakt pdf-format på www.qiagen.com/safety, hvor du kan finde, se og udskrive SDS et for hvert QIAGEN -kit og kittenes komponenter. Affald fra prøver og analyser skal bortskaffes i henhold til lokale bestemmelser vedrørende sikkerhed. Se i det pågældende kits håndbog for at få sikkerhedsoplysninger om det oprensningskit, der bruges. For sikkerhedsinformation vedrørende instrumenterne henvises til det pågældende instruments brugervejledning. Kvalitetskontrol Hvert lot med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit testes i overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede system for kvalitetskontrol mod forudbestemte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. 8 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Indledning artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit er et brugsklart system til detektion af C. trachomatis DNA ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumenter. C. trachomatis Plus RG Master indeholder reagenser og enzymer til specifik amplifikation af en 106 bp-region af C. trachomatis genomet og af en 111 bp-region af det kryptiske plasmid i C. trachomatis. Reagenserne muliggør også specifik detektion af begge amplikoner i fluorescens-kanalen Cycling Green på Rotor-Gene Q MDx, Rotor- Gene Q og Rotor-Gene 6000, eller Cycling A.FAM på Rotor-Gene 3000. Derudover indeholder artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit et andet heterologt amplifikationssystem til at identificere potentiel hæmning af PCR. Dette detekteres som en intern kontrol (IC) i fluorescens-kanalen Cycling Yellow på Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q og Rotor-Gene 6000, eller Cycling A.JOE på Rotor-Gene 3000. Detektionsgrænsen for analytisk PCR af C. trachomatis (se Analytisk sensitivitet side 10) er ikke reduceret. En ekstern positiv kontrol (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control) medfølger. Princip Detektion af patogener ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) er baseret på amplifikation af specifikke regioner af det patogene genom. I Real Time PCR detekteres det amplificerede produkt ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Disse kobler sig normalt til oligonukleotidprober, der specifikt binder sig til det amplificerede produkt. Monitorering af fluorescensintensiteten under PCRkørslen (dvs. i realtid) muliggør detektion og kvantifikation af det akkumulerende produkt, uden at reaktionsrørene skal genåbnes efter PCRkørslen.* Information om patogener Bakterier fra genus Chlamydia (C.) er af stor epidemiologisk vigtighed. Chlamydia trachomatis (serovar D-L) er en af de hyppigste årsager til seksuelt overførte sygdomme i verden. 16 serovarer fra C. trachomatis forårsager forskellige sygdomme. Serovar A-C medfører trakom en kronisk, recidiverende sygdom i conjunctiva og cornea som findes i troperne. Serovar D-K medfører seksuelt overførte urogenitale infektioner og øjeninfektioner samt infektioner hos nyfødte efter perinatal smitte. Serovar LGV I III medfører lymphogranuloma venereum, en seksuelt overført sygdom, der hovedsageligt findes i troperne. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 9

Trakom forekommer næsten udelukkende i tropiske lande med utilstrækkelige hygiejneforhold. På verdensplan er det den mest udbredte øjensygdom, og næstefter katarakt den næsthyppigste årsag til blindhed. Det estimeres, at ca. 150 millioner mennesker er inficerede, og af disse er ca. seks millioner blevet blinde. I de industrialiserede lande er chlamydia den hyppigste bakterielle årsag til urogenitale infektioner. I Tyskland estimeres antallet af nye genitale infektioner til 300.000 om året. Forekomsten af lymphogranuloma venereum (lymphogranuloma inguinale, Durand-Nicolas-Favre sygdom) falder på verdensplan. Denne seksuelt overførte sygdom er imidlertid stadig endemisk i Asien, Afrika, Sydamerika og dele af Caribien. Performance-egenskaber Analytisk sensitivitet Den analytiske detektionsgrænse samt den analytiske detektionsgrænse under hensyntagen til oprensning (sensitivitetsgrænser) blev vurderet for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Den analytiske detektionsgrænse under hensyntagen til oprensning bestemmes vha. C. trachomatis positive, kliniske prøver i kombination med en speciel ekstraktionsmetode. I modsætning hertil bestemmes den analytiske detektionsgrænse uafhængigt af den valgte ekstraktionsmetode med serovarer af kendt koncentration. Den analytiske sensitivitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit blev bestemt ved at opsætte en C. trachomatis serovar E fortyndingsserie fra 10 til 0,003 og fra 6,6 til nominelt 0,0006 C. trachomatis bakterie genom-ækvivalenter/µl (be/µl) og analyseret på hhv. Rotor-Gene 6000 og Rotor-Gene 3000 sammen med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Analyse blev udført på 3 forskellige dage på 8 replikater. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probitanalysen på Rotor-Gene 6000 er vist i figur 1. Den analytiske detektionsgrænse for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sammen med Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 og Rotor-Gene 3000 er hhv. 0,04 be/µl (p = 0,05) og 0,2 be/µl (p = 0,05). Det betyder, at der er 95 % sandsynlighed for, at 0,04 be/µl eller 0,2 be/µl vil blive detekteret. 10 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Figur 1. Probitanalyse: C. trachomatis (Rotor-Gene 6000). Analytisk sensitivitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene 6000. Den analytiske sensitivitet under hensyntagen til oprensning (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene instrumenter blev bestemt vha. en fortyndingsserie af C. trachomatis serovar E fra 6,6 til nominelt 0,0006 C. trachomatis be/µl tilsat kliniske podningsprøver. Disse gennemgik DNA-ekstraktion vha. QIAamp DNA Mini Kit (ekstraktionsvolumen: 200 µl, elueringsvolumen: 100 µl). Hver af de 8 fortyndinger blev analyseret med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på 3 forskellige dage på 8 replikater. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probitanalysen er vist i figur 2. Den analytiske detektionsgrænse under hensyntagen til oprensning af artus C. trachomatis RG Plus PCR Kit sammen med Rotor-Gene 3000 er 300 be/ml (p = 0,05). Det betyder, at der er 95 % sandsynlighed for, at 300 be/ml vil blive detekteret. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 11

Figur 2. Probitanalyse: C. trachomatis (Rotor-Gene 3000). Analytisk sensitivitet under hensyntagen til oprensning (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene 3000. For den analytiske sensitivitet under hensyntagen til oprensning med QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor- Gene instrumenter, må en sensitivitet, der kan sammenlignes med den sensitivitet som opnås med QIAamp DNA Mini Kit, antages, eftersom tabet efter oprensning med begge ekstraktionsmetoder ligger på mellem 0,3 og 1,8 %. Specificitet Specificiteten af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsforhold. Primerne og proberne blev kontrolleret for mulig homologi med alle publicerede sekvenser i genbanker ved hjælp af sekvenssammenligning. Sporbarheden af alle relevante serovarer er derfor blevet sikret med en databasetilpasning og en PCR-kørsel på Rotor-Gene-instrumenter med følgende serovarer (se tabel 1). Derudover blev specificiteten valideret med 30 forskellige urinprøver, 100 podningsprøver og 30 sædprøver, der var negative for C. trachomatis. Disse genererede ikke nogen signaler med de primere og prober, der var specifikke for C. trachomatis, og som er inkluderet i C. trachomatis Plus RG Master. 12 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

En potentiel krydsreaktivitet for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit blev testet ved hjælp af den kontrolgruppe, der er anført i tabel 2. Ingen af de testede patogener har været reaktive. Tabel 1. Analyse af relevante serovarers specificitet Chlamydia Serovar Kilde C. trachomatis A ATCC* (VR-571B) C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontrol (Cycling Yellow eller A.JOE)) + + C. trachomatis B C. trachomatis Ba C. trachomatis C C. trachomatis D C. trachomatis E C. trachomatis F C. trachomatis G C. trachomatis H C. trachomatis I C. trachomatis J C. trachomatis K ATCC (VR-573) ATCC (VR-347, præparat 1) ATCC (VR-572) ATCC (VR-885) ATCC (VR-348B) ATCC (VR-346) ATCC (VR-878) ATCC (VR-879) ATCC (VR-880) ATCC (VR-886) ATCC (VR-887) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 13

* American Type Culture Collection. Tabellen fortsættes på næste side Tabel 1. Fortsat Chlamydia Serovar Kilde C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontrol (Cycling Yellow eller A.JOE)) C. trachomatis LGV I C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV III ATCC (VR-901B) ATCC (VR-902B) ATCC (VR-577) ATCC (VR-903) + + + + + + + + Tabel 2. Testning af kittets specificitet med potentielt krydsreaktive patogener Kontrolgruppe C. trachomatis (Cycling Green eller Cycling A.FAM) Intern kontrol (Cycling Yellow eller Cycling A.JOE) Acinetobacter spp. + Bordetella pertussis + Candida albicans + Candida glabrata + Chlamydia pneumoniae + Chlamydia psittaci + Enterobacter cloacae + Enterococus faecalis + Escherichia coli + 14 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Gardnerella vaginalis + Tabellen fortsættes på næste side Tabel 2. Fortsat Kontrolgruppe C. trachomatis (Cycling Green eller Cycling A.FAM) Intern kontrol (Cycling Yellow eller Cycling A.JOE) Haemophilus parainfluenzae + Klebsiella pneumoniae + Neisseria gonorrhoeae + Proteus mirabilis + Proteus vulgaris + Salmonella enteritides + Salmonella typhimurium + Staphylococcus aureus + Streptococcus pneumoniae + Streptococcus pyogenes + Herpes simplex virus 1 og 2 + Præcision Præcisionsdataene for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit er blevet indsamlet ved hjælp af Rotor-Gene-instrumenter og gør det muligt at bestemme analysens totale varians. Den totale varians består af variabilitet inden for samme analyse (variabilitet af flere resultater af prøver med samme koncentration i ét eksperiment), variabilitet mellem analyser (variabilitet af flere resultater af analysen, der genereres på forskellige instrumenter af samme type af forskellige operatører på ét laboratorium) og variabilitet mellem partier (variabilitet af flere resultater af analysen med anvendelse af forskellige partier). De indhentede data blev brugt til at bestemme standardafvigelse, varians og variationskoefficient for den patogenspecifikke PCR og PCR af den interne kontrol. Præcisionsdata for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit blev indsamlet vha. C. trachomatis serovar E i en koncentration, der er næsten tre gange cut off- artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 15

værdien (2,1 be/µl under hensyntagen til oprensningen, 0,66 be/µl uden hensyn til oprensningen). Analyse blev udført med 8 replikater. Præcisionsdataene blev beregnet baseret på C T -værdierne i amplifikationskurverne (C T : tærskelcyklus, se tabel 3). Baseret på disse resultater er den overordnede statistiske spredning for enhver given prøve af nævnte koncentration 2,45 % (C T ) og 1,87 % (C T ) under hensyntagen til oprensning (QIAamp DNA Mini Kit, tabel 4), og 3,34 % (C T ) og 2,13 % (C T ) under hensyntagen til oprensning (QIAamp DNA Mini Kit) for detektion af den interne kontrol. Disse værdier er baseret på totaliteten af alle enkelte værdier af de bestemte variabiliteter. Tabel 3. Præcisionsdata på basis af C T -værdierne Variabilitet inden for samme analyse: C. trachomatis serovar E (0,66 be/µl) Variabilitet inden for samme analyse: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: C. trachomatis serovar E (0,66 be/µl) Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem partier: C. trachomatis serovar E (0,66 be/µl) Variabilitet mellem partier: Intern kontrol Total varians: C. trachomatis serovar E (0,66 be/µl) Total varians: Intern kontrol Varians Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 0,38 0,14 1,23 0,05 0,01 0,36 0,58 0,33 1,90 1,08 1,18 4,80 0,46 0,21 1,47 0,39 0,15 1,74 0,64 0,41 2,45 0,85 0,72 3,34 16 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Tabel 4. Præcisionsdata på basis af C T -værdier under hensyntagen til oprensning med QIAamp DNA Mini Kit Variabilitet inden for samme analyse: C. trachomatis serovar E (2,1 be/µl) Variabilitet inden for samme analyse: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: C. trachomatis serovar E (2,1 be/µl) Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem partier: C. trachomatis serovar E (2,1 be/µl) Variabilitet mellem partier: Intern kontrol Total varians: C. trachomatis serovar E (2,1 be/µl) Total varians: Intern kontrol Varians Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 0,33 0,11 1,06 0,27 0,07 1,12 0,49 0,11 1,09 0,49 0,24 2,07 0,58 0,34 1,83 0,31 0,09 1,33 0,58 0,34 1,87 0,50 0,25 2,13 Robusthed Verifikationen af robustheden gør det muligt at bestemme den samlede fejlfrekvens for artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. 100 podningsprøver, der var negative for C. trachomatis, 30 negative urinprøver og 30 negative sædprøver blev tilsat 2,1 be/µl elueringsvolumen af C. trachomatis kontrol-dna (ca. tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion med QIAamp DNA Mini Kit (sæd- og podningsprøver) og QIAamp Viral RNA Mini Kit (urinprøver) blev disse prøver analyseret med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. For alle C. trachomatis-prøver var fejlfrekvensen 0 %. Derudover blev robustheden af den interne kontrol vurderet vha. oprensning og analyse af 100 podningsprøver, 30 urinprøver og artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 17

30 sædprøver, der alle var negative for C. trachomatis. Den samlede fejlfrekvens var 0 %. Hæmning blev ikke observeret. Derfor er robustheden af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 99 %. Reproducerbarhed Data for reproducerbarhed muliggør en regelmæssig vurdering af ydeevnen af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit samt en sammenligning af effektiviteten med andre produkter. Disse data indhentes gennem deltagelse i etablerede præstationsprogrammer. Diagnostisk evaluering artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit blev evalueret i 4 studier. Diagnostisk evaluering 1: Sammenligning af podnings- og urinprøver med COBAS Amplicor CT/NG Assay Ved sammenligningen mellem artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit og COBAS Amplicor CT/NG Assay blev 107 retrospektive podnings- og urinprøver testet. I dette studie var den diagnostiske sensitivitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 98 %. Der forekom ingen hæmning. Den diagnostiske specificitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 %. Den afvigende prøve (tabel 5) havde testet positivt med 2 C. trachomatis detektionssystemer i tidligere test. Den ene test blev kørt på LightCycler 2.0 Instrument og den anden blev testet med COBAS Amplicor CT/NG Assay (artus versus COBAS Amplicor). Tabet af koncentration i prøverne pga. opbevaring medfører en ændring i detektionsgrænsen for begge analyser. Derfor forekom de uoverensstemmende resultater af begge prøver ikke pga. uspecificeret amplifikation eller detektion (hverken for artus PCR kits eller COBAS Amplicor Assay). Tabel 5. Resultater af det komparative valideringsstudie 1 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 47 1 48 1 58 59 18 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Diagnostisk evaluering 2: Sammenligning af sædprøver med Cobas Amplicor CT/NG Assay 65 prospektive sædprøver blev testet ved sammenligning mellem artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit og COBAS Amplicor CT/NG Assay. For 65 testede, prospektive sædprøver var der 100 % korrelation af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sammenlignet med COBAS Amplicor Assay. Frekvensen af hæmning var 0 %. Den diagnostiske sensitivitet var 100 %. Den diagnostiske specificitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 % (tabel 6). Tabel 6. Resultater af det komparative valideringsstudie 2 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 16 0 16 0 49 49 Diagnostisk evaluering 3: Sammenligning af podnings- og urinprøver med LCx og Aptima Combo 2 Assay 234 retrospektive podnings- og urinprøver blev testet ved sammenligning af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit med en LCR (ligasekædereaktion, LCx CT Assay) og en TMA (transkriptionsmedieret amplifikation, APTIMA Combo 2 Assay). I det studie var korrelationen af LCR (LCx CT Assay) og Aptima Combo 2 Assay med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 98 % for retrospektive podnings- og urinprøver. Den diagnostiske specificitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 99 % (tabel 7). Tabel 7. Resultater af det komparative valideringsstudie 3 LCx/Aptima Combo 2 + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 104 1 105 2 127 129 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 19

Diagnostisk evaluering 4: Analyse af kliniske øjenpodninger 100 tidligere analyserede øjenpodninger blev testet retrospektivt med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. For de 100 testede retrospektive øjenpodninger var den diagnostiske sensitivitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 100 %. Den diagnostiske specificitet af artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 % (tabel 8). Tabel 8. Resultater af det komparative valideringsstudie 4 Forventet resultat + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 5 0 5 0 95 95 20 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Udstyr og reagenser der ikke medfølger Bær altid egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller under arbejdet med kemikalier. Der er flere oplysninger på de relevante Safety Data Sheets (SDS) (sikkerhedsdatablade), som kan fås hos produktleverandørerne. DNA isolationskit (se Isolering af DNA, side 25) Pipetter (justerbare)* Sterile pipettespidser med filtre Vortex-mixer* Bordcentrifuge* med rotor til 2 ml reaktionsrør Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene instrument* med fluorescens-kanaler til Cycling Green og Cycling Yellow eller med fluorescens-kanaler til Cycling A.FAM og Cycling A.JOE Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q software version 1.7.94 (Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94, Rotor-Gene 3000 software version 6.0.23) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml, til anvendelse med rotor med 72 brønde (katalognr. 981103 eller 981106) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit er ikke valideret til anvendelse med Rotor-Gene rotor med 36 brønde Køleblok (Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes, katalognr. 9018901, eller Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes, katalognr. 9018905) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 21

Vigtige bemærkninger Generelle forholdsregler Vær altid opmærksom på følgende: Anvend sterile pipettespidser med filtre. Positive materialer (prøver, positive kontroller og amplikoner) skal opbevares og ekstraheres separat fra alle andre reagenser og tilsættes til reaktionsblandingen på en fysisk adskilt facilitet. Optø alle komponenter grundigt ved stuetemperatur (15-25 C) inden analysen påbegyndes. Når komponenterne er optøet, skal de blandes (ved at pipettere op og ned eller anvende pulserende vortex) og centrifugeres kort. Arbejd hurtigt og hold komponenterne på is eller i køleblokken (isætningsblok med 72/96 brønde). Prøvetagning, opbevaring og transport Note: Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøst materiale. Kun følgende prøvematerialer er tilladte, og følgende regler og særlige instrukser for disse vedrørende prøvetagning, transport og opbevaring skal overholdes nøje. Urin Øjenpodning, endocervikal podning og uretralpodning Sædprøve Prøverne skal transporteres så hurtigt som muligt for at sikre høj prøvekvalitet. Prøverne skal transporteres under de angivne temperaturforhold. Urinprøver Note: Patienten skal instrueres om ikke at urinere mindst 2 timer inden prøvetagning. 5-30 ml førstestråleurin opsamles i en ren polypropylenbeholder uden konserveringsmidler. Sæt låg og etiket på prøvebeholderen. Note: Urinprøver, der er opsamlet i beholdere med konserveringsmidler, må ikke anvendes. Hvis analyse af urinprøverne kan udføres inden for 24 timer, kan prøverne opbevares ved stuetemperatur (19-23 C). Prøverne skal opbevares ved 2-8 C i køleskab, hvis analyse udføres inden for 7 dage. Hvis urinprøverne ikke kan 22 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

analyseres inden for 7 dage, skal de opbevares ved -20 C eller derunder i højst 30 dage. Urinprøverne skal opbevares ved 2-8 C i køleskab, indtil de afsendes, og skal transporteres ifølge lokale og nationale bestemmelser for transport af patogene materialer. * Podningsprøver Note: Anvend følgende materialer til prøvetagning og transport af øjenpodninger, endocervikale podninger og uretralpodninger. Note: Anvend kun plastikvatpinde med spidser af Dacron, rayon eller kalcium-alginat. Vatpinde af aluminium eller træ må ikke anvendes. Øjenpodninger, endocervikale podninger og utretralpodninger kan tages og transporteres i 1-3 ml af følgende medier. digene Female Swab Specimen Collection Kit (QIAGEN, katalognr. 5123-1220) digene Cervical Sampler (QIAGEN, katalognr. 5122-1220) AMPLICOR STM (transportmedium til prøver, Roche, Inc.) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) M4 CTM (MicroTest TM, Thermo Fischer Scientific) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ChlamTrans CTM (Bartels, Trinity Biotech) Mastazyme Chlamydia Swab Set (MAST DIAGNOSTICA) Mastazyme Chlamydia Transport Medium (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech) Lad vatpinden ligge i dyrkningsmediet til transport. Sæt låg og etiket på prøvebeholderne. Overhold nøje anførte instrukser for opbevaring og transport. Prøverne skal opbevares ved 2-8 C. (Hvis podningsprøverne sendes til et diagnostisk laboratorium, skal de transporteres så hurtigt som muligt efter prøvetagning og ifølge laboratoriets instrukser for transport af chlamydiaprøver.) * International Air Transport Association (IATA). Reglement for farligt gods. Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 23

Hvis podningsprøverne ikke analyseres direkte efter modtagelse på laboratoriet, skal de opbevares ved 2-8 C og analyseres inden for 7 dage. Hvis prøverne ikke analyseres inden for 7 dage efter podning, skal de opbevares ved -15 til -30 C eller derunder og analyseres inden for 30 dage efter podning. Podningsprøver skal transporteres i afkølet tilstand. Podningsprøver skal sendes til laboratoriet så hurtigt som muligt efter podning ifølge laboratoriets instrukser for transport og nedkøling. Prøverne skal transporteres i overensstemmelse med lokale og nationale bestemmelser for transport af patogene materialer. * Sædprøver Note: Der skal være 2 til 4 dages seksuel abstinens inden sædopsamling. Note: Sædprøven skal opsamles samme dag, som den sendes til laboratoriet. Humane sædprøver kan ved brug af almindelige laboratorieprocedurer og -praksis opsamles med en af følgende metoder. Ved masturbation direkte ned i en steril, ren og tør beholder. Sørg for at hele prøven opsamles i beholderen. Hvis en del af prøven går tabt under opsamling, skal det noteres i protokollen for prøvetagning. Ved masturbation med kondom. Efter ejakulation tages kondomet af og lukkes til med twist-bånd i toppen for at holde sæden inden i kondomet. Læg kondomet i en transportpose. Note: Brug kun beholdere uden konserveringsmidler og kondomer uden spermicid eller kunstige stoffer (f.eks. farvestoffer). Hold sædprøverne i 30 til 45 minutter i mørke (f.eks. i en skuffe eller et skab), indtil de er blevet flydende. Nedfrys sædprøverne direkte efter, de er blevet flydende, i cryorør ved -20 C eller derunder. Hvis en sædprøve ikke kan blive analyseret umiddelbart efter modtagelse på laboratoriet, skal den opbevares ved -20 C eller derunder og analyseres inden for 30 dage efter opsamling. Hvis sædprøven skal sendes til et diagnostisk laboratorium, skal den sendes den samme dag, som den er opsamlet, ifølge laboratoriets instrukser for transport af chlamydiaprøver. Derudover skal sædprøve sendes i afkølet tilstand. Prøverne skal transporteres i overensstemmelse med lokale og nationale bestemmelser for transport af patogene materialer. * International Air Transport Association (IATA). Reglement for farligt gods. International Air Transport Association (IATA). Reglement for farligt gods. 24 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Isolering af DNA Kittene fra QIAGEN, der er vist i tabel 9, anbefales til oprensning af DNA fra de humane prøvetyper, der er angivet til brug med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Udfør oprensning af DNA ifølge vejledningen nedenfor, som i visse tilfælde afviger fra protokollerne i håndbøgerne til kittene. Tabel 9. Oprensningskit, der er valideret til brug med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Prøvemateriale Urin Kit til isolering af nukleinsyre QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) Katalognummer (QIAGEN) Carrier- RNA 52904 Inkluderet Sæd, vatpinde QIAamp DNA Mini Kit (50) 51304 Ikke inkluderet Note: artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit bør ikke anvendes med fenolbaserede isolationsmetoder. Anvendelse af QIAamp Viral RNA Mini Kit til urinprøver Note: Anvendelse af carrier-rna er kritisk for effektiviteten af ekstraktion og dermed for DNA/RNA-udbytte. Tilsæt den korrekte mængde carrier-rna til hver ekstraktion ifølge instrukserne i QIAamp Viral RNA Mini Handbook. Note: Den interne kontrol i artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan anvendes direkte i isolationsproceduren (se Intern kontrol side 29). Buffer AVL, som anvendes i proceduren med QIAamp Viral RNA Mini, deaktiverer de utallige uidentificerede PCR-hæmmere, der findes i urin. Protokollen til QIAamp Viral RNA Mini Spin anbefales til isolering af cellulært, bakterielt eller viralt DNA fra urin. Tilpas prøverne til stuetemperatur (19-23 C). Urin indeholder ofte et meget lavt antal bakterier. Derfor kan det hjælpe at koncentrere prøverne. Koncentrer prøverne (5-30 ml hver) ved at centrifugere ved maks. 18.000 x g i 15-20 minutter (eller 3000 x g i 30 minutter). Supernatanten skal kasseres med forsigtighed. Derefter skal pellet en resuspenderes i 1200 µl PBS (1x) ved at vortexmixe grundigt for at opløse og dispergere prøven. Dette trin bør udføres ved at vortexmixe pulserende i 15-30 sekunder. Brug 140 µl forberedt prøve til ekstraktion af DNA. Følg QIAamp Viral RNA Mini Spin-protokollen (QIAamp Viral RNA Mini Handbook, tredje udgave, april 2010, side 23) fra begyndelsen. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 25

Note: Vi anbefaler kraftigt at udføre den anbefalede centrifugering i trin 10 i protokollen for at fjerne eventuelt resterende ethanol. Vi anbefaler at øge denne centrifugeringstid til 3 minutter. Vi anbefaler at anvende et elueringsvolumen på 60 µl. Anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit til podnings- eller sædprøver Note: Anvendelse af carrier-rna er kritisk for effektiviteten af ekstraktion og dermed for DNA/RNA-udbytte. Bemærk at tilsætning af carrier (RNA Homopolymer Poly[rA],* ikke inkluderet i QIAamp DNA Mini Kit) anbefales kraftigt til ekstraktion af nukleinsyrer fra cellefrie kropsvæsker og materialer med små mængder DNA og RNA (f.eks. CSF). I de tilfælde skal carrier-rna forberedes som følger. Resuspender lyofiliseret carrier-rna (RNA Homopolymer Poly[rA], ikke inkluderet i QIAamp DNA Mini Kit) vha. elueringsbufferen (brug ikke lyseringsbufferen) fra ekstraktionskittet (Buffer AE i QIAamp DNA Mini Kit) og forbered en fortynding med en koncentration på 1 µg/µl. Del denne carrier-rna-opløsning op i et antal afmålte portioner, der rækker til det nødvendige behov, og opbevar dem ved -15 til -30 C. Undgå gentagen optøning (>2 x) af en afmålt portion carrier-rna. Brug 1 µg carrier-rna pr. 100 µl lyseringsbuffer. Hvis ekstraktionsprotokollen f.eks. anvender 200 µl lyseringsbuffer, tilsættes 2 µl carrier-rna (1 µg/µl) direkte til lyseringsbufferen (Buffer AL i QIAamp DNA Mini Kit). Inden ekstraktionsproceduren påbegyndes, bør en frisk blanding af lyseringsbuffer og carrier-rna (og intern kontrol, hvis det er relevant, se Intern kontrol side 29) forberedes i henhold til pipetteringsoversigten i tabel 10. Tabel 10. Pipetteringsoversigt til anvendelse med QIAamp DNA Mini Kit Antal prøver 1 12 Buffer AL (lyseringsbuffer)* f.eks. 200 µl f.eks. 2400 µl Carrier-RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Total volumen 202 µl 2424 µl Volumen pr. ekstraktion 200 µl 200 µl hver * Indeholder guanidinhydrochlorid, se sikkerhedsinformation i kittets håndbog. * Bær altid egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller under arbejdet med kemikalier. Der er flere oplysninger på de relevante Material Safety Data Sheets (MSDS) (sikkerhedsdatablade), som kan fås hos produktleverandørerne. 26 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Note: Anvend straks den friskt forberedte blanding af lyseringsbuffer og carrier-rna til ekstraktion. Det er ikke muligt at opbevare blandingen. Note: Den interne kontrol i artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan anvendes direkte i isolationsproceduren (se Intern kontrol side 29). Udfør oprensning med QIAamp DNA Mini Kit i henhold til følgende trin, som afviger fra protokollerne i QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. Tilpas prøverne til stuetemperatur (19-23 C). Podningsprøver, der indeholder en vatpind i dyrkningsmedium til transport, skal blandes i vortexmixer. Hætterne skal tages forsigtigt af prøverørene. Udvis forsigtighed så handskerne ikke kontamineres. Kontaminerede handsker skal udskiftes med et nyt par inden håndtering af den næste prøve. Tryk vatpinden mod siden af røret for at presse væsken ud. Overskydende slim i prøven skal fjernes på dette tidspunkt ved at opsamle det på vatpinden. Eventuel resterende væske fra slimet og vatpinden skal derefter presses ud ved at trykke vatpinden mod siden af røret. Til slut skal vatpinden og slimet fjernes og kasseres. Pipetter 180 µl Buffer ATL og 200 µl af transportmediet ned i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og bland grundigt med vortexmixer. Læg tørre vatpinde direkte i et 1,5 mikrocentrifugerør. Tilsæt 180 µl Buffer ATL og bland i 15-30 sekunder med vortexmixer. Alternativt, pipetteres 200 µl Buffer ATL ned i transportrøret, og vatpinden blandes i røret 15-30 sekunder med vortexmixer. Pipetter derefter 180 µl ned i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Sørg for at væsken fra vatpinden presses ud ved at trykke vatpinden mod siden af røret. Derefter fjernes og kasseres vatpinden. Til ekstraktion af DNA fra sædprøver fortyndes 60 µl af prøvematerialet med 140 µl PBS (1x) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, som blandes med vortexmixer. Pipetter 100 µl af fortyndingen og 180 µl buffer ATL ned i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og bland pulserende med vortexmixer i 15-30 sekunder. Tilsæt 20 µl proteinase K, bland pulserende med vortexmixer og inkuber ved 56 C i 15 minutter (vatpinde) eller 1-12 timer (sædprøver). Bland ind imellem med vortexmixer under inkubationen for at dispergere prøven, eller anbring den i en thermomixer. Note: Der skal anvendes proteinase K. QIAGEN Protease udviser reduceret aktivitet ved tilstedeværelse af Buffer ATL. Centrifuger kort 1,5 ml mikrocentrifugerøret for at undgå krydskontamination forårsaget af væskesprøjt fra prøven på indersiden af låget, når røret åbnes. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 27

Tilsæt 200 µl Buffer AL (med carrier-rna og eventuelt intern kontrol, se ovenfor og Intern kontrol side 29) til prøven. Bland pulserende med vortexmixer i 15 sekunder og inkuber ved 70 C i 10 minutter. Centrifuger kort 1,5 ml mikrocentrifugerøret for at undgå krydskontamination forårsaget af væskesprøjt fra prøven på indersiden af låget, når røret åbnes. Det er meget vigtigt at blande prøven og Buffer AL grundigt for at danne en homogen opløsning. Tilsæt 200 µl ethanol (96-100 %) til prøven og bland pulserende med vortexmixer i 15 sekunder. Centrifuger mikrocentrifugerøret kort for at undgå krydskontamination. Tilsæt omhyggeligt 500 µl af blandingen (inklusive præcipitat) til QIAamp Mini Spin kolonnen (i et 2 ml prøvetagningsrør) uden at væde kanten. Luk omhyggeligt låget og centrifuger ved 6000 x g (8000 rpm) i 1 minut. Anbring QIAamp Mini Spin kolonnen i et rent 2 ml prøvetagningsrør og kasser prøvetagningsrøret med filtratet.* Luk alle kolonner for at undgå produktion af aerosoler under centrifugering. Gentag foregående trin ved at tilsætte resten af blandingen til QIAamp Mini Spin kolonnen. Åbn forsigtigt QIAamp Mini Spin kolonnen og tilsæt 500 µl Buffer AW1 uden at væde kanten. Luk omhyggeligt låget og centrifuger ved 6000 x g (8000 rpm) i 1 minut. Anbring QIAamp Mini Spin kolonnen i et rent 2 ml prøvetagningsrør og kasser prøvetagningsrøret med filtratet. * Åbn forsigtigt QIAamp Mini Spin kolonnen og tilsæt 500 µl Buffer AW2 uden at væde kanten. Luk låget omhyggeligt og centrifuger ved maksimal hastighed (f.eks. 16.000 rpm) i 3 minutter. Kasser prøvetagningsrøret med filtratet. Anbring QIAamp Mini Spin kolonnen i et rent 2 ml prøvetagningsrør og centrifuger ved maksimal hastighed (f.eks. 16.000 rpm) i 3 minutter. Anbring QIAamp Mini Spin kolonnen i et rent 1,5 ml prøvetagningsrør og kasser prøvetagningsrøret med filtratet. Åbn forsigtigt QIAamp Mini Spin kolonnen og tilsæt 50 µl Buffer AE. Inkuber ved stuetemperatur (15-25 C) i 1 minut, og centrifuger derefter QIAamp Mini Spin kolonnen ved 6000 x g (8000 rpm) i 1 minut. Anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit til lyofiliserede eller frysetørrede prøver Note: Anvendelse af carrier-rna er kritisk for effektiviteten af ekstraktion og dermed for DNA/RNA-udbytte. Bemærk at tilsætning af carrier (RNA * Filtratet indeholder Buffer AL eller Buffer AW1 og er derfor ikke forligeligt med blegemiddel. Se sikkerhedsinformation i QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. 28 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Homopolymer Poly[rA], ikke inkluderet i QIAamp DNA Mini Kit) anbefales kraftigt til ekstraktion af nukleinsyrer fra cellefrie kropsvæsker og materialer med små mængder DNA og RNA (f.eks. CSF). I de tilfælde skal carrier-rna forberedes som følger. Resuspender lyofiliseret carrier-rna (RNA Homopolymer Poly[rA], ikke inkluderet i QIAamp DNA Mini Kit) vha. elueringsbufferen (brug ikke lyseringsbufferen) fra ekstraktionskittet (Buffer AE i QIAamp DNA Mini Kit) og forbered en fortynding med en koncentration på 1 µg/µl. Del denne carrier-rna-opløsning op i et antal afmålte portioner, der rækker til det nødvendige behov, og opbevar dem ved -15 til -30 C. Undgå gentagen optøning (>2 x) af en afmålt portion carrier-rna. Brug 1 µg carrier-rna pr. 100 µl lyseringsbuffer. Hvis ekstraktionsprotokollen f.eks. anvender 200 µl lyseringsbuffer, tilsættes 2 µl carrier-rna (1 µg/µl) direkte til lyseringsbufferen (Buffer AL i QIAamp DNA Mini Kit). Inden ekstraktionsproceduren påbegyndes bør en frisk blanding af lyseringsbuffer og carrier-rna (og intern kontrol, hvis det er relevant, se Intern kontrol side 29) forberedes i henhold til pipetteringsoversigten i tabel 11. Tabel 11. Pipetteringsoversigt til anvendelse med QIAamp DNA Mini Kit Antal prøver 1 12 Buffer AL (lyseringsbuffer)* f.eks. 200 µl f.eks. 2400 µl Carrier-RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Total volumen 202 µl 2424 µl Volumen pr. ekstraktion 200 µl 200 µl hver * Indeholder guanidinhydrochlorid, se sikkerhedsinformation i kittets håndbog. Note: Anvend straks den friskt forberedte blanding af lyseringsbuffer og carrier-rna til ekstraktion. Det er ikke muligt at opbevare blandingen. Note: Den interne kontrol i artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan anvendes direkte i isolationsproceduren (se Intern kontrol side 29). Udfør oprensning med QIAamp DNA Mini Kit i henhold til følgende trin, som afviger fra protokollerne i QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. Tilpas prøverne til stuetemperatur (19-23 C). Rekonstituer grundigt den lyofiliserede eller frysetørrede prøve i 500 µl PBS (1x) ved at ryste forsigtigt i hånden. Derefter inkuberes prøverne i mindst 30 minutter ved stuetemperatur (15-25 C) på et rysteapparat (f.eks. thermomixer), om muligt. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 29

Pipetter 200 µl af den rekonstituerede prøve og 360 µl Buffer ATL ned i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og bland grundigt med vortexmixer. Tilsæt 20 µl proteinase K, bland pulserende med vortexmixer og inkuber ved 56 C i 1-12 timer. Bland ind imellem med vortexmixer under inkubationen for at dispergere prøven, eller anbring den i en thermomixer. Note: Der skal anvendes proteinase K. QIAGEN Protease udviser reduceret aktivitet ved tilstedeværelse af Buffer ATL. Centrifuger 1,5 ml mikrocentrifugerøret kort for at fjerne dråber fra lågets inderside. Tilsæt 400 µl Buffer AL (med carrier-rna og eventuelt intern kontrol, se ovenfor og Intern kontrol side 30) til prøven. Bland pulserende med vortexmixer i 15 sekunder og inkuber ved 70 C i 10 minutter. Tilsæt 400 µl ethanol (96-100 %) til prøven og bland pulserende med vortexmixer i 15 sekunder. Tilsæt omhyggeligt 700 µl af blandingen til QIAamp Mini Spin kolonnen uden at væde kanten. Luk låget og centrifuger ved 6000 x g (8000 rpm) i 1 minut. Anbring QIAamp Mini Spin kolonnen i et rent 2 ml prøvetagningsrør og kasser røret med filtratet.* Gentag foregående trin ved at tilsætte resten af blandingen til QIAamp Mini Spin kolonnen. Følg protokollen for væv (QIAamp DNA Mini Blood Mini Handbook, tredje udgave, juni 2012, side 32) og begynd med tilsætning af Buffer AW1 i trin 8. Note: Vi anbefaler kraftigt at udføre den anbefalede centrifugering i trin 10 i protokollen for at fjerne eventuelt resterende ethanol. Vi anbefaler at øge denne centrifugeringstid til 3 minutter. Vi anbefaler et elueringsvolumen på 50 µl Buffer AE. Intern kontrol En intern kontrol (C. trachomatis Plus RG IC) medfølger. Dette gør det muligt for brugeren både at kontrollere isolering af DNA og kontrollere for mulig hæmning af PCR. I denne applikation skal den interne kontrol tilsættes isolationen i et forhold på 0,1 µl pr. 1 µl elueringsvolumen. Ved anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit elueres DNA et f.eks. i 200 µl Buffer AE. Derfor bør 20 µl af den interne kontrol tilsættes initielt. Hvis der elueres i f.eks. 100 µl, skal det tilsvarende volumen på 10 µl anvendes. Kvantiteten af anvendt intern kontrol afhænger kun af elueringsvolumenet. * Filtratet indeholder Buffer AL eller Buffer AW1 og er derfor ikke forligeligt med blegemiddel. Se sikkerhedsinformation i QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. 30 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Note: Den interne kontrol og carrier-rna (se Isolering af DNA ovenfor) skal kun tilsættes blandingen af lyseringsbuffer og prøvemateriale eller tilsættes lyseringsbufferen direkte. Den interne kontrol må ikke direkte tilsættes prøvematerialet. Hvis blandingen af intern kontrol og lyseringsbuffer/carrier-rna tilsættes lyseringsbufferen, skal den forberedes friskt og anvendes med det samme (opbevaring af blandingen ved stuetemperatur eller i køleskab blot nogle få timer kan medføre fejl i den interne kontrol og reduceret ekstraktionseffektivitet). Note: Den interne kontrol og carrier-rna må ikke tilsættes prøvematerialet direkte. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 31

For at kunne betragte oprensningen som vellykket skal C T -værdien af den interne kontrol af en negativ prøve, der er blevet behandlet under oprensning (QIAamp DNA Mini Kit eller QIAamp Viral RNA Mini Kit), nå C T = 24 3 (tærskel: 0,02) på Rotor-Gene Q instrumenter. Den viste afvigelse på op til 3 C T -værdier er baseret på variansen mellem instrument og oprensning. En større afvigelse tyder på et problem med oprensningen. I dette tilfælde skal oprensningen kontrolleres og om nødvendigt valideres en gang mere. Hvis du har spørgsmål eller problemer, skal du kontakte QIAGEN tekniske service. Den interne kontrol kan alternativt anvendes udelukkende til at kontrollere for mulig hæmning af PCR. I denne applikation tilsættes den interne kontrol direkte til blandingen af C. trachomatis Plus RG Master and C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol som beskrevet i trin 2b i protokollen (side 32). 32 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Protokol: PCR- og dataanalyse Vigtigt inden start Inden proceduren påbegyndes læses Vigtige bemærkninger side 20 30. Tag dig god tid til at gøre dig bekendt med Rotor-Gene Q-instrumentet, inden protokollen påbegyndes. Se brugervejledningen til instrumentet. Sørg for at mindst én positiv kontrol og én negativ kontrol (vand, PCRkvalitet) inkluderes i hver PCR-kørsel. Skal gøres inden start Sørg for at køleblokken (tilbehør til Rotor-Gene Q-instrument) forkøles til 2-8 C. Inden hver anvendelse skal alle reagenser optøs fuldstændigt, blandes (ved gentagen pipettering op og ned eller hurtig vortex-blanding) og centrifugeres kort. Procedure 1. Anbring det ønskede antal PCR-rør i adapterne på køleblokken. 2. Hvis den interne kontrol anvendes til at monitorere fremgangsmåden for isolering af DNA og kontrollere for mulig hæmning af PCR, følges trin 2a. Hvis den interne kontrol udelukkende anvendes til at kontrollere for hæmning af PCR, følges trin 2b. 2a. Den interne kontrol er allerede blevet tilsat isolationen (se Intern kontrol side 29). I dette tilfælde forberedes et mastermix ifølge tabel 12. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der er nødvendige for PCR, undtagen prøven. Tabel 12. Forberedelse af mastermix (intern kontrol der anvendes til at monitorere isolering af DNA og kontrollere for hæmning af PCR) Antal prøver 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 0 µl 0 µl Total volumen 15 µl 180 µl artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 33

2b. Den interne kontrol skal tilsættes direkte til blandingen af C. trachomatis Plus RG Master og C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol. I dette tilfælde forberedes et mastermix ifølge tabel 13. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der er nødvendige for PCR, undtagen prøven. Tabel 13. Forberedelse af mastermix (intern kontrol der udelukkende anvendes til at kontrollere for hæmning af PCR) Antal prøver 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 1 µl 12 µl Total volumen 16 µl* 192 µl* * Øgning af volumen pga. af tilsætning af den interne kontrol springes over, når PCRanalysen forberedes. Sensitiviteten af detektionssystemet forringes ikke. 3. Pipetter 15 µl af mastermix et ned i hvert PCR-rør. Tilsæt dernæst 10 µl elueret DNA-prøve (se tabel 14). Tilsvarende skal 10 µl C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control anvendes som positiv kontrol og 10 µl vand (vand, PCR-kvalitet) som negativ kontrol. Tabel 14. Forberedelse af PCR-analyse Antal prøver 1 12 Mastermix 15 µl 15 µl hver Prøve 10 µl 10 µl hver Total volumen 25 µl 25 µl hver 4. Luk PCR-rørene. Sørg for at låseringen (tilbehør på Rotor-Geneinstrumentet) anbringes oven på den 72-brøndes rotor for at forhindre, at rørene utilsigtet bliver åbnet under kørslen. 34 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

5. Opret en temperaturprofil til detektion af C. trachomatis-dna ifølge disse trin. Indstilling af generelle analyseparametre Figur 3, 4, 5 Initiel aktivering af Hot Start-enzym Figur 6 Amplifikation af DNA Figur 7 Justering af fluorescens-kanalens sensitivitet Figur 8 Start af kørsel Figur 9 Alle specifikationer henviser til Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q software version 1.7.94 og Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94 og Rotor-Gene 3000 software version 6.0.23. Der er flere oplysninger om programmering af Rotor-Gene-instrumenter i brugervejledningen til instrumentet. På illustrationerne er disse indstillinger indrammet i en fed sort boks. Illustrationerne er inkluderede for Rotor-Gene Q-instrumenter. Hvis andre værdier er påkrævet til Rotor-Gene 3000, beskrives forskellene i teksten. 6. Først åbnes dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel) (figur 3). Sæt kryds i feltet Locking Ring Attached (låsering påsat) og klik på Next (næste). Figur 3. Dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel). artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 35

7. Vælg 25 som PCR-reaktionsvolumen og klik på Next (næste) (figur 4). Figur 4. Indstilling af generelle analyseparametre. 8. Klik på knappen Edit Profile (rediger profil) i den næste New Run Wizard (guiden ny kørsel) dialogboks (figur 5) og programmer temperaturprofilen som vist i figur 5-7. Figur 5. Redigering af profilen. 36 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

Figur 6. Indledningsvist aktivering af Hot Start-enzym. Figur 7. Amplifikation af DNA. Bemærk at på Rotor-Gene 3000 vil softwaren definere de fluorescerende farver som FAM/Sybr, JOE. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 37

9. Detektionsområdet for fluorescens-kanalerne skal fastsættes i overensstemmelse med fluorescensintensiteterne i PCR-rørene. Klik på Gain Optimisation (optimering af forstærkning) i dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel) (se figur 5) for at åbne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup (indstilling af optimering af automatisk forstærkning). Indstil kalibreringstemperaturen til 60, så den stemmer overens med hybridiseringstemperaturen i amplifikationsprogrammet (figur 8). Figur 8. Justering af fluorescens-kanalens sensitivitet. Bemærk at på Rotor-Gene 3000 vil softwaren definere de fluorescerende farver som FAM/Sybr og JOE. 38 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit-håndbog 01/2015

10. Forstærkningsværdierne, som blev bestemt ved kalibrering af kanalerne, gemmes automatisk. De anføres i det sidste menuvindue i programmeringsproceduren (figur 9). Klik på Start Run (start kørsel). Figur 9. Start af kørsel. Bemærk at på Rotor-Gene 3000 vil softwaren definere de fluorescerende farver som FAM/Sybr og JOE. 11. Når kørslen er færdig, skal dataene analyseres. Følgende resultater er mulige (11a, 11b og 11c). Figur 10 og figur 11 viser eksempler på positive og negative PCRreaktioner. 11a.Et signal detekteres i fluorescens-kanalen Cycling Green. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder C. trachomatis- DNA. I dette tilfælde er detektion af et signal i Cycling Yellow-kanalen ikke vigtig, eftersom høje initiale koncentrationer af C. trachomatis DNA (positivt signal i Cycling Green-kanalen) kan føre til et reduceret eller manglende fluorescenssignal i den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen (konkurrence). Note: Bemærk at på Rotor-Gene 3000 er de relevante kanaler Cycling A.FAM for det positive signal og Cycling A.JOE for den interne kontrol. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook 01/2015 39