Nye hurtigmetoder til påvisnings af mikrobielle forureninger i drikkevand Peter Sektion for Miljøteknologi Institut for Kemi og Bioteknologi Aalborg Universitet Slide 1 1 af 31 Nye hurtigmetoder Tak til Annette S. Bukh (AAU) Mary Bjerring Rasmussen (AAU) Margit Paulsen (AAU) Luminescence and fluorescence based detection of indicator bacteria -et kombineret koncept til filtrering og fluorescens-baseret påvisning af coliforme bakterier og E. coli i vand Slide 2 2 af 31 1
Mikrobielle forureninger Mikroorganismer kan forurene vandforsyninger Oversvømmelse af kildepladser Luftbåren forurening ved vandbehandling -beluftning, filterskylning m.m. Karlby og Sørensen 2002 Nedsivning fra septitanke, utætte kloakrør, opbevaringspladser for husdyrgødning m.m. Indsivning ved ledningsbrud og reparationsarbejde Utætte beholderanlæg Fejlkoblinger på ledningsnettet og i husinstallationer -tilbagesugning, defekte kontraventiler m.m. Slide 3 3 af 31 DS/ISO metoder Udfordring: Bakteriologiske DS/ISO metoder til drikkevand er ofte langsomme, arbejdskrævende og ikke altid entydige.. Traditionelle metoder 21 timer Hurtigmetoder 8 timer Kort analysetid Følsomhed, Specificitet Udfordring: kort analysetid, følsomhed, specificitet -ofte lav koncentration af targetbakterier -fx 1 E. coli : 10 6 grundvandsbakterier i 100 ml vand Slide 4 4 af 31 2
Hurtigmetoder Eksempler på hurtigmetoder til coliforme bakterier i drikkevand Colilert Colisure Colifast Coliguard ColiLight XplOrer64 Og andre. Slide 5 5 af 31 Enzymatiske hurtigmetoder Detektion af specifikke enzymer i indikatorbakterier Brug af kromogene, flurescerende og/eller luminescerende substratanaloger => måling af farve, fluorescens og/eller luminescens Eksempel. Enzymatisk hydrolyse af 4-methylumbelliferyl substrater (4-MU) Coliforme: -D-galactosidase -galactosidase + 4-MU- -D-galactopyranoside -D-galactopyranoside + 4-methylumbelliferone E. coli: -D-glucuronidase -D-glucuronidase + 4-MU- -D-glucuronid -D-glucuronid + 4-methylumbelliferone Ex/Em 355/460 nm Slide 6 6 af 31 3
Relative Fluorescence Units [RFU] FIBLite Ny hurtigmetode: FIBLite Target: Fækale indikatorbakterier (FIB) i drikkevand Princip: Fluorescens (fluorescerende substratanaloger) Analysetid: 60 min Vandvolumen: 1 ml - >10 L Optimeret med hensyn til -substrater, co-substrater, koncentrationer, temperatur, ph, buffere, inkubationstid, permeabilisering, signalforstærkere m.m. Filtreret prøve + Reaktionsmix Fluorescens (Ex/Em 355/460 nm) Slide 7 7 af 31 FIBLite: følsomhed Indledende forsøg: fokus på drikkevand forurenet med spildevand i laboratorieforsøg ( worst case ) 3.000E+0 2.500E+0 2.000E+0 1.500E+0 Forsøg Drikkevand + Spildevand FIBLite: 1 time MPN: 24 timer 1.000E+0 500E+0 0.000E+0-500E+0 R² = 0,9851 0 500 1000 1500 2000 2500 E. coli i forurenet drikkevand (MPN) Konklusion: muligt at påvise spildevand i drikkevand (Aalborg Vand) svarende til <100 E. coli 100 ml på 60 min Slide 8 8 af 31 4
FIBLite: Baggrund og følsomhed Drikkevand fra Aalborg, Aarhus og Sønderborg vandforsyninger forurenet med spildevand (laboratorieforsøg) Forsøg 1 L vand filtreret 1 times analyse (Baggrund) Slide 9 9 af 31 FIBLite: prøvevolumen Effekt af prøvevolumen på påvisning af fækal forurening -drikkevand fra Aalborg Vand forurenet med spildevand Forsøg DV:SV (1000:1) 1-10000 ml vand filtreret 1 times analyse Konklusion: Baggrundssignal stiger ikke væsentligt med volumen. Muligt at øge følsomhed med større prøvevolumen (>100 ml) Slide 10 10 af 31 5
Promega håndholdt [nm] FIB i Biofilm Hurtig påvisning af fækal forurening i biofilm på PEX rør Pilotforsøg PEX rør med drikkevand forurenet med spildevand i 24 timer E. coli koncentration: 7 ml -1 Slide 11 11 af 31 Håndholdt detektion Potentiale for håndholdt måling? FIBLite kan overføres til håndholdt format uden væsentlig tab af følsomhed Detektion af spildevandsforurening svarende til >10 E. coli 100 ml -1 2500 2000 1500 1000 500 R² = 0,9754 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Perkin Elmer Plate Reader [nm] Slide 12 12 af 31 6
Kildesporing Udfordring: Hvor stammer en mikrobiel forureningen fra? FAQ: Dyr? Spildevand? Hvor i forsyningen? Sundhedsfare? Mikrobiologiske kildesporing: Markører og forureningsprofiler Profil/fingeraftryk 4 5 3 2 6 7 8 9 Pilotforsøg Profil for drikkevand baseret på 10 udvalgte enzymaktiviteter og målt via fluorescens. 1 X Slide 13 13 af 31 Profil Eksempler på profiler for drikkevand med og uden mikrobiel forurening (100 ml drikkevand) 10 parametre (enzymaktiviteter) 0 Drikkevand (Aarhus) 0.24 1.11 0.45 0.33 0.63 0.64 0.58 0.54 0.43 0 0.52 Drikkevand forurenet med spildevand (1:1000) (Aarhus) 0.31 36.60 0.89 0.58 11.64 2.64 1.67 20.26 14.17 0 21.39 Slide 14 14 af 31 7
Profiler for rent drikkevand Aalborg Kim: 18 ml -1 (22 C) 0.57 1.09 1.19 0.96 2.04 1.51 2.00 1.39 1.56 0 1.38 Aarhus Kim: 21 ml -1 (22 C) 0.24 1.11 0.45 0.33 0.63 0.64 0.58 0.54 0.43 0 0.52 Sønderborg Kim: 16 ml -1 (22 C) 0.60 1.09 1.06 1.01 2.15 1.73 1.91 1.57 1.54 0 1.91 Gammelt vand i PEX rør (Aalborg) >400 kim ml -1 3.55 10.58 1.53 6.22 2.23 0.47 0.81 0.46 0.39 0 0.94 Slide 15 15 af 31 Profiler Drikkevand forurenet med spildevand Aalborg 1:1000 0.50 8.58 1.02 0.16 3.41 0.49 1.31 1.43 4.46 0 6.38 Aarhus 1:1000 0.31 36.60 0.89 0.58 11.64 2.64 1.67 20.26 14.17 0 21.39 Sønderborg 1:1000 0.64 14.24 1.37 1.14 7.09 2.65 2.92 19.96 4.33 0 9.06 Drikkevand forurenet med overfladevand Aalborg 1 mg overfladejord L -1 TC/EC < 1 100 ml -1 7.75 2.32 0.35 15.03 2.54 1.29 1.31 1.43 0.81 0 2.44 Slide 16 16 af 31 8
Perspektiver Stort potentiale for brug af mikrobielle hurtigmetoder i danske vandforsyninger Early warning -eventuelt At-Line monitering m.m. DDS og egenkontrol -særlige kontrolpunkter, reparationsarbejde m.m. Screening af materialer, overflader, biofilm Hurtig etablering af forureningsprofiler Kritisk: udvælgelse af velegnede metoder + validering under dansk forhold 0 Slide 17 17 af 31 Sektion for Miljøteknologi Institut for Kemi og Bioteknologi Aalborg Universitet www.bio.aau.dk Slide 18 18 af 31 9