Almen cellebiologi 2007 Membrantransport Kap. 12, s. 389-420 Forelæsning 2 Stine Falsig Pedersen sfpedersen@aki.ku.dk 35321546/room 527 1
De næste tre forelæsninger: 1. - Membranen og membran-transport proteiner generelt - Pumper og andre carrier proteiner 2. - Ion-kanaler og membranpotentialet 3. - Ionkanalers roller i nervesystemet fysiologi og patofysiologi 2
Carrier- og kanal-proteiner Carrier proteiner: Binder ion/molekyle, og undergår konformationsændringer, der resulterer i translokation over cellemembranen Medierer passiv eller aktiv transport Kanal proteiner: Vandig pore gennem plasmamembranen, hvorigennem ion/molekyle af passende specificitet transporteres, når poren er åben Medierer kun passiv transport Transport igennem kanaler er typisk 10 5 gange hurtigere end carrier-medieret transport 3
Carrier- og kanal-proteiner 4
Drivkraften for transport er den elektrokemiske gradient Bidrag fra concentrationsgradienten: ΔG concentration : RT ln Cx i /Cx o Bidrag fra ladningen og membranpotentialet: ΔG ladning : z F V m, R= gaskonstanten, T= temperaturen i K, Cx= koncentration af x, F = Faradays konstant, og V m = membranpotentialet Den elektrokemiske gradient = drivkraften for transport bliver derfor: Δμ x : ΔG concentration + ΔG ladning = RT ln Cx i /Cx o + z F V m 5
Nernst- eller ligevægtspotentialet Når ionen x er i ligevægt over membranen må det nødvendigvis være sådan at den drivkraft der skyldes koncentrationsforskellen er lige så stor og modsat rettet den, der skyldes ladningsforskellen, dvs: ΔG concentration,x + ΔG ladning,x = 0 dvs RT ln Cx i /Cx o = - z x F E x dvs E x =-RT/z x F ln Cx i /Cx o - dette er ionen x s ligevægts- eller Nernst-potentiale Da R=8.31 J/mol K, T=310 K (ved 37 C), F = 96500 C/mol, og konversionsfaktoren fra ln til log er 2.3 fås: E x -60 mv/z x log Cx i /Cx o - eller for en monovalent ion: E x -60 mv log Cx i /Cx o 6
Membranpotentialet, V m -I V m er forskellen imellem det elektriske potentiale i cytoplasma og det ekstracellulære miljø Opretholdelse af V m er afgørende for normal cellefunktion V m opstår på grund af koncentrationsgradienterne af alle de permeable ioner (altså dem, der er kanaler åbne for) over membranen Hvor meget en ion bidrager til V m afhænger af dens permeabilitet og dens koncentrationsforskel over membranen 7
Membranpotentialet, V m - II Derfor ligger V m imellem Nernst-potentialerne for de åbne ionkanaler De ioner der i steady state har størst permeabilitet, og derfor bidrager mest til V m, er K + og Cl - Membranpotentiale (mv) +50 0-50 V Na 0 mv V Cl V m V K Typisk er V m mellem -30 og -70 mv - men det er meget celletype-afhængigt Hvad sker der med V m, hvis vi åbner en Na + kanal? 8
Membranpotentialet, V m - III Det antal ioner, der skal flyttes over plasmamembranen for at skabe membranpotentialet er forsvindende lille i forhold til mængden af ioner på hver side af membranen K + K + K + K + ude inde Præcis lige mange positive og negative ladninger på hver side: Vm = 0 ude inde Ganske få ladninger flytter side: Vm 0 9
Samspillet imellem K + leak kanaler og Na +,K + ATPasen er centralt for opretholdelse af V m i hvile Na + : 140 mm K + : 5 mm Na + :15 mm K + : 140 mm 3 Na + 2 K + ~ 10
Måling af transport igennem ionkanaler patch clamp teknikken Ved at lave en elektiske meget tæt forbindelse imellem plamamembranen og en tynd glaspipette forbundet til et elektrisk kredsløb hvor man kan måle og kontrollere strøm og potentiale, kan man måle den strøm, der løber igennem ionkanalerne Sakmann og Neher, Nobelpris i medicin/fysiologi 1991 11
Måling af transport igennem ionkanaler patch clamp teknikken Afhængig af hvordan pipetten sidder kan man måle på strømmen over hele cellen, eller over en enkelt kanal, og man kan kontrollere sammensætningen af opløsningerne på inder- og ydersiden af kanalen. Man kan altså studere hvilke ioner, der passerer igennem kanalen, og hvordan den er reguleret. 12
Med patch clamp teknikken kan man studere strøm igennem enkeltkanaler Ved single-channel patch clamp målinger kan man se at ionkanaler veksler imellem at være åbne og at være lukkede Stimuli, der aktiverer kanalen, gør ikke at den er åben 100% af tiden, men øger sandsynligheden for at den er åben Figuren viser patch clamp målinger fra en macropatch fra en nervecelle med ca 6 spændingsafhængige Na + kanaler en depolarisering åbner mange kanaler, hvilket ses som en indadrettet strøm de inaktiverer hurtigt igen, og derefter ses enkeltkanalaktivitet 13
Cellen som ækvivalent kredsløb Patch clamp teknikken er baseret på, at en celle kan ses som et elektrisk kredsløb. Cellemembranen har en kapacitans, C (fra lipidlaget) og en konduktans, G= 1/modstand, R). Fra Ohms lov har vi at V = I R = I/G, dvs I = V G Gennem en given kanal er strømmen I x = G x (V m -E x ) Dvs den totale strøm er I m = I C + I x = I C + G x (V m -E x ) Ændres V m, fås en I C, der hurtigt henfalder. Derefter er I m kun afh. af G x, dvs ionens konduktans kan bestemmes 14
Kanaler er de virkelige så vigtige? Genetiske defekter i kanalproteiner er årsag til mange arvelige sygdomme Eksempler Cl - kanaler: Cystic fibrose Nyresten K + kanaler: Arvelig hjerte-arytmi døvhed, epilepsi Na + kanaler: Arvelig hjerte-arytmi Muskel-lammelser Ca 2+ kanaler: Arvelig migræne Muskulær dysgenese 15
Kanaler er de virkelige så vigtige? "for discoveries concerning channels in cell membranes" The Nobel Prize in Chemistry 2003 Peter Agre Roderick MacKinnon 1/2 of the prize 1/2 of the prize USA USA "for the discovery of water channels" "for structural and mechanistic studies of ion channels" Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, MD, USA b. 1949 b. 1956 Rockefeller University, Howard Hughes Medical Institute New York, NY, USA 16
Vandkanaler - aquaporiner Kan øge membranens vandpermeabilitet 10-100x meget vigtige i f.eks. nyren Eksempel: aquaporin 1 Tetramer: fire subunits á hver seks transmembrane α-helices Hver subunit sin pore 17
Aquaporiner kan være meget specifikke for H 2 O 18
Ionkanaler er selektive for bestemte ioner De fleste ionkanaler er selektive for en bestemt ion Det betyder typisk at langt fortrinsvis denne iontype kan passere, men at der også er en vis, meget lavere, permeabilitet for andre ioner F.eks. findes der selektive Cl - kanaler Na + kanaler Ca 2+ kanaler K + kanaler Men også nonspecifikke kanaler, f.eks. cation kanaler anion kanaler Hvilke ioner, der kan passere afhænger, som vi skal se, af porens facon og ladningen af de aminosyrer, der ligger nærmest poren 19
Hvordan virker et selektivitetsfilter? Eks. den spændingsafhængige K + kanal I det vandfyldte hulrum i kanalen er ionen hydreret, dvs den har vand bundet til sig For at passere selektivitetsfilteret skal den dehydreres Energien, der kræves dertil, opvejes præcis af interaktion m. 4 carbonylgrupper hvori netop K +, og ikke andre, passer 20
Ionkanaler er gatede I modsætning til porer, som er åbne hele tiden (og primært findes i bakterier) er ionkanalers åbning og lukning kontrolleret det kaldes gating. Der findes forskellige typer af gating: Gating-typer: Spænding ligand mekanisk 21
Eksempel: spændings-gatede K + kanaler F.eks. den type K + -kanaler, der bevirker hyperpolariseringen i aktionspotentialet: En tetramer : α-helices fra fire subunits danner en vandfyldt pore Spændings-gated: kanalen åbnes, når membranen depolariseres Selektiv for K + : et selektivitetsfilter gør at kun K + kan passere 22
Eksempel spændingsgatede K + kanaler Poren er en tetramer dannet af 4 α-subunits med hver 6 transmembrane α-helices 4 x = + 1 x β Set fra siden α-helices fra de 4 subunits danner tilsamen en central, vandfyldt pore, der kan åbnes og lukkes (gating), og et selektivitetsfilter, der sikrer at kun K + kan komme igennem 23
Hvordan virker spændingsgating? lukket åben Det 4. transmembrane segment indeholder mange aminosyrer med positive ladninger (arginin, lysin), og det menes at en ændring i membranpotentialet føles af kanalen via dette segment, muligvis fordi det flyttes i forhold til membranen Når membranen depolariserer, sker der en konformationsændring, så de transmembrane α-helices der danner kanalporen folder ud, så poren bliver stor nok til at K + ionerne kan passere 24
Ionkanaler er gatede I modsætning til porer, som er åbne hele tiden (og primært findes i bakterier) er ionkanalers åbning og lukning kontrolleret det kaldes gating. Der findes forskellige typer af gating: Gating-typer: Spænding ligand mekanisk 25
Den acetycholin-gatede cation kanal Den nicotinerge acetylcholin-receptor i muskel celler er en ligand-gated cation kanal, der aktiveres af en ligand, der binder på den extracellulære side af kanalen Poren er dannet af 5 subunits: 2α, β, δ, γ. Når acetylcholin binder til receptoren, sker der en konformationsændring, så de hydrofobe aminosyrer, der normalt danner kanalens gate går fra hinanden, og tillader passage af cationer, primært Na +. 26
Den acetylcholin-gatede cation kanal Influx af Na + via kanalen resulterer i depolarisering af muskelcellemembranen Signalet afsluttes ved at acetylcholin nedbrydes eller fjernes 27
Ca 2+ -aktiverede Cl - kanaler Andre kanaler er gatede af ligander, der binder til den intracellulære side af kanalen Eks. Ca 2+ aktiverede Cl - kanaler Her ses hel-celle patch clamp målinger af Ca 2+ aktiverede Cl - kanaler i en tumor-cellelinie 28
Ionkanaler er gatede I modsætning til porer, som er åbne hele tiden (og primært findes i bakterier) er ionkanalers åbning og lukning kontrolleret det kaldes gating. Der findes forskellige typer af gating: Gating-typer: Spænding ligand mekanisk 29
Strækaktiverede cation-kanaler i øret 30
Strækaktiverede cation-kanaler i øret Når basilarmembranen løftes, løftes hårcellerne mod tektorialmembranen, og hårcellerne bøjes. Det aktiverer stræk-aktiverede K + kanaler K + influx (fordi hårcellernes hår er badet i høj K + ) depolarisering spændingsafhængige Ca 2+ kanaler åbner Ca 2+ influx neurotransmitter-release i synapsen mellem hårcelle og hørenerve signal transmitteres til hørenerven 31
Strækaktiverede cation-kanaler i øret En hårcelle fra cochlea fra et marsvin udsat for japansk folkemusik... Hårceller fra oksefrøens øre David Zhi-Zhou Dep. of Biomedical Sciences Creighton University 32
Et andet eksempel: svulmningsaktiverede Cl - kanaler Normalt volumen Cl - K + Aminosyrer Når celler svulmer osmotisk aktiverer de efflux-veje for osmolytter for at genetablere deres oprindelige volumen Svulmet Cl - K + H 2 O En af de vigtigste mekanismer er aktivering af K + -og Cl - kanaler Man ved stadig ikke, præcis hvordan svulmning åbner Cl - kanalen 33
Svulmningsaktiverede Cl - kanaler i en tumor-celle 34
Opsummering 1. Ionkanaler har meget høje transportrater, men kan kun mediere passiv transport 2. Ionkanaler kan studeres ved hjælp af patch clamp teknikken 3. Ionkanaler er gatede, dvs kan åbnes og lukkes på reguleret vis 4. Eksempler på gating er spændingsgating (f.eks. mange K + kanaler), ligandgating (f.eks. acetylcholinreceptorkanalen i muskelceller, eller Ca 2+ aktiverede Cl - kanaler), og mekanisk gating (f.eks. cationkanalerne i hårcellerne i øret). 5. Ionkanaler udviser selektivitet for en eller flere bestemte iontyper. Selektiviteten medieres af et selektivitetsfilter 6. Ligevægtspotentialet E x, for ionen X er udtrykt ved Nernst ligningen 7. Membranpotentialet, V m, er bestemt af permeabilitet og Δ concentration for ioner over plasmamembranen - i normalsituationen bidrager K + og Cl - mest til V m 35