DOCUMENTA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA

Transkript

1 DOCUMENTA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA Formler - Fysiske konstanter - Talstørrelser 4. udgave, september 2000 Cellebiologisk kursus Det sundhedsvidenskabelige fakultet Københavns Universitet Forord til 2. udgave Biofysik (almen fysiologi) i det cellebiologiske kursus indgik tidligere som emnegruppe 1 i fysiologiundervisningen. I undervisningen inden for fysiologi fandt man det hensigtsmæssigt at udarbejde et hæfte (Documenta physiologica) med formler, fysiske konstanter og talstørrelser. Hæftet tjener som en vejledning under studiet og udleveres i en udgave med visse udeladelser, som forventes indlært, ved eksamen. I det cellebiologiske kursus har vi fundet det naturligt, at studenterne gives samme mulighed for at have et mindre opslagsværk til hjælp under læsningen og under eksamen. I lighed med Documenta physiologica er visse afsnit og formler i nærværende hæfte markerede for at angive, at tekst og formler betragtes som huskestof, der ikke indgår i den udgave, som udleveres til eksamen. Den markerede tekst er skrevet med denne skrifttype, og formlerne er markeret med (*). Den øvrige tekst, der udleveres til eksamen er skrevet med denne skrifttype. Afsnittet vedrørende emnegruppe 1 (biofysik, almen fysiologi) fra Documenta physiologica ligger til grund for afsnittet om biofysik i dette hæfte. Visse afsnit, som i Documenta physiologica var medtaget for at komplettere pensum, er dog udeladt eller skrevet om. Afsnittene indgår nu i noterne og/eller lærebogen. I undervisningen i biokemi har man hidtil udleveret en formelsamling. Denne formelsamling samt mere materiale, der ikke indgår som huskestof, er inkluderet i dette hæfte. Forord til 3. udgave I den foreliggende, 3. udgave er der kun foretaget mindre rettelser af typografiske fejl. 11. marts 1993 Medicinsk Fysiologisk Institut De biokemiske institutter Forord til fjerde udgave Denne udgave er en lettere modificeret version af 3. udgave med henblik på at lave en version, der kan lægges på institutternes hjemmeside og udskrives derfra. Som tidligere vil der være afsnit i denne udgave, som ikke er medtaget i den udgave, der udleveres til brug ved eksamen. De afsnit, som ikke er medtaget i eksamenseksemplaret er fortsat skrevet i kursiv, og de er desuden indrammet i denne udgave (som teksten i dette afsnit). Formler, som ikke medtages i eksamenseksemplaret, er ligeledes skrevet i kursiv og indrammet, men er ikke længere markeret med (*). September 2000 Medicinsk Fysiologisk Institut De biokemiske institutter

2 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, BIOKEMI I T= I o T er transmissionen, I er intensiteten af det transmitterede lys og I o er intensiteten af det indfaldende lys. 2. A (eller E) = ε c l A (eller E) er absorbansen (extinktionen), ε er den molære absorbtionskoefficient (extinktionskoefficient) i M 1 cm 1, c den molære koncentration, og l er lysvejen i cm. 3. A (eller E), T, I og I o er defineret som ovenfor. Io A (eller E )= log = log T I 4. A X+Y = A X + A Y A X+Y er absorbansen (extinktionen) for en blanding af X og Y, A X er absorbansen (extinktionerne) for X, og A Y er absorbansen (extinktionen) for Y. 5. ph = log(h + ) (H + ) er den molære hydrogenionkoncentration (egentlig aktivitet). 6. pk = logk A K A er ligevægtskonstanten for reaktionen HA! H + + A [protonacceptor] 7. ph = pk A + log [protondonor] 8. pk1+ pk 2 pi = 2 pi er det isoelektriske ph, og pk 1 og pk 2 er pk A for protolyserbare grupper. K' = (C) (D) (A) (B) for reaktionen A + B! C + D. K' eq er en konstant (ph 7,0 og 25 ºC) og (A), (B), (C) og (D) er de molære koncentrationer ved ligevægt. 9. eq 10. G o = 2,303 R T log K' eq G o er ændringen i standard fri energi ved ph 7,0. R er gaskonstanten (1, kcal mol 1 grad 1 eller 8,314 Joule mol 1 grad 1 ), og T er den absolutte temperatur = ºC (C) (D) o' G = G + R T ln (A) (B) for reaktionen A + B! C + D, hvor G er ændringen i fri energi og G o, R og T er defineret som ovenfor. hvor o' o' o' o' G total = G A + G B + G C +... o' G total er den samlede ændring i standard fri energi ved ph 7 af de koblede reaktioner A, B, C... Side 2

3 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, st position (5' end) The Genetic Code 2nd position 3rd position (3' end)! U C A G! U Phe Phe Leu Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr STOP STOP Cys Cys STOP Trp U C A G C Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro His His Gln Gln Arg Arg Arg Arg U C A G A Ile Ile Ile Met Thr Thr Thr Thr Asn Asn Lys Lys Ser Ser Arg Arg U C A G G Val Val Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly U C A G BIOFYSIK (ALMEN FYSIOLOGI) 1. ENHEDER I SI-SYSTEMET 1.1. Decimale multipla af SI-enheder dannes ved hjælp af forstavelser Multiplikationsfaktor Forstavelse Symbol Eksempler på omregninger tera T 10 9 giga G 10 6 mega M 10 3 kilo k 10 2 hekto h 10 deca da 10 1 deci d 10 2 centi c 10 3 milli m 10 6 mikro µ 10 9 nano n pico p femto f atto a 1 cm 3 = (10 2 m) 3 = 10 6 m 3 1µs 1 = (10 6 s) 1 = 10 6 s 1 1 mm 2 s 1 = (10 3 m) 2 s 1 =10 6 m 2 s 1 Sammensatte forstavelser bruges ikke. Fx skrives nm (nanometer) i stedet for mµm. Side 3

4 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, Grundenheder i SI-systemet Størrelse Navn Symbol Længde meter m Masse kilogram kg Tid sekund s Elektrisk strømstyrke ampere A Temperatur kelvin K Stofmængde mol mol Lysstyrke candela cd 1.3. Nogle afledede enheder i SI-systemet Størrelse Navn Symbol Dimension Kraft newton N kg m s 2 Energi, arbejde joule J kg m 2 s 2 = N m = V C Effekt watt W J s 1 = V A Tryk pascal Pa N m 2 Frekvens hertz Hz s 1 Elektrisk ladning coulomb C A s Elektrisk potential volt V kg m 2 s 3 A 1 = J C 1 Potentialforskel volt V kg m 2 s 3 A 1 = J C 1 Elektromotorisk kraft volt V kg m 2 s 3 A 1 = J C 1 Elektrisk modstand ohm Ω V A 1 Elektrisk ledningsevne (konduktans) siemens S Ω 1 = V 1 A Elektrisk kapacitet farad F C V Andre enheders sammenhæng med SI-enhederne Størrelse Navn Symbol Dimension Volumen liter l 10 3 m 3 = 1 dm 3 = 10 3 cm 3 Tryk atmosfære atm Pa Tryk mm Hg Torr 1/760 atm = 133,3 Pa Kraft dyn dyn 10 5 N Kraft kilogram-kraft kf 9,81 N Energi kalorie cal 4,1868 J Energi erg erg 10 7 J Energi liter-atmosfære l atm 101,3 J Energi elektronvolt ev 1, J Osmotisk koncentration osmol Osm* *Osm = T/1,86, hvor T er opløsningens frysepunktsdepression 1.5. Symboler for nogle størrelser, der anvendes inden for biofysik Navn Symbol Dimension Mobilitet B 1 m s 1 N Diffusionskoefficient D m 2 s 1 Elektrisk potential Ψ V Elektrisk potentialdifferens V = Ψ (1) Ψ (2) V Elektrisk felt dψ E = dx V m 1 Permeabilitetskoefficient P = D ( x) 1 m s 1 Fluks J mol m 2 s 1 Stofkoncentration C (M = molær) mol l 1 mol dm 3 Antal elementarladninger pr. dissocieret molekyle (regnet z helt tal med fortegn, dvs. positiv for kationer, negativ for anioner) Isotonisk forkortningshastighed v m s 1, cm s 1 Isotonisk belastning P N Maksimal tetanisk kraft P o N Side 4

5 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, FYSISKE KONSTANTER Navn Symbol Værdi Dimension Avogadros konstant N A 6, molekyler mol 1 Gaskonstanten R 8,314 1,987 J K 1 mol 1 cal K 1 mol 1 Boltzmanns konstant 1 k = R N A 1, J K 1 Faradays konstant F C pr. mol monovalent ion Elementarladningen 1 q e = F N A 1, C pr. univalent molekyle Standard tyngdeacceleration g 9,81 m s 2 Molekylære frysepunktsdepression 1,86 K pr. mol udissocieret stof pr. liter (ideal opløsning) 3. STOFTRANSPORT 3.1. Migration og diffusion Transportligningen Stofmængden J, som pr. tidsenhed passerer en arealenhed anbragt vinkelret på transportretningen (fluks, transportstrømtæthed) er givet ved J = v C = B C f stofmængde m 2 s 1 hvor v (= b f) er den stationære hastighed af de transporterede partikler, B disses mekaniske mobilitet og f er kraften, der virker på hver enkelt partikel. Stofmængden er bestemt ved koncentrationsmålet C (fx antal molekyler pr. m 3, kg stof pr. m 3, mol pr. m 3 etc.). Mængden S, som pr. tidsenhed passerer vinkelret på arealet A, er derfor S = A J stofmængde s Fick's lov for diffusion dc J= D stofmængde m 2 s 1 dx hvor D er stoffets diffusionskoefficient. For de fleste små molekyler og ioner er D for diffusion i vandig opløsning af størrelsesordenen 10 9 m 2 s 1 = 10 5 cm 2 s Diffusionskoefficienten D = k T B (Einstein-relationen); k er Boltzmann's konstant, T den absolutte temperatur. 2 s D = (Einstein-Smoluckowski ligningen), hvor 2t til tiden t; 2 s = s er mål for middelforskydningen til et givet tidspunkt, t. 2 s er middelværdien af de enkelte forskydningers kvadrater Transport ved samtidig migration og diffusion Nernst-Planck ligningerne for elektrodiffusion: kt dc+ dψ J + = B + C + + z+ qe C+ dx dx kt dc dψ J = B C + z qe C dx dx Permeabilitetskoefficienten αd αktb P = = m s 1 h h hvor α er fordelingskoefficienten for det transporterede stof mellem membranen og de to omgivende medier, og h er membrantykkelsen. Fick's lov for stoftransport gennem en membran ved diffusion i retningen i o: J = P [C (o) C (i) ] = P [C (i) C (o) ] Side 5

6 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, Ligevægtsfordeling af ioner over en selektivt permeabel membran Membranpotentialet kan ved ligevægt over en selektivt permeabel membran beregnes ved hjælp af Nernst ligning: (2) (1) (2) RT C V m = ψ - ψ = ln (1) zf C volt hvor C (1) og C (2) er koncentrationerne af den permeerende ion i de to faser, der adskilles af membranen. Bemærk at følgende - principielt forskellige - forhold kan vurderes ved hjælp af Nernst ligning: a) Membranpotentialet (ψ (1) ψ (2) ) såfremt den permeerende ion er i ligevægt mellem de to faser (nettotransporten J = 0). b) Såfremt der ikke er ligevægt i systemet, kan det beregnes ved hjælp af ligningen, hvilken potentialforskel, der skal etableres mellem de to faser for at opnå ligevægt for den permeerende ion ved de givne koncentrationer C (1) og C (2). Dette potential, der kaldes ionens ligevægtspotential, kan altså afvige fra membranpotentialet. Den potentialforskel, der skal etableres for at opnå ligevægt, skal netop være så stor, at nettofluksen J = 0. Det vil være undtagelsen, at potentialdifferensen mellem en celle og dens omgivelser kan udtrykkes ved Nernst ligning. Ligevægtspotentialet for en ion kan derimod altid beregnes af ligningen, når koncentrationerne i cellens og omgivelsernes vandfase er kendte Diffusionspotential Er membranen ikke ideelt selektiv permeabel for enten an- eller kationer således, at begge iontyper kan permeere membranen, opstår der et diffusionspotential, såfremt de to ioners bevægeligheder (B + og B ) er forskellige Osmose En opløsnings osmotiske tryk, frysepunktsdepression, damptryksnedsættelse og kogepunktsforhøjelse er de kolligative egenskaber ved opløsningen, som alle er et mål for aktiviteten af opløsningsmidlet (sædvanligvis vand). En opløsnings osmotiske tryk manifesterer sig først, når opløsningen bringes i kontakt med det rene opløsningsmiddel gennem en membran, som er selektivt permeabel kun for opløsningsmidlet. For tynde ideale opløsninger gælder van't Hoff's formel for det osmotiske tryk som en første ordens tilnærmelse Π = R T C hvor Π opløsningens osmotiske tryk. Trykenheden afhænger af de enheder for R, der anvendes. For en 1 molær opløsning af en anelektrolyt ved 0 C har man således Π = (8,314 J K 1 mol 1 (273 K) (10 3 mol m 3 ) = 2, Pa = 2, (9, atm) = 22,4 atm idet 1 Pa = 1/ atm = 9, atm. Størrelsen af det osmotiske tryk er primært bestemt af antallet af opløste partikler pr. volumenenhed og i mindre grad af opløste partiklers særlige egenskaber. En opløsning med osmolaliteten 1,0 har en frysepunktsdepression på 1,86 K. Adjektiverne isoosmotisk, hypoosmotisk og hyperosmotisk anvendes til at karakterisere, at en opløsning har samme, lavere eller højere osmotisk tryk (frysepunktsdepression) end en given referenceopløsning. Adjektiverne isoton, hypoton og hyperton anvendes for at karakterisere, om en normal celle vil ændre volumen (på grund af en osmotisk betinget nettobevægelse af vand), hvis cellen suspenderes i opløsningen. Vandtransport ved filtration og osmose gennem en ideel semipermeabel membran: (2) (1) (2) (1) Filtration: J HO= K 2 F[P P ]; C s= C C = 0 (2) (1) Osmose: J HO= K 2 F RT C s; P + P = 0 hvor C (1) og C (2) koncentrationerne af opløst stof i de to omgivende faser, og hvor P (1) og P (2) er trykket i disse. K F er filtrationskoefficienten som karakteriserer membranens gennemtrængelighed for vand drevet af en trykgradient både ved filtration og ved osmose Donnanfordeling af monovalente ioner, der kan permeere en membran En donnanfordeling indtræder, når to elektrolytopløsninger, hvoraf den ene indeholder en makroion, bringes i kontakt med hinanden gennem en semipermeabel membran, som kun er impermeabel for makroionen (f.eks. proteinmolekyler). Ved ligevægt har hver kation (+) og anion (-), som kan permeere membranen, fordelt sig mellem de to faser (1) og (2) i overensstemmelse med nedenstående formel Side 6

7 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, 2000 eller C C = C C (1) (1) (2) (2) + + C C C (1) (2) + = (2) (1) + C Ved ligevægt findes der en potentialforskel over membranen (Donnan-potentialet), hvis størrelse kan beregnes ud fra Nernst' ligning. Tilstedeværelsen i den ene fase af en makroion, der ikke kan permeere membranen, medfører, at ligevægt ikke kan etableres, med mindre der etableres et overtryk (kolloid-osmotisk tryk) på den fase, der indeholder makroionen. 4. NERVEFYSIOLOGI 4.1. Perifere nerver Nervemembranens tykkelse er af samme størrelsesorden som de fleste cellemembraner hos dyr, 0, m = 5-10 nm ( Å). Membrankapaciteten, C m, (udtrykt pr. m 2 membran) er ca F m 2 = 1 µf cm 2. Membranmodstanden, R m, er den elektriske modstand af en arealenhed nervemembran. Den hvilende nerves membranmodstand (blækspruttens kæmpeaxon) er ca. 0,1 Ω m 2 = 1000 Ω cm 2. Ledningsevnen (konduktansen) G m = R 1 m er derfor ca. 10 S m 2 = 1 ms cm 2 (= 1 mmho cm 2 ). Den exciterede membrans samlede konduktans øges indtil ca. 40 gange værdien i hvile. Konduktansen for Na + øges under excitationen forbigående til ca. 500 gange (den meget lave) hvileværdi (0,04 mmho cm 2 ). Den specifikke resistans, ρ i, af axoplasma er af størrelsesordenen 1-3 Ω m eller svarende til Ω cm. Hvilemembranpotentialet, V m = ψ (i) ψ (o) = ca. 70 mv, hvor ψ (i) og ψ (o) er det elektriske potential i henholdsvis axoplasma og yderfasen (interstitiel væske, havvand). Transmembran potentialmåling er mulig på kæmpeaxoner ved hjælp af mikroelektrodeteknik. Målinger på nerveceller i CNS hos pattedyr har givet membranpotentialer af samme størrelse ( 70 mv). I den hvilende blækspruttenerve er forholdet mellem permeabiliteten af K +, Cl og Na + = 1: 0,5 : 0,025. Membrankonduktansen, G j, for en ion af typen j er defineret ved eq I = G ( V V ) j j m j eq hvor I j er den transmembrane strøm pr. arealenhed, båret af iontypen j, og hvor V j er ligevægtspotentialet over membranen for denne iontype. Aktionspotentialets amplitude målt transmembranalt er mv og varer ca. 1 ms. Tærskelirritamentet er den laveste irritamentstyrke, som under de givne betingelser kan udløse en nerveimpuls. Tærskelpotentialet er det V m, hvor et aktionspotential udløses. Irritabilitetsændringer i umiddelbar tilslutning til stimulationen: a) irritamentstyrker mindre end tærskelirritamentet fremkalder i det stimulerede membranområde en fase med forbigående forøget irritabilitet; b) med irritamentstyrker større end tærskelirritamentet gennemløber det aktiverede membranområde følgende forbigående irritabilitetsændringer: først er membranen inexcitabel (den absolut refraktære periode), dernæst en fase, hvor irritabiliteten gradvis tiltager mod udgangsværdien (den relativt refraktære periode). Refraktærperiode i α-tråde fra n. ischiadicus hos frø har en absolut refraktær periode på ca. 1 ms og relativ refraktær periode på 3-4 ms. Rheobase er tærskelirritamentet for et "rektangulært" strømstød af vilkårlig lang (uendelig) varighed. Chronaxi er varighed af det tærskelirritament, hvis styrke er lig med den dobbelte rheobase. Nerveledningshastighed er bl.a. bestemt af axonernes diameter, myelinbeklædning og temperaturen. A-fibre: 1. α Tråde fra proprioreceptorer og somatiske, motoriske tråde: µm, m s 1 2. β Tråde for berøring og tryk: 5-12 µm, m s 1 3. γ Motoriske tråde til muskulatur: 3-6 µm, m s 1 4. δ Tråde for smerter og temperatur: 2-5 µm, ca. 10 m s 1 Side 7

8 Documenta Biochimica et Biophysica, 4. udgave, 2000 B-fibre: Præganglionære sympatiske tråde: <3 µm, 3-5 m s 1. C-fibre: Postganglionære og afferente autonome tråde: 0,3-1,3 µm; 0,6-2,3 m s Synaptisk transmission Den synaptiske spalte (afstanden fra det præsynaptiske til det postsynaptiske membrankompleks) er sædvanligvis m (= Å), men værdier ned til m er målt. Den synaptiske forsinkelse er tiden, der forløber fra ankomsten af nerveimpulsen til den præsynaptiske terminal, indtil en potentialændring over den postsynaptiske membran netop kan registreres. Den postsynaptiske responstid er tiden herefter indtil tidspunktet for etableringen af et aktionspotential (klarest defineret ved den neuromuskulære transmission). Begge tider er ca. 0,5-1 ms. Ved den neuromuskulære synapse (motoriske endeplade) er varigheden af endepladepotentialet ca. 15 ms. I interneuronale synapser varer de synaptiske potentialer fra få ms til flere hundrede ms. Frigørelse af excitatorisk transmitter fremkalder en samtidig forøgelse af membranens konduktans for Na + og K +, hvilket fører til en depolarisering af membranen. For at denne skal resultere i et propageret aktionspotential, kræves der fx ved den motoriske endeplade en depolarisering på mv. Nerveimpulser i hæmmende tråde fremkalder en frigørelse af inhibitorisk transmitter fra det præsynaptiske membrankompleks, som øger den postsynaptiske membrans konduktans for K + eller Cl. Denne konduktansforøgelse fører til en stabilisering af membranpotentialet omkring ca. -70 mv eller til en hyperpolarisation til ca. -80 mv: det inhibitoriske postsynaptiske potential (IPSP). Et enkelt neuron kan indgå i fra få hundrede op til ca synapser (Purkinje-celler). Integration og sortering af indkommende signaler sker ved samspillet mellem excitatoriske og inhibitoriske synapser (summation). 5. MUSKELFYSIOLOGI Nedenstående data gælder for tværstribet muskulatur fra frø ved ca. 20 ºC: 5.1. Strukturelle forhold Fiberdiameter µm Fibrildiameter 1 2 µm Sarkomerlængde i slap tilstand ca. 2,2 µm Længde af A-filamenter 1,5 µm Længde af I-filamenter målt fra Z-linien 1,0 µm 5.2. Elektriske forhold Membranpotential i hvile, V m = ψ (i) ψ (o) mv Aktionspotentialets amplitude mv Varighed af spidspotential ca. 2 ms Varighed af "halen" (repolarisationen fra ca. -70 mv til V m ) ms Tærskelpotential for udløsning af aktionspotential ca. 60 mv Tærskelpotential for aktivering af kontraktile system ca. 55 mv 5.3. Mekaniske egenskaber Den isometriske enkeltkontraktion har en latenstid på 2-5 ms. Kontraktionens varighed er ms, og maksimum for kraftudviklingen nås efter ms. En glat isometrisk tetanisk kontraktion kræver en stimulationsfrekvens på Hz. Den maksimale, isometriske kontraktionskraft pr. enhed tværsnitsareal er N cm 2. Ved isotonisk kontraktion kan den funktionelle sammenhæng mellem den initiale forkortningshastighed, v, og belastningen, P, beskrives ved Hill's formel: (P + a) v = (P o P) b hvor a og b er konstanter. P o er den isometriske tetaniske kraft (v = 0) ved den pågældende længde. Den maksimale forkortningshastighed (svarende til belastningen P = 0) er af størrelsesordenen 10 cm s 1 = 0,1 m s 1. Side 8

9 Note 5 til biofysik: En kort introduktion til elektricitetslære Side 1 NOTE 5 TIL BIOFYSIK EN KORT INTRODUKTION TIL ELEKTRICITETSLÆRE af H. P. Nissen-Petersen Skønt basale funktioner i den menneskelige organisme er baseret på elektriske fænomener, er mennesket ikke udstyret til at sanse elektriske størrelser. En fornemmelse for elektriske systemer er derfor baseret på vores forestillingsevne, og de fleste får, i hvert fald i starten, behov for at danne sig sådanne billeder og modeller, som forekommer den enkelte mere naturlige, og som afspejler de elektriske lovmæssigheder. I det følgende og i et kommende afsnit om membranmodeller vil der på denne baggrund blive draget analogier til andre områder af fysikken. Analogierne er indrammede. Som elektrisk mængdeangivelse bruges ladning, som måles i coulomb, der skrives C. Det svarer til masse, som måles i kilogram, der skrives kg. Ladninger findes både positive og negative. Der findes (så vidt vides) kun een slags masse. To ladninger, Q 1 og Q 2 med forskelligt fortegn tiltrækker hinanden med en kraft K, bestemt af Coulomb s lov: Q Q K = k r hvor k er en konstant (tilpasset enhedssystemet) og r er afstanden mellem de to ladninger. Har de to ladninger samme fortegn vil de frastøde hinanden med nævnte kraft. To masser, M 1 og M 2 tiltrækker hinanden med en kraft K bestemt af massetiltrækningsloven: M M K = k r hvor k er en konstant (tilpasset enhedssystemet) og r er afstanden mellem de to masser. I rummet omkring en ladning eksisterer altså kræfter, som vil påvirke andre emner, der har en elektrisk ladning (og kun dem). Man siger en elektrisk ladning skaber et elektrisk felt. Man definerer feltstyrken E, som kraften på en enhedsladning: +1C (enhed: N C 1, newton pr. coulomb). Da kraften K er proportional med ladningens størrelse Q findes (se Coulomb s lov): K = Q E hvor K er kraften målt i N (newton), Q er ladningen målt i C (coulomb) og E er feltstyrken, enhed: N C 1. Kraften K er en vektor, der karakteriseres den både ved en størrelse (numerisk værdi) og en retning. På et givet sted i rummet kan kraftpåvirkningerne fra flere omliggende ladninger Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

10 Note 5 til biofysik: En kort introduktion til elektricitetslære Side 2 adderes som vektorer ( kræfternes parallelogram ), og der kan opstå meget komplicerede felter. Ved at tegne linier, de såkaldte kraftlinier, med en retningsangivelse (en pil) og med en vis tæthed, kan man grafisk illustrere, hvorledes feltet (kraften på en enhedsladning) i et udstrakt område varierer. På et givet sted skal retningen på (tangenten til) kraftlinierne angive feltets retning, og tætheden (linier pr arealenhed) skal angive feltets størrelse. +Q Det enkleste eksempel er feltet omkring en positiv ladning +Q (der befinder sig helt alene i rummet). Set i et plan, vil kraftlinierne stråle radialt bort fra ladningen, som egerne fra navet i et cykelhjul. Dette feltbillede, i eet plan, er i overensstemmelse med Coulomb s lov. Da kuglearealet er proportionalt med afstandskvadratet og kraftlinieantallet konstant, vil kraftlinietætheden (rummeligt set) og dermed feltstyrken (kraften på +1C) aftage med kvadratet på afstanden, som udtrykt i Coulomb s lov. Vendes pilene illustrerer figuren feltet omkring en negativ ladning -Q. Et andet eksempel, yderst relevant for cellebiologien, er feltet mellem to (uendeligt store) planer, hvorpå der jævnt fordelt sidder henholdsvis positive og negative ladninger. For at finde feltstyrken et givet sted mellem planerne skal man altså her finde kraften på den positive enhedsladning, +1C, ved at addere kraftpåvirkninger fra de (uendelig mange) positive og negative ladninger på planerne _ Det viser sig (ved hjælp af Coulomb s lov og lidt matematik), at feltstyrken er konstant overalt mellem de to planer, og vinkelret på disse. Feltet siges at være homogent. Uden for planerne er feltet nul. Eksemplet kunne forestille det elektriske felt inde i en biologisk membran, der ( i hvile ) groft set ikke er ledende, og hvor der typisk på indersiden er overskud af negative ladninger og på ydersiden af positive. Elektrisk potential. For at flytte ladninger i et område, hvor der hersker elektriske kræfter, kan det i nogle situationer kræve et arbejde, i andre kan man få udført et og endelig kan slet intet arbejde være involveret. Det afhænger af kraften og dens retning i forhold til vejstrækningen og dennes retning (arbejde er vejlængde multipliceret med kraftens komposant i vejretningen). Den energi, der modsvarer det udførte arbejde på ladningen, oplagres i ladningen som potentiel energi. Omvendt vil ladningen miste potentiel energi, hvis den må udføre et arbejde ved flytningen. Tænk på den analoge situation i et gravitationsfelt, der påvirker to lodder, som begge har massen m. Det ene står på gulvet, det andet er løftet op på et bord. Hvis bordet har højden h, har loddet på bordet en potentiel energi på m g h (tyngdekraft gange løftelængde) større end loddet på gulvet. Denne potentielle energi ville kunne omsættes til arbejde, ved f. eks at lade loddet falde ned på gulvet. Først ville energien omsættes til bevægelsesenergi og derefter til varme (og lidt lyd), når loddet rammer og opbremses af gulvet. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

11 Note 5 til biofysik: En kort introduktion til elektricitetslære Side 3 Enheden for energi (arbejde) er N m = kg m 2 s 2, som kaldes joule og skrives J. I et elektrisk felt er det elektriske potential på et givet sted defineret som energien af en enhedsladning på stedet (i forhold til en placering i et feltfrit rum, altså uendeligt fjernt fra de ladninger, der skaber feltet (og kræfterne)). Enheden for elektrisk potential bliver derfor J C 1 (joule pr. coulomb), som kaldes volt og skrives V. Som oftest indgår potentialforskelle i problemstillingerne. På dansk bruges betegnelserne spænding og potential i flæng. Som eksempel beregnes potentialforskellen mellem to planer, på hvilke der sidder fordelt henholdsvis positive og negative ladninger med en ladningstæthed Q A 1 (ladninger pr. arealenhed). Afstanden mellem planerne er l og feltstyrken mellem planerne er E (se tidligere figur). Opladningen er sket ved aktivt med energiforbrug at flytte positive ladninger fra det ene plan (som derved bliver efterladt negativt ladet) og føre dem til det andet plan (som derved bliver positivt ladet). At føre endnu en enhedsladning fra det negative plan til det positive kræver et positivt arbejde, da kraften på enhedsladningen E er rettet mod bevægelsesretningen. Arbejdet W bliver da: W = E l (kraft gange vej) svarende til en potentiel energitilvækst U for ladningen på U = E l. Hvis man derfor kender potentialforskellen U mellem planerne (i biologiske situationer vil man ofte kende det såkaldte membranpotential) og afstanden mellem dem, kan man beregne feltstyrken mellem dem som E = U l Dermed vil man kende de elektriske kræfter på elektrisk ladede partikler, fx ioner, der befinder sig i membranen. Som enhed for feltstyrke anvendes derfor ofte V m 1 (volt pr. meter). (Kontrol af enheden: V m 1 (volt pr. m) = J C 1 m 1 = N m C 1 m 1 = N C 1 (newton pr. coulomb), som iflg. definitionen var enheden for feltstyrke). Ovennævnte betragtninger har forudsat statiske forhold, hvor ladninger ikke bevæger sig, selv om de er påvirket af kræfter. De indgående materialer karakteriseres som isolatorer, og forholdene her kaldes elektrostatiske. Når materialerne er elektrisk ledende (fx metaller og elektrolytopløsninger), vil ladninger kunne bevæge sig under påvirkning af elektriske kræfter, og elektriske strømme vil opstå. Man definerer elektrisk strøm, som det antal coulomb, der pr. tidsenhed strømmer gennem et tværsnit vinkelret på udbredelsesretningen. Man bruger typisk bogstav I for elektrisk strøm, og enheden bliver da C s 1 (coulomb pr. sekund) som kaldes ampere og skrives A. Man taler også om strømtæthed og mener dermed strømmen pr. arealenhed. Er den samlede strøm I gennem en flade med arealet S, bliver den gennemsnitlige strømtæthed I S -1 (ampere pr. kvadratmeter). Strømmens størrelse i en leder af et bestemt materiale bliver rimeligt nok bestemt af, hvor vanskeligt det er for ladningerne at bevæge sig i lederen og den energi, der er til rådighed for dette arbejde. Man definerer derfor lederens modstand R, som bliver bestemmende for strømmens størrelse I ved en given energi, der er udtrykt ved potentialforskellen U mellem lederens endeflader. Jo større modstand, des mindre strøm. Hersker der simpel omvendt proportionalitet, kan dette udtrykkes gennem Ohm s lov: U = R I Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

12 Note 5 til biofysik: En kort introduktion til elektricitetslære Side 4 Enheden for R bliver: V A 1 = J C 2 s, som kaldes ohm, der skrives Ω (græsk: omega). I biologien foretrækkes ofte at karakterisere en leder ved sin ledningsevne G, som den reciprokke værdi af modstanden R G = 1 R Ohm s lov omskrives da til I = G U der med ord udtrykker, at jo større (bedre) ledningsevne G en leder har og jo større potentialforskel U, der er til rådighed, jo større bliver strømmen I. Enheden for ledningsevne er Ω 1, som kaldes siemens og skrives S. En vittig sjæl har engang foreslået mho, som nu anvendes fuldt legalt. Ofte anvendes de afledte enheder, med foranstillet m (milli = 10 3 ) og µ (mikro = 10 6 ). Den analoge vandmodel til illustration af Ohm s lov ville være en pumpe, der skaber tryk og dermed leverer den energi, som får vandet til at strømme gennem en (snæver) slange. Energien bruges til at overvinde gnidningsmodstanden i slangen. Vandtrykket (enhed pascal = N m 2 (newton pr. arealenhed) eller J m 3 (energi pr. mængdeenhed) svarer til elektrisk potential (enhed volt = J C 1 (energi pr. mængdeenhed)). Vandstrømmen (enhed m 3 s 1 (mængde pr. sekund)) svarer til elektrisk strøm (ampere = C s 1 (coulomb pr. sekund) = el-mængde pr. sekund)). Gnidningsmodstanden kaldes den hydrodynamiske modstand og svarer til den elektriske modstand. Jo længere slangen er, des sværere bliver det at strømme igennem: modstanden vokser. Bliver derimod slangen tykkere strømmer vandet lettere: modstanden mindskes. I en elektrisk leder defineres begrebet specifik modstand ρ, som modstanden mellem to modstående flader i en terning af det aktuelle materiale, der måler een meter på hver led. Som i vandmodellen vokser modstanden med længden l af lederen, og mindskes med arealet S, dvs. ρ l R = S Drejer det sig fx om modstanden på tværs gennem en membran, vil modstanden vokse med tykkelsen (længden), men aftage med arealet. For en membran med en vis tykkelse vil man typisk angive modstand r pr. arealenhed r (og ikke den specifikke modstand ρ). Modstanden R af hele arealet S af denne membran vil da være R = r og enheden for r må være Ω m 2 S (og ikke Ω pr. m 2 pga. den omvendte proportionalitet mellem R og S). I øvelsen selektivt permeable membraner i det cellebiologiske kursus indledes med eksperimenter med simple elektriske kredsløb. Her kan læses yderligere om Ohm s lov, serie- og parallelforbundne modstande og kredsløb med to spændingskilder (Kirschoffs lov). Senere, i et efterfølgende afsnit om membranmodeller, gennemgås kapacitets-begrebet og et simpelt ohmsk kabel (med tab), som grundlag for forståelsen af nerveaktionspotentialets udbredelseshastighed og udbredelseslængde. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

13 Teoretisk gennemgang af elektrisk kapacitet og membranmodeller. (03/01) Indledning: I den tidligere omtalte kort introduktion til elektricitetslære forud for øvelse med ionselektive membraner blev de grundlæggende definitioner vedr. elektriske kræfter og de elementære regler for jævnstrømskredsløb gennemgået: Coulombs lov, som beskriver elektriske kræfters afhængighed af ladninger og afstande. Elektrisk feltstyrke E på et givet sted blev defineret som kraften på en enhedsladning +1C på stedet (enhed: N/C = newton pr coulomb). Elektrisk spænding (potential) U blev defineret som elektrisk energi, knyttet til ladninger. (enhed: V = volt = joule pr coulomb). Elektrisk strøm I blev defineret som antal ladninger, der pr sekund passerer det aktuelle tværsnit (enhed A = ampere = coulomb pr sekund). Elektrisk modstand R defineredes udfra den lineære sammenhæng mellem strøm og spænding (Ohms lov): U = R I I det følgende gennemgås kapacitetsbegrebet og de membranmodeller, som indgår i biofysikøvelsen om nerven. Elektrisk Felt: Nedenstående figur viser to planer, hver med areal S i afstanden a, hvor der (ved brug af energi) er flyttet Q positive ladninger fra den nederste plade til den øverste Q Potentialforskel U Feltstyrke E afstand: a Planareal: S Q Man kan vise, at feltstyrken E mellem planerne, hvis planerne er store, er konstant overalt (et homogent felt) og har størrelsen: Q 1 E = S Kε 0, hvor Q/S betegnes ladningstæthed, og ε 0 og K er konstanter Elektrisk potential: For at beregne forholdet mellem antallet Q af fordelte ladninger og den derved opståede potentialforskel mellem planerne, føres en enhedsladning +1C fra det negative plan til det positive. Det nødvendige arbejde W hertil (kraft gange vej) er: W = E a (enhed: J = joule), som modsvarers af ladningens potentialtilvækst, og dermed udtrykker potentialforskellen (spændingsforskellen) U mellem planerne: U = E a = Q (K ε 0 S) -1 a (enhed J/C = volt) som kan skrives: Q = C U, hvor C = K ε 0 S a -1 (1) 1

14 Elektrisk kapacitet: Q = C U Der er altså proportionalitet mellem det antal ladninger Q, som er fordelt mellem planerne, og den potentialforskel U som derved er opstået. Proportionalitetsfaktoren C kaldes kapaciteten (eng: capacitance) mellem planerne. Kapaciteten vokser med planernes areal S og aftager med deres afstand a. ε 0 = 8, C 2 N -1 m -2 er en konstant, tilpasset enhedssystemet. K er en dimensionsløs materialeafhængig konstant, som benævnes dielektricitetskonstanten (K = 1 i vacuum og K > 1 for andre isolationsmaterialer, som fylder mellemrummet mellem planerne). Enheden for kapacitet bliver: C V -1 = C 2 s 2 kg -1 m -2, som kaldes farad ( blødt d ) og skrives F. Oftest bruges de afledede enheder: µf (microfarad = 10-6 F), nf (nannofarad = 10-9 F) og pf (picofarad = F). NB! Bogstav C bruges både som forkortelse for den elektriske ladningsenhed coulomb og til at indikere kapacitet. Opladning af kondensator. Den hastighed, hvormed spændingen U over en elektrisk kondensator lader sig ændre, afhænger af ladestrømmen. Denne fortæller, hvor mange ladninger der pr tidsenhed kan flyttes mellem pladerne. Denne elektrisk strøm I(t) (enhed: A = ampere = coulomb pr tid), leveres i nedenstående figur fra en generator. I(t) Generator I(t) C Q Q U(t) Den hastighed, hvormed spændingen ændres, kan matematisk udtrykkes ved at differentiere ligning (1) m.h.t. tiden: dq du( t = I( t) = C ) (2) dt dt der udtrykker, at du(t)/dt (volt/sekund), afhænger af strømmen I(t) (ladninger pr sekund) og af kapaciteten C. Således vil en stor kondensator (med stor kapacitet) ændre spændingen relativt langsomt ved en given ladestrøm, men større ladestrøm giver større hastighed. En uendelig hurtig spændingsændring er ikke mulig, da det ville kræve en uendelig stor strøm! Under opladning går der ingen strøm i mellemrummet mellem pladerne i kondensatoren. Ladningerne fjernes fra den negative plade, føres som strøm i ledningerne og hober sig op på den positive, alt imens spændingen U(t) mellem pladerne vokser. t 1 Integreres ligning (2) fås: U( t) = I( t) dt+ U0 C 0 2

15 Der viser, at spændingen på kondensatoren til tiden t er proportional med summen af de ladninger, som ladestrømmen har tilført, og at denne spænding er omvendt proportional med kapaciteten (U 0 er en evt begyndelsesspænding). Oplagret energi: Energien (leveret af generatoren), der er medgået til opladningen til U volt, er oplagret i det elektriske felt, som er opbygget mellem pladerne, og det beregnes ved at summere arbejdsbidragene ved flytningen af alle ladningerne. Arbejdet afhænger af, hvor stor spændingen (eller feltet) er blevet på det aktuelle stade. Hvis spændingen, når der er flyttet q ladninger, er U(q) (volt = joule pr coulomb) bliver arbejdet dw med at flytte det næste ladningsbidrag dq: dw = U(q) dq Idet q = C U(q) findes dq = C du(q) som indsat ovenfor giver: dw = C U(q)dU(q), der ved integration fra U(t) = 0 til U giver Denne energi vil genvindes ved afladning af kondensatoren. Parallelforbindelse af kondensatorer. = 0 W U CU ( q) du( q) = ½ C U 2 C 1 C 2 C 3 C n C p De to systemer har samme kapacitet, hvis der opnås samme spænding U, når de oplades med samme ladning Q p = Q 1 + Q 2 + Q 3 + +Q n. Q 1 =C 1 U, Q 2 =C 2 U, Q 3 =C 3 U, Q n = C n U og Q p = C p U, der indsat ovenfor giver: U C p = U ( C 1 + C 2 + C C n ) eller C p = C 1 + C 2 + C C n Serieforbindelse af kondensatorer. C 1 C 2 C 3 C n C s Imellem de serieforbundne kondensatorer sker samme ladningsforskydning, som i de ydre tilledninger, således at de serieforbundne kondensatorer oplades med samme strøm (og dermed samme ladning), men til individuelle spændinger: Q s = Q 1 = Q 2 = Q 3 = Q n. og U 1 + U 2 + U 3 + U n. = U U 1 =Q/C 1, U 2 =Q/C 2, U 3 =Q/C 3, U n = Q/C n og U = Q/C s, der indsat ovenfor giver: Q ( 1/C 1 + 1/C 2 + 1/C 3 + +!/C n ) = Q 1/ C s eller 1/ C s = 1/C 1 + 1/C 2 + 1/C /C n 3

16 Reglerne for at sammensætte parallel- og serieforbundne kondensatorer er altså lige omvendt af reglerne for sammensætning af modstande: Parallel: 1/R p = 1/R 1 +1/R 2 +1/R /R n Serie: R s = R 1 +R 2 +R R n Membranmodellerne. 1. Den kugleformede celle. Figuren til venstre viser en kugleformet celle. En elektrode er anbragt i cellens indre, og til tiden t = 0 udsendes fra elektroden en strøm konstant I m, som passerer membranen og samles op af en ydre elektrode (ikke er vist). Formålet med eksperimentet er at studere indflydelsen fra de karakteristiske størrelser R m og C m på den opståede ændring af membranspændingen U m. Figuren til højre viser et elektrisk ækvivalent kredsløb. Im Im R m C m U m Im Igennem membranen deler den konstante membranstrøm I m sig i en del I r (t), der løber gennen modstanden R m og en del I c (t), som er ladestrøm til C m. I. flg. Kirschoffs lov, der vedrører et knudepunkt, gælder til ethvert tidspunkt.: I m = I r (t)+ I c (t) endvidere er (til tiden t) I r (t) = U m (t)/r m (Ohms lov) og I c (t) = C m du m (t)/dt (af ligning (2)) der indsat ovenfor giver: I m = U m (t)/r m + C du m (t)/dt eller U m (t) + R m C m du m (t)/dt = R m I m (3) Denne ligning er en såkaldt første ordens (lineær og homogen) differentialligning. Den udtrykker, at summen af membranspændingen og en brøkdel (R m C m ) af den hastighed, hvormed membranspændingen ændrer sig, altid har den konstante værdi R m I m. (Alle leddene i ligningen har enheden volt, idet R m C m har enheden sekund.) I det øjeblik, hvor I m påtrykkes (t = 0), antages at U m (0) = 0, og af (3) ses, at membranspændingen da vokser med den maksimale hastighed, som er: du m (0)/dt = (R m I m ) / (R m C m ) = I m / C m (4) 4

17 Til t = 0, hvor I m påtrykkes, vil I r (t) være nul, da U m (0) er nul, og hele I m bliver da ladestrøm, altså I c (0) = I m. Efterhånden som C m oplades og U m (t) dermed vokser, må du m (t)/dt aftage mod nul, når U m (t) nærmer sig spændingen R m I m. For t = uendelig bliver derfor I r = I m. Denne opvoksen af U m (t) fra nul mod R m I m med aftagende hastighed, kan beskrives matematisk som løsningen til ligning (3): hvor τ = R m C m kaldes systemets tidskonstant. U m ( t) = R m Im(1 e Det grafiske forløb af de omtalte størrelser er skitseret nedenfor. t τ ) I m I r I m I c I m R m I m U m 63% 0 τ t sec Øverst ses den påtrykte membranstrøm I m, og herunder delstrømmene I r og I c. Nederst er vist den deraf opståede membranspændingsændring U m,, som vokser eksponentielt mod slutværdien R m I m. Til t = τ antager membranspændingen værdien U m (τ) = R m I m (1-e -1 ) = 0.63 R m I m Til t = 0 er kurvens hældning (begyndelsestangenten s) tidligere bestemt af (4) til du m (0)/dt = (R m I m ) / (R m C m ) = (R m I m )/τ 5

18 Denne begyndelsestangent skærer slutværdien til tiden t = τ. Med kendskab til I m, kan man således af kurvens slutværdi bestemme R m, og af kurvens begyndelsestanget (eller af tidskonstanten) bestemme C m. (ligning (4) For et eksponentialt forløb, f. eks. ovennævnte tidsmæssige opvoksen, gælder det, at tangenten til et vilkårligt punkt på kurven vil skære slutværdien i afstanden tidskonstanten τ fra punktet. Eller sagt på en anden måde: Hvis forløbet fortsatte (lineært) med den hastighed, det har til et givet tidspunkt, ville slutværdien nås i løbet af tiden τ. Den cylinderformede celle. Et membranpotential U m, påtrykt nervens indre (i forhold til det uendelig godt ledende ydermedie) vil udbrede sig i x-aksens retning, på langs i nervens indre. Afhængigt af den indre langsgående modstand r l og af membranmodstanden r m vil potentialet aftage med voksende afstand fra stimulusstedet. I nedenstående betragtninger og beregninger er bl.a. membrankapaciteten udeladt, hvorfor kun membranpotentialets stationære udbredelse betragtes, og ikke dets tidsmæssige forløb. Figuren til venstre viser en nerve, som elektrisk er karakteriseret ved en langsgående modstand r l (Ω/m) (pr. længdeenhed af nerven) og en membranmodstand r m (Ω m) (pr. længdeenhed af nervens membranareal) (Bemærk enheden: Ω m). Figuren i midten viser en tynd skive med tykkelsen dx, så tynd at langsgående strøm i l og udgående membranstrøm i m kan regnes for konstante. Den langsgående strøm, der forlader skiven bliver i l di i. Figuren til højre viser det elektriske ækvivalente kredsløb af skiven. Først en overordnet kvalitativ betragtning: Membranspændingen U m (x) i afstanden x afhænger af membranspændingen umiddelbart før segmentet og af det indre spændingsfald i segmentet. Dette spændingsfald d(u m (x)) afhænger af modstanden R l og af strømmen i l, hvoraf en del er membranstrømmen, som igen afhænger af modstanden R m og af U m (x). Altså: spændingen afhænger af spændingsfaldet, der igen afhænger af spændingen. Denne afhængighed udtrykkes matematisk: Den indre modstand er proportional med længden: R l (Ω) = r l dx Membranmodstanden er omvendt proportional med arealet, og dermed med længden: R m (Ω) = r m /dx 6

19 Af Kirschoff s knudepunktslov findes: i m (x) = - d(i l (x)) (5) Faldet i membranspænding skyldes spændingsfaldet over R l : d(u m (x))=-i l (x) R l =-i l (x) r l dx eller d(u m (x))/dx = - r l i l (x) (6) Membranstrømmen bestemmes af membranspænding og membranmodstand: i m (x) = U m (x)/r m = (1/r m ) U m (x) dx Indsættes (5) heri fås: - d(i l (x)) = (1/r m ) U m (x) dx (7) Ligning (6) differentieres: d 2 (U m (x))/dx 2 = - r l d(i l (x)) dx og (7) indsættes: d 2 (U m (x))/dx 2 = - r l d(i l (x)) dx = r l (1/r m ) U m (x) dx, der omformes til: d 2 (U m (x))/dx 2 (r l /r m ) U m (x)dx = 0, Løsningen antages at have formen: U m (x) = A e Bx (8) For x = 0 antager U m (0) værdien U m,der indsat i (8) giver: A = U m, U m (x) = U m e Bx (9) Løsningen (9) indsættes i diferentialligningen: B 2 U m e Bx - (r l /r m ) U m e Bx = 0 1 hvoraf : B = rm rl Den endelige løsning bliver da: m m x λ U ( x) = U e hvor λ = r r m l kaldes længdekonstanten. Membranspænding aftager altså eksponentielt med afstanden fra stimulusstedet. Det samme gør både den langsgående strøm og membranstrømmen. 7

20 Nedenfor er membranspændingens eksponentielt aftagende forløb vist: U m (x) U m U m λ x mm For x = λ fås U m (λ) = U m e -1 = U m 0.37 Kurvens hældning findes ved differentation: x d( Um( x)) U m λ = e dx λ For x = 0 bliver hældningen -U m /λ, og begyndelsestangenten vil da skære y-aksen i afstanden λ fra 0-punktet. Hvis kurven havde fortsat faldet lineært med begyndelseshældningen, var spændingen blevet nul i afstanden λ fra stimuluspunktet. Imidlertid aftager hældningen også (eksponentielt) med afstanden fra stimulusstedet. Det gælder for et hvert punkt, at tangenten til kurven vil skære x-aksen i afstanden λ fra punktet. Som nævnt tidligere er der i ovenfor gennemførte betragtninger og beregninger bl.a. ikke taget hensyn til tidsafhængigheden, knyttet til membrankapaciteterne og den hertil hørende ladestrøm. Ovenstående kurve viser derfor den værdi, som membranspændingen ville nå, når membrankapaciteterne på et givet sted var helt opladede (altså efter uendelig lang tid). Forår 2001, Hans Peter Nissen-Petersen 8

21 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 1 INDLEDNING BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS I biofysik (almen fysiologi) i det cellebiologiske kursus behandles følgende områder: 1. TRANSPORTPROCESSER 2. ALMEN NERVEFYSIOLOGI 3. CELLULÆR SIGNALERING 4. IMPULSTRANSMISSION OVER CELLEGRÆNSER 5. ALMEN SANSEFYSIOLOGI 6. ALMEN MUSKELFYSIOLOGI Undervisningen i biofysik baseres på Noter til biofysik ( o Note 1: Migration og diffusion o Note 2: Membranpotentialer o Note 3: Receptorer o Note 4: Opklarende note om transport o Note 5: En kort introduktion til elektricitetslære o Note 6: Teoretiske gennemgang af "elektrisk kapacitet" og "membranmodeller" Alberts et al.: The Cell, 4. udgave (1994) ELLER Lodish et al.: Molecular Cell Biology, 4. udgave (2000) Berne & Levy: Physiology, 4. udgave (1998) Vejledninger i biofysikøvelser ( o Øvelse 1: Membrantransport o Øvelse 2: Nerveimpulsen o Øvelse 3: Sensoriske receptorer o Øvelse 4: Muskelkontraktionen Læsevejledningen anfører ikke alle de forudsætninger i matematik, fysik og kemi, som er nødvendige for forståelsen af stoffet. Til hjælp ved indlæringen er sådanne forudsætninger tjener bl.a. notesamlingen. Som eksempler herpå er afsnittene om elektrisk felt og potential i note 1 (Migration og diffusion). Stof af denne type vil ikke blive afkrævet som samlet besvarelse, men det er nødvendigt for tilegnelse af lærestoffet at være fortrolig med begreber som elektrisk felt, elektrisk potential og elektrisk kapacitet. Lignende forhold gælder en række andre fysiske begreber som kraft, energi, effekt, tryk etc., der står anført i Documenta Biochimica et Biophysica ( Ved henvisninger til undervisningsmaterialerne anvendes forkortelserne N1, N2, N3 og N4 (noterne), A (Alberts et al.), L (Lodish et al.), B&L (Berne & Levy) og Ø1, Ø2, Ø3 og Ø4 (øvelserne) I det følgende har vi defineret de adfærdstermer - efter Blooms taksonomi - der anvendes i denne læsevejledning: definere og beregne: er præcise udtryk og skulle ikke volde vanskeligheder. angive: oplyse om en størrelse, f. eks. om en koncentration eller et koncentrationsinterval, eller oplyse om indgående faktorer i en relation (f. eks. sammenhængen mellem diffusionskoefficient og molekylbevægelighed), eller oplyse om en systematisk inddeling (fx elektrisk versus kemisk synaptisk transmission). Som det vil fremgå af pensumbeskrivelsen anvendes termen ret bredt. beskrive: bruges når der ikke indgår årsags-virkningsforhold i emnet. Beskrivelsen kan naturligvis gøres mere eller mindre detaljeret (jf. næste punkt). redegøre for: bruges når man ønsker en beskrivelse af processer eller mekanismer, hvori der indgår årsagsvirkningssammenhænge. skitsere: anvendes når man ønsker kendskab til en kurves forløb med angivelse af parametre (kvalitativt) på X-akse (abscisse) og Y-akse (ordinat). tegne: anvendes når der skal tegnes et nøjagtigt kurveforløb med angivelse af parametrenes art og enhedernes størrelse på X-akse (abscisse) og Y-akse (ordinat). LÆSEVEJLEDNING INDEN FOR DE SEKS EMNEOMRÅDER Den studerende forventes at kunne: 1. TRANSPORTPROCESSER (N1; N2; A: ; L: , ; B&L: 3-29; Ø1) 1.1. STOFTRANSPORT I ET FRIT, UBEGRÆNSET MEDIUM definere transportstrømtætheden eller fluxen (N1) redegøre for den almene transportligning (J = N v = B N X) og herunder beskrive de enkelte faktorer, som er bestemmende for fluxen (N1) redegøre for de drivende kræfter bag transport ved migration og diffusion (N1) Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

22 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 2 beskrive de karakteristiske træk ved en diffusionsproces (N1) redegøre for Ficks lov for diffusion (N1, B&L) definere koncentrationsgradienten (N1) definere diffusionskoefficienten (N1, B&L) angive faktorer, der er bestemmende for diffusionskoefficientens størrelse (N1) redegøre i grove træk på det molekylære plan for mekanismen ved diffusionsprocessen (N1, B&L) angive sammenhængen mellem middelforskydning og diffusionskoefficient (Einstein-Smoluchowski-ligningen) og anvende relationen til vurdering af det tidsmæssige forløb af diffusionsprocesser (N1) angive sammenhængen mellem diffusionskoefficient og molekylbevægelighed (Einsteins relation) (N1) redegøre for størrelsen af stoftransport ved elektrodiffusion som eksempel på kombineret migration og diffusion (jf. Nernst-Planck-ligningerne som angives i Documenta Biochimica et Biophysica) (N2) 1.2. MEMBRANTRANSPORT definere permeabilitetskoefficienten (P) for et stof, der kan trænge gennem membranen (N1, A) angive de faktorer, som er bestemmende for permeabilitetskoefficientens størrelse (N1) anvende permeabilitetskoefficient ved beregning af transport (flux) af et stof med uladede molekyler gennem en membran (N1) 1.3. LIGEVÆGTSPOTENTIAL OG DIFFUSIONSPOTENTIAL definere begrebet en selektivt permeabel membran (N2) redegøre kvalitativt for oprindelsen til membranpotentialet over selektivt permeable membraner (N2, B&L) definere ligevægtspotential (N2) angive Nernst ligning for ligevægtspotentialet, og beskrive de enkelte faktorer, der er bestemmende for dette (N2, A, L, B&L) angive at der medgår så (relativt) få ladninger til opladning af en membran til ligevægtspotentialet, at koncentrationen i væskerne af den permeerende ion ikke ændres måleligt (N2, A) beregne ved hjælp af Nernst ligning om en given iontype er i ligevægt over en membran (N2, A, L) definere diffusionspotential (N2) redegøre kvalitativt for mekanismen bag et diffusionspotentials opståen og for de faktorer, som er bestemmende for dettes størrelse (N2, B&L) 1.4. OSMOSE definere begreberne en semipermeabel membran og en ideel semipermeabel membran (N1, N2) definere osmose (N1, B&L) redegøre kvalitativt for mekanismen ved osmose (N1, B&L) definere osmotisk tryk (N1, B&L) angive og anvende van't Hoffs ligning (N1, B&L) angive hvilke faktorer der er bestemmende for størrelsen af det osmotiske tryk (N1, B&L) 1.5. DONNANLIGEVÆGT angive betingelserne for fremkomsten af en Donnanligevægt (N2, A, L, B&L) angive udtrykket for ligevægtsfordelingen af de permeerende ioner (N2, B&L) angive hvorledes membranpotentialet, Donnanpotentialet, kan beregnes med Nernst ligning (N2, B&L) 1.6. DEN LEVENDE CELLES MEMBRANPOTENTIAL angive rimelige værdier under normale fysiologiske forhold for koncentrationerne af Na +, K + og Cl i axoplasma og ekstracellulærvæsken (A, L, B&L) angive et eksempel på den uexciterede (hvilende) membrans relative gennemtrængelighed for ioner (nerven: P Na : P K : P Cl = 1 : 40 : 30) redegøre for hvorfor de to oven for anførte forhold bevirker, at der eksisterer en potentialforskel over membranen (hvilemembranpotentialet) (N2) redegøre for de faktorer, som er bestemmende for hvilemembranpotentialets størrelse og fortegn (N2, B&L) redegøre for den mekanisme (aktiv transport), der betinger opretholdelse i længere tid af den "skæve" ionfordeling over membranen (A, L, B&L) redegøre for at membranpotentialet skal klassificeres som et diffusionspotential (og ikke som et ligevægtspotential), idet animalske membraner er permeable for mere end een iontype (N2) 1.7. TRANSPORT GENNEM CELLEMEMBRANER Passive transportmekanismer redegøre for cellemembranens passive permeabilitetsegenskaber i relation til cellemembranens struktur (A, L) beskrive de karakteristiske træk for transport ved simpel diffusion gennem cellemembraner (N1, N4, A, L) angive hvilke typer af stoffer, som transporteres gennem cellemembranen ved simpel diffusion (N4, A, L) angive hvilke typer af stoffer, som nødvendigvis må transporteres ved faciliteret diffusion ("carrier-mediated diffusion") (N4, A, L, B&L) beskrive karakteristiske træk for faciliteret transport (mætningskinetik, kemisk specificitet, kompetitiv hæmning) (N4, B&L) Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

23 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 3 beskrive at elektrodiffusion sker gennem ionkanaler, som veksler mellem åben og lukket tilstand, afhængig af de fysiske (fx "voltage gated") eller kemiske ("ligand gated") påvirkninger, de er følsomme for (A, L) Aktiv transport definere aktiv transport (A, L, B&L) beskrive de karakteristiske træk ved aktiv transport gennem en cellemembran (A, L, B&L) angive eksempler på aktive transportsystemer (Na + /K + -ATPase og Ca 2+ -ATPase) redegøre for de væsentligste betydninger af aktiv transport (opretholdelse af iongradienter og osmotisk ligevægt over membranen; stabilisering af cellevolumen; forudsætning for sekundær aktiv transport ) (A, L, B&L) Cotransport (symport), antiport og "sekundær aktiv transport" beskrive at den ved aktiv transport etablerede Na + -gradient er det energetiske grundlag for transport af visse andre stoffers transport imod deres koncentrationsgradient ("sekundær aktiv transport") og angive eksempler herpå (Na +,glukose- og Na +,aminosyre-cotransport, Na + /H + -antiport (udveksling)) (A, L, B&L) 2. ALMEN NERVEFYSIOLOGI (A: ; L: ; B&L: 30-41; Ø2) 2.1. PERIFERE NERVER definere nerveimpulsen: elektrisk signal (aktionspotential), som ledes uformindsket gennem hele axonets længde (B&L, A, L) angive rimelige værdier for hvilemembranpotentialet, tærskelpotentialet og aktionspotentialets spidspotential (B&L) redegøre for, at hvilemembranpotentialet påvirkes ved ændringer af den ydre K + -koncentration men ikke væsentligt af ændringer i den ydre Na + -koncentration (A, Ø2) beskrive begrebet "local response" i forbindelse med en subliminal ("subthreshold") stimulering (B&L) beskrive summation af subliminale stimuli samt det membranrespons efter første (konditionerende) stimulus, som muliggør summationen (pga. membranens kapacitive egenskaber tager det en vis tid efter et subliminalt stimulus, før den subliminale depolarisering svinder. I den tid kan yderligere depolarisering med et nyt subliminalt stimulus være tilstrækkeligt til at tærskeldepolarisering opnås, jf. summation af EPSP'er ved interneuronal synaptisk transmission) (A, Ø2) redegøre for, at nerveimpulsen udløses ved katoden under stimulering med eksterne elektroder (ved katoden depolariseres membranen af den udadgående strøm, som indebærer tilføjelse af positive ladninger til membranens indside og fjernelse af positive ladninger fra udsiden) (B&L(Fig.3-2: øverste kurver er målt ved katoden), Ø2 (Fig.2-5: katode ved 0 cm)) Aktionspotentialet beskrive "alt eller intet"-loven (B&L, L) redegøre for ionteorien for aktionspotentialet (herunder de følgende ni punkter) (B&L, A, L, Ø2) redegøre for, at aktionspotentialets amplitude falder ved sænkning af den ydre natriumkoncentration (A, Ø) tegne med angivelse af tiden (abscisse) forløbet under aktionspotentialet af membranpotential-, natriumkonduktansog kaliumkonduktansændringerne (B&L, L) beskrive funktionen af de to vigtigste spændingsafhængige ionkanaltyper, som betinger aktionspotentialet (A, L) beskrive den selvforstærkende kobling mellem membrandepolarisering og natriumkonduktans (A, L) definere natriumkonduktansens inaktivering (inaktivering af de spændingsafhængige Na + -kanaler - trods fortsat depolarisering indtil repolarisering har fundet sted) (A, L, B&L) redegøre for mekanismen bag den hurtige repolarisering og den efterfølgende hyperpolarisering (kombination af natriumkonduktansens inaktivering og den forøgede kaliumkonduktans) (B&L, L) definere begreberne absolut og relativ refraktærperiode og angive årsagen til disse perioder (B&L, L, Ø2) redegøre for "alt eller intet"-loven ud fra ionteorien (konstante ligevægtspotentialer for Na + og K + i forbindelse med tidsbestemt maksimum for natriumkonduktansen) (L) redegøre for at hvis natrium erstattes af kalium i ydermediet, så depolariserer membranen så aktionspotentialet blokeres og at forhøjet calciumkoncentration eller magnesiumkoncentration hæver tærsklen for udløsning af aktionspotentialet (Ø2) Aktionspotentialets propagering skitsere et aktionspotential og de strømsløjfer i og omkring membranen, som medfører aktionspotentialets propagering (B&L, A, L) angive, ud fra viden om væskernes ionsammensætning og membranens øjeblikkelige permeabiliteter, hvilke ioner der fortrinsvis bærer aktionsstrømmene (strømsløjferne) ekstracellulært (Na +, Cl ), intracellulært (K + ) og gennem membranen (Na + ind, K + ud) (Ø2) angive axondiameterens betydning for nerveledningshastigheden (B&L) beskrive betydningen af myelinisering for nerveledningshastigheden (saltatorisk impulsudbredning) (B&L, A, L) tegne med angivelse af tid (abscisse) det ekstracellulært afledede difasiske og monofasiske aktionspotential, og angive årsagen til, at det monofasiske har kortere varighed end det difasiske (det monofasiske AP optegnes under passage af een elektrode, mens det difasiske optegnes under passage af to elektroder) (Ø2) Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

24 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 4 3. CELLULÆR SIGNALERING/KOMMUNIKATION (A: ; L: ) beskrive principperne ved de fire typer af ekstracellulære signaler: parakrin, synaptisk, endokrin og autokrin signalering (A, L) redegøre for signalmolekylers funktioner og levetider, herunder at acetylkolin kan udøve forskellige typer af reaktioner på målcellen afhængigt af dennes egenskaber (A, L) redegøre for nitrogenoxid (NO) som signalmolekyle (A, L) redegøre for funktionen af tre typer af receptorer på cellemembranens overflade: ionkanaler, G-protein-koblede receptorer og enzym-koblede receptorer (A, L) redegøre for G-proteiners opbygning og funktion (A, L) redegøre i store træk for cyklisk AMP (camp) i rollen som intracellulær messenger (A, L) redegøre for reguleringen af camp koncentrationen i cellen (A, L) redegøre for Ca 2+ ionens rolle som intracellulær messenger (A, L) redegøre for syntesen af inositolfosfater og for IP 3 som en Ca 2+ -frigivende messenger (A, L) beskrive at G-proteiner direkte kan regulere ionkanaler, herunder angive forskellen på funktionen af den muskarinkolinerge receptor og den nikotin-kolinerge receptor (A, L) redegøre i korte træk for tyrosinkinaser, deres opbygning og signalvej (A, L) redegøre i korte træk for RAS aktivering af MAP Kinaser 4. IMPULSTRANSMISSION OVER CELLEGRÆNSER (A: ; L: ; B&L: 43-58) DESUDEN NEDENSTÅENDE TILFØJELSER (SKREVET MED FED SKRIFT) definere en synapse (A, L) angive at der findes to principielt forskellige transmissionsmekanismer: elektrisk transmission og kemisk transmission (A, L) redegøre for forskellen mellem de to transmissionsmekanismer (den elektriske synapse er en elektrisk lavresistent forbindelse, gap junction, mellem det præ- og postsynaptiske område, og under transmissionen ledes strømsløjfer direkte ind i det postsynaptiske membranområde. Fordel: transmission uden forsinkelse. Eksempel: hjertemuskelcellers elektriske kobling. Ved kemisk transmission er de præ- og postsynaptiske membranområder totalt adskilte, om end i nærkontakt. Det kemiske transmitterstofs præsynaptiske frigørelse, diffusion over til og virkning på den postsynaptiske membran kræver tid (synaptisk forsinkelse), men kemisk transmission muliggør funktionel mangfoldighed: excitatoriske og inhibitoriske synapser, transmission med forstærkning, regulering m.m.) (A, L) 4.1. NEUROMUSKULÆR TRANSMISSION definere begrebet motorisk enhed (et motorisk neuron og de muskelfibre (3 1000), som neuronet innerverer) beskrive i grove træk den neuromuskulære endeplades struktur (terminale axon, hvori acetylkolin syntetiseres (mitokondrier, vesikler), den præsynaptiske membran, den synaptiske spalte og endelig den postsynaptiske membran, der er tæt forsynet med acetylkolinfølsomme receptorer) redegøre for den elektriske impulsoverførsel fra det terminale axon via endepladeregionen til og med igangsætningen af muskelfiberens aktionspotential beskrive kalciums rolle for acetylkolinfrigørelsen beskrive at acetylkolin, som frigøres fra den præsynaptiske region, diffunderer over den synaptiske spalte og bindes til receptorer på den postsynaptiske membran, samt at acetylkolin spaltes af kolinesterasen og dermed hurtigt elimineres beskrive at acetylkolinets spaltningsprodukter (kolin og eddikesyre) diffunderer tilbage til den motoriske nerveterminal og her resyntetiseres og deponeres som acetylkolin beskrive acetylkolinets virkning på den postsynaptiske membrans ionpermeabilitet og disse ændringers betydning for fremkomsten af endepladepotentialet definere et endepladepotential (et lokalt, ikke propagerende postsynaptisk potential, som skyldes permeabilitetsændringer i den postsynaptiske membran og medfører depolarisering til fyringstærskel i naboområdet) redegøre for endepladepotentialets funktion ved impulstransmissionen (endepladepotentialet søger mod en værdi på ca. 15 mv og medfører derved depolarisering af den omgivende, excitable muskelfibermembran til over tærskelværdien. Derfor overføres ethvert aktionspotential i den motoriske nerve til et aktionspotential i muskelfiberen) beskrive endepladepotentialets tidsforløb og rumlige udbredning (ved forhindring af aktionspotentialets udløsning ved curarisering kan man med mikroelektroder registrere endepladepotentialet indtil ca. 4 mm fra endepladeregionen. Denne udbredning uden for endepladen skyldes en passiv (ikke propagerende) elektrotonisk proces) beskrive miniature-endepladepotentialerne i forbindelse med kvantefrigørelsen af acetylkolin (vesikelhypotesen) og sammenhængen mellem miniaturepotentialerne og endepladepotentialet Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

25 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 5 angive måder hvorpå den synaptiske transmission kan påvirkes: 1) præsynaptisk membran: ændret frigørelse af transmitter (fx elimineret ved forgiftning med botulinustoxin, udskilt fra bakterier, der vegeterer under anaerobe forhold i fx konserverede madvarer ( pølseforgiftning )), 2) synaptisk spalte: nedsat elimineringshastighed af acetylkolin med anti-kolinesteraser, hvorved endepladepotentialets størrelse og varighed øges. Fx er plantealkaloidet fysostigmin (terapeutisk anvendelse) samt visse krigsgasser og en række insekticider (toxiner med irreversibel effekt) anti-kolinesteraser, 3) postsynaptisk membran: receptorblokade (fx med curare og curarelignende stoffer) 4.2. INTERNEURONAL TRANSMISSION angive at i centralnervesystemet har nogle synapser en exciterende (depolariserende) virkning på neuronets dendritter og somamembran (dvs. forøger tendensen til start af et propageret aktionspotential fra axonhøjen), mens andre synapser modvirker denne tendens (hæmmende synapser) redegøre for det excitatoriske postsynaptiske potential (EPSP): 1) postsynaptiske konduktansændringer og ionbevægelser bag EPSP (foruden øget natriumkonduktans, som medfører en indadrettet, depolariserende Na + - strøm, er også kaliumkonduktansen forøget således, at den postsynaptiske membrans potential under påvirkning af transmitteren søger mod en værdi ("reversal potential" mellem ligevægtspotentialerne for Na + og K + ) på ca. 0 mv), og 2) den resulterende strømudbredning, som kan medføre udløsning af et aktionspotential i axonhøjen (en elektrisk strøm vil løbe fra de depolariserede områder (dendritter, soma) mod axonhøj og axon, som derved depolariseres - evt. til axonhøjens (særligt lave) fyringstærskel) redegøre for konduktansændringer og ionstrømme, som ligger til grund for det inhibitoriske postsynaptiske potential (IPSP): (pga. øget K + - eller Cl -konduktans ligger reversal potential nær ligevægtspotentialerne for K + og Cl, og strømme af disse ioner vil modvirke somaets depolarisering, evt. medføre hyperpolarisering mod 80 mv) redegøre for at der til start af et propageret aktionspotential i neuronets tilhørende axon kræves en samtidig aktivering af et stort antal exciterende synapser, herunder for vekselvirkningen (summation) mellem EPSP'er og IPSP'er angive at salte af aminosyrerne glutaminsyre og asparaginsyre er vigtige excitatoriske neurotransmittere, og at glycin og γ-aminosmørsyre er den vigtigste inhibitoriske neurotransmitter. 5. ALMENE SENSORISKE RECEPTORMEKANISMER (N3; Ø3; A: ) definere en sensorisk receptor: en biologisk transducer, som omformer fysisk eller kemisk energi til elektrisk energi i form af membranpotentialændringer definere en sensorisk receptors adækvate stimulus angive en inddeling af sensoriske receptorer efter den fysiske karakter af det adækvate stimulus beskrive fælles træk ved funktionen af alle sensoriske receptorer: omsætning af absorberet energi til et receptorpotential (generatorpotential) og transformation af receptorpotentialet til impulser i det tilhørende afferente axon med en frekvens, som stiger med stimulationsstyrken beskrive typer af receptorsystemer (primære, sekundære og tertiære receptorer) angive at et sensorisk neuron formidler information til centralnervesystemet inden for et frekvensområde på ca. 2 Hz 300 Hz redegøre for forskellige adaptationsmønstre (fuldstændig og ufuldstændig adaptation: fasiske henholdsvis toniske receptorceller) og for deres funktionelle betydning (fasiske receptorer informerer kun om indtrufne påvirkningsændringer, mens toniske receptorer tillige informerer vedvarende om konstant påvirkning) beskrive at adaptation kan bero på ændringer knyttet til forskellige trin i transmissionssystemet samt til centrale mekanismer angive tre K + -kanaltyper, som er væsentlige for kontrol af fyringsfrekvensen: forsinkede K + -kanaler sikrer hurtig afslutning af hver impuls; tidlige K + -kanaler sikrer muligheden for lav frekvens ved at hæmme depolariseringshastigheden; Ca 2+ -aktiverede K + -kanaler medfører adaptation) definere en sensorisk receptors dynamikområde (forholdet mellem største og mindste stimuleringsenergi, som receptoren kan håndtere) og angive størrelsesordenen for fotoreceptorers og akustiske mekanoreceptorers dynamikområde (henholdsvis og ); for at dette kan indkodes i frekvensbåndet Hz, indgår bl.a. centralt betinget adaptation, såkaldt "volumenkontrol", i sådanne receptorers funktion 6. ALMEN MUSKELFYSIOLOGI (A: ; L: ; B&L: , , , , , 365; Ø4) 6.1. ALMENT OM KONTRAKTILITET beskrive det molekylære grundlag for kontraktilitet (sarkomeret, "sliding filament model") (A, L, B&L) angive de vigtigste ATP-kilder under kontraktionsprocessen fra 1) frit ATP (ringe mængde, kun tilstrækkeligt til ca. 10 enkeltkontraktioner), 2) hurtig transfosforylering mellem ADP og kreatinfosfat (CP): ADP + CP ƒ ATP + C, 3) anaerob glykolyse, 4) oxydativ fosforylering af ADP (B&L) redegøre i grove træk for de funktionelle forskelle mellem 1) skeletmuskulatur (kun kontrolleret af det somatiske nervesystem; adskilte fibre; hurtigt system pga. Ca 2+ -mobilisering ved hvert sarkomer), 2) hjertemuskulatur (funk- Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

26 Note 0: Læsevejledning til biofysik, cellebiologisk kursus Side 6 tionelt syncytium med elektriske synapser (gap junctions); autorytmik med frekvensmodulation via autonom innervation) og 3) glat muskulatur (stor heterogen gruppe af korte fibre uden tværstribning; ofte funktionelle syncytier; bevaret evne til celledeling; tonus med overlejrede langsomme og ofte langvarige kontraktioner, kontrolleret af det autonome nervesystem i forbindelse med forskellige modulerende faktorer, fx hormonale) (A, B&L) 6.2. KONTRAKTIONSTYPER OG MEKANISKE EGENSKABER FOR EN TVÆRSTRIBET SKELETMUSKEL definere hvad der forstås ved en isometrisk og en isotonisk kontraktion (Ø4) definere begrebet mekanisk latenstid: tiden fra stimulering (aktionspotentialets depolariseringsfase) til mekanisk respons (isometrisk kraftudvikling). Perioden dækker over excitations-kontraktionskoblingen (Ø4 ) tegne længde-spændingsdiagrammet for en muskel i hvile og under isometrisk kontraktion (B&L) tegne sammenhængen mellem den isometriske kontraktile kraft og muskellængden ved forskellige strækningsgrader (B&L) beskrive stimuleringsfrekvensens indflydelse på den isometriske kontraktionskraft, og i forbindelse hermed skitsere isometrisk 1) enkeltkontraktion, 2) summation efter to eller flere stimuli og 3) glat tetanus (B&L) redegøre for at der kræves stimulering med en vis minimumsfrekvens (fusionsfrekvens) for at opnå maksimal kontraktionskraft (glat tetanus): konstant maksimal aktivering er ikke mulig ved lavere frekvenser pga. faldende intracellulær Ca 2+ -koncentration mellem stimulationerne) (B&L) skitsere hvorledes forkortningshastigheden ved den isotoniske kontraktion afhænger af belastningen, når musklen forkorter sig fra samme udgangslængde (B&L) angive at den initiale (maksimale) isotoniske forkortningshastighed er uafhængig af stimuleringsfrekvensen, idet det kontraktile system opnår fuld aktivering allerede efter første stimulus (Ø4) skitsere den ydre mekaniske effekt som funktion af belastningen (effekten er maksimal ved moderate belastninger, dvs. ca. 1/3 af den maksimale belastning, som kan bæres af musklen) (B&L) beskrive at muskelkraften ved store belastninger kan overstige den maksimale kraft, som kontraktionsmekanismen i sig selv kan yde (excentrisk kontraktion) (B&L) 6.3. MUSKELFIBERENS FUNKTION I RELATION TIL FINSTRUKTUREN beskrive hvilke ændringer der sker i de to filamentsystemers indbyrdes placering (i) under passiv strækning, (ii) når fiberen forkorter sig under kontraktion (belastningsafhængig sarkomerforkortning med proportionalt tilsvarende muskelforkortning og (iii) når fiberen kontraherer sig isometrisk (næsten ingen forskydning) angive titinfilamenternes placering og deres sandsynlige funktion: sikring af myosinfilamenternes centrering i sarkomeret (yder et væsentligt bidrag til fiberens hvilespænding) (A) beskrive tværbroernes betydning for "sliding filament" mekanismen under kontraktionen (A, L, B&L) redegøre for sammenhængen mellem størrelsen af den isometriske kontraktionskraft og fiberens sarkomerlængde (B&L) 6.4. EXCITATIONS-KONTRAKTIONSKOBLINGEN I TVÆRSTRIBET MUSKULATUR beskrive oversigtligt begivenhedsforløbet af excitations-kontraktionskoblingen (A, B&L) redegøre for den funktionelle betydning af muskelaktionspotentialet som "trigger"-mekanisme for udløsning af kontraktionsprocessen med "alt-eller-intet" karakter (aktionspotentialets udslag fra ca. 90 mv til +30 mv sammenholdes med, at kontraktionsresponset allerede begynder ved depolarisering til ca. 50 mv, som er tærsklen for åbning af Ca 2+ -frigørelseskanalerne i det sarkoplasmatiske reticulum) (B&L) angive at T-tubuli fungerer som elektrisk signalsystem mellem overflademembranen og det sarkoplasmatiske reticulum (B&L) redegøre for betydningen af det sarkoplasmatiske reticulum for den intracellulære Ca 2+ -koncentration og dermed for kontraktionens aktivering og for relaksation (A, B&L) redegøre for udvikling af muskelstivhed, rigor (A) tegne, med angivelse af koordinater, membranpotentialvariationerne som funktion af tid for en pacemakercelle i hjertet (sinusknuden) og angive de tilgrundliggende ionstrømme (konduktansændringer) (B&L) tegne som funktion af tid et aktionspotential og det resulterende kontraktionsrespons i (a) skeletmuskelceller (enkeltkontraktion) og (b) hjertemuskelceller (B&L:(Fig.18-3; Fig.22-2, tidsakse Fig.22-1), Ø4) redegøre for forskellen mellem skeletmuskelfibre og hjertemuskelceller med hensyn til mobilisering af aktiverende Ca 2+ : skeletmuskelfibre aktiveres (næsten) udelukkende af Ca 2+ fra det sarkoplasmatiske reticulum (SR) og kan derfor kontrahere sig i Ca 2+ -frit medium. Hjertecellers kalcium-depot i SR er utilstrækkeligt til normal kontraktion, som derfor kræver influx af ekstracellulært kalcium gennem cellemembranen. Hjertekontraktionen svækkes eller går i stå ved for lav ekstracellulær Ca 2+ -koncentration (B&L, Ø4) Medicinsk Fysiologisk Institut; 4. sept 2002

27 MEDICINSK FYSIOLOGISK INSTITUT MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Side 1 MÅLBESKRIVELSE MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Biofysiske undersøgelser danner grundlag for forståelsen af cellefysiologiske emner som kontrol af stoftransport gennem biologiske membraner, etablering af elektriske membranpotentialer, regulering af kommunikation mellem nerver og mellem nerver og effektororganer, fx muskler og kirtler, kontrol af inter- og intracellulære signalsystemer, samt relationer mellem struktur og funktion i effektorceller. Indsigt i basale, biofysiske processer giver baggrund for en forståelse af overordnede fysiologiske processer og funktioner såvel på det cellulære niveau som inden for organfysiologien. Forståelsen af de fysiske principper for transport af næringsstoffer, elektrolytter og vand er grundlæggende for en senere forståelse af væsentlige aspekter i fysiologien. Som eksempel kan anføres, at en beskrivelse af nyrernes funktion er baseret på bl.a. en forståelse af behandlingen af salt og vand i de proksimale og distale tubuli, herunder hormoner og lægemidlers påvirkning af funktionen. En beskrivelse af organismens kontrol af sekretionsprocesser og absorptionsprocesser og sygdomme relateret hertil, er baseret på en forståelse af transportprocesser og deres regulering. Forståelse af patogenesen for fx en række endokrine, neurologiske (inkl. neuromuskulære), kardiologiske og gastro-enterologiske lidelser forudsætter kendskab til transportprocesser. Endvidere skal det fremhæves, at transport over kapillærer, væskefordelingen mellem disse og lymfe/interstitialvæske beskrives ud fra kendskab til elementære biofysiske processer. Tværstribet muskulatur spiller en central rolle i organismens funktion og bevægelse. Denne del af bevægeapparatet rammes hyppigt af forskellige typer muskelsygdomme, hvor ætiologien enten er heriditær eller erhvervet. Som eksempel på en heriditær sygdom kan anføres gruppen af muskeldystrofier, der er karakteriseret ved en progredierende degeneration af muskelfibrene med celledød til følge. De cellulære og membranrelaterede ændringer er kun sporadisk kendt men vides at omfatte ændringer af muskelcellemembranens gennemtrængelighed for ioner. Patienter med erhvervede muskelsygdomme, som ofte er stærkt invaliderende og erhvervshæmmende for patienterne, ses meget ofte af lægen og tandlægen. Kendskab til det biofysiske grundlag for skeletmuskulaturens funktion indgår som et væsentligt og basalt element i diagnostik, behandling og forebyggelse - og forskning - af muskelsygdomme. Andre typer af muskler, hjertemuskulatur og glat muskulatur, er strukturelt og funktionelt anderledes. Det biofysiske grundlag for disse muskeltypers (forskellige) kontraktionsformer indgår som et centralt element i forståelsen af disse muskeltypers forskellige funktioner, hjertemuskulaturen i den rytmiske, regulerbare pumpning af blodet i kredsløbet, og fx glat karmuskulaturs medvirken i regulering af blodtrykket og tarmvæggens muskulatur i tarmkanalens peristaltiske kontraktioner. Undervisningen omfatter fire emnegrupper, hver med en tilknyttet øvelse: transportprocesser (aktive og passive), cellemembraners elektriske egenskaber (ionkanaler, hvilemembranpotential, aktionspotential), cellulær signalering (synaptisk og sensorisk transmission, receptorer, ekstracellulære og intracellulære signalmolekyler) og muskelkontraktion (aktivering, ekscitations-kontraktionskobling og kontraktionsrespons i skelet- og hjertemuskelceller). INDHOLDSBESKRIVELSE 1. TRANSPORTPROCESSER Relation til andre fag og studiets mål Cellemembranens transportfunktioner gennemgås med henblik på forståelse af, hvorledes passiv og aktiv transport af molekyler og ioner muliggør opretholdelse af konstant cellevolumen, en forskellige sammensætning af de ekstra- og intracellulære væskefaser og etablering og opretholdelse af en elektriske potentialforskel over membranen. Membranens gennemtrængelighed for ladede og uladede stoffer beskrives og permeabilitetsbegrebet introduceres. Permeabiliteten anvendes gennemgående i beskrivelsen af passiv transport (simpel og faciliteret diffusion, elektrodiffusion og vandtransport ved osmose) og sættes i relation til membranens struktur. Membranens dobbelte lipidlag tillader kun simpel diffusion af uladede molekyler og lipofile stoffer, mens ioner og næringsstoffer altovervejende transporteres gennem membranens integrale transportproteiner, der ofte - især for ionkanalernes vedkommende - er underkastet en kontrol af signalmolekyler eller af ændringer i det elektriske membranpotential. Den levende celles membranpotential er en kompliceret, sammensat størrelse med bidrag fra de ioner, der kan transporteres gennem membranen. Med udgangspunkt i at kun en ion bidrager til potentialet introduceres 21. oktober 2000

28 MEDICINSK FYSIOLOGISK INSTITUT MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Side 2 Nerst ligning. Når flere ioner indgår, udvides beskrivelsen, og Millman-ligningen og Goldman-ligningen anvendes. Aktiv transport beskrives, og der gøres rede for, hvorledes et integralt protein i membranen under ATPforbrug transporterer natrium-ioner ud af cellen og kalium-ioner ind i cellen, en transportfunktion, der er essentiel for næsten alle cellers overlevelse og funktion. Den opbyggede koncentrationsforskel for natrium over membranen (natriumgradienten) kan i flere celletyper gennem en kobling til andre transportmekanismer drive en transport af fx sukkerstoffer, aminosyrer og elektrolytter, inklusive brintioner, således at der sker en opkoncentrering inde i cellen ("sekundær, aktiv transport"). Faglige Forudsætninger Kendskab til 1) elektrokemiske og bioenergetiske begreber som Nernst ligning, termodynamisk ligevægt og "energirig binding" på et niveau med den forudgående undervisning i medicinsk kemi, 2) elektricitetslære på niveau med det forudgående kursus i medicinsk fysik, 3) dele af anatomiundervisningen (cellemembranens opbygning, nerve- og muskelcellers struktur m.m.) og 4) dele af biokemiundervisningen (metabolisme, ATPsyntese m.m.), som er beskrevet i andre delafsnit. Tilstræbt fagligt mål Det til tilstræbes, at studenten får forståelse af, hvorledes de væsentlige stofgrupper (ioner, vand, næringsstoffer) transporteres over biologiske membraner. De skal have et simpelt begrebsapparat, hvormed de kan beskrive transportprocesserne således, at de er i stand til at kunne skelne mellem simpel diffusion, faciliteret diffusion og aktiv transport, herunder koblede transportprocesser. Studenten skal desuden kunne forstå membranpotential og mekanismen ved dets opståen, samt sammenhænge mellem membranpotential og transport af elektrolytter gennem cellemembranen. 2. MEMBRANENS ELEKTRISKE EGENSKABER 2.1. Ionkanaler Relation til andre fag og studiets mål Ionkanaler består af forskellige familier af membranproteiner, der udgør den strukturelle baggrund for membraners strømbærende evne (specifikke ion-konduktanser). Viden om ionkanalers funktion og regulering samt deres tilstedeværelse i givne celletyper er af afgørende betydning for forståelse af cellulære processer - fx regulering af membranpotential og transport af ioner og vand. Ionkanalers funktionstilstand spiller en vigtig rolle ved flere patologiske tilstande, fx arytmier, hypertension, type II diabetes og forstyrrelser i væske- og elektrolytbalancen. En række farmaka og toxiner virker specifikt på ion-kanaler, og i de senere år er der arbejdet intensivt på udviklingen af nye stoffer, som kan ændre ionkanalers funktionstilstand. Faglige forudsætninger Kendskab til opbygning af celler og væv, membranproteiner, membranpotentialer, Nernst ligning, Millmannligning og Goldman-ligning. Tilstræbt fagligt mål Det forventes, at studenten får forståelse af: 1) ionkanaler som det molekylære grundlag for membrankonduktanser og for den fysiologiske regulering af disse, 2) hvordan ionkanaler spiller en vigtig rolle i en række fysiologiske og patofysiologiske forhold og 3) hvordan man farmakologisk er i stand til at påvirke ionkanalers regulering. Herved tilstræbes det, at studenten kan redegøre for, at ionkanaler er membranproteiner, der er karakteriseret ved deres konduktans, deres selektivitet og nævne eksempler på forskellige ionkanaler. Endvidere får studenten indsigt i, at ion-kanaler kan moduleres af en række fysiologiske parametre, fx membranpotential, Ca 2+, ph, nukleotider (fx ATP, ADP og GTP), G-proteiner, fosforylering og defosforylering. Det forventes endvidere, at studenten opnår kendskab til at en række farmaka virker ved at aktivere eller inhibere ionkanaler, fx perorale antidiabetikas (tolbutamid og glibenclamid) hæmmende virkning på ATPfølsomme K + -kanaler i insulin-secernerende beta-celler; pinacidils antihypertensive virkning gennem aktivering af K + i glat muskulatur i modstandskarrene, calciumantagonisters effekter på calciumkanaler m.m Aktionspotentialet Relation til andre fag og til studiets mål Aktionspotentialet er en kortvarig ændring af potentialforskellen over ekscitable cellers membran. Aktionspotentialet følger en alt-eller-intet -lov og danner grundlag for opståen af andre elektriske fænomener, som bl.a. omfatter nerveimpuls og elektrisk aktivitet i hjertet og tværstribet og glat muskulatur. 21. oktober 2000

29 MEDICINSK FYSIOLOGISK INSTITUT MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Side 3 Forståelse af aktionspotentialets natur er en nødvendig forudsætning for forståelse af store dele af fysiologien og de dele af læge- og tandlægestudiet, der beskæftiger sig med sygdomsprocesser i nervesystemet, bevægeapparatet, hjertet og mave-tarmkanalen. Emnet indgår dermed som et centralt element i flere kliniske specialer, specielt neuromedicin og intern medicin. I forbindelse med undersøgelse og sygdomsbehandling kan det være hensigtsmæssigt at kunne gribe ind i den normale mekanisme bag aktionspotentialet. Emnet får dermed også betydning for fagområderne farmakologi og anæstesiologi. Faglige forudsætninger Elektricitetslære svarende til niveauet i medicinsk fysik, kendskab til biologiske membraners opbygning og funktion (transportprocesser, elektrodiffusion, ligevægtspotential og den levende celles hvilemembranpotential). Tilstræbt fagligt mål Kendskab til følgende forhold og begreber vedrørende excitabilitet: De fysiologiske ionkoncentrationer i cellens indre og i ekstracellulærfasen, hvilekonduktans, membranstrøm, tærskelværdi, alt-eller-intet -loven, spidspotential, refraktærperiode, repetitiv aktivitet, spændingsafhængige Na + - og K + -kanaler, aktivering og inaktivering af ionkanaler Nervecellen: stimulering og udbredelse af nerveimpulsen Relation til andre fag og til studiets mål Neuroner aktiveres normalt ved naturlige, ydre stimuli, ved synaptisk transmission eller evt. ved hjælp af pacemakeregenskaber i nervemembranen, men aktivering kan også fremkaldes ved elektrisk eller magnetisk påvirkning. Forståelse af hvorledes nerveceller stimuleres er nødvendig for forståelsen af neurofysiologien og en række af de undersøgelser, der udføres i neurologi, audiologi, oftalmologi og odontologi. Udbredelsen af impulsen er en proces, som er en nødvendig forudsætning for normal funktion af nervesystemet. Ved lokalanæstesi og forskellige neurologiske sygdomme er propagering af impulsen kompromitteret. Forståelse af impulsudbredelsens natur og registreringen af impulsudbredningen er derfor vigtig især for fagområderne neurofysiologi, anæstesiologi, neurologi og odontologi. Faglige forudsætninger Forståelse af mekanismen bag aktionspotentialet. Tilstræbt fagligt mål Kendskab til: a) elektriske forhold omkring stimulationselektroder, b) begreberne "local response" og summation, c) ionstrømme ved propagerende aktionspotential, d) faktorer af betydning for nerveledningshastighed, e) forskellige former for registrering af aktionspotentialet, inklusive måling af nerveledningshastighed Synaptisk transmission. Relation til andre fag og til studiets mål Kommunikation mellem sanseceller og nerveceller, mellem nerveceller indbyrdes og mellem nerveceller og effektorceller (muskelfibre, kirtelceller og sanseceller) er i hovedsagen båret af kemiske signalstoffer (neurotransmittere og peptider). De processer, der ved synapserne forbinder impulsaktiviteten i de præ- og postsynaptiske celler, er det fysisk/kemiske grundlag for hjernens informationsbehandling. Differentiering af transmissionsprocesserne og synapsernes indbyrdes organisation er et hovedelement i den funktionelle specialisering i forskellige hjerneregioner og er baggrunden for hjernens uovertrufne kapacitet for informationsbehandling. En række alvorlige neurologiske og psykiske lidelser skyldes ændringer i synaptisk transmission eller bortfald af bestemte synaptiske forbindelser. Næsten al virksom medicinsk behandling ved neurologiske og psykiatriske lidelser er rettet mod elementer i de synaptiske transmissionsprocesser (midler mod epilepsi, Parkinsons sygdom, angst, søvnløshed, depression, skizofreni etc.). Faglige forudsætninger Kendskab til membranpotentialet, cellemembraners ionselektivitet, ionkanaler, ekscitable membraner, receptorer og ionkanaler. Tilstræbt fagligt mål Forståelse af de specialiserede kommunikationsveje mellem ekscitable celler. exocytose, receptorfunktion, signaltransduktion og signalintegration. Endvidere ønskes en forståelse af præsynaptisk kobling mellem impulsaktiviteter, postsynaptisk receptorbinding. 21. oktober 2000

30 MEDICINSK FYSIOLOGISK INSTITUT MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Side Sensorisk transmission Relation til andre fag og til studiets mål Sanseorganerne er organismens hovedkilde til information om omverdenen og om organernes funktionstilstand. I sanseorganerne omformes ydre stimuli (lys, muskelspænding etc) til impulsaktivitet i de nerver, der forbinder det enkelte sanseorgan med hjernen. De specialiserede transmissionsprocesser, der kobler stimulus med impulsaktivitet, udgør det fysiske grundlag for hvilke stimuli det enkelte sanseorgan er følsomt for og hvorledes relationen er mellem stimulusstyrke og impulsmønster (kodning, dynamik). Sensorisk transmission er grundlaget for beskrivelsen af de enkelte sanseorganers normale funktion. Desuden er ændrede transmissionsprocesser årsag til farveblindhed, smertesensibilisering, medikamentelt betinget høretab, aldersforandringer i syn og hørelse m.m.. Faglige forudsætninger Kendskab til elementær fysik som pensum opnået gennem kursus i medicinsk fysik, enzymkaskader, allosteri, receptorer og ionkanaler. Tilstræbt fagligt niveau Forståelse for at sensorisk transmission klassificeres efter stimulus oprindelse, stimulus energiform (adækvat stimulus) og efter sansekvalitet. Absorption af energi, omformning af absorberet energi gennem transduktionskæde til graderet generatorpotential. Transformation af generatorpotential til impulskode. Fasisk/tonisk transmission. Adaptationsprocesser. Dynamikområde. 3. EKSTRACELLULÆRE SIGNALMOLEKYLER OG INTRACELLULÆR SIGNALERING De fleste celler indeholder et yderst komplekst system af membranproteiner, der giver mulighed for at reagere på stimuli fra andre celler og dermed have cellulære funktioner kontrolleret udefra. Cellerne er også i mange tilfælde i stand til selv at kunne kommunikere med andre celler. Det er membranproteiner, der fungerer som ydre receptorer. Der findes imidlertid også intracellulære receptorproteiner, proteinkinaser, proteinfosfataser og et komplekst sæt af signalstoffer, som også bidrager til at styre cellulære funktioner. En lang række signalstoffer, hormoner, secerneres fra bestemte organer og bæres med blodet, oftest i meget lave koncentrationer, til en målcelles receptorer. En anden type signalstoffer, transmittere, frigives fra nerveenden som følge af en nerveimpuls, der ankommer hertil. Signalet er oprindeligt udløst fra en anden nerve eller en anden type stimulus og transmitteren frigives lokalt omkring målcellen, hvorefter en receptor aktiveres. Signalveje mellem de enkelte celler i et væv, fx epitel eller glat muskulatur, spiller også en stor rolle for et overordnet koordineret respons. Disse signaler viderebringes via små porer mellem cellerne. Efter receptoraktivering kan igangsættes en række intracellulære signaler, der udløses ved dannelsen af cellulære signalstoffer. Disse stoffer formidler således overførsel af information, der er ankommet til membranen, til biokemiske reaktioner ved at katalysere en række processer. Disse kan omfatte et komplekst sæt af proteinfosforyleringer, men også dannelsen af stoffer som frigiver calcium fra intracellulære depoter til aktivering af ionkanaler, kontraktion, exocytose m.m. Relation til andre fag og til studiets mål De grundlæggende fysiologiske processer, som aktivering af muskulatur, absorptive og sekretoriske processer, neurofysiologisk signalkontrol, celledeling og differentiering, immunsystemets reaktioner m.m. har som baggrund aktivering af cellulære signaler. En lang række sygdomme og behandlingstiltag fokuserer på de cellulære signaler. Et område som har været genstand for stor interesse er sygdomme indenfor det neurofysiologiske område - fx manio-depressive lidelser, Parkinsons syge m.m. og med henblik på de absorptive og sekretoriske processer forklares cystisk fibrose som bl.a. en ændring i de intracellulære signalkontrolveje. Immunsystemets receptorer og deres ændrede aktivitet beskrives bl.a. i mange allergiske lidelser, og celledeling og differentiering styres for cellernes vedkommende ved ekstracellulært ankommende signaler. Faglige forudsætninger Kendskab til forudgående stoftransportundervisning, biokemiske afsnit om nukleotider og energirige forbindelser, organellers funktion. Tilstræbt fagligt mål Det ønskes indlært at de ekstracellulære signaler består af transmittere, hormoner og vækstfaktorer (proteiner), såvel som enkelte lipidopløselige stoffer. Disse stoffer aktiverer receptorerne, som kan være koblede til ionkanaler,. G-proteiner, eller enzymatiske processer. 21. oktober 2000

31 MEDICINSK FYSIOLOGISK INSTITUT MÅL - OG INDHOLDSBESKRIVELSE FOR BIOFYSIK I DET CELLEBIOLOGISKE KURSUS Side 5 De G-proteinkoblede receptorer formidler signaler via binding af et G-protein til receptoren, herefter binding af GTP til proteinet og diffusion ud til et nyt bindingssted, hvor signalet videreføres. Herefter kan både enzymer og ionkanaler aktiveres. Receptorer knyttet til enzymer formidler aktivering af proteinkinaser, som igangsætter cellulære reaktioner. Studenterne vil også få kendskab til syntesen af cykliske nukleotider (camp og cgmp), som aktiverer bl.a. proteinkinaser. Samspillet mellem alle disse processer udløser i en given celletype et specifikt cellulært respons. 4. MUSKELKONTRAKTION Formålet med undervisningen i muskulaturens biofysik er at bidrage til studenternes forståelse hvordan muskelfibrene kontraherer sig under forskellige betingelser afhængig af excitationsmønstret svarende til nervesystemets impulsdannelse, og hvordan disse egenskaber kan genfindes i organismens integrerede muskelfunktion. Et kendskab hertil er væsentlig for forståelsen af dele af organfysiologien (fx motorisk kontrol, træning, metabolisme under arbejde, hjertefunktion, tarmmotorik) og af patogenesen af arvelige muskelsygdomme (forskellige typer af muskeldystrofi, myotoni, malignt hypertermi, hypo- og hyperkaliæmisk paralyse etc.) samt for visse sygdomme af sports- og arbejdsmedicinsk og odontologisk art. Desuden tilstræbes at studenten forstå den neuromuskulære forbindelses funktion, især med henblik på patogenesen af myasteni og virkningen af visse farmaka og toxiner (curare, botulinum-toxin, prostigmin, insekticider, krigsgasser). Faglige forudsætninger Kendskab på niveau med den forudgående del af kursus til proteiners struktur og funktion, cellulær energiomsætning, hvilemembran- og aktionspotential, generel synapsefunktion, muskelfibrenes og synapsernes lys- og elektronmikroskopisk struktur. Tilstræbt fagligt mål Der tilstræbes et grundigt kendskab til skeletmuskelfibrenes funktionssystemer som omfatter kontraktionsapparatet (myofibriller) og styringssystemet (motorisk endeplade, sarkolemma, T-tubuli, SR) samt disse systemers energiforsyning (ATP fra mitokondrier og cytosolær glykolyse). Kendskab til disse højt differentierede cellers funktion letter forståelsen af hjertemuskulaturens og de glatte muskelcellers funktion. Undervisningen tilstræber tillige at give et indblik i disse muskeltypers funktionskontrol. Der lægges særligt vægt på kalciumionernes centrale betydning for koblingen mellem muskelfiberens aktionspotential og kontraktion og på disse ioners samtidige betydning for hjertemuskelcellers aktionspotenital. I øvelsesundervisningen observerer studenterne ved hjælp af en (tilsyneladende) simpel forsøgsopstilling umiddelbart skeletmuskelfibrenes kontraktion og afleder fra egne iagttagelser og målinger komplicerede relationer (længde-spændings-diagram, kraft-hastigheds-diagram, ydre arbejde og effekt). 21. oktober 2000

32 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 1 1. Begreber fra fysikken Forelæsninger om nerveimpulsen (nr ) g: konduktans (siemens) = modstand -1 (ohm -1 ) c: kapacitet (farad) = ladning spænding -1 (coulomb volt -1 ) : længdekonstant (meter) = udtryk for hvor hvor langt synaptiske potentialer og andre passive potentialer kan udbrede sig i membrancylindre (f. eks. dendritter) inden de svækkes til e -1 af oprindelig størrelse : tidskonstant (sekund) = udtryk for hvor hvor hvor lang tid der går før synaptiske potentialer og andre passive potentialer svækkes til e -1 af oprindelig størrelse 2. Membranproteiner a. Na + -kanaler: Er spændingsafhængige, de aktiveres af depolarisering, og de inaktiveres af depolarisering. Kinetikken for aktivering er hurtigere end kinetikken for inaktivering. Antallet af åbne Na + -kanaler bestemmer membranens Na + - konduktans b. K + -kanaler: Er spændingsafhængige og aktiveres af depolarisering. De inaktiveres ikke. Antallet af åbne K + -kanaler bestemmer membranens K + konduktans. Der findes mange andre K + -kanaler end de, der har betydning for aktionspotentialet c. Na + /K + -ATPase: Vedligeholder ionkoncentrationerne intra- og ekstracellulært, men har ingen betydning for det enkelte aktionspotential. Under et enkelt aktionspotential sker ingen koncentrationsændringer af betydning Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

33 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 2 3. Aktionspotentialet Intracellulært: Ekstracellulært: Varer ca. 1 ms og har en amplitude på ca 100 mv Varer ca. 1 ms (monofasisk) og har amplitude mellem 0.01 mv og 1 mv Intracellulært registreret aktionspotential med tilhørende konduktansændringer Eksempler på rimelige ionkoncentrationer og ligevægtspotentialer i pattedyrs centralnervesystem K + : intracellulært 130 mm, ekstracellulært 4 mm, E K -90 mv Na + : intracellulært 10 mm, ekstracellulært 140 mm, E Na +55 mv Cl - : intracellulært 6 mm, ekstracellulært 104 mm, E Cl -75 mv g K : g Cl : g Na = 1 : 0.05 : Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

34 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 3 4. Refraktærperiode I refraktærperioden kan axonet ikke exciteres så let som når det er i hvile. Den del af refraktærperioden, hvor axonet slet ikke kan exciteres, kaldes den absolutte refraktærperiode. Denne periode overgår i den relative refraktærperiode, hvor excitation er mulig, men hvor det er sværere end i hviletilstanden. Refraktærperioden skyldes: a. Inaktivering af Na + -konduktans, b. aktivering af K + -konduktans (virker som shunt) og c. hyperpolarisering. Refraktærperiode illustreret med dobbeltstimulation. Stimulus to er meget større end stimulus 1 og flytter sig i tid i forhold til stimulus 1. Otte registreringer er lagt oven i hinanden Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

35 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 4 4. Summation To stimuli, der hver for sig er for små til at udløse et aktionspotential, kan, hvis de optræder samtidigt eller næsten samtidigt, resultere i at aktionspotentialet udløses. Man taler om temporal summation, hvis det er samme stimulus, der gives to gange (f.eks. ved at en synapse er aktiv to gange), og om spatial summation hvis der er tale om to forskellige stimuli (f. eks to forskellige synapser, der er aktive samtidigt) Summation: Aktionspotential udløst af to subliminale stimuli (4 registreringer) Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

36 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 5 5. Local response Et local response er et svar på en stimulation, der ikke er kraftig nok til at udløse et aktionspotential. Et local response udbreder sig passivt gennem en nervecelle og afsvækkes (attenueres) med tiden. Afsvækkelsen beskrives med og. Tidskonstanten udtrykker hvor hurtigt afsvækkelsen sker på et givet sted og længdekonstanten udtrykker afsvækkelsen som funktion af afstanden til stimulationsstedet. Local response udløst med kortvarig intracellulær stimulation. Konduktansændringerne hørende til største og mindste stimulation er vist nederst. Bemærk at hvilekonduktansen er størst for K + og at det er aktiveringen af Na + -konduktansen i forbindelse med stimulationen, der giver anledning til at membranpotentialet forbliver nær tærsklen i et stykke tid efter stimulationens ophør. Den forøgede K + -konduktans genererer en slags efterhyperpolarisering Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

37 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning 6 6. Ekstracellulær stimulation og registrering Detaljerede oplysninger om registrering med ekstracellulære elektroder findes i øvelsesvejledningen til øvelse 2 Nerveøvelsen. Der vises derfor her blot illustration af forholdene omkring stimuluselektroderne: Stimulation af et axon med ekstracellulært placeret stimulator Anoden gør ekstracellulærrummet mere positivt. Herved bliver den transmembrane potentialforskel større, dvs. membranen hyperpolariseres. Katoden gør ekstracellulærrummet mere negativt. Herved bliver den transmembrane potentialforskel mindre, dvs. membranen depolariseres Den hyperpolarisering, som udløses ved anoden giver anledning til anodeblokade. Ved katoden kommer enten et depolarisering under tærsklen (local response) eller et aktionspotential. Når aktionspotentialet har udbredt sig til første ekstracellulære måleelektrode ses et udslag på 1 mv eller mindre. Intracellulært måles ca. 100 mv. Registrering af et aktionspotential med ekstracellulær (øverst) og intracellulær (nederst) måleteknik. Ionstrømmene i og omkring membranen er angivet med pile Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj 2001

38 Forelæsningsresumé - biofysik i cellebiologikurset - ny studieordning Når aktionspotentialet når anden ekstracellulære måleelektrode fås et udslag med modsat polaritet.med intracellulærelektroden måles nu efterhyperpolariseringen. 7. Nogle sproglige tips Det hedder et aktionspotential (ikke aktionspotentiale) et stimulus, flere stimuli (ikke en stimulus, flere stimulusser ) en transmitter, flere transmittere (ikke transmittorer) HUSK DET NU! Medicinsk Fysiologisk Institut, 18. maj

39 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 1 NOTE 3 TIL BIOFYSIK RECEPTORER 1. RECEPTORER OG SYNAPTISKE SIGNALER (AF S. DISSING) ALMENE SENSORISKE RECEPTORMEKANISMER (AF J. SKYDSGAARD) Sanseorganer og sensoriske receptorer Almene bemærkninger Adækvat stimulus og klassificering af sensoriske receptorer Én- og flercellereceptorer Kodningsprocesserne Transduktion til receptorpotential Transformation til afferent impulsfrekvens Indkodningsmembranens egenskaber Adaption Spontan aktivitet Overføringsfunktion og dynamikområde Sammenfatning RECEPTORER OG SYNAPTISKE SIGNALER (AF S. DISSING) I biofysikøvelse 3 (strækreceptorøvelsen) fokuserer vi på funktion og funktionsmekanismer for sensoriske receptorer samt synaptiske receptorer, der i centralnervesystemet reagerer på kemiske signalstoffer. I den praktiske del af øvelsen analyseres kodningsmønstret for en strækreceptor, vingeledsreceptoren hos græshopper. Vi vil desuden, ud fra litteraturen, beskæftige os med receptorfunktioner i en bredere sammenhæng, herunder receptorer for transmitterstoffer og hormoner. Det perifere nervesystem er bindeled mellem centralnervesystemet og resten af organismen. Signaler fra somatiske sanseorganer og sensorer i de indre organer sendes via afferente neuroner til centralnervesystemet. Signaler fra centralnervesystemet sendes via efferente somatiske neuroner til skeletmuskulaturen og via efferente neuroner i det autonome nervesystem (parasympatiske og sympatiske) til glat muskulatur og kirtler. Kommunikationen mellem nerveceller indbyrdes og mellem nerveceller og målceller varetages i hovedsagen af kemiske signalstoffer Den kemiske kommunikation mellem nerveceller (eller kirtelceller) og deres mål celler (neuroner, muskelceller og kirtelceller) bæres altså af extracellulære signalmolekyler. Signaleringsformen kategoriseres efter afstanden mellem afsendercelle og målcelle. Ved endokrin signalering (1) er signalet et hormon oftest secerneret fra et endokrint organ som via blodbanen kan nå målceller over hele kroppen. Ved parakrin signalering (2) påvirker signalmolekylet naboceller. Signalmolekylet har som regel kort levetid. I det somatiske og det autonome nervesystem er parakrin signalering den almindeligste signaleringsmåde. Parakrine signalmolekyler omfatter neurotransmittere og neurohormoner som er aktiveringssignaler for nerveceller, muskelceller, kirtler m.m. Ved autokrin signalering (3) reagerer cellerne på signalmolekyler, som de selv frigiver. Fx kan tumorceller frigive vækstfaktorer, som stimulerer deres egen celledeling og vækst. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

40 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 2 Fig Skematisk diagram af nervesystemet modificeret fra Lodish et al. (Fig. 21-9). Denne øvelse (strækreceptorøvelsen) demonstrerer hvorledes en strækreceptor reagerer på et adækvat stimulus (strækning). Impulsmønstret ved forskellige stimulationer analyseres og diskuteres. Desuden diskuteres receptorbegrebet og receptortyper for kemiske signalstoffer med udgangspunkt i relevante tekster i Alberts et al., The Cell eller i Lodish et al., Molecular Cell Biology. Læs afsnittene om cellulær signalering og om receptorer og synaptiske signaler. De almene sensoriske receptorer er mindre udførligt behandlet i Alberts et al., og Lodish et al. og vi har derfor udarbejdet en note om dette emne, som kan læses efterfølgende. 2. ALMENE SENSORISKE RECEPTORMEKANISMER (AF J. SKYDSGAARD) 2.1. Sanseorganer og sensoriske receptorer Almene bemærkninger De elektriske signaler som transmitteres og koordineres af nervesystemet har to typer af oprindelse: (i) Spontan fyring i visse excitable celler, fx de neuroner i hjernen, som er ansvarlige for åndedrættets rytmik, og hjertets pacemakerceller, som er ansvarlige for hjertes autorytmik. (ii) Signaler med oprindelse i sanseorganernes sensoriske receptorer, som registrerer begivenheder og tilstande i organismens ydre og indre miljø. Det er de almene principper i funktionen af de sidstnævnte sensoriske receptorer, som skal omtales her. Sanseorganer er biologiske transducere, som omsætter energien fra påvirkninger i omgivelserne til elektrisk energi, således at centralnervesystemet kan modtage information om påvirkningerne i form af propagerede aktionspotentialer i de afferente, sensoriske neuroner. Sanseorganerne er udviklede til præcis skelnen mellem stimuli af forskellig type, til at operere indenfor et meget stort område af stimulationsenergi, og ofte til den yderste grad af følsomhed, idet fx absorption af fem fotoner i det menneskelige øje opfattes som et lysglimt. Et sanseorgan består af Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

41 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 3 sensoriske receptorceller, som udfører selve transduktionen til elektrisk energi, og mere eller mindre komplicerede accessoriske strukturer, der fungerer som støttevæv og gennem modifikation og fordeling af stimulationsenergien har betydning for hvilke af organets receptorceller, der stimuleres, og for hvorledes og hvor kraftigt de påvirkes. Eksempler på sådanne accessoriske strukturer er ørets cochlea, øjets optiske elementer og lamellerne omkring den trykfølsomme nerveende i et Vater Pacini følelegeme (Fig. 2.1A). En lang række informationer om organismens indre aktiviteter, som ikke nødvendigvis kommer til individets bevidsthed, formidles også via sensoriske receptorer, fx muskel- og senetene, som registrerer henholdsvis strækningsgraden af muskler og mekanisk spænding i sener. Fig. 2.l. A: Et Pacini-legeme. Eksempel på en én-celle-receptor (efter Quilliam & Sato, l955). B: Eksempel på to-celle-receptorer: sekundær akustisk mekano-receptor (hårcelle) og tilhørende sensorisk nerveterminal i cochlea samt et lille udsnit af de accessoriske strukturer. Ved tryksvingninger i cochlea bevæges basalmembranen op og ned, således at hårcellens cilier bøjes mod membrana tektoria Adækvat stimulus og klassificering af sensoriske receptorer En sensorisk receptor er specielt følsom for en bestemt type fysisk eller kemisk energi, det adækvate stimulus. På grundlag af adækvat stimulus kan sensoriske receptorer klassificeres som foto-, kemo-, mekano- og termoreceptorer. Hos visse fisk findes elektroreceptorer, som er følsomme for meget svage elektriske felter, og som kan tjene til lokalisering af fødeobjekter, der påvirker elektriske felter udsendt fra dyrenes egne elektriske organer. Hertil kommer nocireceptorer (smertesansning), som registrerer vævsbeskadigelse af kemisk eller fysisk art. De sensoriske receptorers specificitet er dog ikke absolut. Fx kan slag på bulbus oculi medføre synsindtryk, og alle receptorer kan stimuleres af stærke elektriske strømme. Udover adækvat stimulus anvendes andre kriterier til inddeling af sensoriske receptorer, fx receptorens placering i forhold til stimuluskilden: telereceptorer eller afstandsreceptorer (syn, hørelse og lugtesans), exteroceptorer med følsomhed for kontaktpåvirkninger (smag, berøring, varme, kulde), interoceptorer med følsomhed for det indre miljø (blodtryk, kuldioxydtension m.m.) og proprioceptorer, som giver information om relative positioner og bevægelse af muskler og skelet. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

42 Note 3 til biofysik: Receptorer Side Én- og flercellereceptorer I de simplest opbyggede sensoriske receptorer er hele den primære transmissionskæde, fra absorption af stimulusenergien til ledning af de afferente nerveimpulser, knyttet til een celle, selve det sensoriske neuron. I sådanne én-celle receptorer, fx et Pacini-følelegeme (Fig. 1A), er neuronets perifere terminal specialiseret til følsomhed for stimulus, in casu et mekanisk tryk. Kappen af lameller omkring den stimulusfølsomme terminal er en accessorisk struktur af betydning for det nedenfor omtalte fænomen, adaptation. Visse én-celle receptorer mangler specielle accessoriske strukturer, idet den stimulusfølsomme nerveende ligger frit i det omgivende væv. En mere kompleks type receptorer er to-cellereceptorer, hvor det sensoriske neuron er synaptisk forbundet med en specialiseret sekundær receptorcelle (Fig. 1 B), som efter reaktion på stimulus frigør en kemisk transmitter, der igen exciterer neuronet (jvf. afsnit i lærebogen vedrørende synaptisk transmission). I retina findes tre-celle receptorer, idet bipolære celler er indskudt mellem de sensoriske neuroner og de lysfølsomme receptorceller, stave og tappe (tertiære receptorceller) Kodningsprocesserne Kodningsprocesserne, dvs. omsætningen af stimulus til et impulsmønster i den sensoriske nerve, omfatter følgende kæde af begivenheder (Fig. 2.2): (i) Absorption af stimulusenergien i det område af receptorcellen, som er differentieret til høj følsomhed for det adækvate stimulus. (ii) Transduktion af den absorberede energi, evt. via forstærkermekanismer, til elektrisk energi i form af en ændring af receptorens membranpotential, receptorpotentialet (også kaldet generatorpotentialet), som er gradueret efter stimulusstyrken. (iii) Transformation af receptorpotentialet til afferente nerveimpulser med en frekvens, der stiger med receptorpotentialets størrelse og derved med stimulusstyrken. Fig Elementerne i den primære transducerkæde for sensoriske én- (A) og tocellereceptorer (B). Efter Aidley, l97l. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

43 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 5 Impulsfrekvensen er imidlertid sjældent en entydig funktion af stimulationsstyrken. Ved fastholdt stimulationsstyrke sker der i reglen en (iv) adaptation, dvs. impulsfrekvensen falder som funktion af tiden. Hvis adaptationen er fuldstændig, taler man om fasiske receptorer, som kun registrerer ændringer i receptorens omgivelser. Ufuldstændigt adapterende receptorer, som adapterer til en stationær fyringsfrekvens under fastholdt stimulationsstyrke, kaldes toniske receptorer. Sidstnævnte vil altså initialt med relativt høje frekvenser give et relativt kraftigt signal om karakteren af stimulationens dynamiske fase, dvs. om størrelse og hastighed af ændringen af det adækvate stimulus og dernæst med en lavere konstant frekvens informere vedholdende om stimulationens stationære fase Transduktion til receptorpotential Mekanismerne, hvormed den absorberede energi påvirker receptormembranens ionkonduktanser er ikke kendt i detaljer. Det kan være en kemisk reaktion i cellen, som via en "second messenger" påvirker membrankonduktansen som fx i retinas fotoreceptorer. Der kan også være tale om mere direkte påvirkning af membranproteiner, hvilket kan tænkes under deformering af visse mekanoreceptorers membran. Under alle omstændigheder er det karakteristisk, at den primære begivenhed i receptoren, som fører til ændring af membranens ionkonduktanser, kan aktiveres af en meget lav (adækvat) stimulusenergi. Fx kan ét foton medføre en membranpotentialændring på 1 mv i en fotoreceptor, og fem fotoner er som sagt nok til at give et synsindtryk, dvs. tilstrækkelige til at fremkalde aktionspotentialer. Energien, som medfører et tilstrækkeligt receptorpotential til udløsning af aktionspotentialer, overstiger langt energien i de fem fotoner. Receptoren har altså forstærket stimulusenergien. Det er en generel egenskab ved sensoriske receptorer, at omsætningen af stimulusenergien til nerveimpulser kan omfatte en betydelig forstærkning. Forstærkningsenergien stammer bl.a. fra den potentielle energi, som konstant opretholdes i form af de elektrokemiske gradienter over de excitable cellers membran, og som udløses ved ændringer af membranens ionkonduktanser. Receptorpotentialet vil i reglen være en depolarisering, fremkaldt ved åbning af en speciel type natriumkanaler i receptormembranen. En undtagelse er øjets fotoreceptorer, hvor der sker en hyperpolarisering ved lukning af natriumkanaler. Det væsentlige er, at receptorpotentialet ligesom EPSP eller IPSP i postsynaptiske membraner er et gradueret respons, som afspejler stimulationsstyrken. Relationen mellem stimulusstyrke og receptorpotential har kunnet måles med en intracellulær mikroelektrode i fx muskelspindler (strækreceptorer) i frømuskler (Fig. 2.3). Det er toniske én-celle receptorer, hvor en intracellulær elektrode vil måle både receptorpotentialet og de resulterende, overlejrede aktionspotentialer (Fig. 2.3A). Receptorpotentialet alene (Fig. 2.3B) måltes efter blokering af aktionspotentialerne med et lokalbedøvelsesmiddel, som blokerer natriumkanalerne i axonet, men ikke de specielle kanaler i receptormembranen. Ved strækning af receptoren ses et receptorpotential, som indledes med en dynamisk fase i forbindelse med strækningen og derefter hurtigt adapterer til en stationær værdi for til sidst at forsvinde ved stimulationens ophør. Både den dynamiske og den stationære fase af receptorpotentialet er gradueret efter stimulationsstyrken (Fig. 2.3C). I strækreceptorer kan receptorpotentialet være næsten lineært tiltagende med strækningen, men i reglen vil receptorpotentialer afhænge ikkelineært af stimulationsstyrken, således som vist for Pacini følelegemet i Fig. 2.4B. Det giver mulighed for kodning af et relativt stort område af stimulationsstyrken. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

44 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 6 Fig Receptor- og aktionspotentialer fra en isoleret frømuskelspindel. A. Øverste spor: Receptorpotential med overlejrede aktionspotentialer. Nederste spor: Stimulation ved strækning af spindlen i. B. Receptorpotentialet alene efter bedøvelse af axonet. C. Initiale dynamiske faser af receptorpotentialet (R) under forskellige stimulationsstyrker (S). Fig Stimulering af et Pacini følelegeme (A) og dets receptorpotential som funktion af stimulationsstyrken (B). (Modificeret efter Loëwenstein, l96l). I to-cellereceptorer medfører receptorpotentialet i receptorcellen som nævnt en frigørelse af en kemisk transmitter i den synaptiske spalte mellem receptorcelle og neuron (Fig. 2.2). Transmitte- Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

45 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 7 ren fremkalder en depolarisering af neuronet, generatorpotentialet, der ligesom receptorpotentialet og transmitterfrigørelsen er gradueret som funktion af stimulusstyrke. Betegnelserne receptorog generatorpotential har oprindeligt ovennævnte betydninger, men de bruges i flæng. Det væsentlige er, at disse graduerede potentialændringer i sidste ende medfører den elektrotoniske strømudbredning, generator-strømmen (Fig. 2.4A), som udløser de afferente nerveimpulser Transformation til afferent impulsfrekvens Generatorstrømmen passerer ud gennem det sensoriske neurons membran (depolariserer membranen) og medfører udløsning af aktionspotentialer i et specialiseret, let excitabelt membranområde, i det følgende kaldet indkodningsmembranen, som fx kan være første Ranvier'ske indsnøring af myelinskeden på Pacini-legemets nervetråd (Fig. 2.1A og Fig. 2.4A). Da aktionspotentialerne er alt-eller-intet signaler, må størrelsen af receptor- eller generatorpotentialet indkodes som en frekvens af impulser. Indkodningsmembranen er derfor af den type, hvor en opretholdt generatorstrøm medfører repetitiv fyring. Jo større generatorstrømmen er, jo hurtigere vil fyringsområdet blive depolariseret til tærsklen, og jo højere bliver fyringsfrekvensen. I toniske receptorer gælder dette både den indledende dynamiske fase og den efterfølgende stationære fase. Dette er vist på figur 2.5. Til venstre i figuren ses ovenfra og nedefter reaktionen af en strækreceptor på stigende grader af strækning, alle med samme strækningshastighed. Til højre er den resulterende impulsfrekvens for både dynamisk og stationær fase vist som funktion af strækningsgraden. Fig Fyringsfrekvensen som funktion af stimulationsstyrken i en strækreceptor (muskelspindel hos en frø). Til venstre receptorpotential med overlejrede aktionspotentialer under forskellige grader af strækning ved samme hastighed (de underste spor). Bemærk, at den dynamiske fase under selve strækningen giver stigende og størst impulsfrekevns. Til højre ses frekvensen som funktion af strækningsgraden. (Efter Ottoson & Sheppard, l971). Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

46 Note 3 til biofysik: Receptorer Side Indkodningsmembranens egenskaber Indkodningsmembranens specielle egenskaber muliggør udløsning af aktions-potentialer med en frekvens, der er jævnt gradueret som funktion af stimulusintensiteten, og som i reglen ligger mellem ca. 2 og 300 impulser per sekund (2 Hz 300 Hz). Axonmembranen, som ligger i forlængelse af indkodningsmembranen, og hvis opgave er at transmittere den indkodede frekvens hurtigt og præcist til centralnervesystemet, vil i reglen ikke i sig selv være egnet til indkodning. Under påvirkning af en konstant stimulusstrøm vil de fleste axoner enten fyre een gang og dernæst forblive refraktære, eller de vil fyre med en høj frekvens, som kun varierer lidt med stimulusintensiteten. Indkodningsmembranen skal således have i hvert fald to egenskaber, som adskiller den fra axonmembranen: (i) Den skal som sagt være særligt let excitabel for at sikre funktionen som impulsernes udløsningssted, og (ii) den skal besidde mekanismer til at forsinke depolariseringen mellem to aktionspotentialer under opretholdt generatorstrøm for at kunne fyre i den lave ende af frekvensbåndet. (i) Det første krav tilgodeses formentlig ved en særlig stor tæthed af de Na + -kanaler, som betinger aktionspotentialet. Der er formentlig også en stor tæthed af K + -kanalerne bag den forøgede kaliumkonduktans, som sammen med natriumkanalernes inaktivering medfører den hurtige repolarisering mod kaliums ligevægtspotential, V eq K +. Repolariseringen, som er forudsætningen for ophævelsen af Na + -kanalernes inaktive tilstand, modvirkes af den udadgående generatorstrøm. En stor tæthed af K + -kanaler og dermed særlig høj kaliumkonduktans, G K +, under repolariseringen kan derfor være nødvendig for, at membranpotentialet, V m, trods generatorstrømmen kan nærme sigv eq K +. (ii) Ovennævnte K + -kanalers forhindring af, at generatorstrømmen depolariserer membranen på ny, er kortvarig, idet kanalerne lukker igen ved membranens repolarisering ( G K + falder til hvileniveauet). Herefter kan generatorstrømmen igen depolarisere membranen til fyringstærsklen. Kravet om gradueret forsinkelse af denne depolarisering tilgodeses ved, at indkodningsmembraner besidder mindst to ekstra typer af K + -kanaler, som kan aktiveres og øge G K + væsentligt allerede ved små depolariseringer (under tærsklen), og hvis aktivering bl.a. er betinget af et forudgående aktionspotential. Den ene kanaltype kaldes "A-kanaler" eller "tidlige K + -kanaler", fordi de aktiveres hurtigt og midlertidigt ved små depolariseringer. Når generatorstrømmen begynder at depolarisere membranen, åbner A-kanalerne, og yderligere depolariserende effekt hæmmes, indtil A- kanalerne inaktiveres. Herefter kan generatorstrømmen atter gøre sig gældende og med forsinkelse depolarisere membranen til fyring. Under aktionspotentialet forbliver A-kanalerne inaktiverede, fordi de (ligesom Na + -kanalerne) kræver repolarisering, før de atter kan åbnes. Jo mere negativt V m bliver, jo flere A-kanaler vil igen kunne aktiveres. Disse kanalers åbning kan herved fremmes at et forudgående aktionspotential, idet en hyperpolarisering efterfølger et aktionspotential (trods uafbrudt generatorstrøm. Den anden kanaltype er Ca 2+ -kontrollerede K + -kanaler. De aktiveres af Ca 2+ -ioner således, at en stigende intracellulær Ca 2+ -koncentration, [Ca 2+ ] (i), medfører stigende G K +. Denne betinges af forudgående aktionspotentialer på følgende måde: De Ca 2+ - kontrollerede K + -kanaler er lukkede ved den lave [Ca 2+ ] (i) (~10 7 M), som findes i hvile. Den ydre [Ca 2+ ] er ca gange højere. En Ca 2+ -ATPase transporterer calcium aktivt ud af cellen for at opretholde denne store Ca 2+ -koncentrationsforskel. Under aktionspotentialet åbnes nogle spændingsafhængige Ca 2+ -kanaler, hvorved calcium passivt strømmer ind i cellen, således at [Ca 2+ ] (i) stiger og aktiverer de Ca 2+ -kontrollerede K + -kanaler, indtil [Ca 2+ ] (i) atter er reduceret ved aktiv Ca 2+ -transport. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

47 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 9 De Ca 2+ -kontrollerede K + -kanaler vil særlig gøre sig gældende ved høj impulsfrekvens, hvis den aktive Ca 2+ -transport ikke når at reducere [Ca 2+ ] (i) mellem aktionspotentialerne. Dermed vil G K + kunne stige under den repetitive fyring og medføre stigende forsinkelse af depolariseringen mellem impulserne, indtil Ca 2+ -pumpen netop kan fjerne lige så meget calcium, som der strømmer ind under aktionspotentialerne. Herved falder fyringsfrekvensen under en konstant stimulationsstyrke jævnt fra et initialt niveau til en lavere stationær frekvens, hvilket er det karakteristiske billede for adaptation i toniske receptorer Adaption De fuldstændigt adapterende fasiske receptorer informerer kun om forandringers indtræden og intensitet. De er hensigtsmæssige, når organismen udover en advarsel om forandring ikke behøver distraheres af en varig påvirkning, fx et ufarligt tryk, registreret af et Pacini-legeme. Ufuldstændigt adapterende toniske receptorer er vigtige, når organismen konstant skal orienteres om en parameter, fx en kemisk koncentration. Fig. 2.6 viser adaptation for to fasiske følereceptorer (Pacini-legeme og hårreceptor) og to toniske proprioceptorer (muskelspindel og ledkapselreceptor), alle mekanoreceptorer. Fig Eksempler på fuldstændig og ufuldstændig adaptation. (Fra Guyton, l986). Adaptationsmekanismer i sensoriske receptorer er mangfoldige og kan være knyttet til ethvert led i den primære transducerkæde fra påvirkningen af receptordelen til afsendelse af impulser i det afferente neuron. Endvidere kan der gennem feed-back mekanismer være centralt betinget adaptation. Et eksempel på, at adaptation kan være knyttet allerede til en specialiseret accessorisk struktur omkring de sensoriske receptorceller, kendes fra Pacini-følelegemerne (Fig. 2.1A). Uden beklædningen med lameller vil et konstant tryk på den ene side af receptoren medføre et langvarigt receptorpotential og en langvarig, kun langsomt faldende fyringsfrekvens. Med normal forsyning af lamelbeklædning adapterer Pacini-legemet imidlertid fuldstændigt på mindre end et sekund (Fig. 2.6). Det forklares ved, at lamelkappen er en viskøs-elastisk struktur, hvorigennem et ensidigt tryk omgående medfører et ensidigt tryk på receptoren, og receptorpotentialet opstår. Ved en hurtig omfordeling af lamellernes væske bliver trykket dernæst ensartet overalt i Pacini-legemet, hvorved den rumligt uensartede påvirkning af receptormembranen og dermed receptorpotentialet ophører. Når trykket på legemet fjernes, opstår der igen trykforskelle i receptoren, og der fyres atter et kortvarigt impulstog. Pacini-legemet udviser et såkaldt "on off" respons. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

48 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 10 Adaptationsmekanismer i selve transducerkæden kan fx være tidsafhængige ionkonduktanser i receptormembranen, og der kan være tale om faldende koncentration af stimulusfølsomme kemiske komponenter i receptorcellen (fx rhodopsin i retina) eller den kemiske transmitter, som frigøres i synapsen til det sensoriske neuron i tocelle-receptorer. Adaptation knyttet til indkodningsmembranen i toniske receptorer vil ofte være baseret på de ovenfor omtalte Ca 2+ - kontrollerede K + -kanaler Spontan aktivitet En del receptorer er spontant aktive, idet de uden stimulation sender med en basal fyringsfrekvens. Et eksempel på dette er receptorer i sidelinien hos fisk, hvor den spontane aktivitet giver følsomhed for kanalvæskebevægelser i både kranial (øget frekvens) og kaudal retning (faldende frekvens). Spontan aktivitet kan i andre tilfælde have den funktion at give receptoren en relativ høj følsomhed, idet der ikke findes subliminal stimulusintensitet, således at den mindste påvirkning vil afspejles i fyringsfrekvensen Overføringsfunktion og dynamikområde Impulsfrekvensen som funktion af stimulationsstyrken, overføringsfunktionen, varierer meget mellem forskellige typer sensoriske receptorer, men kan tilnærmelsesvis beskrives ved følgende generelle udtryk: F = k(s - S o ) n (jvf. Fig. 2.7) hvor F er frekvensen, S er stimulationsstyrken, S o er styrken af tærskelstimulationen, og k er en konstant. Receptorer med en overføringsfunktion, hvor n < 1, kan informere om et relativt stort stimulationsstyrkeområde og er almindeligt forekommende. Tilfælde hvor n > 1 er sjældne, men kan findes for smertereceptorer (nocireceptorer). Eksempler på n = 1 kendes fra visse strækreceptorer (se Fig. 2.5). Fig Tilnærmede overførselsfunktioner. F: Afferent fyringsfrekvens. S: Stimulationsstyrken. Ved en receptors eller et sanseorgans dynamikområde forstås forholdet mellem den minimale energi og den maksimale energi, som kan håndteres. Visse receptorer har meget store dynamikområder, specielt fotoreceptorer (1:10 11 ) og akustiske mekanoreceptorer (for sanseorganet som helhed 1:10 l2 ). For at kunne håndtere så store dynamikområder, er det nødvendigt med en automatisk "volumenkontrol" (udtryk fra radioteknikken), som undertiden er en form for adaptation, og som kan være perifert eller centralt betinget. For øjets vedkommende er iris funktion som blænde et eksempel. For ørets vedkommende er stimulation af m. stapedius og m. tympani med- Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

49 Note 3 til biofysik: Receptorer Side 11 virkende til kontrol over, hvilke lydbølge-frekvenser og lydstyrker øret er følsomt overfor (dæmpning af støj og egen tale). Relativt store dynamikområder kan også opnås ved, at antallet af responderende receptorceller stiger med stimulationsstyrken. Muligvis har visse sanseorganer receptorer med forskellig stimulationstærskel, således at centralnervesystemet "opfatter" selv lavfrekvente impulstog fra en sensorisk receptor som en kraftig påvirkning af sanseorganet Sammenfatning En sensorisk receptorcelle er en biologisk transducer, som omformer energien fra en bestemt fysisk eller kemisk påvirkning (det adækvate stimulus) til elektrisk energi, hvormed det tilhørende afferente sensoriske neuron stimuleres til fyring af impulstog med en impulsfrekvens, som stiger med stigende stimulationsintensitet inden for et frekvensbånd mellem ca. 2 Hz og 300 Hz. Efter karakteren af det adækvate stimulus inddeles sensoriske receptorer i mekano-, foto-, og kemoreceptorer. Sanseorganer består af sensoriske receptorer omgivet af mere eller mindre komplicerede accessoriske strukturer, der tjener som støttevæv og ofte modificerer (fx koncentrerer) stimulus på vej til receptorcellerne. I primære receptorceller (én-celle receptorer) er receptorfunktionen knyttet til selve det sensoriske neurons perifere ende. Sekundære og tertiære receptorceller (i flercellereceptorer) er specialiserede receptorceller, som er synaptisk forbundet med det sensoriske neuron. Kodningsprocesserne. Generelt kan sensoriske receptorcellers funktion beskrives ved følgende kæde af begivenheder: (i) Absorption af den adækvate energiform i et specialiseret celleområde, som, evt. via forstærkningsmekanismer, medfører (ii) en ændring af receptormembranens ionkonduktans og dermed en potentialændring over membranen, receptorpotentialet, som er gradueret efter stimulationsstyrken. Receptorpotentialet medfører via kemisk transmission i flercellereceptorer en ligeledes gradueret potential-ændring, generator-potentialet, i den tilstødende del af det sensoriske neuron. Generatorpotentialet (receptorpotentialet i éncelle-receptorer) medfører (iii) en elektrotonisk strøm (generatorstrømmen), som stimulerer det sensoriske neuron i et særligt følsomt område, indkodningsmembranen, hvor (iv) de afferente nerveimpulser udløses med en frekvens, der afhænger af generatorpotentialets og dermed af stimulations-intensitetens størrelse. Forstærkning. Energien til udløsning af nerveimpulser over-stiger i mange receptorer den absorberede tærskelenergi for receptoren. Fx kan fem fotoner være tilstrækkeligt til at medføre et synsindtryk. Energien til forstærkning af stimulus er bl.a. den potentielle energi, som findes i form af elektrokemiske iongradienter over receptorens membraner og udløses ved ændring af membranens ionkonduktanser. Adaptation. Impulsfrekvensen er ikke en entydig funktion af stimulationsstyrken, idet frekvensen falder som funktion af tiden under fastholdt stimulationsstyrke. I denne forbindelse skelner man mellem to typer receptorer: Fasiske receptorer er fuldstændigt adapterende og reagerer derfor kun på ændringer i påvirkning (evt. med både "on" of "off" reaktion), og toniske receptorer, der er ufuldstændigt adapterende med en dynamisk og en statisk fase. Toniske receptorer vil således informere centralnervesystemet både om en indtruffet ændring (relativ stor initial frekvensændring) og om konstant påvirkning. Adaptationsmekanismer kan findes i alle transduktions- og transmissionsled fra ændringer i de accessoriske strukturer til tilbagekobling fra centralnervesystemet. Dynamikområde. Herved forstås forholdet mellem den minimale og den maksimale energi, som receptoren kan håndtere. For at indkode store dynamikområder (som fx 1:10 11 i fotoreceptorer og 1:10 12 i akustiske mekanoreceptorer) i et frekvensbånd på 2 og 300 impulser per sekund (maks i akustiske receptorer) er medvirken af perifert og/eller centralt betingede adaptationsmekanismer ("volumenkontrol") nødvendig. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

50 Forelæsningsresume biofysik i cellebiologikurset ny studieordning Forelæsning nr. 68 (bf19) Skeletmuskulatur (innovation og neuromuskulær transmission) (H. Schmalbruch) Skeletmuskelfibre er organiseret i motoriske enheder således, at grupper på 100 til 1000 (muligvis endnu flere) muskelfibre innerveres af en motorisk forhornscelle. Hvert motorneuron har et myeliniseret axon, som ikke forgrener sig før det har nået musklen. Hvert muskelfiber innerveres af kun en motorisk forhornscelle; derfor hører hver muskelfiber kun til en motorisk enhed. Det terminale axon danner en specialiseret synapse, den motoriske endeplade, som sidder midt på muskelfiberen. Dermed bliver ledningsvejen over fiberens længde så kort som mulig. Muskelfibrene er lige så lange som muskelbugen. I menneskets m. biceps brachii måler muskelfibrene fx omkring 10 cm i længden (og µm i tykkelsen). Ledninghastigheden langs en muskelfiber er 3 6 m s 1 og dermed meget langsommere end langs det motoriske axon (50 60 m s 1 hos mennesket; tallene på 100 m s 1 eller mere gælder kun for katte). Når aktionpotentialet i et motorisk axon ankommer til det terminale axon, som ikke er myeliniseret, åbnes spændingsafhængige Ca 2+ -kanaler, og Ca 2+ strømmer ind i axoplasmaet. Ca 2+ fremmer en fusion af synaptiske vesikler med den præsynaptiske membran og acetylkolin (ACh) bliver exocyteret. ACh diffunderer over den synaptiske kløft og binder til acetylkolinreceptorer (AChR) i den postsynaptiske membran. Derved åbnes uspecifikke kationkanaler. På grund af hvilemembranpotentialet og den høje ekstracellulære Na + -koncentration strømmer Na + -ioner gennem den postsynaptiske membran. Når membranpotentialet bliver tiltagende positiv, strømmer K + -ioner i den modsatte retning. Potentialet når begge ionstrømme er lige store kaldes reversal potential. Dette potential ligger mellem 0 og 15 mv. Åbningen af de uspecifikke kationkanaler medfører et ikke-propageret endepladepotential, som bevirker åbning af nærtliggende spændingsafhængige Na + -kanaler, som igen bevirker at der opstår et aktionspotential i muskelfiberens plasmamembran (sarkolemma). Den neuromuskulære endeplade er en enestående synapse, fordi den har en så høj safety factor, at hvert ankommende aktionspotential udløser et postsynaptisk aktionspotential. Ved endepladen kan man også i hvile registrere meget små endepladepotentialer på omkring 0,4 mv, som tilskrives exocytose af enkelte ACh-vesikler og som ikke udløser et postsynaptisk aktionspotentiale. Disse miniature endplate potentials MEPPs er enten af samme størrelse eller to til tre gange større end de mindste. ACh-indholdet af en vesikel betegnes som kvantum; man regner med ACh molekyler per vesikel. Virkningen af ACh på AChR er kortvarig, fordi ACh nedbrydes til edikkesyre og kolin af acetylkolinesterase (AChE) som findes i den synaptiske kløft bundet til basalmembranen. En stor del af kolin genoptages af det terminale axon og genbruges til syntese af ACh ved hjælp af kolinacetyltransferase (CAT). Motorneuronet kan ikke danne kolin; kolintransport over membranen kan hæmmes med hemicholinium hvilket efter nogen tid nedsætter ACh indholdt i det terminale axon. Forstyrret funktion af den neuromuskulære synapse medfører svaghed og lammelse. Ved myastenisk syndrom Lambert-Eaton, som fx findes hos nogle patienter med lungekræft, dannes antistoffer mod de præsynaptiske Ca 2+ -kanaler; ved myasthenia gravis dannes antistoffer mod de postsynaptiske AChR. Myasthenia gravis behandles med anti-ache således, at ACh virkningen forlænges og forstærkes. Virkningen af disse terapeutisk brugte anti-ache er reversibel og varer nogle timer (eksempel: Prostigmin); man har udviklet irreversible anti- AChE til brug som krigsgasser (eksempel: Sarin) og også insekticider som virker på insekter og som er så ugiftige som muligt for mennesker (eksempel: Bladan). Medicinsk Fysiologisk Institut, 2. maj 2001

51 Forelæsningsresume biofysik i cellebiologikurset ny studieordning Giftvirkningen af de irreversible AChE inhibitorer formidles ikke primært gennem de nikotinerge AChR i skeletmuskulatur men gennem muskarinerge AChR i hjerte og glat muskulatur. Modgiften atropin virker der og ikke ved skeletmuskler. Den neuromuskulære synapse er angrebspunkt af forskellige gifte. Det indianske pilegift kurare blokerer AChR og er et vigtigt hjælpemiddel ved operationer i narkose og sørger for muskelrelaksation; selvfølgeligt skal patienten være i respirator, fordi respirationsmusklerne også lammes. Prostigmin virker som modgift. Alfa-bungarotoxin er et slangegift, som lammer byttet ved at blokere AChR. Botulinumtoxin, som dannes af anaerobt voksende bakterier ( pølseforgiftning ), hæmmer frigørelsen af ACh-vesikler fra den præsynaptiske membran. Forgiftningerne har en meget høj mortalitet fordi respirationsmusklerne lammes. Botulinumtoxin bruges terapeutisk og injiceres lokalt ved krampe i enkelte muskler, fx øjenmuskler. Medicinsk Fysiologisk Institut, 2. maj 2001

52 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-1 NOTER TIL STOFTRANSPORT KAPITEL 2: MEMBRANPOTENTIALER 2.1. INDLEDNING ELEKTRISK FELT OG POTENTIAL IONTRANSPORT I OPLØSNINGER Migration Migration med overlejret diffusion LIGEVÆGTSPOTENTIALET Kvalitativ beskrivelse af oprindelsen til membranpotentialet over selektivt permeable membraner Nernst-ligningen Tætheden af overskydende ladninger på de to membransider Udledning af Nernst's ligning Det ækvivalente elektriske kredsløb for den ionselektive membran Måling af strøm-spændingskarakteristikken Membranstrøm og membrankonduktans Det ækvivalente kredsløb Membrankonduktans og membranpermeabilitet DONNANPOTENTIALET Kvalitativ beskrivelse af donnanpotentialets fremkomst Kvantitativ behandling af donnansystemet DIFFUSIONSPOTENTIAL Kvalitativ beskrivelse af diffusionspotentialet Nedbrydning af Donnan-regimet Diffusionspotentialet for en binær elektrolyt Saltbro til elimination af diffusionspotentialet Kvantitativ beskrivelse af diffusionspotentialet Beregning af diffusionspotentialet for en binær monovalent elektrolyt Diffusionspotentialet for en mosaik-membran (Millman-ligningen) Diffusionspotentialet når feltet i membranen er konstant (Goldman-ligningen)...29 Medicinsk Fysiologisk Institut Københavns Universitet 2001

53 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side INDLEDNING I kapitel 1 behandles kun den passive transport af uladede molekyler i opløsning, fx sukrose. I dette kapitel redegøres der for nogle af de karakteristiske træk ved den passive transport af elektrolytter i et frit, ubegrænset medium og for nogle af de mekanismer, som ligger til grund for, at der kan fremkomme en elektrisk spændingsforskel over en membran (membranpotentialer). En elektrolytopløsning indeholder dels ioner med elektrisk positive ladninger (kationer) og dels ioner med negative ladninger (anioner). Dette indebærer oftest, at man skal beskrive transporten af kat- og anioner hver for sig, idet det hører til undtagelsen, at man kan nøjes med at beskrive transporten af saltet som helhed. Dissociationen til ioner med positive og negative elektriske ladninger medfører endvidere, at såvel systemet som helhed som bevægelsen af anioner og kationer bliver pålagt den ekstra tvangsbetingelse, at der aldrig noget sted i rummet kan fremkomme en afvigelse mellem mængden af positive og negative elektriske ladninger, der er tilstrækkelig stor til, at den kan måles ved en simpel kemisk analyse. Man siger, at i elektrolytopløsninger skal der herske makroskopisk elektroneutralitet. Årsagen hertil er, at der opstår enorme elektriske tiltrækningskræfter, såfremt der et sted i rummet fremkommer frie positive og negative ladninger, selv når et helt forsvindende antal an- og kationer skilles fra hinanden. Beskrivelsen af ioners passive transport bliver også mere kompliceret, hvis der hersker en elektrisk potentialforskel gennem opløsningen eller over en membran. Ionerne vil nu ikke alene bevæge sig under indflydelse af deres koncentrationsgradienter, dvs. ved diffusion alene, men også på grund af det elektriske kraftfelt, der er knyttet til potentialgradienten, og som vil give anledning til, at ionerne vil bevæge sig ved migration alene, også i tilfælde uden en koncentrationsgradient i opløsningen. Udgangspunktet for beskrivelsen af ionernes bevægelse bliver derfor ikke Fick's lov (lign. 1.12), men Smoluchowski-ligningen (lign. (1.27) respektive lign. (1.28)), som beskriver transporten, der er resultatet af tilstedeværelsen af såvel en koncentrationsgradient som et ydre virkende kraftfelt. Hvis to elektrolytopløsninger er i kontakt med hinanden gennem en membran, som er gennemtrængelig for enkelte eller samtlige ioner i opløsningerne, vil man oftest kunne måle, at der findes en elektrisk potentialforskel mellem de to opløsninger, og at potentialspringet ligger over membranen, som skiller de to opløsninger. Spændingsforskellen fremkommer, dersom ionerne ved deres diffusion gennem membranen også medbringer en nettoladning, således at den ene opløsning tildeles et overskud af fx positive ladninger, mens et tilsvarende overskud af negative ladninger efterlades i den anden opløsning. Den spændingsforskel, som herved fremkommer over membranen betegnes som membranpotentialet. To forhold er nødvendige for fremkomsten af membranpotentialet: (1) membranen skal være gennemtrængelig for nogle eller alle de ioner, der findes i de opløsninger, som omgiver membranen, og (2) de to opløsninger må have forskellig sammensætning. At disse to betingelser ikke er tilstrækkelige, skulle fremgå af de følgende afsnit, hvor der redegøres nærmere for de faktorer, der spiller en rolle for fremkomsten af de elektriske spændingsforskelle, som kan opstå såvel i fri opløsninger som over membraner ELEKTRISK FELT OG POTENTIAL Omkring enhver ladet partikel findes der et større eller mindre område, hvor andre elektriske ladninger vil blive påvirket med en kraft. Når ladningerne ligger stille i forhold til hverandre, betegner vi denne kraft som en elektrostatisk kraft. I det område, hvor en elektrisk ladning påvirkes med en elektrostatisk kraft, siger vi, at der findes et elektrisk felt. Størrelsen af det elektriske felt er defineret som forholdet mellem den elektrostatiske kraft, X, som en positivt ladet partikel påvirkes med, og partiklens ladning q. Formlen for feltstyrken E! er derfor:

54 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-2! E =! F q hvor prøveladningen q dog skal være så lille, at dens tilstedeværelse ikke forstyrrer det oprindelige elektriske felt E!. Denne vektorstørrelse E!, som karakteriserer feltet i hvert punkt, har mange navne, som bruges i flæng mellem hverandre: elektrisk felt, elektrisk feltstyrke, elektrisk feltintensitet og elektrisk intensitet. Har feltstyrken størrelsen E på det sted, hvor ladningen q befinder sig, er den kraft, X, den påvirkes med X = q E e Drejer det sig om en ion, fx en proton, så er kraften X = q E (2.1) e hvor q e = 1, coulomb er den positive elementarladning. For en kation K z+, der bærer z + positive elementarladninger, er kraften X = z q E (2.2) + e og for en anion A z med z negative elementarladninger er kraften X = z q E (2.3) e altså modsat rettet kraften, der virker på kationen. Nært knyttet til det elektriske felt er en anden størrelse, som ligeledes karakteriserer det elektriske felt, det elektriske potential. Når man flytter en ladning rundt i et rum, med et elektrisk felt, må man udføre et arbejde for at flytte ladningen, idet den hele tiden er påvirket af en kraft. Omvendt kan man også sige, at feltet udfører et arbejde på ladningen ved at flytte denne. Det arbejde, man må udføre for at flytte en ladning fra et punkt (1) i rummet til et andet punkt (2), må afhænge af størrelsen af både den bevægede partikels ladning q, og feltet mellem de to punkter. Jo større felt, jo større arbejde. Det arbejde, der skal udføres for at flytte ladningen, er derfor også et mål for feltstyrken i rummet. Sammenhængen mellem disse to størrelser skal nu vises. Til at karakterisere dette arbejde indføres en ny størrelse, potentialet. Som symbol for det elektrostatiske potential anvendes det græske bogstav Ψ (psi). Den fysiske betydning af potentialet i et punkt kan illustreres således: Vi betragter for simpelheds skyld feltet omkring en punktladning. Feltet vil aftage med kvadratet på afstanden fra punktladningen. Bevæger vi os bort fra ladningen, vil feltet aftage og gå mod nul, når afstanden går mod uendelig. Vi tænker os nu, at vi fører en positiv, lille ladning q fra uendelig hen til punktet (1). Herved udfører vi arbejde W(1) joule. Vi siger da, at potentialet i dette punkt er W(1) Ψ = q -1 (1) ( joule per coulomb,jc ) Potentialet er altså arbejdet, der udføres, når ladningen 1 coulomb føres mod feltet fra uendelig til punktet (1). Det elektriske potential har altså dimensionen arbejde per coulomb, som betegnes med en speciel enhed, nemlig volt: 1 joule per coulomb = 1 volt (V). Føres ladningen i stedet til punktet (2), udføres arbejdet W(2), og potentialet i dette punkt er W(2) Ψ (2) = (volt) q

55 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-3 Arbejdet, der skal ydes for at flytte ladningen fra punktet (1) til punktet (2), er altså [ Ψ Ψ ] W(2) W(1) = q (2) (1) og potentialforskellen mellem punkt (2) og punktet (1) er W(2) W(1) Ψ (2) Ψ (1) = q Der findes en simpel relation mellem potentialet Ψ og feltstyrken E, som vi nu skal udlede. Vi lader punkterne (1) og (2) rykke så nær hinanden, at kraften, man skal benytte for at flytte ladningen fra (1) til (2), kan betragtes som konstant. Lad denne kraft være X. Lad endvidere punkterne (1) og (2) være beliggende i positionerne x og (x + h), og lad potentialet i de to punkter være Ψ(x) og Ψ(x + h). Arbejdet, vi skal udføre for at flytte ladningen q over afstanden h, er eller [ Ψ Ψ ] dw = X h = q ( x + h ) ( x ) Ψ(x+ h) Ψ(x) X = q h Lader man dernæst h 0, fås kraften i positionen x, dvs. X = q dψ dx Nu er den kraft X, vi skal påvirke ladningen med for at flytte den, numerisk lig med den kraft, hvormed feltet virker på ladningen. Denne kraft, som er lig med E q, er modsat rettet kraften X, som vi virker med, altså Man har da X = Eq Eq = q dψ dx eller E = dψ (2.4) dx Dette betyder, at feltstyrken i et givet punkt er lig med den negative gradient af potentialet i dette punkt IONTRANSPORT I OPLØSNINGER I dette afsnit skal der redegøres for nogle af de begreber og love, som specielt anvendes til beskrivelsen ved transporten af ioner, der findes i opløsning.

56 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side MIGRATION Vi betragter en elektrolytopløsning med ensartet koncentration. I opløsningen er der anbragt to pladeelektroder som er tilsluttet en elektrisk spændingsgenerator (fx et batteri). Er det elektriske spændingsfald mellem pladeelektroderne V volt og afstanden mellem pladerne L m, så vil der i opløsningen herske et elektrisk felt i spændingsfaldets retning, som er E = V L ( volt per meter) Lad N j være koncentrationen (antal ioner per m 3 ) af iontypen j, fx Ca 2+, som har ladningstallet z j (dvs. +2 for Ca 2+ ). Feltets tilstedeværelse medfører, at hver af ionerne er påvirket af en kraft, som for de positive ioners vedkommende har den samme retning som feltet, mens kraften er modsat rettet på de negative ioner. Ionen af type j bærer ladningen Q = z j q e, hvor q e er den positive elementarladning. Kraften, X j, der virker på hver ion af type j, er derfor X j = QE = zj qe E (2.5) og hvor retningen af kraften er bestemt ved fortegnet for ladningstallet z j. Kraften X j vil tildele ionen en migrationshastighed v j som er v = B X (2.6) j j j hvor B j er ionens mekaniske mobilitet (sml. kapitel 1, afsnit 1.4.1). Indsættes heri udtrykket for X j, fås hvor vj = zj qe Bj E = uj E (2.7) u = z q B (2.8) j j e j betegnes som ionens elektriske mobilitet, dvs. den stationære hastighed, som ionen tildeles under påvirkning af et elektrisk felt på 1 V m 1. I vandig opløsning er ionhastighederne for felter på 10 V m 1 af størrelsen m s 1, så ionernes elektriske mobilitet er af størrelsen m 2 s 1 V 1. Den migrationsflux, J j, af ionen af type j, som er frembragt af kraften X j, er lig med v j N j. Indsættes heri det ovenstående udtryk for v j, (lign. (2.7)), fås J = u N E (2.9) j j j Hver ion bærer en elektrisk ladning, som er Q = z j q e. Til fluxen J j svarer der derfor en elektrisk strøm, I j, båret af iontypen j, som er I = z q J (2.10) j j e j Da fluxen angiver den stofmængde, som per tidsenhed passerer en arealenhed (m 2 ), der er anbragt vinkelret på transportstrømmens retning, så følger det, at I j er strømmen i ampere, der løber gennem denne arealenhed. I j er således strømtætheden, (dvs. ampere per m 2 ) af iontypen j. Indsættes lign. (2.9) i lign. (2.10) fås I = z q u N E (2.11) j j e j j Dette udtryk kan også skrives

57 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-5 hvor N A er Avogadro's tal. Nu er N j I j = zj( qe NA) uj E N N N j 1 A A = koncentrationen C j i mol m 3, og N A q e = F = Faradays's tal = coulomb per ækvivalent. Lign. (2.11) kan derfor også skrives som I = z q Fu C E (2.12) j j e j j I en leder, der gennemløbes af en strøm på I ampere, som er frembragt af spændingsfaldet på V volt, er sammenhængen mellem disse størrelser givet ved Ohm's lov V = RI hvor R er lederens resistans målt i ohm (Ω). Ohm's lov skrives også tit på formen hvor I = 1 V = GV (2.13) R G = 1 (2.14) R betegnes som lederens konduktans. Denne måles i reciprokke ohm (Ω 1 ) eller siemens (S). Konduktansen af en leder med tværsnitsarealet A og længden L kan skrives som G A m per m L 2 = χ ( ) (2.15) hvor konstanten χ (S m 1 ) betegnes som lederens specifikke konduktivitet, eller blot konduktiviteten. χ er konduktansen af en leder med tværsnitsarealet 1 m 2 og længden 1 m. Lign. (2.15) multipliceres med spændingsfaldet V over lederen med længden L. Dette giver GV = χ A V = χ AE = i L hvor i er strømmen, der løber gennem tværsnitsarealet A. Divideres ligningen på begge sider med A, fås i på venstre side strømtætheden I =. Man har da A I = χ E som blot er et andet udtryk for Ohm's lov, der giver sammenhængen mellem strømtæthed og feltstyrke i lederen. Sammenholdes dette udtryk med Lign. (2.12), fås χ = zj FujCj (2.16) som er det bidrag til elektrolyttens konduktivitet, som hidrører fra ionen af typen j. Den totale strømtæthed, der stammer fra migrationen af alle de n tilstedeværende ioner, er j= n I = E z Fu C (2.17) j= 1 j j j

58 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-6 hvorfor opløsningens totale konduktivitet κ er χ j= n = zj FujCj (2.18) j= 1 Hertil svarer der en resistivitet ρ = 1 (2.19) χ dvs. modstanden af en terning af elektrolytten med siden 1 m. Er længden i strømmens retning ikke 1 m, men h m, så svarer dertil en resistans R= ρ h= h (2.20) χ som er modstanden af et prisme af elektrolytten stadig med tværsnitsarealet 1 m 2, men med længden h. Den hertil svarende konduktans er G 1 χ = = (2.21) R h Da χ har dimensionen siemens m 1, har ovenstående konduktans dimensionen siemens m 2. Tilsvarende har hver enkelt ion af typen j en konduktans G j, som er givet ved G j z Fu C h j j j = (2.22) Ved beskrivelsen af ioners transport gennem membraner skal vi senere møde denne specielle form for konduktanser, dvs. konduktansen af en leder med tværsnitsareal 1 m 2 og længden eller tykkelsen h MIGRATION MED OVERLEJRET DIFFUSION Vi betragter nu den situation, hvor såvel elektrolytkoncentrationen som det elektriske potential Ψ(x) varierer gennem rummet. De enkelte ioner vil nu bevæge sig både ved diffusion (på grund af koncentrationsgradientens tilstedeværelse) og ved migration. Fluxen er derfor givet ved Smoluchowski-ligningen (se Kap. 1) = dc (1.27) J BC Xmigr D dx Det elektriske felt i et punkt i positionen x, hvor det elektriske potential er Ψ(x), vil derfor påvirke en kation med valensen z + med en kraft X + el, som ifølge lign. (2.2) og lign. (2.4) er el X z q d e E z q Ψ e dx = = (2.23) Erstattes dernæst den drivende kraft X migr i lign. (1.27) med det ovenstående udtryk for den elektriske kraft, fås dc+ J D z q d e B C Ψ + = + (2.24) dx dx

59 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-7 hvor J + er fluxen af kationen med diffusionskoefficienten D + og bevægeligheden B + på stedet med positionskoordinaten x, hvor koncentrationen er C +, koncentrationsgradienten dc dx+, og potentialgradienten er dψ. dx Indsættes Einstein-relationen (Kap. 1, lign. (1.19)) D = KT B + + i lign. (2.24), fås dc+ J kt B z q d e B C Ψ + = + (2.25) dx dx eller kt dc J = B C + z q dψ e C+ dx dx (2.26) De tilsvarende udtryk for fluxen, J, af en anion med valensen z er (jvf. lign. (2.3)) og dc J D z q d e B C Ψ = + (2.27) dx dx kt dc J B C z q dψ = e C dx dx (2.28) Ligningerne (2.25) - ((2.28) kaldes for elektrodiffusionsligningerne eller Nernst-Planck-ligningerne. Disse ligninger skal senere anvendes ved behandlingen af transporten af ioner over cellemembraner LIGEVÆGTSPOTENTIALET I dette afsnit skal der redegøres for en ions ligevægtspotential. Dette begreb fremkommer i forbindelse med beskrivelsen af den gensidige udveksling af ionerne mellem to elektrolytopløsninger, der er adskilt fra hinanden ved en membran, der er gennemtrængelig for én eller alle de tilstedeværende typer af ioner. Ligevægtspotentialet spiller her en helt central rolle både ved vurderingen af retningen, som en ion passivt vil vandre gennem membranen, og for forståelsen af de faktorer, der er bestemmende for størrelsen af den elektriske spændingsforskel, membranpotentialet, der måtte vise sig at findes over membranen KVALITATIV BESKRIVELSE AF OPRINDELSEN TIL MEMBRANPOTENTIA- LET OVER SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Vi begynder med at betragte det ekstremt simple tilfælde, hvor membranen er selektivt permeabel over for enten kationer eller anioner. Sådanne membraner anvendes teknologisk i form af de såkaldte ionbyttermembraner. En sådan membran består af en matrix af kulbrintepolymerer, hvorpå der findes kovalent bundne anioner, fx sulfonsyre SO 3, eller kationer fx ammoniumioner + NH 3. De fixe ladninger medfører, at ioner af modsat ladning, modioner (counterioner), kan trænge ind i membranens matrix på grund af betingelsen om elektroneutralitet og udveksles med

60 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-8 de modioner, der allerede måtte befinde sig i membranens matrix. Derimod vil ioner med samme ladning, "medioner" (co-ions "co-ioner"), blive frastødt elektrostatisk, og membranen vil opføre sig, som om den er uigennemtrængelig for medionen. Som eksempel tager vi, som vist i Fig. 2.1, en kationpermeabel membran, der adskiller to faser (1) og (2), i hvilken der anbringes to KCl opløsninger med koncentrationerne C (1) og C (2). Fig Den selektivt permeable membran Er C (1) > C (2), vil K + -ionen, der kan diffundereregennem membranen, have en tendens til at diffundere fra fasen (1) til fasen (2) som følge af koncentrationsforskellen, C = C (1) C (2), mellem de to faser. Under denne proces vil modionen, Cl, forblive i fase (1), da membranen ikke tillader passage af anioner. Resultatet heraf er, at elektroneutraliteten i de to faser ikke længere opretholdes, idet der kommer et overskud af de positivt ladede K + -ioner i fase (2), som ikke kan neutraliseres af Cl -ionerne i denne fase. Et tilsvarende underskud af positive ioner fremkommer i fase (1) med den høje koncentration. Der vil derfor komme et elektrisk potentialspring over membranen, hvor fase (2) har et elektrisk potential, Ψ (2), som er højere end potentialet Ψ (1) i fase (1). Altså Ψ < Ψ, når C > C ( 1) ( 2) ( 1) ( 2) og membranen kun er permeabel for K +. I membranen vil der nu findes et elektrisk felt E = dψ Ψ Ψ dx h (2) (1 ) hvor h er membranens tykkelse. Det ses, at feltets retning er fra fasen (2) mod fasen (1). Dette elektriske felt vil påvirke en K + -ion i membranen med en kraft F + = q E e i samme retning og derfor søge at bevæge K + -ionen i retningen fra (2) til (1), altså modsat transportretningen hidrørende fra tilstedeværelsen af koncentrationsgradienten i membranen. Den potentialforskel, Ψ (2) Ψ (1), som er opstået mellem de to faser ved diffusion af fri K + -ioner, uden ledsagelse af et tilsvarende antal Cl -ioner, vil derfor modvirke diffusionen af K + -ioner fra (1) til

61 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-9 (2). Resultatet heraf er en nedsat nettotransporthastighed af K + -ioner fra (1) til (2). På et eller andet tidspunkt vil der være diffunderet netop så mange fri K + -ioner over i fasen (2), at potentialforskellen Ψ (2) Ψ (1) over membranen har antaget den værdi, som lige hindrer en nettotransport af K + -ioner fra (1) til (2) ved diffusion som følge af den koncentrationsforskel C (1) C (2), der findes mellem de to faser (sml. Fig. 2.2). Der er hermed indtrådt ligevægt i systemet: per tidsenhed vil der gå lige så mange K + -ioner fra fase (1) til fase (2) som fra fase (2) til fase (1). Herefter vil der ikke mere ske nogen makroskopiske ændringer i systemet. Fig Til illustration af ligevægt over den selektivt permeable membran Den potentialforskel, der skal etableres over membranen, for at der er ligevægt for den diffusible ion mellem de to faser, kaldes for ligevægtspotentialet for ionen ved den pågældende koncentration. I det foreliggende tilfælde drejer det sig om ligevægtspotentialet for K + -ionen, og vi betegner det som V +. eq K Denne potentialforskel medfører tilsyneladende ingen ændring i Cl -ionernes tilstand, da de jo antages ikke at kunne trænge gennem membranen. Men når der findes et elektrisk felt mellem de to faser, som påvirker en positiv ion i retningen fra fase (2) mod fase (1), så vil negativt ladede ioner have en tendens til at bevæge sig i den modsatte retning, altså fra fase (1) til fase (2). Dette er den samme retning, som de søger at bevæge sig som følge af koncentrationsforskellen mellem de to faser. Cl -ionerne er altså kommet endnu mere bort fra ligevægtstilstanden. Lad os derefter tænke os, at vi har en membran, som er sådan indrettet, at vi ved en eller anden påvirkning pludselig kan ændre membranens permeabilitet fra at være selektivt permeabel for K + til at blive selektivt permeabel for Cl i stedet. Cl -ionerne vil bevæges ved diffusion i retningen svarende til den faldende koncentrationsgradient. Denne vandring vil tilmed blive understøttet ved tilstedeværelsen af den potentialforskel over membranen, som var opbygget svarende til den tidligere ligevægtstilstand (membranen selektivt permeabel for K + -ioner). Da membranen nu er selektivt permeabel for Cl -ioner, vil der foregå en bevægelse af Cl -ioner fra fase (1) til fase (2), som ikke er ledsaget af et tilsvarende antal K + -ioner. Resultatet heraf er, at fase (2) nu lades op med overskydende negative ioner, mens fase (1) kommer til at indeholde et tilsvarende underskud af negative ioner. Fasen (2) vil derfor antage et lavere potential end fasen (1). Når der igen er indtrådt ligevægt, vil der være et potentialspring over membranen af samme størrelse som i den tidligere betragtede situation, hvor membranen var selektivt permeabel for K +, men polariteten af membranpotentialet vil være den modsatte, altså

62 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-10 Ψ > Ψ, når C > C ( 1) (2) (1) (2) og membranen kun er permeabel for Cl NERNST-LIGNINGEN Som anført fremkommer ligevægtspotentialet over den selektivt permeable membran, når de permeable ioners diffusion ind i fasen med den laveste koncentration holdes i skak af de elektriske kræfter, der søger at drive ionerne i den modsatte retning. Jo større koncentrationsgradient, jo større diffusionsflux og desto større elektrisk felt må der opbygges, før nettofluxen går i stå. Det må derfor forventes, at der må findes en kvantitativ sammenhæng mellem de to fasers koncentrationer af den permeable ion og ligevægtspotentialets størrelse. Den tyske fysiske kemiker Walther Nernst viste i 1888, at relationen mellem disse størrelser er givet ved Ψ C = = (2.29) (2) ( 1 ) (1 ) eq j Ψ V RT j ln ( 1 ) zf j C j og som sædvanligvis betegnes som Nernst's ligning. I det ovenstående udtryk er R gaskonstanten (8,314 joule mol 1 K 1, F er Faraday's tal (96491 coulomb mol 1 ), T er temperaturen i Kelvin-grader, K, og z j er ladningstallet for ionen af typen j, dvs. z j er 1,2,3... for kationer og 1, 2, 3... for anioner. For at forebygge enhver misforståelse angående fortegnet for z j bruges undertiden skrivemåden z j for anioner. Størrelsen RT F skal have dimensionen volt. Dette fremgår også af dimensionsanalysen RT F = joule mol 1 K 1 K (coulomb mol 1 ) = J C 1 = volt. Tabel 2.1 angiver værdierne af RT ved forskellige hyppigt forekommende temperaturer. F Det er tit bekvemt at benytte 10-tals logaritmen i stedet for den naturlige logaritme (grundtal e = 2, ), som indgår i lign. (2.29). Relationen mellem de to typer af logaritmer er ln(x) = 2,3026 log(x). I tabellen er ligeledes angivet værdier af 2,3026 RT F. Tabel 2.1. Nogle værdier af R T F 1 ved forskellige temperaturer ûc K RT F (mv) 2,3026 RT F (mv) 0 273,15 23,5 54, ,15 25,7 59, ,15 26,7 61,5 Nernst-ligningen kan derfor også skrives på formen Ψ C = = (2.30) (2) ( 1 ) (1 ) eq j Ψ V RT j 2,3026 ln ( 1 ) zf j C j Ved 25 ûc har man

63 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-11 Ψ C = V = log (mv ) (2.31) (2) ( 1 ) (1 ) eq j Ψ 59,2 j ( 1 ) z j C j Hvis C C ( 2 ) j ( 1 ) j = 0,1, fås et ligevægtspotential på 59,2 mv, såfremt membranen er selektivt permeabel for K + -ioner (z + =1) og et ligevægtspotential på +59,2 mv, hvis membranen i stedet kun er permeabel for Cl -ioner, idet z j i lign. (2.31) skal erstattes med z = Tætheden af overskydende ladninger på de to membransider Man kan skønne over, hvor mange ukompenserede K + -ioner, der skal bevæge sig gennem membranen for at etablere ligevægtspotentialet. Biologiske membraner har alle en elektrisk kapacitet C m, som er af størrelsen C = 1µ F cm m 2 Lad os antage, at der er en spændingsforskel på 60 mv over membranen. Til denne spændingsforskel svarer der en ladningstæthed q, som per cm 2 er q = CV = 10 µ F cm volt = 6 10 coulomb cm m m Et mol K + -ioner kan bære en ladning F = = ca coulomb mol 1. På den membranside, som vender mod den positivt ladede fase, findes altså 6 10 C cm 10 C mol = 6 10 mol cm 13 2 Et tilsvarende antal negative ladninger vil findes på membranens anden side. Den ovennævnte ladningstæthed svarer igen til 6 10 mol cm 6,03 10 ioner mol = 3,6 10 ioner cm Groft set svarer dette tal til et enkelt tætpakket lag af hydrerede K + -ioner. Det vil med andre ord sige, at antallet af uneutraliserede ioner, der skal til for at give et membranpotential på størrelsen 100 mv, er forsvindende lille. Kunstige membraner har i almindelighed en langt mindre elektrisk kapacitet. Det ovenstående tal for den overskydende ladningstæthed vil derfor mindskes lige så mange gange, som ionbyttermembranens kapacitet er mindre end C m = 1 µf cm Udledning af Nernst's ligning Der er flere forskellige måder, hvorpå Nernst's ligning kan udledes. Her skal vises én måde, hvor udgangspunktet er Nernst-Planck-ligningerne. Vi betragter situationen, der er angivet i Fig En membran med tykkelsen h, der er selektivt permeabel fx for kationer, adskiller to elektrolytopløsninger, fx KCl, med forskellige koncentrationer, hvor C (1) > C (2). Så længe der foregår en nettoflux af K + -ioner i retningen (1) (2), vil potentialforskellen Ψ (1) Ψ (2) over membranen opbygges. Denne flux er beskrevet ved Nernst-Planck-ligningerne, hvoraf vi vælger den form, som er udtrykt ved lign. (2.26)

64 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-12 kt dc J = B C + z q dψ e C+ dx dx (2.26) hvor dc+ og d Ψ er henholdsvis koncentrationsgradienten og potentialgradienten i enhver position 0 x dx dx h på x-aksen, der er anbragt vinkelret på membranen og med retningen (1) til (2) værende positiv. Når der er indtrådt ligevægt i systemet, er potentialforskellen over membranen vokset til den karakteristiske eq værdi, ligevægtspotentialet, V +, for K + -ionen, der sikrer, at nettofluxen af K + -ioner gennem membranen nu er nul, dvs. ved ligevægt er J = 0 og Ψ Ψ = V (2.32) ( 1 ) (1 ) eq + + Både B + og C + er positive størrelser. J + i lign. (2.26) kan derfor kun blive nul, såfremt leddet i parentesen er nul for alle værdier af x i området 0 x h. Dette indebærer, at potentialgradienten d Ψ har justeret dx sig således i forhold til koncentrationsgradienten dc dx+, at ved membranligevægt er d kt 1 dc = dx z q C dx Ψ + + e + Højre og venstre side multipliceres med dx. Dette giver d kt dc = (2.33) Ψ + z+ qe C+ hvilket vil sige, at potentialændringen dψ i membranen mellem to nært beliggende punkter (x+dx) og x er lig med den relative nedgang i koncentrationen dc dx+ mellem de samme punkter multipliceret med kt. z+ qe Potentialspringet over membranen fås nu ved integration af lign. (2.33). Så længe vi befinder os enten i fase (1) eller fase (2), er potentialet og koncentrationerne konstante overalt i de to faser, dvs. C + = C ( 1) + og Ψ = Ψ (1) = konstant i fase (1), og C + = C ( 2 ) + og Ψ = Ψ (2) = konstant i fase (2), eller med andre ord dc + = 0 og dψ = 0 i hver af de to faser (1) og (2). Det spiller derfor ingen rolle, om integrationsvejen kun lige omfatter membranen, eller om den strækker sig fra et vilkårligt punkt i fase (1) til et andet punkt i fase (2). Man har da Ψ = Ψ (2) (2) C+ = C+ dc+ dψ = z kte q C C C ( 1 ) (1 ) = = + Ψ Ψ eller (2) (2) (1 ) kt (2) (1 ) kt C+ Ψ Ψ = lnc lnc ln ( 1 ) z q + + = + e z+ qe C+ (2.34) Da N A k = R og N A q e = F, fås

65 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-13 Ψ C = = (2.29) (2) ( 1 ) (1 ) eq j Ψ V RT j ln ( 1 ) zf j C j som er Nernst's ligning DET ÆKVIVALENTE ELEKTRISKE KREDSLØB FOR DEN IONSELEKTIVE MEMBRAN Når ioner vandrer gennem en membran, vil de samtidig bære en elektrisk strøm gennem membranen. Der er en simpel relation mellem fluxen J j af en ion af typen j og den elektriske strømtæthed I j (dvs. strøm per arealenhed), som svarer til fluxen: En ion med ladningstallet z j bærer ladningen z j F coulomb mol 1. Er fluxen J j gennem membranen angivet i mol m 2 s 1, vil der hertil svare en strømtæthed i ampere m 2, som er I z FJ Am 2 j = j j ( ) (2.35) Bevægelsesretningen for de positive ladninger regnes ifølge konventionen som den positive strømretning. For kationer, som bærer positive ladninger, er retningen af fluxen J j og den dertil hørende strømtæthed I j derfor den samme. Anioner vil derimod bære negative ladninger i anionfluxens retning. Hertil svarer der en elektrisk strøm, som løber i den modsatte retning. Flux og strømtæthed er derfor modsat rettede for anioners vedkommende. Disse forhold afspejles korrekt gennem lign. (2.35), såfremt ladningstallet z j anføres med fortegn, idet I+ = z+ FJ+ og I = z FJ (2.36) Ved beskrivelsen af iontransport gennem membraner anvendes hyppigt elektriske målestørrelser, dvs. elektrisk strømtæthed i stedet for ionflux og membranmodstand, respektive membrankonduktans, som udtryk for ionens permeabilitet. Elektriske målemetoder er meget følsomme og præcise, og deres evne til at følge et hurtigt tidsforløb overstiger alle andre metoder til bestemmelse af iontransport. Det er således muligt at følge begivenheder i membranen, som afspilles i løbet af mikrosekunder (10 6 s). Elektriske målemetoder har derfor i særlig grad været værdifulde ved karakteriseringen af excitable membraners egenskaber Måling af strøm-spændingskarakteristikken Fig. 2.3 illustrerer principperne i en forsøgsopstilling, der kan anvendes til at måle sammenhørende værdier af membranpotential og membranstrøm over en kunstig membran. Kammerets to halvdele (1) og (2), der indeholder en elektrolyt med koncentrationer C (1) og C (2), er opdelt af membranen M. Spændingsforskellen over denne, V = Ψ (1) Ψ (2), måles af voltmeteret ved hjælp af elektrodeparret E(1) og E(2), der er anbragt så tæt som muligt mod membranen. Den ydre kontrol af spændingsforskellen over membranen sker ved hjælp af de to pladeelektroder E'(1) og E'(2), som er forbundet til en spændingsgenerator, Ge, der kan frembringe en elektromotorisk kraft, hvis størrelse og polaritet kan ændres af undersøgeren. Ved hjælp af afbryderen S kan spændingsgeneratoren til- eller afkobles kammeret. Strømmen I, som løber i det ydre kredsløb - og dermed også gennem membranen - måles med amperemeteret A. I det følgende antages membranen at være selektivt permeabel for kationer, og lad fx opløsningerne i de to kamre være NaCl.

66 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-14 Fig Skitse over måleopstilling til bestemmelse af sammenhørende værdier af membranpotential og membranstrøm. Hvorledes bæres strømmen rundt i hele det elektriske kredsløb? Vi undersøger sammenhængen mellem I og V over den ionselektive membran. Membranstrømmen (I Na ) bæres naturligvis af natriumioner, som hver bærer en positiv elementarladning. I de ledninger, som forbinder spændingsgeneratoren (Ge) med de strømgivende elektroder E'(1) og E'(2), bæres den elektriske strøm af elektroner. Ved elektroderne foregår processer, hvorved elektroner udveksles mellem strømelektroder og ioner. Reduktion/oxydation af H 2 O, H 3 O + og OH sker lettere end reduktion/oxydation af Na + og Cl. Ved katoden (som er forbundet med spændingsgeneratorens negative pol) dannes derfor hydrogen (2H 3 O + + 2e! 2H 2 O + H 2 ), der bobler op fra elektroden. Ved anoden dannes frit oxygen (2OH! H 2 O + ½O 2 + 2e ), som bobler op fra denne elektrode (det fremgår af de to reaktionsligninger, at ph ændrer sig ved strømgennemgangen, idet ph stiger i katodekammeret og falder i anodekammeret). Nettoresultatet af de beskrevne elektrodeprocesser er, at 2 elektroner er blevet overført fra katoden til anoden. Elektroneutraliteten i de to saltopløsninger opretholdes ved, at natriumioner vandrer gennem den kationselektive membran fra anodekammeret til katodekammeret. Fig Eksempler på strøm-spændingskarakteristikker for en ionselektiv membran ved (A) ens saltkoncentrationer i de to kamre og (B) forskellige koncentrationer, C < ( 1 ) (2) C NaCl NaCl Membranstrøm og membrankonduktans Såfremt de to kammerhalvdele indeholder samme elektrolytopløsning (fx NaCl) i samme koncentrationer (fx 150 mm, fysiologisk saltvand), vil der ikke herske nogen spændingsforskel over

67 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-15 membranen, så længe spændingsgeneratoren er frakoblet. Der vil naturligvis heller ikke løbe nogen strøm gennem membranen. Spændingsgeneratoren tilsluttes derefter, og der måles en række sammenhørende værdier af strømtæthed I og potentialforskel V m over membranen. Et eksempel på en sådan måling er angivet ved kurve A i Fig I dette diagram regnes strømmen for positiv, når den løber i retningen fra kammer (1) til kammer (2). Det fremgår af figuren, at der er en direkte proportionalitet mellem membranpotentialet V og strømtætheden I Na, som kan skrives som I = G V (2.37) + + Na Na hvilket svarer til Ohms lov (sml. lign. (2.13)). KonstantenG Na + har dimensionen ohm 1 m 2 = siemens m 2 og angiver således en konduktans per enhed membranareal. G Na +, som kaldes for membranens natriumkonduktans, angiver i dette tilfælde strømmen, der løber gennem én arealenhed af membranen, når spændingsforskellen over membranen er 1 volt. Da membranen kun er permeabel for kationer og de omgivende opløsninger kun indeholder NaCl, bæres strømmen gennem membranen kun af natriumionen. Størrelsen af denne strøm og dermed af konduktansen G Na + afhænger af følgende to forhold: (i) Den hastighed, ν Na +, hvormed det herskende elektriske felt i membranen driver den enkelte ion gennem membranen. Denne hastighed afhænger af ionens elektriske bevægelighed u Na (dvs. den hastighed, som ionen tildeles af feltet 1 volt m 1 ), som igen er proportional med ionens mekaniske bevægelighed B Na +. (ii) Koncentrationen C Na + af natriumioner i membranen. Jo større koncentrationen er, desto større er antallet af ladningsbærere og desto større bliver strømmen per arealenhed for en given vandringshastighed, ν Na +, for den enkelte ion. Natriumionens konduktans kan i det foreliggende tilfælde udtrykkes analogt til lign. (2.22) G z Fu C h + Na + = (2.38) + + Na Na Na hvor h nu er tykkelsen af den selektivt permeable membran. I det foreliggende tilfælde, hvor membranen er omgivet af identiske opløsninger med samme koncentration, vil koncentrationen af natrium i membranen, C Na +, ikke ændres ved strømgennemgangen uanset størrelsen af I. Så længe ionbevægeligheden u Na + respektive B Na + ikke ændres med feltstyrken i membranen, vil der findes en direkte proportionalitet mellem I og V, som angivet i figuren kurve A. Vi betragter herefter den situation, hvor NaCl-koncentrationerne i de to kamre er forskellige, fx C (1) = 15 mm og C (2) = 150 mm. Så længe spændingsgeneratoren (Ge) er afkoblet fra kredsløbet, er der ingen ionflux og heller ingen membranstrøm, idet der vil være indtrådt ligevægt i eq systemet, hvor membranpotentialet V er lig med ligevægtspotentialetv Na + for natrium. Dette kan eq beregnes efter Nernst ligning (lign. (2.29)). Ved 25 ºC fås V = V 59,2log = = 59,2 mv. Na 15 Disse sammenhørende værdier, I = 0, når V = V +, afsættes i strøm-spændingsdiagrammet. Vi eq Na har hermed et punkt i strøm-spændingsdiagrammet for membranen i den ny tilstand, hvor den støder op til samme opløsning, men med forskellige koncentrationer. De øvrige måleresultater fås ved at indstille spændingsgeneratoren (Ge) på forskellige værdier, og hver gang aflæse de samhørende værdier af strømtæthed I og membranpotential V. Hvis membranpotentialet er lave-

68 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-16 eq re end +59,2 mv (dvs. V < V Na + ), vil natriumionerne ikke længere være i ligevægt over membranen, da der netop kræves en spændingsforskel på +59,2 mv for at bremse natriumionernes diffusionstilbøjelighed i koncentrationsfaldets retning fra (2) til (1). Er membranpotentialet kun +50 mv, vil der derfor være en flux, J Na +, af natriumioner fra (2) til (1). Hertil svarer der en membranstrømtæthed, hvis numeriske værdi er I + = F J +, men som er negativ ifølge vor vedtagelse for fortegnet for strømretningen i kammeret. Påtrykkes derimod en membranspænding V > Na Na eq V Na +, fx V = 65 mv, er natriumionerne atter ude af ligevægt, fordi den elektriske kraft, der virker på ionerne i membranen, nu er større end den, som kræves for at hindre en nettovandring af natrium ved diffusion i koncentrationsfaldets retning. Natriumionerne vil derfor blive drevet gennem membranen i retningen fra (1) til (2), hvorfor fluxen, J Na +, og strømtætheden, I +, nu begge er positive. For små forskydninger ( V < 10 mv) af membranpotentialet V omkring lige- Na vægtspotentialet vil man finde en retlinet relation mellem I og V (kurvestykket a - b på figurens kurve B). I dette område kan relationen beskrives ved ligningen eq ( ) I = G V V (2.39) Na Na Na hvor G + er membranens natriumkonduktans for V V +. Som illustreret i Fig. 2.4, kurve B, vil Na man hyppigst finde, at I - V-diagrammet afviger fra det retlinede forløb, når membranpotentialet forskydes længere bort fra ligevægtspotentialet. I biologiske membraner kan afvigelsen fra linearitet endda blive meget betydelig, specielt i alle excitable membraner. også i sådanne tilfælde har det vist sig hensigtsmæssigt stadig at beholde det ovenstående formelbillede til beskrivelse af sammenhængen mellem membranpotential og ionstrøm, dvs. eq ( ) j j j eq Na I = G V V (2.40) men ionkonduktansen i membranen, G j, for ionen af typen j er nu ikke mere konstant, men varierer med membranpotentialet. Den nøjere funktionelle sammenhæng G j = G j (V) bestemmes eksperimentelt ved at måle sammenhørende værdier af I og V og benytte lign. (2.40) som definitionsligningen til bestemmelse af G j ud fra værdierne af I j og V, dvs. I G j j = V V eq j (2.41) hvor ligevægtspotentialetv eq j er den værdi af membranpotentialet V, hvor membranstrømmen I j er nul. Det kan vises, at en stigende respektive faldende koncentrationsprofil af ionen j gennem membranen alene vil medføre, at ionkonduktansen G j varierer med membranpotentialet. I mange biologiske membraner, specielt de excitable membraner, vil man finde, at G j varierer langt stærkere med membranpotentialet, end den simple model angiver. Dette indebærer, at ionens bevægelighed i membranen, respektive dens permeabilitet, er afhængig af størrelsen af det elektriske felt, som hersker i membranen. Opklaringen af den molekylære mekanisme bag denne proces er stadig en af de store udfordringer inden for membranbiofysikken Det ækvivalente kredsløb Fig. 2.5 anskueliggør ionstrømmens afhængighed af spændingsforskellen over membranen ved en elektriske model, som også kaldes for det elektriske ækvivalentdiagram svarende til lign. (2.40). Det består af en modstand R j = 1/G j, som er anbragt i serie med en elektromotorisk kraft,

69 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-17 der er lig med ligevægtspotentialet for den pågældende ion, både hvad angår størrelse og fortegn. Spændingsforskellen mellem klemmerne (1) og (2) er lig med membranspændingen V. Et sådant ækvivalentdiagram kan være til nytte ved behandlingen af den mere komplekse situation, hvor flere ioner samtidig vandrer gennem membranen. Fig Det ækvivalente kredsløb for den ionselektive membran. Det bør bemærkes, at måleopstillingen, som er vist i Fig. 2.3, kun tillader bestemmelse af den enkelte ionkonduktans, såfremt man har sikret sig, at det kun er én enkel iontype, som kan passere membranen. Hvis det ikke er tilfældet, og membranstrømmen bæres af flere forskellige iontyper (både kat- og anioner), kan man stadig optegne en strøm-spændingskarakteristik for membranen. Relationen mellem membranstrøm og membranspænding kan skrives på formen I = G( V V m ) men her er I summen af de enkelte ionstrømme, dvs. den totale ionstrøm, og G er den totale membrankonduktans. Endvidere er V m ikke mere et ligevægtspotential, men et mere eller mindre komplekst diffusionspotential, der, som beskrevet i afsnit 2.6, etablerer sig, når systemet er overladt til sig selv, dvs. membranpotentialet svarende til, at membranstrømmen er nul Membrankonduktans og membranpermeabilitet Vi har nu mødt to parametre, ionkonduktans og ionpermeabilitet, der anvendes til beskrivelse af en ions gennemtrængelighed i en membran. Hvad er sammenhængen mellem disse to størrelser? Ud over udsagnet, at konduktansen er proportional med permeabiliteten, kan der ikke gives noget enkelt svar på dette spørgsmål. I kap. 1 defineredes permeabiliteten ved P j αd h αktb h j j = = (1.35) Det fremgår heraf, at permeabiliteten er proportional med ionens diffusionskoefficient D j, respektive dens mekaniske bevægelighed B j, dvs. med størrelser, der angiver, hvor langt den enkelte ion bevæges per tidsenhed af den drivende kraft X j på ionen. Ionens elektriske bevægelighed u j er defineret ved u = z q B (2.8) j j e j som indsat i lign. (1.35) giver P = αkt u = αrt u zqh zfh (2.42) j j j j e j

70 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-18 der viser, at permeabiliteten er proportional med ionens elektriske mobilitet u j. Konduktansen G j er derimod proportional med produktet af bevægeligheden u j og koncentrationen C j i membranen. G j må derfor også være proportional med produktet af permeabiliteten P j og koncentrationen af ionen i membranen. Den eksplicitte relation mellem P j og G j er kun relativ enkel i den simple situation, hvor der er ens koncentrationer af samme salt på begge sider af membranen. Ionkoncentrationen C j i membranen er da konstant, og konduktansen er lig med G j zfuc h j j j = (2.22) Elimineres heri u j ved hjælp af lign. (2.42), fås zfc j j zf j Gj = Pj = CP (2.43) j αrt RT idet C j = αc (sml. kap. 1, lign. (1.32)). Er saltkoncentrationen forskellig i de to faser, bliver relationen mellem G j og P j betydelig mere kompliceret. Findes der også en potentialforskel over membranen, øges tilmed kompleksiteten, da feltet i membranen kan påvirke formen af ionens koncentrationsprofil i membranen. Dette forhold alene vil medføre, at konduktansen afhænger af størrelsen og fortegnet af potentialforskellen over membranen. Men som nævnt tidligere, vil man tilmed i mange biologiske membraner finde, at ionbevægeligheden u j og dermed også permeabiliteten P j varierer med membranpotentialet, hvorved membrankonduktansen kan komme til at variere ganske betydeligt med membranpotentialet DONNANPOTENTIALET Indtil nu har vi betragtet to typer af membraner: 1) Den ideelt selektivt permeable membran, der kun er gennemtrængelig for enten positivt eller negativt ladede ioner, og 2) den ideelt semipermeable membran, der kun er permeabel for opløsningsmidlet og totalt impermeabel for samtlige opløste stoffer. En tredje gruppe membranfænomener opstår, når membranen er permeabel både for vand og for lavmolekylære stoffer og ioner. Denne membran kaldes semipermeabel, fordi den er gennemtrængelig for vand og for nogle af de opløste stoffer. Til denne gruppe hører bl.a. biologiske membraner, der omgiver de enkelte celler. Transport af ioner og uladede stoffer gennem de biologiske membraner vil blive behandlet senere. I dette afsnit behandles en speciel type af ligevægt over den semipermeable membran, der er permeabel både for vand og lavmolekylære anioner og kationer, og når der i en af de omgivende faser er et så stort ioniseret makromolekyle, at det ikke kan trænge gennem membranen. Den indiffusible ioniserede komponents tilstedeværelse vil påvirke de diffusible ioner således, at man ved opnået ligevægt har: 1) en uens fordeling af de diffusible ioner mellem de to faser, 2) en elektrisk spændingsforskel (donnanpotentialet) over membranen, og 3) en osmotisk trykforskel mellem faserne, som er bestemt både af polyelektrolyttens koncentration og af fordelingsforholdet mellem de diffusible ioner i de to faser. Denne type af membranligevægt er oprindelig beskrevet af den amerikanske fysiker Willard Gibbs (1875) og senere studeret indgående såvel teoretisk som eksperimentelt af den engelske fysisk-kemiker F.G. Donnan. Den betegnes derfor hyppigt som Gibbs-Donnan ligevægten.

71 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side KVALITATIV BESKRIVELSE AF DONNANPOTENTIALETS FREMKOMST Til beskrivelsen af mekanismen, som fører til denne membranligevægt, betragter vi den simplest tænkelige situation, som er angivet i Fig. 2.6, hvor de to faser (1) og (2) er adskilt af den semipermeable membran. I udgangstilstanden (A) indeholder fase (1) en opløsning af makromolekyler NaP med koncentrationen C, som tænkes at være fuldstændigt dissocieret i Na + og P. Membranen antages at være gennemtrængelig for vand og lavmolekylære ioner, men ikke for makroionen P. Til fase (2) sættes nu en NaCl-opløsning med samme koncentration C. Det antages endvidere, at volumen af fase (2) er langt større end volumen af fase (1) således, at den efterfølgende udveksling af vand, Na + og Cl -ioner mellem de to faser ikke får nogen målelig indflydelse på koncentrationen af NaCl i fase (2). Fig Udgangssituation ved udviklingen af en Donnan-ligevægt mellem to faser, som er adskilt af en membran, der er impermeabel for makroionen P. Initialt indeholder fase (1) en opløsning af NaP (Na + og P ) i koncentrationen C, mens der i fase (2) findes NaCl med samme koncentration C. Fase (1) kan ved hjælp af stemplet St påtrykkes et tryk P til at forhindre, at der samtidig sker vandbevægelse fra fase (2) ind i fase (1). Initialt vil der ikke være ligevægt mellem de to faser, fordi koncentrationen af Cl i fase (1) er nul og C i fase (2). Denne koncentrationsforskel bevirker, at Cl -ionerne vil bevæge sig ved diffusion ind i fase (1) således, at der her nu vil findes en ringe mængde af ukompenserede negativt ladede Cl -ioner, som vil tildele fase (1) et lavere elektrisk potential end fase (2). Den herved fremkomne potentialforskel mellem de to faser vil som beskrevet tendere til at bremse yderligere indstrømning af Cl -ioner (se afsnit 2.4.1). Membranen er også permeabel for Na + -ioner, og da fase (2) har et højere potential end fase (1), hersker der ikke længere ligevægt i systemet for Na + - ionernes vedkommende, selvom de har samme koncentration i de to faser. Na + -ionerne vil derfor bevæge sig under indflydelse af de elektriske kræfter fra fase (2) til fase (1) og herved tendere til at udslukke den elektriske ubalance mellem de to faser. Resultatet heraf, at flere Cl -ioner vil kunne diffundere ind i fase (1) fra fase (2), og dette vil igen bevirke en yderligere indvandring også af Na + -ioner i fase (1). De to ioner vil hurtigt indstille deres vandringshastigheder i membranen, således at både Na + og Cl bevæger sig i ækvivalente mængder fra fase (2) til fase (1), indtil der er opnået ligevægt. Når dette er sket, vil fase (1), som indeholder den ikke-permeerende anion P, have en vis Cl - koncentration, C, og en Na + -koncentration, C+ C, som er højere end Na + -koncentrationen i fase (2). Ved ligevægt gælder det for hver ion, der kan permeere membranen, at dens koncentrationsforskel over membranen og det herskende membranpotential, som er V = Ψ Ψ eq ( 1 ) (2) D har indstillet sig i et ganske bestemt forhold til hinanden således, at ionens tendens til at passere membranen i én retning på grund af koncentrationsforskellen mellem de to faser netop opvejes af den elektriske potentialforskel mellem faserne, som søger at drive ionen i den modsatte retning. Membranpotentialet, der fremkommer under denne specielle form for membranligevægt, der skyldes tilstedeværelsen af den ikke-permeerende makroion P, betegnes som Donnan-

72 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-20 eq potentialet. Sammenhængen mellem størrelsen af Donnan-potentialet, V D, og de permeerende ioners koncentrationer i faserne (1) og (2) må være givet ved Nernst ligning (lign. (2.29)). I det foreliggende tilfælde, hvor z Na = +1 og z Cl = 1, har man derfor C C V = = ln = ln (2.44) (2) (1 ) eq ( 1 ) (2) RT + Na RT Cl D Ψ Ψ ( 1 ) (2) F C F + C Na Cl Ved indtrådt ligevægt er ionfordelingen af de permeerende ioner således bestemt ved C C C = = r (2.45) (2) (1 ) + Na Cl ( 1 ) (2) + C Na Cl hvor r D betegnes som Donnan-forholdet. Ved ligevægt har Na + og Cl fordelt sig således mellem de to faser, at forholdet mellem Na + -koncentrationerne i de to faser, er det omvendte af forholdet mellem Cl -koncentrationerne i de to faser KVANTITATIV BEHANDLING AF DONNANSYSTEMET Den "skæve" ligevægtsfordeling af de permeerende ioner fremkommer som omtalt, fordi den ene fase indeholder ikke-permeerende ioner. Sammenhængen mellem koncentrationen af den ikke-permeerende ion og fordelingsforholdet for de permeerende ioner skal nu beregnes. Vi antager, at den ikkepermeerende ion er en polyelektrolyt, der dissocierer efter skemaet D Na z P! z Na + + P z ( 1 ) Na ( 1 ) Cl (2) Na (2) CCl ( 1 ) og at dissociationen er fuldstændig. Lad den molære koncentration af polyelektrolytten være C z P og ligevægtskoncentrationerne for Na + og Cl være henholdsvis C +, C, C + og. Ligevægtskoncentrationerne kan nu beregnes, idet man tager hensyn til, at der i hver fase må herske elektroneutralitet. Herved ses der bort fra den forsvindende mængde af elektrisk ukompenserede ladninger, som etablerer potentialforskellen V D mellem faserne. For fase (1) er elektroneutralitetsbetingelsen C C zc = 0 (2.46) ( 1 ) (1 ) (1 ) + Na Cl z P hvor z angiver antallet af negative ladninger, som makroionen bærer, dvs. z er et positivt tal. For fase (2) gælder C = C = C (2.47) (2) (2) (2) + Na Cl Ligevægtsbetingelsen lign. (2.45) kan derfor skrives som ( 1 ) (1 ) (2) C + C = C Na Cl Cl 2 som sammenholdt med lign. (2.46) giver ( 1 ) 2 (1 ) (1 ) (2) 2 + Na z P + Na C zc C C = 0 hvoraf ( 1 ) C Na + kan bestemmes som

73 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-21 ( 1 ) 2 zc z ( 1 ) (1 ) P (2) + z Na P C = ½zC + + C = (2.48) Sammenholdes dette udtryk med lign. (2.46) fås endvidere ( 1 ) 2 zc z ( 1 ) (1 ) P (2) z Cl P C = ½zC + + C = (2.49) ( 1 ) ( 1 ) C + C Na Cl ( 1 ) hvoraf fordelingsforholdene og kan bestemmes som funktion af C (2) (2) z P. Vi skal nu betragte to C C ekstreme situationer: ( 1 ) (i) Lav polyelektrolytkoncentration i forhold til den ydre elektrolytkoncentration. Hvis C z P er meget mindre end C (2), bliver indholdet i den skarpe parentes i lign. (2.48) og lign. (2.49) med tilnærmelse lig med [C (2) ] 2. Man har derfor med tilnærmelse C = C + ½zC (2.50) ( 1 ) (2) (1 ) + Na z P og C = C ½zC (2.51) ( 1 ) (2) (1 ) Cl z P Under disse betingelser er halvdelen af ladningerne på de ikke-permeerende anioner kompenseret ved et overskud af modioner (Na + ), og den anden halvdel af ladningerne er kompenseret ved et underskud af ioner - i dette tilfælde Cl - med samme fortegn (co-ioner) som polyelektrolytens anioner. Den osmotiske trykforskel Π = P P ( 1 ) (2) som hersker ved ligevægt mellem fase (1) og fase (2), skal nu bestemmes. Benyttes van't Hoffs udtryk (lign. (1.57)) som første tilnærmelse, har man Π = RT C hvor C er forskellen mellem den molære koncentration af de opløste komponenter i henholdsvis fase (1) og fase (2). Man har da ( 1 ) (1 ) (1 ) (2) C = C + + C + C z 2C Na Cl P som sammenholdt med lign. (2.50) og lign. (2.51) giver ( 1 ) C = C P z. Heraf fås Π ( 1 ) = z (2.52) RT C P ( 1 ) (2) Den osmotiske trykforskel mellem fase (1) og fase (2) er derfor i dette tilfælde C z " C udelukkende P bestemt ved polyelektrolytkoncentrationen. Π betegnes derfor også som det kolloidosmotiske tryk. (ii) Høj polyelektrolytkoncentration i forhold til fase (2)'s koncentration. Det er bekvemt først at omforme lign. (2.48) til

74 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-22 (2) ( 1 ) (1 ) (1 ) C C + = ½zC z + ½zC z 1 Na P P + ( 1 ) zc z P 2 (2.53) Da C ( 1 ) (2) z P # C kan vi benytte den algebraiske tilnærmelse 1+ a = 1+ ½a, når a " 1. Det ovenstående udtryk bliver derfor (2) 2 C ( 1 ) (1 ) (1 ) + = z + ( 1 ) z Na P P zc z P C zc zc Indsættes dette i lign. (2.46), fås ( 1 ) z P 2 (2) C ( 1 ) C = 0 (2.54) Cl zc ( 1 ) (2) I dette tilfælde ( C z # C ) kompenseres polyelektrolyttens anioner nu næsten fuldstændigt af modionerne (Na + ), og membranen opfører sig, som var den impermeabel for co-ionerne (Cl ). Det osmotiske P tryk er [ ] (2.55) ( 1 ) (1 ) (2) (1 ) Π = RT C + + C z 2C = RT z + 1 C z Na P P hvor ikke blot den indiffusible ion, men også modionen bidrager til det osmotiske tryk DIFFUSIONSPOTENTIAL Når spændingsforskellen over en membran kan karakteriseres som et ligevægtspotential, gælder det for enhver ion, som kan passere membranen, at nettofluxen gennem membranen er nul for hver enkelt iontype taget for sig. Vi skal nu betragte en mere hyppigt forekommende type af membranpotentialer, diffusionspotentialet, hvor den tilgrundliggende ladningsseparering fremkommer ved en diffusionsproces, der involverer både kat- og anioner. Selv om ionerne har forskellige værdier for deres bevægeligheder, vil det elektriske felt, som etableres, tvinge de forskellige iontyper til at bevæge sig i ækvivalente mængder i koncentrationsfaldets retning således, at nettostrømmen, som bæres af de diffunderende ioner, er nul. Der hersker således ikke en ionligevægt over det område, hvor der findes et diffusionspotential. I det følgende redegøres der for mekanismen ved fremkomsten af et diffusionspotential KVALITATIV BESKRIVELSE AF DIFFUSIONSPOTENTIALET Som indledning skal vi udgå fra en allerede kendt ligevægtssituation, der involverer både kat- og anioner Nedbrydning af Donnan-regimet I Donnan-systemet, skitseret i Fig. 2.6 opretholdes ligevægtstilstanden på grund af de impermeable makroioners tilstedeværelse i fase (1). Hvis membranen pludselig bliver permeabel også for makroionen, vil denne vandre over i fase (2), drevet såvel af det elektriske felt som af koncentrationsfaldet i retningen fra (1) til (2), dvs. ved elektrodiffusion. Det elektriske dobbeltlag af overskydende negative og positive ioner i overgangszonen vil hermed reduceres og i takt hermed vil også det elektriske felt aftage. Ligevægtskoncentrationerne for de små ioner vil heller ikke mere kunne opretholdes. Systemet vil hermed bevæge sig hen mod en ny ligevægtstilstand med

75 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-23 en ensartet fordeling i begge faser for samtlige ioner og en udslukt potentialforskel mellem faserne. Men før denne tilstand er indtrådt, vil der, afhængig af det indbyrdes størrelsesforhold af ionmobiliteterne, kunne opretholdes en forbigående potentialforskel mellem faserne, som aftager i takt med koncentrationsudligningen. Denne potentialforskel, som hersker i et ikkeligevægtssystem, og som skyldes diffusion af ioner med forskelle mellem de enkelte iontypers mobiliteter, kaldes et diffusionspotential Diffusionspotentialet for en binær elektrolyt Mekanismen ved et sådant diffusionsregime fremgår ved at betragte en situation, der er illustreret i Fig Membranen adskiller fase (1) med en binær elektrolyt, NaCl, fra fase (2), som kun indeholder vand. Membranen er permeabel for både Na + og Cl, som begge vil diffundere ind i fase (2) som følge af koncentrationsgradienten. Na + -ionen har en mindre bevægelighed end Cl - ionen og diffunderer langsommere end Cl -ionen. Efter kort tid overlapper de to koncentrationsprofiler ikke helt, idet koncentrationen af Cl -ionerne er en smule højere end Na + - ionerne i fase (2) som følge af Cl -ionernes hurtigere uddiffusion fra fase (1). Koncentrationen af Cl -ionerne er tilsvarende lavere end Na + ionerne i fase (1). Den manglende overlapning af de to koncentrationsprofiler medfører, at der opbygges en zone med overskydende positive ladninger i fase (1) og en zone med et tilsvarende overskud af negative ladninger i fase (2). Fig. 2.7a. Til illustration af diffusionspotentialets opståen. Initialt vil fluxen af Na + være mindre end fluxen af Cl, da B + < B. Na Cl Fig. 2.7b. Til illustration af diffusionspotentialets opståen. Et potential er etableret som følge af ladningsseparationen og bevirker, at forholdet mellem fluxen af Na + og Cl bliver 1. Denne fordeling skaber et elektrisk felt, som er rettet fra fase (1) mod fase (2) og en elektrisk potentialprofil gennem overgangszonen, hvor fase (2) med den laveste koncentration af NaCl vil blive negativt ladet op i forhold til fase (1), fordi Cl bevæger sig hurtigst ved diffusion. Det elektriske felt i overgangszonen medfører, at hastigheden for Na + -ioners vandring i retningen (1)

76 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-24 (2) øges noget, mens Cl -ioners vandringshastighed mindskes tilsvarende. Slutresultatet bliver derfor, at Na + - og Cl -ioner diffunderer fra fase (1) til fase (2) med samme flux samtidig med, at der hersker en potentialforskel, et diffusionspotential, mellem de to faser, hvis polaritet i dette tilfælde er givet ved Ψ > Ψ, når B > B+ og C > C ( 1 ) (2) (1 ) (2) I det foreliggende tilfælde vil totalkoncentrationen af NaCl i fase (1) aftage, mens den vil tiltage i fase (2). Den aftagende koncentrationsgradient i overgangszonen af NaCl medfører, at de fri rumladninger gradvis aftager og i takt hermed vil diffusionspotentialet mellem de to faser aftage og til sidst være helt udslukt, når koncentrationen er blevet den samme overalt i det tilgængelige rum Saltbro til elimination af diffusionspotentialet Det fremgår af det foregående, at jo større anionbevægeligheden B er i forhold til bevægeligheden for kationen, B +, jo større bliver det diffusionspotential, som ved en given koncentrationsforskel, C (1) - C (2), etableres mellem faserne. Har begge ioner derimod samme bevægelighed, vil diffusionsfluxen være ens for begge ioner. Der vil derfor ikke ske nogen rumlig adskillelse af positive eller negative ioner og elektroneutraliteten bevares gennem hele systemet. I dette tilfælde har man derfor Ψ = Ψ, når B = B+ og uanset om C > C eller C < C ( 1 ) (2) (1 ) (2) (1 ) (2) K + - og Cl -ioner har næsten lige store bevægeligheder. Den ovenstående betingelse ville derfor have været opfyldt med stor tilnærmelse, såfremt fase (1) havde været fyldt med en KCl opløsning i stedet for NaCl. Det samme vil også gælde, selv om fase (2) initialt indeholder en anden elektrolytopløsning, fx LiCl, med forskellige kat- og anionbevægeligheder. Forudsætningen herfor er dog, at C er meget mindre end C. Ved diffusionen af KCl i retningen (1) (2) (2) LiCl ( 1 ) KCl og af LiCl i retningen (2) (1) vil begge sæt af ionfluxe søge at etablere hvert sit diffusionspotential. Konkurrencen mellem disse to bliver et resulterende diffusionspotential, hvis størrelse er domineret af diffusionspotentialet for den elektrolyttype, som diffunderer under indflydelse af ( 1 ) (2) den største koncentrationsgradient, dvs. KCl i det foreliggende tilfælde, hvor CKCl # CLiCl. Diffusionspotentialet over de to fasers overgangszone bliver herved domineret af diffusionspotentialet for KCl. Dette vil imidlertid beløbe sig til maksimalt 1 2 mv på grund af de næsten identiske værdier af ionbevægelighederne for K + og Cl. Denne særlige egenskab ved KClopløsningen kan med held udnyttes alle steder, hvor man ønsker at etablere en elektrisk kontakt mellem to elektrolytopløsninger med forskellig sammensætning, uden at der derved samtidig opstår en uønsket spændingsforskel mellem de to opløsninger som følge af elektrolytternes indbyrdes diffusion. Har man fx to opløsninger bestående af 0,1 M HCl og 0,1 M NaCl vil der etableres et diffusionspotential mellem dem af størrelsen 31 mv, dersom opløsningerne bringes i direkte kontakt med hinanden. Forbindes de to opløsninger i stedet ved et rør, en saltbro der indeholder en mættet opløsning af KCl (4,2 M), så vil der nu findes et lille diffusionspotential mellem HCl-opløsningen og den stærke KCl-opløsning (måske 4 mv) og et endnu mindre mellem NaCl- og KCl-opløsningen (måske 11,5 mv). Resultatet er, at diffusionspotentialet, der ville være fremkommet ved den direkte kontakt mellem de to elektrolyttyper, nu er blevet reduceret mindst med en faktor 10 på grund af etableringen af kontakten ved hjælp af saltbroen KVANTITATIV BESKRIVELSE AF DIFFUSIONSPOTENTIALET En beregning af diffusionspotentialets størrelse under helt alment givne diffusionsbetingelser for en vilkårlig elektrolyt (elektrolytten indeholder mere end én type af kat- og anioner, som har mere end én va-

77 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-25 lens) byder på næsten uoverkommelige matematiske vanskeligheder. Derimod er det en forholdsvis enkelt sag at beregne diffusionspotentialet under helt simple diffusionsregimer, hvis der også indføres visse fysiske simplifikationer som fx tilstedeværelse af elektroneutralitet. Der skal i det følgende gives nogle eksempler på sådanne diffusionsregimer, der også har relevans inden for biologien Beregning af diffusionspotentialet for en binær monovalent elektrolyt Vi betragter en situation svarende til Fig. 2.1, men hvor membranen nu er gennemtrængelig både for katog anioner. De to omgivende faser indeholder samme binære elektrolyt, fx LiCl eller NaCl, med koncentrationerne C (1) og C (2). Lad D +, D = Diffusionskoefficienter i membranen for kat- og anionen B +, B = Ionbevægelighederne i membranen for kat- og anion C +, C = Koncentrationer i membranen af kat- og anion J +, J = Flux af kation og anion gennem membranen ψ(x) = Elektrisk potential i membranen i positionen x ψ (1), ψ (2) = Elektrisk potential i faserne (1) og (2) V dif = ψ (1) ψ (2) = diffusionspotentialet. I dette tilfælde kan diffusionspotentialet beregnes ved følgende formel (2) diff ( 1 ) (2) RT B+ B V = Ψ Ψ = ln C ( 1 ) F B + B C (2.56) + hvis udledning er angivet nedenfor. Udledning af lign. (2.56). Fluxen gennem membranen er ifølge afsnit 2.3.2, lign. (2.25) dc+ J kt B q d e B C Ψ + = + (2.25a) + + dx dx for kationen, idet z + = 1, og tilsvarende er fluxen for anionen dc J ktb q d e B C Ψ = + (2.25b) dx dx d idet z = 1. Når diffusionen er blevet stationær, er der blevet etableret et felt E = Ψ i membranen dx af netop den størrelse, hvor J = J (2.57) + Det antages nu, at der hersker elektroneutralitet overalt i systemet, dvs. Indsættes dette i lign. (2.25) og lign. (2.29), fås fra lign. (2.57) eller hvoraf fås C + (x) = C (x) = C(x) (2.58) dc d dc kt B q B C Ψ = ktb + q B C dψ + + dx e + + dx dx e dx q d dc e C Ψ B B kt B B dx dx [ + ] = [ ] + +

78 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-26 hvilket også kan skrives på formen dψ kt B+ B = 1 dc dx q B + B C dx d e e + kt B B = dc q B + B C Ψ + + Bortset fra faktoren B B + er denne ligning identisk med lign. (2.33) og dens integration følger helt den B+ + B samme linie som i afsnit , dvs. Ψ Ψ (2) (2) C= C kt B+ B d dc Ψ = q B + B C ( 1 ) e + (1 ) C= C eller kt B+ B Ψ Ψ = V = lnc lnc q B + B (2) (1 ) diff (2) (1 ) e + V RT B+ B = Ψ Ψ = ln C F B + B C diff ( 1 ) (2) + (2) ( 1 ) (2.56) hvor man igen udnytter, at N A k = R og N A q e = F. Ved 25 ºC (Tabel 2.1.) kan lign. (2.56) skrives som B B C B B C diff + V = 59,2 log + + (2) ( 1 ) (2.59) Den mekaniske bevægelighed B k er proportional med diffusionskoefficienten D j = k T B j og med den elektriske bevægelighed u j = z j q e B j. Udtrykket kan derfor erstattes med de tilsvarende værdier for Bj Bj Bj + Bj D j og u j. I Tabel 2.2. er nogle ionbevægeligheder angivet ved uendelig fortynding. Tabel 2.2. Udvalgte ionbevægeligheder ved uendelig fortynding. H + K + Na + Li + Cl µ ion 10 8 (m 2 s 1 V 1 ) 36 7,58 5,17 3,99 7,88 Er C C ( 1 ) (2) = 10, skulle man forvente følgende diffusionspotentialer

79 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-27 diff V 36 7,88 HCl = 59,2 1,0 = 37,9 mv ,88 diff V 7,58 7,88 KCl = 59,2 1,0 = 1,1 mv 7,58 + 7,88 diff V 5,17 7,88 NaCl = 59,2 1,0 = 12,3 mv 5,17+ 7,88 diff V 3,99 7,88 LiCl = 59,2 1,0 = 19,4 mv 3,99 + 7,88 som illustrerer nogle af de træk, der er blevet omtalt i det foregående afsnit Diffusionspotentialet for en mosaik-membran (Millman-ligningen) Lign. (2.56) omfatter også som et specialtilfælde den selektivt permeable membran, der jo er karakteriseret ved kun at være permeabel for enten kat- eller anionen (jvf. afsnit 2.4.1). Disse to tilstande kan også karakteriseres ved: B = 0, for kationpermeabel membran B + = 0, for anionpermeabel membran Sættes enten B eller B + lig med nul i lign. (2.56), ses denne at gå over i udtrykket for Nernst ligningen, lign. (2.29), svarende til en af de to situationer. Vi skal nu betragte en membran med en helt speciel opbygning - den såkaldte mosaikmembran - hvis egenskaber er meget relevante for forståelsen af potentialforskellen - membranpotentialet - der findes over de biologiske cellemembraner. En mosaikmembran er opbygget på den særlige måde, at den består af en matrix, der er uigennemtrængelig for ioner af nogen art. I denne matrix er der nu indlejret utallige, tætliggende små cylindre, som alle strækker sig gennem hele membranens tykkelse. Disse cylindre har meget specielle egenskaber, idet de ikke alene er selektivt ionpermeable, men også ionspecifikt permeable, således at hver enkelt cylinder er kun gennemtrængelig for én ganske bestemt ion (fx specifikt K + -permeabel eller specifikt Cl - permeabel). Vi betragter nu en sådan mosaikmembran, der er udstyret med tre cylindertyper (også kaldet ionkanaler), hvor én er specifikt permeabel for Na + -ioner, én for K + -ioner og én for Cl -ioner. De to kamre, der omgiver membranen, fyldes med opløsninger, der indeholder Na +, K + og Cl i et sådant forhold, at koncentrationerne for hver iontype er forskellige i de to kamre. Denne membran vil være gennemtrængelig for alle tre iontyper, og slutresultatet vil derfor være den tilstand, hvor koncentrationerne er ens i de to kamre for hver enkelt iontype. Men før den tilstand er fremkommet, vil der under forløbet af koncentrationsudligningen have eksisteret et diffusionspotential over membranen, og dermed også over alle tre typer af ionkanaler.

80 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-28 Fig Det ækvivalente kredsløb for en mosaikmembran med ionkanaler, der er specifikt permeable for K +, Na + og Cl. Vi skal nu beregne størrelsen af dette diffusionspotential, membranpotentialet, og som vi fremover betegner med V m. Vi betragter først totaliteten af de specifikt permeable Na + -cylindre (Na + -kanaler). Hvis de to andre typer af ionkanaler ikke havde været der, ville membranen have opført sig som selektivt - og ionspecifikt - permeabel membran for Na +. Membranens strømspændingsaf-hængighed ville være beskrevet ved lign. (2.39) og ved et ækvivalent elektrisk kredsløb, som angivet i afsnit , Fig Det samme vil gælde, hvis membranen kun havde været forsynet med enten K + eller Cl -kanaler. Membranen, der er forsynet med alle tre ionkanaltyper, vil derfor have et ækvivalent kredsløb, som er vist i Fig Lad potentialet over membranen være V m. Strømmene, som hver af de tre iontyper bærer, er givet ved hvorg +, K G Na + og eq ( ) I = G V V K K K eq ( ) I = G V V Na Na Na eq ( ) I = G V V Cl Cl Cl GCl er membrankonduktanserne for henholdsvis natrium-, kalium- og kloridionerne. De tre ligevægtspotentialer for ionerne kan beregnes ved hjælp af Nernst's ligning, lign. (2.29), hvis ionernes yderkoncentrationer er kendt, idet V eq + K RT C = ln 1F C (2) + K ( 1 ) + K V eq + Na RT C = ln 1F C (2) + Na ( 1 ) + Na V eq Cl RT C = ln 1F C (2) Cl ( 1 ) Cl

81 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-29 Hvis ionkonduktanserne i membranen er meget mindre, end de ville have været i fri opløsning, vil diffusionsudligningen foregå meget langsomt og membranpotentialet V m vil kun ændre sig langsomt med tiden. Så længe vi kun befinder os inden for et tidsinterval, hvor V m ikke aftager mærkbart, må nettomembranstrømmen være så forsvindende, at man for alle praktiske formål kan sætte den til nul. Betingelsen I + I + I = K Na Cl kombineret med lign. (2.39) medfører derfor, at eq eq eq G + V K m V + G + V K Na m V + G V Na Cl m V + + = 0 Cl som ved løsning med hensyn til V m giver V m G V + G V + G V = G + G + G eq eq eq + K + K + Na + Na Cl Cl + + K Na Cl (2.60) Det fremgår heraf, at membranpotentialet kan beskrives som summen af produkterne af ionernes ligevægtspotentialer og deres membrankonduktans divideret med summen af ionernes konduktanser, dvs. membranens totale ionkonduktans. Er en enkelt ions permeabilitet særlig stor, vil konduktansen også blive tilsvarende stor. Den pågældende ions ligevægtspotential vil derfor komme til afgørende at dominere membranpotentialets størrelse og fortegn. I det ekstreme tilfælde, hvor fx har man med stor tilnærmelse, at G # G G + + K Na Cl G V C V V ln eq ( 2 ) + + K K eq RT + K m = = + = K ( 1 ) G + 1F K C + K Lign. (2.60) opstilledes først af den amerikanske elektroingeniør J. Millman (1940) i en afhandling om elektroniske kredsløb; dog med den forskel atv K + repræsenterede elektromotoriske eq kræfter i form af batterier og G K + konduktansen af sædvanlige Ohm'ske modstande Diffusionspotentialet når feltet i membranen er konstant (Goldman-ligningen) Under visse forhold er det rimeligt at antage, at det elektriske felt d Ψ er konstant igennem membranen, dvs. potentialprofilen gennem membranen er retlinet. Denne antagelse sammenholdt dx med antagelsen om tilstedeværelsen af makroskopisk neutralitet gennem membranen medfører, at det nu igen bliver en relativ simpel sag at integrere Nernst-Planck-ligningerne for hver enkelt ion for sig, Detaljerne ved disse beregninger skal dog ikke vises her. Sættes totalstrømmen gennem membranen igen lig med nul (svarende til meget langsomt aftagende membranpotential), fås følgende udtryk for diffusionspotentialet over membranen

82 Noter til stoftransport. Kapitel 2: Membranpotentialer Side 1-30 V P C + P C + P C (2) (2) (1 ) RT K K Na Na Cl Cl m = ln ( 1 ) (1 ) (2) F P + C + + P + C + + P C K K Na Na Cl Cl (2.61) Tæller og nævner i brøken udgøres af produkter af ionpermeabiliteter P +,P + og P og ionkoncentrationerne på de to sider af membranen. Ligningen er udledt under antagelsen om ionernes K Na Cl diffusion gennem en homogen membran og ikke en mosaik membran. Ligningen blev først udledt af Planck (1890) og senere genopdaget af D.E. Goldman (1943). Den ovenstående form hidrører fra A.L. Hodgkin & B. Katz (1949) og har været meget anvendt i cellebiologisk forskning til vurdering af størrelsen af cellers membranpotential. Den betegnes derfor også som "Goldman-Hodgkin-Katz"-ligningen. Ligningen udtrykker ligesom Millman-ligningen, at membranpotentialet er et diffusionspotential, der vægtes af de enkelte ioners evne til at trænge gennem membranen ved diffusion i koncentrationsfaldets retning. Det ses også, at Goldmanligningen reduceres til Nernst's ligning, såfremt membranens gennemtrængelighed domineres af en enkelt ions permeabilitet, fx hvis P # P P + + K Na Cl og de tre koncentrationer er indbyrdes beskafne således, at går lign. (2.61) over i P C # P C + P C og P C # P C + P C (2) (2) (1 ) (1 ) (1 ) (2) + K + K + Na + Na Cl Cl + K + K + Na + Na Cl Cl P C C V ln ln V (2) (2) RT + + K K RT + K eq m = = = ( 1 ) (1 ) + F F K P + C + C + K K K som er Nernst's ligning.

83 NOTER TIL STOFTRANSPORT KAPITEL 1: MIGRATION OG DIFFUSION 1.1. INDLEDNING FLUX TRANSPORTTYPER MIGRATION GNIDNINGSKOEFFICIENT OG MOBILITET MIGRATIONSFLUX DIFFUSION FÆNOMENOLOGISK BESKRIVELSE DIFFUSIONSFLUX (FICK S LOV) Diffusionskoefficienten Et simpelt eksempel på anvendelse af Fick s lov MOLEKYLÆR BESKRIVELSE AF DIFFUSIONSPROCESSEN Brown ske bevægelser Random walk Random walk og Fick's lov Einstein-Smoluchowski-relationerne Einstein-Stokes-relationen Den drivende kraft ved diffusionsprocessen DIFFUSION OG MIGRATION FORLØBER SAMTIDIG SMOLUCHOWSKI-LIGNINGEN Med kraftbetragtning som udgangspunkt Med Random walk betragtning som udgangspunkt DIFFUSION GENNEM MEMBRANER PERMEABILITETSKOEFFICIENTEN UDVEKSLINGSKINETIK Koncentration i fase (2), C (2), holdes konstant på nul Koncentrationen i fase (2), C (2), er endelig og konstant, koncentrationen i fase (1), C (1), er initialt nul UNIDIREKTIONELLE FLUXER KONVEKTIV OG OSMOTISK VANDBEVÆGELSE GENNEM MEMBRANER KONVEKTIV VANDBEVÆGELSE OSMOTISK VANDBEVÆGELSE Osmotisk tryk Kolligative egenskaber Mekanismen bag den osmotiske vandbevægelse Størrelsen af det osmotiske tryk (vant' Hoff's ligning) Osmotisk koefficient FRYSEPUNKTSDEPRESSIONEN Frysepunktsdepression og osmotisk tryk Osmolaritet Reflektionskoefficienten...35 Medicinsk Fysiologisk Institut Københavns Universitet 2001

84 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-1 The relation of size to the time required for diffusion is one of the most fundamental of all considerations in the 'design' of animals and plants. On a humbler level, it is also of primary importance in planning physiological experiments, or interpreting physiological results. (A.V. Hill, 1965) 1.1. INDLEDNING Membranstrukturer er til stede overalt i biologiske systemer. De tjener til at adskille cellens indre fra dens omverden, og de indgår også i mange vigtige intracellulære strukturer som fx mitokondrier. Gennem cellens overflademembran passerer stof og energi til og fra cellen. Der er et meget stort spektrum af hastigheder, hvormed de forskellige stoffer passerer membranen. For nogle stoffer er membranen relativ let at passere, for andre stoffer er den næsten eller helt uigennemtrængelig. Endvidere varierer membranens gennemtrængelighed fra den ene celletype til den anden. Gennem de sidste 30 år er der samlet et væld af iagttagelser, som viser, at levende membraner ikke altid fungerer som en passiv barriere for stoftransport mellem cellen og dens omgivelser. Megen stoftransport betegnes nu som en aktiv transport, dvs. en transportproces, der kræver energi hidrørende fra cellens stofskifteprocesser for at kunne forløbe, og som er i stand til at udnytte denne energi til at drive stoffer gennem membranen mod den retning, som de passivt virkende kræfter søger at bevæge stofferne. Cellemembraner er således dynamiske, komplekse strukturer, som besidder en kemisk reaktivitet med det formål at tilvejebringe en selektiv transport af stoffer i overensstemmelse med cellens og organismens behov. Cellemembranen er derfor ikke en passiv sæk, der omslutter cellens indre, men snarere et organ med regulatorisk kapacitet. En lignende funktion må tilskrives mange af de membranstrukturer, der forekommer i cellens indre. For at kunne tage stilling til om en transportproces må betragtes som aktiv, er det nødvendigt at have en klar forståelse af den fysiske baggrund for de transportprocesser, der betegnes som passive. Herved forstås de processer, hvis umiddelbare forløb ikke er betinget af en samtidig udnyttelse af energi, der hidrører fra stofskifteprocesser i cytoplasmaet eller i cellemembranen FLUX En passiv transportproces af et stof vil forløbe i ethvert system, såfremt stoffets fordeling i systemet (fx mellem den intra- og ekstracellulære fase) ikke svarer til den termodynamiske ligevægtsfordeling for stoffet. Den passive stoftransport afspejler således systemets tendens til at bevæge sig hen imod ligevægtstilstanden. Som bekendt giver termodynamikken et ganske præcist svar på, om der hersker ligevægt i et system, og om i hvilken retning en proces vil forløbe, såfremt der ikke hersker ligevægt i systemet. Derimod giver termodynamikken ingen oplysning om den tid, det vil tage for et system at opnå sin ligevægtstilstand. Fra et praktisk synspunkt er tiden, det tager for at opnå en given ændring, en størrelse, som er af den allerstørste betydning. Det kan være en ringe trøst at vide, at en proces vil løbe i en vis retning, hvis det til gengæld tager 1000 år at opnå ændringen. Af denne grund er det nødvendigt også at råde over en kinetisk beskrivelse. Beskrivelsen af den kinetiske reaktionshastighed ved den kemiske reaktion skal nu udstrækkes til en særlig simpel type af processer, transportprocesser, hvor en fysisk størrelse som masse, energi, bevægelsesmængde eller elektrisk ladning transporteres fra ét område i det betragtede system til et andet. I det følgende vil vi kun behandle massetransport i en opløsning, dvs. transport af atomer, molekyler og submikroskopiske partikler, som kan forekomme i elektrisk neutral eller ioniseret tilstand.

85 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-2 Massetransport kan anskues fra to synspunkter: a) Ved den individuelle betragtningsmåde søger man at redegøre for, hvorledes den enkelte partikel bevæger sig omkring i det tilgængelige rum. b) Man kan også betragte en sværm af partikler som et hele. Ved denne kollektive betragtningsmåde søger man at redegøre for partikelsværmens opførsel ud fra kendskabet til de enkelte partiklers bevægelse. Hvis antallet af partikler i sværmen, der bevæger sig i en given retning, er større end antallet, der bevæger sig i den modsatte retning, vil der fremkomme en nettotransport af partikler i en bestemt retning. Til karakterisering af intensiteten af nettotransporten af en given partikelkomponent i systemet er det bekvemt at indføre transportstrømtætheden eller fluxen, J, af den transporterede komponent. Fluxen er defineret som den mængde af stof, som pr. sekund passerer en arealenhed anbragt vinkelret på transportstrømmens retning. Fluxen har derfor følgende enheder: J mængde m s 2 1 = i i (1.1) hvor mængden er angivet i enheder, som er mest egnet i den givne situation, fx antal partikler, kg, cm 3, mol etc. Fluxen er således analog med den elektriske strømtæthed, der er angivet i ampere m 2 eller coulomb m 2 s 1. I det følgende skal der redegøres for, hvilke faktorer der er bestemmende for størrelsen af fluxen i et system TRANSPORTTYPER Massetransport i et isotermt system fremkommer ved følgende mekanismer: 1) På grund af de irregulære termiske bevægelser (molekylært kaos), som både de opløste partikler og opløsningsmidlets molekyler udfører, vil alle systemets molekyler uophørligt skifte plads og bevæge sig omkring i det tilgængelige rum på helt tilfældig måde. Er koncentrationen ens overalt i systemet, vil de termiske bevægelser ikke give anledning til, at der fremkommer en nettotransport af opløste partikler i nogen retning i systemet. Er de opløste partikler derimod uensartet fordelt gennem systemet, vil der fremkomme en nettotransport af partikler i koncentrationsfaldets retning. Denne transport fremkommer, fordi antallet af partikler, der i et givet tidsrum vandrer ud af et område med en høj koncentration, er større end antallet af partikler, der i samme tidsrum vandrer ind fra naboområdet med den lavere koncentration. En stoftransport, som hidrører fra de opløste partiklers termiske egenbevægelser kombineret med tilstedeværelsen af en koncentrationsgradient for stoffet, kaldes diffusion. 2) Hvis hver opløst partikel er påvirket af en ydre kraft, vil denne bevirke, at alle partiklerne tildeles en ekstra hastighedskomponent i kraftens retning, som overlejrer de termiske bevægelser med det resultat, at hver partikel og dermed også partikelsværmen som helhed bevæger sig med en given hastighed i kraftens retning. I denne situation vil man derfor også få en nettotransport af partikler, selv om partikelkoncentration er ens overalt i systemet. Denne transporttype, som skyldes tilstedeværelsen af et ydre kraftfelt, der virker på hver enkelt partikel, kaldes migration. De kræfter, som kan være af interesse, er tyngdekraften og andre g-kræfter samt elektriske kræfter, hvis partiklerne bærer en elektrisk ladning. Transport ved migration vil foregå, selv om systemet kun indeholder én eneste opløst partikel. I modsætning hertil er der kun mening i at tale om stoftransport ved diffusion, der er et kollektivt fænomen, såfremt antallet af opløste partikler er så stort, at partikelkoncentrationen udgør et kontinuum i tid og rum, dvs. man kan se bort fra indflydelsen af termiske fluktuationer på partikelkoncentrationen. 3) Endelig kan stoftransporten fremkomme, såfremt systemet som et hele ikke befinder sig i hvile, men strømmer i en given retning, fordi der hersker et trykfald gennem systemet. Denne transporttype kaldes for hydrodynamisk strømning eller undertiden konvektion.

86 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side MIGRATION I det følgende skal der gives en nærmere beskrivelse af de tre ovennævnte transporttyper og af de faktorer, der er bestemmende for størrelsen af den frembragte flux. Vi indleder beskrivelsen med at definere nogle nyttige begreber GNIDNINGSKOEFFICIENT OG MOBILITET Vi betragter en partikel med massen m, som er opslæmmet i en væske (Fig. 1.1). Partiklen er påvirket af en ydre kraft X (fx tyngden), der virker i x-aksens positive retning. Lad hastigheden til tiden t være v (m s 1 ). Under sin bevægelse skal partiklen flytte opløsningsmidlets molekyler og bliver derved underkastet en gnidningskraft, respektive friktionskraft, X f, som er modsat rettet den ydre virkende kraft X. Som en første tilnærmelse antages gnidningskraften at være proportional med den øjeblikkelige hastighed v X f = βv (1.2) hvor minustegnet hidrører fra, at friktionskraften X f og hastigheden v er modsat rettede. Fig Til illustration af sammenhængen mellem den ydre virkende kraft X på partiklen med massen m og friktionskraften X f der opstår ved partiklens bevægelse gennem mediet med hastigheden v Konstanten β i lign. (1.2) kaldes partiklens gnidningskoefficient og afhænger af partiklens form og af det omgivende mediums egenskaber. Den resulterende kraft i x-aksens retning, X+X f, er ifølge Newtons lov lig med partiklens masse m gange dens acceleration dv til tiden t. Bevægelsesligningen bliver dt derfor eller ved anvendelse af lign. (1.2) dv m X X dt = + f dv m = X βv (1.3) dt På et vist tidspunkt har partiklen opnået den konstante hastighed, hvor gnidningskraften og den drivende kraft har samme størrelse. Man har da (v = konstant medfører, at dv = 0) dt X = βv (1.4)

87 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-4 hvor den konstante hastighed hidrører fra kraften X. lign. (1.4) kan også skrives som 1 v= X = BX β (1.5) hvor den ny konstant 1 v B = = β X (1.6) kaldes for partiklens mekaniske bevægelighed eller mobilitet. Af lign. (1.5) ses B at være lig med den stationære hastighed, som partiklen tildeles, når den påvirkes af kraften én. I SIenhedssystemet er dimensionen af B derfor B = m s 1 N 1 (meter per sekund per newton) MIGRATIONSFLUX Vi betragter nu en suspension af ens partikler, som er ensartet fordelt i væsken, og som alle bevæger sig med samme stationære hastighed v under indflydelse af den ydre virkende kraft X migr. Fluxen J er knyttet til partikelkoncentrationen, C, og den stationære hastighed, v, ved relation, som nu skal udledes. Vi betragter en flade med arealet A (m 2 eller cm 2 ) anbragt vinkelret på bevægelsesretningen for stoftransporten (se Fig. 1.2). Fig Til illustration af begrebet fluks eller transporttæthed Hvor mange partikler vil passere dette areal per tidsenhed? Hvis alle partiklerne bevæger sig nedad med en stationær middelhastighed, v, vil hver partikel i tiden t have bevæget sig over en afstand v t. Alle partikler, som indeholdes i prismet med volumen Av t, vil derfor i tiden t have passeret det betragtede fladeelement. Hvis antallet af partikler per m 3 er N, indeholder prismet NAv t partikler, som er lig med antallet af partikler M, der passerer enhedsarealet i tiden t M=N A v t Fluxen J er antallet af partikler, som passerer en arealenhed pr. tidsenhed (sml. lign. (1.1)). Man har derfor J = M (A t) 1, eller J = Nv (1.7)

88 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-5 N og v har henholdsvis dimensionerne (partikler) m 3 og m s 1. Produktet N v har derfor dimensionen (partikler) m 3 m s 1 = (partikler) m 2 s 1, hvilket stemmer overens med definitionen givet i lign. (1.1). Fluxen kan også beskrives ved hjælp af den drivende kraft, X migr som virker på hver partikel. Indsættes lign. (1.5) i lign. (1.7), fås J = BNX migr (1.8) dvs. flux = mobilitet koncentration drivende kraft. Lign. (1.8) gælder også, hvis man anvender et andet koncentrationsmål. Divideres ligningen på højre og venstre side med Avogadros tal, N A = 6, molekyler mol 1, får koncentrationen og fluxen enhederne C = mol m 3, og J = mol m 2 s 1. Stofmængden M, som i tiden t sekunder transporteres gennem et tværsnitsareal A (m 2 ), når hver partikel påvirkes med en drivende kraft X migr i bevægelsesretningen, er ifølge lign. (1.1) og lign. (1.8) givet ved JAt = ABCX migrt (1.9) Udtrykket for migrationsfluxen, J = BCX, gælder også, hvis koncentrationen C varierer gennem systemet. Situationen bliver blot lidt mere kompliceret, idet der nu sker en stoftransport ved både migration og diffusion. Før vi behandler denne situation, vil vi imidlertid betragte den rene diffusionsproces DIFFUSION Som allerede anført vil en stoftransport kun foregå som en diffusionsproces, såfremt koncentrationen af det betragtede stof varierer gennem det betragtede system. I dette afsnit skal der nærmere redegøres for denne afhængighed FÆNOMENOLOGISK BESKRIVELSE Som illustration på en diffusionsproces kan man tage et farvet opløseligt krystal, fx kaliumpermanganat, og anbringe det i et glas vand. Man vil observere, at ikke alene går saltet i opløsning, men efterhånden udbreder de farvede molekyler sig i vandfasen for til slut at have fordelt sig ensartet i hele det tilgængelige rum. Når denne tilstand er indtrådt, vil man ikke observere nogen yderligere ændring af fordelingen af de opløste molekyler. Til en yderligere illustration af de karakteristiske træk ved processen betragter vi en diffusionscelle, som er vist i Fig I (A) indeholdes den rene vandfase og opløsningen i hvert sit glaskammer. I (B) er de to kamre forsigtigt skubbet hen over hinanden mellem de to faser. Derefter observeres det, at det farvede stof gradvis trænger ind i vandfasen fra overgangszonen, men på en sådan måde, at under udbredningsprocessen er koncentrationen af det farvede stof i det øverste kammer altid højest i overgangszonen, også selv om koncentrationen i denne zone efterhånden aftager i takt med stoffets udbredning ind i det øverste kammer. Venter man tilstrækkelig længe, vil man finde, at stoffet har fordelt sig ensartet over begge de to kamre. Fig. 1.4 viser forskellige koncentrationsprofiler, der er fremkommet til de forskellige tidspunkter t 1 < t 2 < t 3 <... t.

89 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-6 Fig Diffusionscelle. I (A) findes opløsningen i nederste kammer, mens det øvre kammer kun indeholder vand. I (B) er de to kamre forsigtigt skubbet over hinanden, og det opløste stof er ved at diffundere ind i det øverste kammer. Fig Koncentrationsprofiler til forskellige tider af det diffunderende stof gennem kammeret i fig (B). Dette forsøg illustrerer de karakteristiske træk ved en diffusionsproces: 1) den nødvendige betingelse for, at en stoftransport foregår ved en diffusionsproces, er, at der findes en uensartet rumlig fordeling af stoffets molekyler; 2) stoftransporten ved diffusion foregår i den retning, hvor stofkoncentrationen aftager; 3) transporthastigheden er størst i det område, der har den stejleste koncentrationsprofil. Til belysning af sammenhængen mellem transporthastigheden og stejlheden af koncentrationsprofilen kan man anvende en opstilling vist i Fig De to faser, (1) og (2), indeholder det diffunderende stof i koncentrationerne C (1) og C (2). Ved hjælp af omrøring sikres en ensartet fordeling i hver af faserne. M er en membran eller en plade af et homogent materiale af tykkelse x, som tillader passage mellem de to faser, men som er tilstrækkelig finporet til at hindre, at omrøringen medfører nogen mekanisk opblanding inde i membranen. Transporten vil som anført forløbe fra fasen med den høje koncentration C (1), som angivet ved retningen x. Når transportprocessen i membranen er blevet stationær, måles mængden M, som i tiden t har passeret fra fase (1) til fase (2), og samtidig bestemmes middelkoncentrationer C (1) og C (2). Disse målinger gentages for et sæt af koncentrationsforskelle C (1) og C (2). Endvidere gentages forsøget for forskellige arealer A af membranen vinkelret på transportretningen samt for forskellige tykkelser ( x) af membranen.

90 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-7 Fig Opstilling til bestemmelse af den mængde, som til tiden t diffunderer gennem en membran, når koncentrationerne på de to sider (1) og (2) holdes konstante. Det viser sig, at de opnåede resultater sammenfattende kan beskrives ved følgende udtryk (1) (2) C C M = konstant i A t x (1.10) hvor konstanten er en størrelse, der er karakteristisk for det diffunderende stof og for membranen. Der er en slående lighed mellem dette udtryk og udtrykket, der beskriver varmeledning gennem en stav (Fourier's lov: koncentrationer C (1) og C (2) erstattes med temperaturerne T 1 og T 2, og M med transporteret varmemængde Q). Der er en tilsvarende lighed med udtrykket for bevægelsen af elektrisk strøm i en leder (Ohms lov: C (1) og C (2) erstattes med de elektriske potentialer ψ 1 og ψ 2, og M med transporteret ladning q). Af hensyn til det følgende omskrives lign. (1.10) på følgende måde: (1) (2) (2) (1) C C C C C M = DA t = DA t = DA t x x x (1.11) hvor D er en konstant og C = C (2) - C (1) er koncentrationstilvæksten over stykket x i den retning, som stoftransporten foregår, dvs. i retningen fra den høje koncentration C (1) til den lave koncentration C (2). Tilvæksten C er derfor en negativ størrelse DIFFUSIONSFLUX (FICK S LOV) I det følgende beskrives transporten ved diffusion i det tilfælde, hvor koncentrationsprofilen varierer gennem rummet som angivet i Fig. 1.4 og Fig Vi betragter væskelaget mellem de to parallelle og lige store flader A og A' anbragt i afstandene x og (x+ x), hvor afstanden x er tilstrækkelig lille til, at koncentrationsfaldet fra koncentrationen C(x) i punktet x til koncentrationen C(x+ x) i punktet (x+ x) kan betragtes som retlinet.

91 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-8 Fig Til udledning af Fick s lov. Stofmængden, M, som i tiden t er diffunderet gennem arealerne A og A', hvor koncentrationerne henholdsvis er C(x) og C(x+ x), er ifølge lign. (1.11) Cx ( ) Cx ( + x) Cx ( + x) Cx ( ) M = DA t = DA t x x Denne ligning divideres igennem med A t. Herved fås M C( x+ x) C( x) = D A t x Venstre side er lig med fluxen J i området mellem planerne ved x og x+ x, hvor vi har antaget, at x er så lille, at koncentrationsfaldet mellem x og x+ x er tilnærmelsesvis retlinet. Lader vi nu x 0, fås J dc = D dx (1.12) hvor dc angiver hældningen af koncentrationsprofilen i punktet x. Størrelsen dc betegnes også dx dx som koncentrationsgradienten i retningen x og er et mål for stejlheden af koncentrationsprofilen i det betragtede punkt x. Den er lig med den koncentrationsændring, δc, man ville have opnået per længdeenheds fremadskriden fra x, såfremt koncentrationsprofilen havde fortsat med samme stejlhed som i x, altså δc = dc 1 (jf. Fig. 1.7). dx Fig Til illustration af begrebet koncentrationsgradienten.

92 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-9 Fortegnet for koncentrationsgradienten angiver den retning, hvor koncentrationen vokser. En positiv værdi for dc angiver, at koncentrationen vokser i x-aksens positive retning, medens en dx negativ værdi betyder en aftagende koncentration i denne retning. Lign. (1.12) udtrykker således, at diffusionsfluxen er proportional med koncentrationsgradienten, men taget med modsat fortegn, idet minustegnet angiver, at stoftransporten forløber i retningen svarende til den aftagende koncentration. Lign. (1.12) kaldes også for Fick s lov til ære for den tyske fysiolog Adolf Fick, der opstillede ligningen i Diffusionskoefficienten Konstanten D kaldes for det diffunderende stofs diffusionskoefficient. Dimensionen af D fremgår af lign. (1.12), idet (mængde) m 2 s 1 = D (mængde) m 3 m 1, dvs. D = m 2 s 1 i SI-enheder, eller cm 2 s 1 i c.g.s.-systemet. Diffusionskoefficienten D er en størrelse, som er karakteristisk for den diffunderende molekyltype under de givne betingelser. Den indeholder ikke blot de faktorer, der er bestemmende for transporthastigheden som molekylets størrelse og form, men også egenskaber ved det omgivende medium (fx viskositeten), gennem hvilket molekylet diffunderer. I almindelighed er der endvidere en vis afhængighed af størrelsen af D og det diffunderende stofs koncentration (se også afsnit Einstein-Stokes-relationen). I vandig opløsning har de fleste lavmolekylære stoffer en diffusionskoefficient af størrelsen m 2 s 1 eller cm 2 s Et simpelt eksempel på anvendelse af Fick s lov. Vi tænker os en væskesøjle, hvori der til et givet tidspunkt er etableret en lineært aftagende koncentrationsprofil af et stof i retningen x. Stoffets diffusionskoefficient er cm 2 s 1. I punktet x 1 er koncentrationen 1 mol liter 1, og i punktet x 2 = x cm er koncentrationen 0,5 mol liter 1. Hvor stor er diffusionsfluxen angivet i mol m 2 s 1? Man har og hvorfor C = C(x 2 ) C(x 1 ) = 0,5 mol liter 1 = 500 mol m 3 x = x 2 x 1 = 10 cm = 0,1 m 3 1 dc C 500 molim im = = = 5000molim i m dx x 0,1m 3 1 Endvidere er D = cm 2 s 1 = m 2 s 1, og af lign. (1.12) fås J = ( m 2 s 1 ) (-5000 mol m 4 ) = 2, mol m 2 s MOLEKYLÆR BESKRIVELSE AF DIFFUSIONSPROCESSEN. Fick s lov er en ren fænomenologisk beskrivelse af sammenhængen mellem diffusionsfluxen og koncentrationsgradienten i et system, som per volumenenhed indeholder et meget stort antal af de diffunderende molekyler. I biologiske systemer er denne situation næsten altid opfyldt, så det hører til undtagelserne, at man løber ind i vanskeligheder ved at benytte denne lov. Imidlertid vil

93 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-10 det være instruktivt også at se på det enkelte diffunderende molekyles opførsel, fordi man derigennem får et indblik i mekanismen på det molekylære plan ved diffusionsprocessen Brown ske bevægelser Nøglen til denne forståelse ligger i det fænomen, der betegnes som de Brown ske bevægelser. I 1828 observerede den engelske botaniker Robert Brown, at pollenkorn, som var opslæmmede i vand, udførte vedvarende irregulære bevægelser. Gennem årene fremkom der mange dels forkerte og dels ufuldstændige forklaringer på fænomenet, indtil A. Einstein (1905) og M. v. Smoluchowski (1906) uafhængigt af hinanden fremkom med den nu accepterede teori for de Brown'ske bevægelser. Betragter man en enkelt af de suspenderede partikler og samtidig tager en række mikrofotografier af partiklen - fx med samme tidsinterval - er det muligt bagefter at give en grov rekonstruktion af partiklens bevægelse. Eksempler herpå er vist i Fig Fig To eksempler på rekonstruktion af de bevægelser en suspenderet partikel udfører som følge af Brown ske bevægelser i t sekunder. I (A) er partiklen endt i punktet b, svarende til en nettoforskydning 1 til højre for udgangsstillingen. I (B) er nettoforskydningen 2 til venstre for udgangsstillingen. I fig. 1.8A er partiklens udgangspunkt a, og efter fx 100 sekunder findes den ved b. Punkterne angiver positionerne, hvor hvert fotografi blev taget. Nettobevægelsen 1 i en given retning x til tiden t = 100 s ses at være fremkommet som resultatet af en kompliceret zig-zag-bevægelse, hvor de enkelte forskydninger, δ i, varierer på tilfældig måde, både hvad angår størrelse og retning. I Fig. 1.8A er slutpositionen b til højre for udgangspositionen a, og nettoforskydningen i x- aksens retning er 1. Ved en senere gentagen iagttagelse (Fig. 1.8B) findes det samme principielle mønster, men slutpositionen b' er nu til venstre for udgangspositionen a', og nettoforskydningen i x-aksens retning er nu 2. Foretager man et stort antal af denne type forsøg, vil man finde, at de positive og negative værdier af tenderer til at ophæve hverandre således, at der er samme sandsynlighed for, at en partikel til tiden t enten befinder sig i positionen + eller i - i forhold til udgangspositionen. Optegnes den hyppighed, hvormed man i et stort antal forsøg observerer en nettoforskydning (positiv eller negativ) efter samme tidsinterval t 1 fås en fordeling af forskydninger som angivet i Fig Figuren angiver endvidere fordelingen af forskydningerne bestemt til to senere tidspunkter t 2 og t 3.

94 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-11 Fig Fordelingen af nettoforskydningerne til tiden t, når observationerne i fig. 1.8 gentages et stort antal gange. De tre kurver angiver forskydninger observeret til tre forskellige tider, hvor t 1 < t 2 < t 3.. Kurverne kan opfattes som sandsynligheden for, at en partikel til tiden t observeres i en afstand fra udgangspositionen. Kurverne ses at være symmetriske omkring denne, hvilket igen betyder, at den til tiden t forventede forskydning lige så godt kan være positiv som negativ. Dette betyder, at middelforskydningen = 1 i = n i n i= 1 til tiden t ved n efterfølgende observationer af en enkelt partikel er nul, såfremt n er meget stor. Til karakterisering af den forskydning (positiv eller negativ), som i middel kan forventes under én iagttagelsesperiode på t sekunder, er det rimeligt at tage middelværdien af kvadratet på forskydningerne fra udgangspositionen 2 1 i = n 2 i = n i= 1 således, at forskydningen s 2 = s er standarddeviationen på forskydningerne. Det ses endvidere, at kurverne svarende til tidspunkterne t 2 og t 3 aftager i højde og bliver bredere, hvilket betyder, at med tiden aftager sandsynligheden for at finde partiklen i den først observerede position samt, at standarddeviationen for forskydningen fra denne vokser med tiden. Årsagen til at en suspenderet partikel eller et opløst molekyle udfører denne ovennævnte karakteristiske helt tilfældige zig-zag-bevægelse, hidrører fra de termiske bevægelser, som udføres af vandmolekylerne, der omgiver partiklen. Derved udsættes partiklen for et uophørligt, men uregelmæssigt bombardement fra alle sider. På grund af den helt tilfældige karakter af molekylstødene vil det fra tid til anden ske, at intensiteten af bombardementet meget kortvarigt vokser på den ene side af partiklen. Resultatet heraf er, at partiklen bevæger sig et stykke δ 1 i den resulterende impulsretning. Noget senere (efter ca s forløb) vil partiklen igen udsættes for et asymmetrisk tilfældigt bombardement, hvorved partiklen bevæger sig et andet stykke δ 2, hvis retning er ganske uafhængig af retningen af det forudgående spring.

95 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side Random walk Den tekniske betegnelse for den ovennævnte vandringstype er "random walk" eller drukkenboltens gang. Problemstillingen for den endimensionale "random walk" kan formuleres således: Man tager en mønt og slår plat eller krone. Kommer krone op, går man ét skridt frem, og kommer plat op, går man ét skridt tilbage. Hvad er nu sandsynligheden W(N,m) for, at man efter at have gået i alt N skridt frem og tilbage befinder sig i en afstand fra udgangspunktet, der svarer til en lige fremadrettet gang bestående af i alt m skridt? Fig viser to eksempler på en vandring bestående af N = 18 skridt, som begge ender med en slutposition svarende til m = 4 lige fremadrettede skridt. Ved hjælp af sandsynlighedsbetragtninger kan den søgte sandsynlighed W(N,m) betegnes. Det kan også vises, at for store værdier af N fås en sandsynlighedsfordeling af samme form som den kurve, der er angivet i Fig Fig Til illustration af begrebet random walk. Figuren viser to forskellige måder hvorpå man ved at foretage i alt 18 trin frem eller tilbage kan ende i en afstand svarende til 4 lige fremadrettede trin. Dette kan gøres på i alt forskellige måder Fig Sandsynlighedstætheden for random walk når antallet af trin er stort. Sandsynligheden for at man til tiden t befinder sig mellem x og (x+dx) er lig med P(x,t 1 )dx. Den stiplede kurve angiver sandsynlighedstætheden til et senere tidspunkt Denne kurve angiver sandsynligheden for, at man til tiden t 1 befinder sig i positionen x fra udgangspunktet, hvor t 1 er den tid, som det har taget at foretage i alt N fremad- og tilbagerettede skridt. Det ses, at kurven for sandsynlighedsfordelingen for forskydningen x til tiden t har samme form som de eksperimentelt bestemte kurver for forskydningerne af de Brown'ske partikler. Begge kurver har endvidere samme principielle form som den Gauss ske (eller normale) fordelingskurve: x P = exp 2Πs 2 s (1.13) At kurven er symmetrisk omkring udgangspunktet betyder, at sandsynlighederne er lige store for, at en partikel til tiden t enten bevæger sig stykket x i én retning eller det samme stykke i den modsatte retning. Selvom dette er tilfældet, kan man få en ensrettet nettotransport, der hidrører fra molekylernes termiske bevægelser. Før vi redegør for dette forhold, skal vi give kurven i Fig en anden fortolkning. Man tænker sig, at et stort antal molekyler med en tæthed på N (molekyler) m 2 kastes ind i opløsningen til tiden t = 0 og i en plan vinkelret på x-aksen svarende til positionen x = 0. Ordinaten angiver derved den forventede middelkoncentration i afstandene ±x til tiden t 1, som er fremkommet ved, at molekylerne i denne tid har bevæget sig bort fra udgangsstillingen x = 0 på grund af det uophørlige, uregelmæssige bombardement hidrørende fra vandmolekylernes termiske bevægelser. Den stiplede kurve angiver fordelingen af partikelsværmen til et senere tidspunkt t 2. Sammenlignes de to kurver P(x,t 1 ) og

96 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-13 P(x,t 2 ), ses det, at til det senere tidspunkt t 2 befinder der sig et færre antal partikler omkring udgangsstillingen samtidig med, at en større fraktion af partiklerne har bevæget sig længere bort derfra. Af hensyn til det følgende er det bekvemt først at indføre en forenklet beskrivelse af partikelsværmens bevægelse bort fra udgangspunktet, efterhånden som tiden går. Vi opgiver at holde rede på hele spektret af forskydninger og karakteriserer i stedet sværmens bevægelse ved hjælp af to forskydninger, + x og x, som er middelforskydningerne af partiklerne, som har bevæget sig henholdsvis i den positive og den negative retning fra udgangspositionen. Disse middelforskydninger er lige store, men modsat rettede, og svarer til positionerne af massemidtpunkterne for de to partikelsværme, som bevæger sig til hver side bort fra udgangspunktet. Hvis koncentrationsprofilen svarer til den normale fordelingskurve, vil 68,3% af partiklerne befinde sig i området s < x <s, og 15,85% af partiklerne i hvert af områderne x > s og x < s. Det kan endvidere vises, at partiklernes middelforskydning x fra udgangspositionen i én retning er givet ved x = ( 2Π s) 1 = 0,8 s. Heraf kan man beregne, at 57,8% af partiklerne til tiden t vil befinde sig i området x < x < + x, mens de resterende 42,2% af partiklerne vil være vandret længere bort fra udgangspositionen. Ved hjælp af disse to middelforskydninger, + x og x, kan partikelsværmens bevægelse beskrives på følgende simplificerede måde: Af de N (molekyler) m 2, som oprindelig befandt sig i positionen x = 0, vil ½N molekyler i snit have bevæget sig et stykke + x og i tiden t, mens de resterende ½N molekyler i samme tidsrum vil have bevæget sig i modsat retning og befinde sig omkring positionen x i forhold til udgangspunktet x = Random walk og Fick's lov Vi skal nu anvende denne forenkling til at beskrive nettotransporten i en partikelsværm, hvis koncentration aftager lineært med afstanden i en given retning. Argumentet skyldes A. Einstein (1908), som på opfordring af den hollandske kemiker R. Lorentz gav en simplificeret fremstilling af teorien for de Brown ske bevægelser. Vi betragter et plan med areal A (den skraverede flade i Fig. 1.12), som er anbragt vinkelret på den retning, som de opløste partikler diffunderer, dvs. modsat retningen af de diffunderende partiklers koncentrationsgradient. Dette plan er den fælles endeflade for to tilstødende volumenelementer, hver med siden x, som er de diffunderende partiklers middelforskydning i tiden t. Volumenelementet til venstre for fladen A kaldes (1). Middelkoncentrationen deri er koncentrationen i prismets midte. Lad denne være N(x), hvor N i dette tilfælde angiver antallet af partikler per volumenenhed. Tilsvarende angives volumenelementet til højre for fladen A ved (2). Positionen svarende til dette prismes midte er (x+ x), og middelkoncentrationen der er N(x+ x). Det skraverede areal vil nu krydses af partikler, der bevæger sig fra prisme (1) ind i prisme (2), og af partikler, der samtidig bevæger sig fra (2) ind i (1). Ved det specielle valg af volumenelementernes sider, nemlig middelforskydningen x i tiden t, har man sikret sig, at blandt de partikler, der oprindelig befinder sig i volumenelementet (1), har halvdelen en chance for netop at have krydset planet i det skraverede areal A efter tiden t er forløbet. Fig Til illustration af Einsteins simplificerede behandling af en diffusionsproces baseret på random walk. Antallet af partikler, der initialt findes i volumenelement (1), er N(x)A x. Efter t sekunders forløb vil halvdelen af disse partikler have bevæget sig ud af volumenelementet i retningen mod venstre, mens den resterende halvdel har bevæget sig mod højre og derved krydset det skraverede plan A. Transporten M 1 2 gennem planet i tiden t i retningen 1 2 er lig med M = N( x) Ax 2

97 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-14 Tilsvarende er transporten M 2 1 gennem planet A i retningen 2 1 M = N( x+ x) Ax Nettovandringen M i retningen 1 2 gennem planet er derfor [ ] ( ) 2 N( x+ x) N( x) M M = Ax N( x) N( x+ x) = A x 2 2 x Fluxen i denne retning er J = MA 1 t. Heraf fås 1 ( ) 2 N ( x+ x ) N ( x J = x ) (1.14) 2t x Er koncentrationsprofilen retlinet gennem de to prismer, eller hvis vi nu kun betragter ganske korte tider t, således at x << 1, går det ovenstående udtryk for fluxen over i ( x ) 2 dn J = 2t dx (1.15) Faktoren ( x 2 (2t) 1 ) er en konstant størrelse (Einstein viste dette ved direkte at kvadrere summen af N forskydninger af længde x, som er forløbet i tiden t). Det ovenstående udtryk bliver således identisk med Fick's lov, hvis man sætter ( x ) 2 D = (1.16) 2t Fick's lov er hermed deduceret ud fra antagelsen om tilstedeværelsen af Brown ske bevægelser, og samtidig er der redegjort for mekanismen ved fremkomsten af diffusionsfluxen, uden at der har været behov for at indføre nogle specielle, ensrettede kræfter, der driver de enkelte partikler ned af koncentrationsprofilen. Alle partiklerne udfører Brown ske bevægelser med lige stor sandsynlighed for et fremadrettet eller et tilbagerettet trin. Partiklerne vil herved bevæge sig kaotisk frem og tilbage, og nettotransporten i én retning fremkommer, når tætheden af partiklerne varierer i én bestemt retning. Et lag med en større tæthed end i nabolaget vil per tidsenhed afgive flere partikler til nabolaget, end det vil modtage i samme tidsrum fra dette, netop fordi sandsynligheden for hver partikels vandring er den samme uanset koncentration. Divideres lign. (1.15) på begge sider med Avogadros tal N A, bliver koncentrationsmålet i stedet molariteten C Einstein-Smoluchowski-relationerne I udtrykket for Fick s lov J dc = D (1.17) dx er det diffusionskoefficienten D, som er den parameter, der er bestemmende for diffusionsfluxens størrelse for et givet stof. Ved betragtning af diffusionsprocessen på det molekylære plan ses det, at diffusionsfluxen må være bestemt af, hvor langt en partikel, der udfører Brown ske bevægelser, i snit vil bevæge sig bort fra udgangspositionen i løbet af tiden t. Et bekvemt mål herfor var standardafvigelsen s på forskydningen. Man kan derfor forvente, at der må findes en relation mellem de tre størrelser D, s og t. Endvidere må partiklens gnidningskoefficient β (lign. (1.2)) eller dens bevægelighed B (lign. (1.6)) være bestemmende for, hvor langt par-

98 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-15 tiklen forskydes, når den udsættes for en kortvarig impuls på grund af et asymmetrisk bombardement fra nabomolekylerne. Man kan derfor ligeledes forvente, at de to størrelser D og B må være sammenknyttede på en eller anden måde. Disse sammenhænge fremkommer af teorien for diffusionsprocessen, som er udviklet af Einstein og Smoluchowski på grundlag af de Brown ske bevægelser. Det første resultat er 2 s D = (1.18) 2t der kaldes Einstein-Smoluchowski-ligningen, som næsten er identisk med lign. (1.16), idet det kan vises, at middelforskydningen x = 0,8 s. Sammenhængen mellem D og B er endvidere (Einstein 1905): D = kt B (1.19) hvor k = 1, joule K 1 per molekyle er Boltzmanns konstant (gaskonstanten per molekyle) og T den absolutte temperatur (K). Den sidste ligning kaldes Einstein-relationen. Lign. (1.18) er vigtig, fordi den giver et udmærket første ordens skøn over, hvor langt en partikelsværm vil udbrede sig i tiden t. Lad partiklerne, hvis diffusionskoefficient sættes til 10 6 cm 2 s 1, initialt befinde sig i et plan svarende til x = 0. Efter t sekunders forløb vil 68,3% af partiklerne befinde sig i området s < x < s, mens resten af partiklerne vil være vandret længere bort. Hvis s er 1 cm, har man af lign. (1.18) s t = = = 510 i sekunder 6 2 D 210 Er derimod s = 1 µm, fås t = 5 ms, og til s = 100 Å = 10 nm svarer en værdi af t på 0,5 µs. En stoftransport, som beror på Brown ske bevægelser, tager derfor kun kort tid, hvis området, som stoffet skal udbredes i, er lille. Skal stofudbredningen ske over store afstande i løbet af kort tid, må konvektion ved hydrodynamisk strømning træde i stedet som transportmekanisme. Dette sker hos levende organismer ved hjælp af kredsløbet Einstein-Stokes-relationen Ved at anvende makroskopisk gyldige hydrodynamiske love viste G. G. Stokes (1856), at hvis en kugleformet partikel med radius r befinder sig i et flydende medium med viskositeten η og påvirkes med en kraft X, som tildeler den en stationær hastighed v, så er denne hastighed sammenknyttet med kraften X ved følgende relation X = 6Π rη v (1.20) der betegnes som Stokes ligning. Partiklens mekaniske bevægelighed er defineret ved v = BX. For en kugleformet partikel har man derfor 1 B = 6 Π rη (1.21)

99 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-16 forudsat, at radius er stor nok i forhold til vandmolekylernes radius, at de hydrodynamiske love stadig gælder. Indsættes heri Einstein-relationen (lign. (1.19)), fås kt D = 6 Π rη Multipliceres tæller og nævner med Avogadros tal N A, fås RT D = (1.22) Π 6 rη NA idet (N A k) er lig med gaskonstanten R, hvis numeriske værdi er 8,314 J mol 1 K 1. lign. (1.22) kaldes Einstein-Stokes-relationen, selvom den alene skyldes Einstein. Denne relation er vigtig, bl.a. fordi den gør det muligt at bestemme molekylære dimensioner af opløste partikler ved måling af diffusionskoefficienten D. Lign. (1.22) belyser også det forhold, at diffusionskoefficienten kun varierer svagt med molekylvægten. Massen af en kugle med massefylde ρ og radius r er 4 m= Π 3 3 r ρ Hvis denne masse repræsenterer et enkel sfærisk molekyle, så er molekylvægten for stoffet Heraf følger MW = N Am = Π r ρn A r Fra lign. (1.22) har man 3 MW Dr = konstant hvorfor man også skulle forvente, at 3 D MW = konstant (1.23) I Tabel 1.1 er der angivet sammenhørende værdier for diffusionskoefficient og molekylvægt 3 for en række stoffer samt produktet D MW. Det ses, at selv med det meget store spektrum i molekylvægte forbliver produktet D MW rimelig 3 konstant.

100 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-17 Tabel 1.1. Sammenhæng mellem et stofs diffusionskoefficient og dets molekylvægt. (Efter Setlow og Pollard, 1962) Molekyle M (g mol 1 ) D (m 2 s ) D MW 10 9 Glycin Arginin Cytochrom C Pepsin CO-hæmoglobin Urease Tobakmosaikvirus ,1 9,0 6,2 3,5 0,53 4,02 3,24 2,73 2,94 2,53 2,74 1, Den drivende kraft ved diffusionsprocessen Stoftransport ved migration fremkommer, fordi hver partikel er påvirket af en ydre kraft, X migr, som driver partiklen gennem opløsningsmidlets molekyler med en middelhastighed v i kraftens retning, uanset at alle systemets molekyler uophørligt udfører irregulære tilfældige termiske bevægelser. Migrationsfluxen er J migr = BNX (1.8) migr Som anført i afsnittet Random walk og Fick's lov er det kombinationen af en uensartet fordeling af de opløste molekyler og disses "random walk", der fører til stoftransporten ved diffusion. Der er således ikke tale om, at der ved etableringen af en koncentrationsgradient fremkommer en særlig "diffusionskraft", som driver hvert enkelt opløst molekyle i koncentrationsfaldets retning. Ved visse formelle beregninger kan det alligevel være bekvemt at se bort fra de processer, som på det molekylære niveau ligger til grund for stoftransporten ved diffusion, og i stedet anskue diffusionsprocessen, som fremkommet ved, at hver enkelt partikel er påvirket af en kraft, der driver partiklerne i koncentrationsfaldets retning. Størrelsen af denne ækvivalente eller fiktive diffusionskraft skal nu bestemmes. Vi betragter et sted i rummet, hvor koncentrationen er C og koncentrationsgradienten er dc dx. Diffusionsfluxen J diff er i følge Fick s lov J diff dc = D dx Højre side af denne ligning multipliceres med 1 = (B B 1 ) (C C 1 ), og leddene arrangeres således: J diff D 1 dc = BC BC dx Dette maskerede udtryk for Fick s lov har helt den samme form som udtrykket for migrationsfluxen givet ved lign. (1.8). Det følger heraf, at den diffusionsflux, der findes i et område med

101 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-18 koncentrationsgradienten dc og koncentrationen C, formelt kan omskrives som en migrationsproces, der er frembragt af den ækvivalente dx diffusionskraft X diff D 1 dc D dlnc = = (1.24) B C dx B dx dvs. den kraft per opløst partikel, der i et område med ensartet koncentration C netop giver en stoftransport af samme størrelse som den stoftransport, der sker ved diffusion som resultat af tilstedeværelsen af en koncentrationsgradient af størrelsen dc dx. Udtrykket på højre side af lign. (1.24) betegnes hyppigt som den termodynamiske kraft for diffusionsprocessen. Selv et så imponerende navn ændrer dog ikke det forhold, at "diffusionskraften" er en pseudokraft ligesom fx en centrifugalkraft. Indføres Einstein-relationen (lign. (1.19)), fås følgende nyttige udtryk for diffusionskraften X diff kt dc dln C = = kt (1.25) C dx dx 1.6. DIFFUSION OG MIGRATION FORLØBER SAMTIDIG SMOLUCHOWSKI-LIGNINGEN Ved beskrivelsen af passiv transport i biologien opstår hyppigt i den situation, at den passive flux af et stof forløber, fordi det pågældende stof både er uensartet fordelt i det betragtede område og samtidig er påvirket af en ydre drivende kraft, fx en elektrisk kraft, der virker på en ion, således at der i virkeligheden er tale om en diffusionsproces, hvorpå der er overlejret en migrationsproces. Fluxligningen, som indeholder begge disse to tendenser, betegnes undertiden som Smoluchowski-ligningen. Vi skal nu udlede denne ligning, dels ved hjælp af det ovennævnte udtryk for diffusionskraften og dels ved anvendelse af "Random walk" betragtninger Med kraftbetragtning som udgangspunkt Lad der på hvert sted i det pågældende område findes dels en koncentrationsgradient af størrelsen dc, og dels en ydre kraft, X, der virker på hver enkel partikel. Formelt kan fluxen på et sted dx i rummet med koncentrationen C skrives som J = BC X = BC( X + X ) (1.26) tot migr diff hvor X tot inkluderer det ækvivalente kraftbidrag, der hidrører fra diffusionsprocessen. Diffusionskraftens størrelse er angivet ved lign. (1.24). Man har derfor X tot D 1 dc = Xmigr BC dx som indsat i lign. (1.26) giver

102 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-19 dc = (1.27) J BC Xmigr D dx der angiver størrelsen af fluxen, når stoftransporten sker, både fordi der virker en ydre drivende kraft X migr på hver partikel, og fordi der findes en koncentrationsgradient af størrelsen dc på det dx sted i rummet, hvor koncentrationen er C. Migrationsfluxen kan ifølge lign. (1.7) også skrives som J = C v hvor v er den stationære migrationshastighed. lign. (1.27) kan derfor også skrives på den alternative form dc J = D + Cv (1.28) dx lign. (1.27) respektive lign. (1.28) kaldes undertiden for Smoluchowski-ligningen Med Random walk betragtning som udgangspunkt Ligningen kan også udledes fra en "Random walk" betragtning svarende til udledningen af Ficks lov (afsnittet Random walk og Fick s lov). Men hver enkelt opløst partikel har nu overlejret en ensrettet migrationshastighed v oven på de irregulære og helt tilfældige Brown'ske bevægelser. Dette indebærer, at middelforskydningen til tiden t ikke mere er symmetrisk omkring udgangspositionen som i det kraftfri tilfælde (sml. Fig. 1.11), idet partikelsværmen som helhed vil have bevæget sig i tiden t et stykke i kraftens retning, som er lig med vt. De to situationer er vist i Fig Fig Forskydningerne til tiden t af en partikelsværm, der til tiden t=0 befinder sig i planet omkring x=0. (A) Ingen ydre drivende kraft. (B) Partikelsværmen er underkastet en migrationskraft X, der tildeler hver partikel en hastighed v i kraftens retning. Middelforskydningen fra udgangspositionen x=0 er derfor asymmetrisk. I det kraftfri tilfælde (Fig (A)) er middelforskydningen x til tiden t symmetrisk omkring udgangspositionen x = 0. I (B) er sværmen påvirket af en migrationskraft X, der tildeler hver opløst partikel en hastighed v i kraftens retning. Sværmens symmetriplan vil derfor i tiden t have bevæget sig fra udgangspositionen x = 0 over et stykke vt i kraftens retning. Dette indebærer, at middelforskydningerne fra udgangspositionen bliver asymmetrisk, idet middelforskydningen x + i kraftens retning er x + = x+ vt, hvor x er middelforskydningen i det kraftfri tilfælde. Tilsvarende er middelforskydningen x i den modsatte retning lig med x = x- vt.

103 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-20 Fig Til udledning af nettofluksen i en partikelsværm, som bevæges både under indflydelse af en koncentrationsgradient og en ydre drivende kraft. Den "Einstein'ske kasse" svarende til Fig er vist i Fig Kraften antages at være rettet fra venstre mod højre. Lad N betegne koncentrationen = antal opløste partikler per volumenenhed. Antallet af partikler som i tiden t har passeret den skraverede flade med arealet i Fig i kraftens retning er lig med halvdelen af de partikler, som findes til venstre for den skraverede flade i prisme (1), som har siden x+ vt og fladen A. Dette antal er M = N( x) A( x + vt) hvor N(x) er middelkoncentrationen i prisme (1), dvs. koncentrationen midt mellem prismets to endeflader, hvilket svarer til positionen x i afstanden ½( x+ vt) fra den skraverede endeflade. Midten af prisme (2) med sidelængde x- vt er i afstanden ½( x- vt) til højre for den skraverede flade. Afstanden mellem de to prismers midter er derfor x + vt x vt + = x 2 2 dvs. lig med middelforskydningen til tiden t, når partiklerne udfører Brown ske bevægelser uden indflydelse af en ydre drivende kraft. Antallet af partikler som i tiden t har passeret fra prisme (2) gennem den skraverede flade ind i prisme (1) er lig med halvdelen af partiklerne i prisme (2), dvs. M = N( x+ x)( x vt) A Fluxen gennem den skraverede flade er derfor som omskrives til { } M M 1 1 A N ( x )( x + vt ) N ( x + x )( x vt J = = ) At 2 At ( x ) 2 N( x+ x) N( x) 1 1 J = + N( x) v+ N( x+ x) v 2t x 2 2 Hvis x << 1, dvs. t << 1 går det ovenstående udtryk over i eller, idet man sætter ( x ) 2 (2t) 1 = D ( x ) 2 dn J = Nv 2t dx +

104 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-21 dn J = D + Nv dx som ved division på begge sider af lighedstegnet med Avogadros tal N A går over i lign. (1.28) DIFFUSION GENNEM MEMBRANER I forhold til cellens indre væskefase (cytoplasmaet) og dens ydermedium udgør cellemembranen en meget betydelig barriere for transporten af ioner og hydrofile molekyler. Man kan derfor med meget stor tilnærmelse regne med, at hele koncentrationsændringen mellem den indre væskefase (cytoplasmaet) og ydermediet ligger over cellemembranen. Lad et stof have koncentrationen C (1) i cytoplasmaet og C (2) i ydermediet. Fluxen af stoffet ved diffusion gennem cellemembranen i retningen (1) (2) er da ifølge Fick's lov J dc = D (1.12) dx hvor dc er koncentrationsgradienten og D er diffusionskoefficienten for stoffet i membranen. dx Det antages, at koncentrationsprofilen i membranen er lineær. Denne antagelse er korrekt for uladede partikler. Antagelsen vil også gælde for ioner, såfremt der ikke hersker et elektrisk felt over membranen. Lad koncentrationerne af stoffet på membranens inder- og yderside være C (1) og C (2). Er membranens tykkelse h, har man derfor fra lign. (1.12) (2) (1) Cm Cm D (1) (2) J = D = ( Cm Cm ) (1.29) h h PERMEABILITETSKOEFFICIENTEN Muligheden for at anvende ovennævnte udtryk er imidlertid meget begrænset. Membrantykkelsen kendes kun med tilnærmelse. En yderligere komplikation kan være, at stoffets opløselighed i membranen ikke er den samme, som i de to omgivende medier. Formelt kan man råde bod herpå ved at skrive C = α C (1.30) (2) (2) m og C = α C (1.31) (1) (1) m hvor α er fordelingskoefficienten for stoffet. lign. (1.29) kan herved skrives på formen αd (2) (1) J = ( C C ) (1.32) h Med et givent sæt værdier af C (2) og C (1) er det således faktoren α D αkt B P = = (1.33) h h

105 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-22 der er bestemmende for størrelsen af fluxen gennem membranen. Det er endvidere den parameter, som umiddelbart kan bestemmes, hvis man kender C (2) og C (1) og kan måle fluxen J, der svarer til disse koncentrationer. Faktoren P kaldes membranens permeabilitetskoefficient eller blot dens permeabilitet for det pågældende stof. Diffusionskoefficienten D har dimensionen m 2 s 1, og α er et rent tal. Permeabiliteten har dermed dimensionen m s 1. Fick's lov for stoftransporten gennem en membran ved diffusion i retningen (1) (2) skrives hyppigst på formen (1) (2) ( ) J = P C C (1.34) hvor vort ufuldstændige kendskab til de parametre, der er bestemmende for fluxens størrelse, er sammenfattet i permeabilitetskoefficienten P. Det er alligevel værd at erindre sig den indflydelse, som stoffets opløselighed i membranen og dermed fordelingskoefficienten har for stoftransportens størrelse. Selv om stoffets diffusionskoefficient D i membranen er mindre end diffusionskoefficienten D' for stoffet i vandig opløsning, kan virkningen heraf på stoftransporten gennem membranen modvirkes ved, at stoffets opløselighed er højere i membranen end i opløsningen. Det ses af lign. (1.33)at membranen overhovedet ikke vil frembyde nogen transportbarriere i forhold til det omgivende medium, såfremt α D = D' Omvendt vil transporten af et stof, der har samme diffusionskoefficient, respektive mobilitet, i vandig opløsning og i membranen, alligevel kunne begrænses ved membranens tilstedeværelse. Hertil kræves blot, at stoffets opløselighed i membranen er mange gange mindre end i den vandige opløsning. En membran frembyder således den største transportbarriere for de stoffer, hvis mobilitet og opløselighed i membranen er meget mindre end i de omgivende medier UDVEKSLINGSKINETIK Når man skal bestemme membranpermeabiliteten P, er den eksperimentelle situation i Fig. 1.5 meget bekvem, især såfremt stofudvekslingen gennem membranen ikke ændrer det diffunderende stofs koncentration i de to faser (1) og (2) (fx under forhold med store volumina af de to faser). Ved bestemmelsen af permeabiliteten af biologiske cellers membraner kan denne situation kun sjældent realiseres, idet cellens ringe volumen medfører, at stofkoncentrationen i cellens indre (fase (1)) ændrer sig under udvekslingen med det omgivende medium. Man kan imidlertid opstille eksperimentelle situationer, hvor dette forhold ikke medfører nogen større komplikation ved bestemmelsen af P. I det simpleste tilfælde sørger man for, at volumen af den omgivende fase (fase (2)) bliver så stor i forhold til det totale cellevolumen, at man for alle praktiske formål kan regne med, at koncentrationen i fase (2) (yderfasen) er konstant. Vi betragter to tilfælde: Koncentration i fase (2), C (2), holdes konstant på nul Lad koncentrationen C (1) i fase (1) være C(t) til tiden t og C(0) til tiden t = 0. Fluxen i retningen (1) (2) til tiden t er da ifølge lign. (1.34) (2) J= P Ct () C = PCt () (1.35) da C (o) = 0 for alle værdier af t. Antallet af mol, δn, som i tiden δt er fjernet fra fasen (i) ved diffusion gennem membranen, er

106 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-23 δn = J Aδt hvor A er membranernes areal. I samme tidsrum er koncentrationen i fase (1) faldet fra C(t) til C(t + δt). Volumen af fase (1) er V, og man har da [ () ( )] Divideres begge sider med Vδt, fås Lader man δt gå mod nul, fås δn = C t C t+ δt V = J Aδt = APCδt Ct ( + δ t) Ct ( ) AP = C δ t V hvor størrelsen dc A P = C = kc (1.36) dt V AP k = (1.37) V kaldes hastighedskoefficienten for udvekslingsprocessen. Det ses af lign. (1.36), at funktionen C(t) og dens første afledte dc er proportionale. Denne dt egenskab har eksponentialfunktionen y = e x. Som en mulig løsning af lign. (1.36) forsøger vi derfor med funktionen som indsat i lign. (1.36) giver Ct () = e at at β e = ke at Heraf følger β = k. Een løsning af lign. (1.36) er derfor at Ct () = Ke (1.38) hvor K er en arbitrær konstant, hvis absolutte værdi afhænger af karakteren af det pågældende fysiske problem, hvis generelle matematiske beskrivelse er givet ved lign. (1.36). Den aktuelle situation, som denne ligning skal kunne gengive, er initialbetingelsen C(t) = C(0) for t = 0 Indsættes denne betingelse i lign. (1.38), fås K = C(0)

107 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-24 Den endelige løsning af lign. (1.36) bliver derfor eller Ct () = C(0) e kt (1.39) ln Ct ( ) = ln C(0) kt (1.40) Det fremgår heraf, at koncentrationen i fase (1) aftager eksponentielt med tiden. Hastigheden, hvormed dette sker, afhænger af størrelsen af hastighedskoefficienten k = AP V Jo større hastighedskoefficienten er, desto hurtigere vil stoffet forsvinde fra fase (1). De faktorer, som er bestemmende for størrelsen af hastighedskonstanten, er ifølge lign. (1.37) forholdet mellem membranareal A og volumen V af fasen samt membranens permeabilitet P. Måles koncentrationerne af stoffet i fasen (1) til forskellige tider t, vil der fremkomme en retlinet afhængighed mellem lnc og t. Denne kurves hældning er ifølge lign. (1.40) lig med k. Hermed kan hastighedskoefficienten bestemmes. Kender man endvidere membranens areal A og volumen V af fase (1), kan membranpermeabiliteten P for det pågældende stof beregnes fra lign. (1.37) Koncentrationen i fase (2), C (2), er endelig og konstant, koncentrationen i fase (1), C (1), er initialt nul I dette tilfælde foregår transporten fra fase (2) med konstant koncentration C (2) til fase (1), som initialt har koncentrationen nul. Lad koncentrationen der være C(t) til tiden t. Fluxen i retningen (2) (1) til tiden t er da () (1.41) (2) J = P C C t I tiden δt er der transporteret mængden δn = JAδt ind i fase (1) med areal A og volumen V. Denne mængde kan også skrives som divideres igennem med δt fås (2) [ ] δn = C( t+ δt) C() t V = J Aδt = AP C C() t δt Lader man dernæst δt 0, fås + δ δ t Ct ( t) Ct ( ) AP C (2) = C t V () dc k C (2) C t som er differentialligningen for akkumuleringen af stof i fase (1). Sættes = () dt (1.42) (2) Ut () = C Ct () (1.43)

108 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-25 har man du dt = dc. lign. (1.42) tager dermed formen dt du dt = ku som er identisk med lign. (1.36). Den almene løsning for U er derfor på formen kt Ut () = Ke (1.44) For t = 0 er C(t) = 0. Dette indsat i lign. (1.43) giver U(0) = C (o), hvorfor Ut C e C Ct (2) (2) () = kt = () eller ( ) = (1.45) (2) Ct () C 1 e kt som viser, at koncentrationen i fase (1) vokser eksponentielt og asymptotisk mod C (2) og med den samme hastighedskonstant som i det foregående tilfælde. Det ses endvidere, at der er en lineær relation mellem tiden t og ln [l - C(t) (C (2) ) 1 ] og igen med hældningen k UNIDIREKTIONELLE FLUXER I den oven for anførte, eksperimentelle situation holdtes koncentrationen i fase (2) hele tiden på nul. Dette medfører, at ingen molekyler, der én gang har vandret gennem membranen fra fase (1), vil have mulighed for at vandre tilbage igen på grund af "random walk". Til karakterisering af fluxen for denne specielle transportsituation har man indført en særlig betegnelse for fluxen, som kaldes en unidirektionel flux. Nogle finder det endvidere bekvemt også at anvende dette begreb i de situationer, hvor der er en endelig koncentration af stoffet i begge faser. Ved at omskrive lign. (1.34) til (1) (2) J = PC PC = J1 2 J2 1 opfattes fluxen i retningen (1) (2) som resultanten af to unidirektionelle fluxer, der har modsat retning. Den første af disse, fra cellens inderfase til ydermediet J = PC = J = J = J (1.46) (1) 1 2 ud out eff kaldes outflux, respektive efflux, og den anden J = PC = J = J (1.47) (2) 2 1 ind in for influx. Denne rent formelle manipulation med Fick s lov giver naturligvis ingen forøget fysisk indsigt i transportprocessen gennem membranen. Ved visse beregninger kan det dog være meget bekvemt rent formelt at operere med unidirektionelle fluxer i lighed med, at det var bekvemt at indføre en "diffusionskraft" i afsnit 1.61 ved udledningen af fluxligningen for den kombinerede migrations- og diffusionsproces.

109 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side KONVEKTIV OG OSMOTISK VANDBEVÆGELSE GENNEM MEM- BRANER Few phenomena are so well understood thermodynamically, or so ill understood kinetically, as osmotic flow of solvent through a semipermeable membrane. (Longuet-Higgins & Austin, 1966) I de tidligere afsnit har vi beskrevet den passive transport gennem en membran af uladede, vandopløste molekyler. Alle biologiske membraner er imidlertid også mere eller mindre let gennemtrængelige for vand. I det følgende skal der redegøres for de to mekanismer, som er af særlig betydning for vandtransport gennem biologiske membraner, nemlig vandtransport ved konvektion og vandtransport ved osmose KONVEKTIV VANDBEVÆGELSE De to ovennævnte typer af vandbevægelser demonstreres klarest ved at betragte vandbevægelsen gennem en membran med en helt ekstrem permeabilitet, nemlig den ideale semipermeable membran. Herved forstås en membran, der kun er gennemtrængelig for opløsningsmidlet - i det foreliggende tilfælde vand - men komplet impermeabel for samtlige opløste stoffer. Et eksempel herpå er en membran, der er bygget af celluloseacetat. Et eksempel på en måleopstilling til at undersøge vandbevægelserne gennem en semipermeabel membran er vist i Fig Fig Opstilling til illustration af vandtransport gennem en semipermeabel membran ved henholdsvis konvektion (filtration) og osmose. For yderligere forklaring se teksten. Den semipermeable membran er anbragt inde i et cylindrisk rør og omgivet på begge sider af et finmasket net, der medfører, at membranen nu kan bære en betydelig trykforskel, uden at den derved udbules og eventuelt sprænges. Den semipermeable membran adskiller de to kamre (1) og (2), hvis endevægge består af to stempler St (1) og St (2), som både er tætsluttende og samtidig så letglidende, at der kan ses bort fra gnidningsmodstanden ved bevægelsen mellem stempel og cylindervæg. Begge kamrene er fyldt med vand og indeholder ingen luftbobler. Stempel St (1) påvirkes nu med en kraft X (1) samtidig med, at stempel St (2) holdes fast. Herved tildeler stemplet væsken i kamrene et tryk P (1), som er lig med P (1) = X A (1) (1) hvor A (1) er arealet af St (1). Tilsvarende kan vi påvirke stempel St (2) med en kraft X (2), fastholde St (1) og derved etablere et tryk i kamrene, som er

110 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-27 P (2) = X A (2) (2) hvor A (2) er arealet af St (2). Trykket har dimensionen newton per m 2 (N m 2 ), som også betegnes med den specielle enhed Pascal (Pa). Den hyppigst anvendte trykenhed var tidligere 1 atmosfære (1 atm), som er lig med det tryk, der kræves til at bære en kviksølvsøjle med højden 760 mm. Denne søjle (med massefylde 13, kg m 3 ) udøver trykket: 0,76 m 13, kg m 3 9,81 m s 1 = 1, N m 2 (eller Pa) = 1 atm. Dvs. 1 atm er meget nær 100 kpa. Hvis P (1) > P (2) og ingen af stemplerne er fastlåste, vil vandmolekylerne presses gennem den porøse struktur i membranen, og trykforskellen vil således foranledige, at der foregår en nettotransport af vand fra kammer (1) til kammer (2). Forskydningen af fx stempel St (2) kan registreres ved hjælp af en passende anordning. Til en forskydning x vil der svare en volumenforøgelse i kammer (2), som er V (2) = xa (2). Er denne forskydning sket i tiden t, vil der til volumenforøgelsen svare en vandflux J v gennem den semipermeable membran med arealet A, som er J v V = A t (2) (1.48) I dette tilfælde er vandfluxen J v angivet i m 3 m 2 s 1 = m s 1, og den betegnes derfor også som volumenfluxen. Ønskes fluxen i stedet angivet i mol, må volumenfluxen, J v, divideres med vandets molære volumen V v, som er det volumen, der indeholder 1 mol H 2 O ved den pågældende temperatur, dvs. meget nær 18 dm 3 mol 1 ved stuetemperatur. Fig Illustration af sammenhængen mellem vandflux gennem en semipermeabel membran og den hydrostatiske trykforskel mellem membranens to sider. J v i retningen (1) (2) regnes som positiv. A. (1) og (2) indeholder begge kun vand. B. (1) indeholder en sukroseopløsning, (2) rent vand. Ved trykforskellen P(1) P(2) = Π er vandfluksen i retningen (2) (1) nul. Overtrykket Π betegnes som sukroseopløsningens osmotiske tryk Fig (kurve A), viser et eksempel på vandfluxens afhængighed af trykforskellen P (1) - P (2) = P mellem de to kamre. Modstanden mod vandbevægelsen antages at være langt større i membranen end i de to kamre således, at trykfaldet over den semipermeable membran kan betragtes som værende identisk med hele trykfaldet P. Det ses, at vandfluxen er proportional med trykforskellen over membranen. Dette kan skrives som v p (1) (2) ( ) J = L P P (1.49)

111 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-28 hvor koefficienten L P betegnes som membranens hydrauliske konduktans (m s -1 Pa -1 ). Det ovenstående simple udtryk for J v gælder kun inden for et vist trykområde P (i) - P (2), som afhænger af den semipermeable membrans specielle egenskaber. Overskrides dette trykområde, ophører koefficienten L P med at være en konstant størrelse. Men selvom L P nu varierer med størrelsen af J v, benytter man stadig lign. (1.49) som definition af den hydrauliske konduktans og til beregning af dennes størrelse ved den pågældende værdi af J v, idet man sætter L p = P J P v (1) (2) (1.50) hvor L P nu opfattes som en funktion af volumenfluxen J v af vandet gennem den semipermeable membran OSMOTISK VANDBEVÆGELSE Der findes imidlertid også en anden måde, at etablere en vandstrøm gennem den semipermeable membran. Vi erstatter den rene vandfase fx i kammer (1) med en opløsning af molekyler, der er så store i forhold til vandmolekylerne, at de ikke kan trænge gennem membranen, fx en sukroseopløsning. Holdes trykkene på samme værdi (P (1) = P (2) ), vil der foregå en spontan bevægelse af vand fra kammer (2), som kun indeholder det rene opløsningsmiddel, gennem den semipermeable membran ind i kammer (1). Herunder vil volumen af kammer (1) øges i takt med, at volumen af kammer (2) aftager, og overlades systemet til sig selv, vil slutresultatet blive, at volumen af kammer (2) er helt forsvundet, idet alt vandet, som oprindelig fandtes heri, har bevæget sig ind i kammer (1), som indeholder sukroseopløsningen. Ved en umiddelbar betragtning ser det ud som om, at der fra kammer (1), der indeholder de opløste molekyler, som ikke kan trænge gennem membranen, udøves et sug gennem den semipermeable membran på vandmolekylerne, der findes i den rene vandfase i kammer (2). Denne spontane bevægelse af vand fra en mere fortyndet opløsning ind i mere koncentreret opløsning, når disse er adskilt fra hinanden ved en semipermeabel membran, betegnes som osmose (R. Dutrochet, 1827, som udgik for det græske ord for "skubbe"), eller som en osmotisk vandbevægelse. Oprindelig anvendtes betegnelserne "endosmose" og "exosmose" for derved samtidig at specificere retningen af vandbevægelsen, men denne praksis er nu forladt Osmotisk tryk Ved hjælp af de to stempler påtrykkes nu en trykforskel (1) (2) P= P P over membranen og samtidig måles vandfluxen J v, idet man sørger for, at hver volumenforskydning V bliver så lille, at ændringen af sukrosekoncentrationen i kammer (1), som fremkaldes ved volumenændringen, forbliver ubetydelig. Det fremgår af Fig. 1.16, kurve B, at relationen mellem P og J v fortsat er retlinet og med samme hældning L P som kurve (A), men at kurve (B) i forhold til kurve (A), som går gennem (0,0) er parallelforskudt til højre og skærer trykaksen i punktet Π. Relationen mellem P og J v kan derfor skrives på formen (1) (2) ( ) ( ) J = L P P Π = L P Π (1.51) v p p

112 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-29 dvs. for alle trykforskelle P (1) - P (2) < Π vil der foregå en bevægelse af vand i retningen fra kammer (2) ind i kammer (1), der indeholder sukroseopløsningen, mens ved alle trykforskelle P (1) - P (2) > Π vil vandet drives fra sukroseopløsningen i kammer (1) ind i den rene vandfase i kammer (2). Skillelinien mellem disse to situationer svarer derfor til en nettoflux af vand gennem membranen, som er nul, når trykforskellen mellem sukroseopløsningen og den rene vandfase er lig med Π, eller J for P P (1) (2) v = 0 =Π (1.52) Dette karakteristiske tryk Π betegnes som det osmotiske tryk, og da dettes fremkomst skyldes tilstedeværelsen af opløsningen i det ene kammer betegnes trykket Π som opløsningens osmotiske tryk. Denne terminologi kan være en smule vildledende, fordi den kan lede til forestillingen om et tryk, som frembringes af opløsningen og derved frembringer den osmotiske vandbevægelse. Det er derfor vigtigt at huske, at et osmotisk tryk kan kun fremkomme, når en opløsning er bragt i kontakt med det rene opløsningsmiddel ved hjælp af en ideel semipermeabel membran, hvorved der fremkommer en osmotisk vandtransport ind i opløsningen fra den rene vandfase. Opløsningens osmotiske tryk er det overtryk, der skal lægges på opløsningen for at hindre, at der foregår en vandtransport ind i opløsningen ved osmose Kolligative egenskaber En opløsning har en række egenskaber, som for de såkaldte ideale opløsningers vedkommende ikke afhænger af de opløste molekylers specielle fysiske eller kemiske karakteristika, men afhænger udelukkende af antallet af tilstedeværende opløste molekyler set i forhold til opløsningens samlede antal molekyler, dvs. af molekylbrøken X for det opløste stof X No = N + N o v (1.53) hvor N o er antallet af opløste molekyler og N v antallet af vandmolekyler i opløsningen. Disse egenskaber betegnes derfor opløsningens kolligative egenskaber (colligare: at knytte sammen), der er fællesbetegnelsen for følgende egenskaber ved opløsningen, som sammenlignet med det rene opløsningsmiddel indebærer følgende: 1) en nedsættelse af damptrykket: 2) en forhøjelse af kogepunktet; 3) en nedsættelse af frysepunktet; 4) et osmotisk tryk. Da hver af de kolligative egenskabers størrelse kun afhænger af molekylbrøken X for det opløste stof, vil der også være en præcis, veldefineret relation mellem én kolligativ egenskab og de resterende andre tre. Det er muligt, fx ved anvendelse af en termodynamisk argumentation, at beregne relationen mellem den kolligative egenskab og molekylbrøken for det opløste stof. Omvendt kan man ved en måling af størrelsen af en kolligativ egenskab, fx frysepunktsdepressionen, beregne det opløste stofs molekylbrøk X Mekanismen bag den osmotiske vandbevægelse Den termodynamiske formulering af den osmotiske ligevægt og af beregningen af det osmotiske tryk og de størrelser, der indvirker herpå, har været fuldt gennemarbejdet i mange år, begyndende med den hollandske fysiske kemiker J. vant' Hoff i Derimod er detaljerne ved den kinetiske teori for vandbevægelsen ved osmose stadig meget ufuldstændig. I det følgende skal vi da også kun komme ind på de helt overordnede synspunkter ved osmosen. Osmose repræsenterer en strøm af vand gennem en semipermeabel membran fra et område med den høje vandkoncentration til det tilstødende område med den lave vandkoncentration. Heri afviger osmose ikke principielt fra en diffusionsproces, som er en strøm af de opløste partikler fra et område med en høj partikelkoncentration til det tilstødende område med den lave koncentration. Begge processer repræsenterer en spontan opblanding mod den ensartede stoffordeling over hele det tilgængelige rum, en proces hvis molekylære grundlag er Brown'ske be-

113 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-30 vægelser fremkaldt af den uophørlige termisk betingede pladsveksling, som alle systemets molekyler deltager i. En diffusionsproces i et frit ubegrænset medium afviger derimod fra osmose ved selv i det simpleste tilfælde at omfatte to samtidigt forløbende transportprocesser. Betragter vi fx en vandig opløsning af sukrose, så er molekylbrøkerne for sukrose, X s, og for vand, X v, givet ved X s N N s v = og Xv = Ns + Nv Ns + Nv hvoraf følger X s + X = 1 v som vil gælde overalt i opløsningen, uanset om sukrosekoncentrationen X s er konstant eller varierer i rummet. Gælder det sidste, har man fx i x-retningen, at dx dx s dx = dx v Til en given værdi af koncentrationsgradienten så stor men modsat rettet koncentrationsgradient dx s dx for det opløste stof svarer der således en lige dx v dx for vandet. Man skulle derfor forvente, at man altid, selv i det simpleste tilfælde som fx det, der er beskrevet i eksemplet afsnit 1.522, skulle operere med to diffusionsfluxer og dermed også med to diffusionsligninger, en for det opløste stof og en for opløsningsmidlet. Dette er imidlertid ikke nødvendigt, fordi ved den fri diffusionsproces er fluxen af det opløste stof J s og den modsat rettede flux af vandet, J v, underkastet den ekstra tvang, at processen foregår uden volumenændringer, dvs. at på ethvert sted i rummet flyttes hele tiden lige store volumina af opløst stof og af vand, men i hver sin retning. Af den grund er det tilstrækkeligt kun at betragte diffusionsfluxen af det opløste stof. Den ovennævnte situation med to lige store og modsat rettede volumenforskydninger af henholdsvis opløst stof og vand ses sjældent opfyldt, når to opløsninger med forskellige koncentrationer af opløst stof er adskilt ved en membran, med vidt forskellig gennemtrængelighed for vand og opløst stof. Er membranens vandpermeabilitet meget større end permeabiliteten for det opløste stof, vil den diffusionsbetingede strøm af vand ind i den mest koncentrerede opløsning være større end den diffusionsbetingede strøm af det opløste stof. Resultatet heraf er, at denne fase øger sit volumen forbigående. Den mest ekstreme situation vil man se, når membranen er ideal semipermeabel, dvs. kun gennemtrængelig for vand. Er trykkene ens på membranens to sider, vil vandtransporten gennem membranen have karakter af en diffusionsflux, hvis størrelse er bestemt af forskellen mellem de to opløsningers vandkoncentrationer og membranens permeabilitet for vand. Er koncentrationerne af vand ens på de to sider af membranen, sker der ingen nettobevægelse af vand gennem membranen ved diffusion. Påvirkes de to opløsninger med to forskellige hydrostatiske tryk, vil vand bevæges gennem membranen i trykfaldets retning. Etableres der nu en trykforskel på de to opløsninger med forskellige vandkoncentrationer, adderes den hydrauliske komponent ved vandbevægelsen til den diffusive komponent, dvs. forøge vandbevægelsen, når tryk- og koncentrationsfald har samme retning og modvirke vandbevægelsen ved diffusion, når tryk- og koncentrationsfald er modsat rettede. Svarende til en given forskel mellem vandkoncentrationerne vil der findes en ganske

114 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-31 bestemt trykforskel, der netop vil kompensere vandbevægelsen ved diffusion og resultere i en nettobevægelse af vand, som er nul. Denne trykforskel er lig med forskellen mellem de to opløsningers osmotiske tryk (sml. lign.(1.52)) Størrelsen af det osmotiske tryk (vant' Hoff's ligning) De første velgennemførte og systematiske undersøgelser over opløsningers osmotiske tryk blev gjort af den tyske plantefysiolog Wilhelm Pfeffer i Han arbejdede med membraner af kobberferrocyanid, som er gennemtrængelige for vand, men uigennemtrængelige for sukrose og fandt, at størrelsen af opløsningens "osmotiske tryk", som han kaldte ligevægtstrykket, var proportional med koncentrationen af sukrosen og med den absolutte temperatur. Pfeffers undersøgelser gav stødet både til de efterfølgende mere omfattende eksperimentelle undersøgelser over osmotisk tryk, og især til de termodynamiske betragtninger, som den hollandske fysiske kemiker J. vant' Hoff publicerede i 1885, og som bl.a. indeholdt det eksplicitte udtryk for den måde, hvorpå det osmotiske tryk afhænger af koncentration og temperatur. Dette udtryk er angivet som lign. (1.56). Den nedenstående udledning skal blot illustrere de tilnærmelser, som fører til vant' Hoff's udtryk, og som medfører, at det kun har gyldighed for ideale og fortyndede opløsninger. Størrelsen af det overtryk Π, der skal virke på en opløsning, der er i kontakt med det rene opløsningsmiddel (vand) gennem en semipermeabel membran for at hindre, at vandmolekylerne bevæger sig ind i opløsningen (osmotisk sug), kan vises at være givet ved følgende relation RT RT Π= ln Xv = ln ( 1 Xo) (1.54) V V v v hvor R er gaskonstanten, T temperaturen i Kelvin grader og Vv er middelværdien af det molære volumen af det rene vand mellem trykkene 0 og Π. X v er vandets molekylbrøk i opløsningen og X o =1-X v er det opløste stofs molekylbrøk. Nu har man ln(1 ± Y) = ± Y, hvis Y << 1. Drejer det sig om en fortyndet opløsning, er X o << 1. For denne opløsning gælder derfor med tilnærmelse Π= RT V v ln X o Dette udtryk kan simplificeres yderligere, fordi opløsningen er fortyndet, idet man da kan sætte: X o = n o (n o + n v ) n o n v, hvor n o og n v er antallet af grammolekyler af henholdsvis opløst stof og vandet i opløsningen. Indsættes det tilnærmede udtryk for X o i den ovenstående ligning, fås RT Π= n V v v n Endvidere vil n v V v ikke afvige væsentligt fra opløsningens samlede volumen V. Sættes derfor n v V v = V, fås o n RT V o Π= = RT Co (1.55) idet C o = n o V 1 er den molære volumenkoncentration af det opløste stof. For den fortyndede ideale opløsning gælder således, at størrelsen af det osmotiske tryk er givet ved relationen

115 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-32 Π= RTC (1.56) hvor C er koncentrationen af det opløste stof i mol m 3. Denne ligning udledtes først af J. vant' Hoff i 1885, og kaldes derfor vant' Hoff's ligning. Det ses af lign. (1.56), at en osmotisk vandbevægelse er i stand til at modstå ganske betydelige tryk. Er koncentrationen af sukrose 1 molær, (1 mol dm 3 = 1000 mol m 3 ), er dens osmotiske tryk ved stuetemperatur (25 C = 273, = 298,15 K): Π = 8,314 joule mol 1 K 1 298,15 K 1000 mol m 3 = N m 2 = 2, Pa = 2, Pa (1, Pa atm 1 ) 1 = 27,4 atm. Ved 0 C er dette tryk meget nær ved 22,4 atm. Hvis kammer (1) indeholder en opløsning af en række nonelektrolytter med koncentrationerne C 1, C 2, C 3,... C n bliver opløsningens osmotiske tryk i stedet Π= RT C n (1.57) i overensstemmelse med det ovenfor anførte forhold, at opløsningens osmotiske tryk er en kolligativ egenskab ved opløsningen, dvs. Π afhænger kun af antallet af de opløste molekyler og ikke af disses specielle egenskaber. Det følger også heraf, at en elektrolytopløsning med den molære koncentration C, hvor hvert molekyle i opløsningen er dissocieret i k + kationer og k anioner, vil have et osmotisk tryk, som er ( ) Π= RT k + k C (1.58) + En NaCl-opløsning vil således have det dobbelte osmotiske tryk som en sukroseopløsning med samme koncentration. Indeholder begge kamre i Fig opløsninger, med osmotiske tryk Π (1) og Π (2), så er sammenhængen mellem volumenfluxen og de to tryk P (1) og P (2), der virker på de to stempler, givet ved ( ) Jv = L p P P Π Π (1) (2) (1) (2) hvoraf følger, at det overtryk, der skal virke på opløsningen i kammer (1) for at hindre en vandtransport gennem membranen, er (1) (2) (1) (2) P P for J v =Π Π = Osmotisk koefficient Vant' Hoff's udtryk, lign. (1.56), og de deraf afledte udtryk gælder kun for ideale opløsninger, som er fortyndede. I en ideal opløsning har de indbyrdes virkende kræfter mellem de enkelte vandmolekyler samme størrelse som kræfterne, der virker mellem vandmolekylerne og de opløste molekyler. Forskellene mellem det rene vands egenskaber og den ideale opløsning ligger kun i, at i opløsningen er antallet af vandmolekyler per volumenenhed mindre end i det rene vand. Jo mere koncentreret opløsningen er, dvs. i praksis for C > 0,2 mol dm -3 for en nonelektrolyt, jo større bliver afvigelserne fra lign. (1.56). Drejer det sig om en opløsning af elektrolytter, optræder afvigelserne fra vant' Hoff's ligning allerede ved meget større fortyndinger. For at opretholde formen af vant' Hoff's ligning, også når der optræder betydelige afvigelser fra idealitet, indførte

116 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-33 den danske fysiske kemiker N. Bjerrum i 1909 en faktor g, den osmotiske koefficient, hvorved den aktuelle koncentration korrigeres således, at udtrykket for vant' Hoff's ligning formelt opretholdes. Den osmotiske koefficient er defineret ved Π= grtc (1.59) og bestemmes eksperimentelt ved at måle Π ved en række koncentrationer af det pågældende stof. Et eksempel på sådanne bestemmelser er vist i Tabel 1.2. Tabel 1.2 Værdier af osmotiske koefficienter for nogle opløsninger (0,15 M) ved 25 C Opløsning K 2 SO 4 NaCl Na 2 SO 4 KCl Sukrose g 0,76 0,93 0,77 0,92 1, FRYSEPUNKTSDEPRESSIONEN Alle opløsninger viser sig at have et lavere frysepunkt end det rene opløsningsmiddel. Som anført tidligere hører denne nedsættelse af opløsningens frysepunkt, frysepunktsdepressionen, ligesom det osmotiske tryk til opløsningens kolligative egenskaber. Frysepunktsdepressionen T for opløsningen er defineret ved T = T T v o hvor T v er frysepunktet for det rene opløsningsmiddel (vand) og T o (< T v ) er frysepunktet for opløsningen. En ideal opløsning af en nonelektrolyt med koncentrationen 1 mol dm 3 (dvs. C = 1 molær) viser sig at have en frysepunktsdepression, T f, som er 1,858 K, for 1 M ideal nonelektrolytopløsning. Denne opløsning har ifølge vant' Hoff's ligning et osmotisk tryk på 2, Pa (22,4 atm) ved 0 C Frysepunktsdepression og osmotisk tryk Som allerede anført er de fire kolligative egenskabers størrelser indbyrdes proportionale. En opløsning med en frysepunktsdepression T f ville derfor vise sig at have et osmotisk tryk af størrelsen T Π= i 22, 4 atm. 1,85 ved 0 C, såfremt opløsningen udviste ideal opførsel. Målinger af opløsningers frysepunktsdepression erstatter meget ofte den direkte måling af opløsningens osmotiske tryk, fordi dels er bestemmelsen af opløsningens frysepunkt lettere at udføre eksperimentelt, og dels er det muligt at måle frysepunktsdepressioner på selv meget små væskevolumina, hvor en direkte trykbestemmelse er teknisk uigennemførlig. Det osmotiske tryk - og de øvrige kolligative egenskaber - er udtryk for, at tilsætningen af de opløste molekyler medfører en ændring af vandets egenskaber i opløsningen set i forhold til det rene vands egenskaber. I første række er de ændringer, der frembringes, kun bestemt af antallet af opløste molekyler per volumenenhed. For en opløsning af uladede partikler er dette antal lig med opløsningens molære koncentration multipliceret med Avogadro's tal N A (6, molekyler per mol stof). For en elektrolytopløsning skal dette tal endvidere multipliceres med antallet

117 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side 1-34 n= k+ + k af partikler, som saltmolekylet dissocierer i, idet k + er antallet af kationer og k antallet af anioner, der indgår i saltmolekylet. Fortyndede opløsninger af NaCl og Na 2 SO 4 vil have osmotiske tryk, der er henholdsvis det dobbelt og tredobbelte af trykket i en sukroseopløsning med samme molære koncentration (sml. lign. (1.58)). I anden række kommer dernæst de forskellige faktorer, høj koncentration, de opløste molekylers form, elektrostatisk virkende kræfter mellem ioner i opløsningen og de enkelte vandmolekyler, etc., som er sammenfattede i den osmotiske koefficients størrelse (sml. lign. (1.59) ). En 0,15 M opløsning af Na 2 SO 4 vil således ifølge Tabel 1.2 have et osmotisk tryk, som er identisk med det, osmotisk tryk i en ideal opløsning af uladede partikler, med koncentrationen C = 0,77 3 0,15 = 0,3465 M, og begge opløsninger vil ved 25 C have et osmotisk tryk: Π = 0, ,4 = 9,494 atm = 9,494 1, = 9, = 961,8 kpa. To opløsninger med samme molære koncentration kan således have vidt forskellige osmotiske tryk, ligesom to opløsninger med samme osmotiske tryk kan afvige stærkt, hvad angår opløsningernes molære koncentrationer. Endelig kan to opløsninger også have forskellige osmotiske tryk, selvom de indeholder samme antal opløste partikler per volumenenhed. Denne situation vil fremkomme, såfremt de to opløsningers afvigelser fra idealitet er forskellige, dvs. hvis de indbyrdes tiltrækningskræfter mellem vandmolekylerne og de opløste molekyler er forskellige i de to opløsninger Osmolaritet Når to opløsninger adskilles af en semipermeabel membran, så er det forskellen mellem de to opløsningers osmotiske tryk (eller med andre ord forskellen mellem opløsningernes vandaktivitet), der er bestemmende for retningen og intensiteten af vandbevægelsen gennem membranen. I alle levende biologiske celler sker vandtransport mellem cellens indre og dens omgivende væske ved osmose. Da cellemembranerne er eftergivelige og elastiske, er det væsentligt at kunne vurdere størrelsen af de osmotiske tryk inden i og uden for cellen. De biologiske opløsninger, blodplasma, ekstra- og intracellulær væske, etc. indeholder mange forskellige stoffer og i meget varierende koncentrationer. En vurdering af de osmotiske tryks størrelse ud fra de enkelte stoffers koncentrationer deres osmotiske koefficienter under de pågældende omstændigheder er en meget ubekvem procedure. I biologien har det derfor vist sig formålstjenligt at indføre et nyt mål for koncentrationen, som er et præcist mål for disse partiklers evne (deres osmotiske effektivitet) til at ændre aktiviteten af vandet i opløsningen, og som samtidig afspejler antallet af fri partikler i opløsningen uden hensyntagen til deres specielle egenart. Koncentrationsmålet kaldes for opløsningens osmolaritet. En 1 osmolær opløsning (indeholdende 1 osmol per liter) har ved 0 C et osmotisk tryk på 22,4 atm og udviser en frysepunktsdepression på 1,858 C. Er opløsningen ideal, indeholder 1 osmol per dm 3 6, opløste partikler. En ikke-ideal opløsning af et enkelt salt med den molære koncentration C og osmotisk koefficient g vil have en osmolaritet, som er osmolaritet = g nc hvor n er antallet af partikler, som molekylet kan dissociere i. Således vil en 0,15 M opløsning af NaCl indeholde 0,93 2 0,15 = 0,279 osmol dm 3 eller 279 milliosmol dm 3. Det normale humane blodplasma har en frysepunktsdepression T plasma på 0,52-0,54 C. Plasmaets osmolære koncentration er derfor: 0,53 1,86 1 = 0,285 osmol dm -3, eller som oftest udtrykt i daglig fysiologisk og klinisk sprog: 285 milliosmol per liter.

118 Noter til stoftransport. Kapitel 1: Migration og diffusion Side Reflektionskoefficienten Hidtil har vi kun behandlet den osmotiske vandbevægelse gennem en ideal semipermeabel membran, dvs. en membran der ikke tillader passage af de opløste stoffer i vandfasen. I praksis møder man imidlertid mange membraner, bl.a. biologiske membraner, der i vekslende grad også er gennemtrængelige for de opløste stoffer. Til at stoppe en osmotisk vandbevægelse gennem en sådan membran skal der påtrykkes fasen med opløsningen et hydrostatisk overtryk, som er mindre end det osmotiske tryk, der skulle etableres, hvis membranen havde været ideal semipermeabel. Hvis membranen havde været permeabel i lige grad for vand og opløst stof, så ville der (jvf ) kun foregå en diffusion af stoffer mellem de to faser, uden at dette var ledsaget af nogen nettobevægelse af vand gennem membranen. Eksperimentelt ville man derfor observere, at opløsningens osmotiske tryk var nul. Dette repræsenterer det ene yderpunkt af det osmotisk tryk, hvor det andet tryk, Π ideal, svarer til den ideale semipermeable membran. Imellem disse ligger trykket Π eff 0 Πeff Π ideal hvor Π eff vokser mod Π ideal i takt med, at membranens permeabilitet for det opløste stof aftager. I 1951 viste den hollandske fysiske kemiker Staverman, at en ikke-ideal permeabel membran kunne karakteriseres ved en enkelt parameter, som han kaldte membranens reflektionskoefficient. Argumentationen var følgende. Vi betragter en opstilling som vist i Fig. 1.15, men hvor membranen ikke er ideal semipermeabel. Lad fase (1) indeholde en opløsning med koncentrationen C (1). Vi påtrykker ved hjælp af stemplerne de to faser (1) og (2) en trykforskel P = P (1) - P (2) Π ideal, hvor fase (2) initialt kun indeholder rent vand. Herved vil et filtrat, dvs. vand + opløst stof, presses gennem membranen ind i fase (2). Koncentrationen af opløst stof i filtratet, C f, vil afhænge af den lethed, hvormed det opløste stof trænger gennem membranen. Er C f = C (1) har vi den situation, hvor vand og opløst stof er lige gennemtrængelige. Er C f = 0, har vi at gøre med en ideal semipermeabel membran. Som mål for den relative lethed hvormed vand og opløst komponent j samtidig passerer membranen ved filtration, indførte Staverman følgende parameter C f σ j = 1 (1.60) C (1) j hvor σ j kaldes reflektionskoefficienten for molekylet af type j. Det ses, at lign. (1.60) er et mål for, hvor godt den pågældende membran fungerer som en "molekylær si". Er σ j = 0, vil membranen ikke skelne mellem vand og molekyler i opløsningen. Er σ j = 1,0, er membranen totalt impermeabel for det pågældende stof. Staverman viste endvidere, at det overtryk, der skulle lægges på opløsningen med koncentrationen C (i) for at stoppe vandbevægelsen gennem membranen med reflektionskoefficienten σ j var givet ved følgende modifikation af vant' Hoff's ligning (1) Π eff = σ j RT C (1.61) hvor Π eff betegnes som det effektive osmotiske tryk af opløsningen af stoffet j. Det skal understreges, at Π eff afspejler den pågældende opløsnings osmotiske "adfærd" over for en ganske bestemt ikke-ideal semipermeabel membran. Π eff er en bekvem størrelse til at skønne over størrelsen af de osmotiske vandbevægelser gennem membranen, idet vandfluxen nu kan skrives som (1) ( ) ( σ ) J = L P Π = L P RTC (1.62) v p eff p j Men forudsat at opløsningen udviser ideal opførsel, vil den fortsat have et osmotisk tryk, Π, som er og en molær frysepunktsdepression på 1,858 K. Reflektionskoefficienten kan bestemmes som σ j Πeff = (1.63) Π ideal ved dels at bestemme Π eff ved en osmotisk trykmåling og dels Π ideal ved måling af den samme opløsnings frysepunktsdepression.

119 Note 4 til biofysik: Opklarende note om transport Side 1 NOTE 4 TIL BIOFYSIK OPKLARENDE NOTE OM TRANSPORT Nomenklatur Transportprocesser deles op i Passive transport Simpel diffusion. Det transporterede stof diffunderer gennem membranen uden at lave kemiske bindinger undervejs. Processen drives af den fiktive diffusionskraft som følge af en koncentrationsgradient over membranen. Følger Fick s lov, jvf. figurerne A og B. Faciliteteret diffusion. Den passive transport af stoffet fremmes gennem tilstedeværelse af transportmekanismer, integrale proteiner, i membranen, som specifikt interagerer med stoffet under transporten. Principelt kan stoffet transporteres ad to veje: 1) gennem lipidfasen ved simpel diffusion og 2) gennem det specifikke transportprotein, der faciliterer, fremmer, transporten. Bidraget fra 1) til den totale fluks er oftest beskeden (jvf. kurve 1 i figur C), nogle gange negliabel. Kinetisk kan den faciliterede transportproces sædvanligvis beskrives (empirisk) ved hjælp af Michaelis-Menten kinetik (se nedenfor). Betegnes ofte i litteraturen for carrier-medieret, en uheldig betegnelse, da den antyder en transportmekanisme, som ikke findes naturligt i biologiske membraner. Al passiv transport, der ikke foregår ved simpel diffusion, kan klassificeres som faciliteret (d.v.s. transport fx gennem kanaler og via udvekslingsmekanismer). Aktiv transport Defineres som transport af et stof imod dets kemiske og/eller elektriske gradient under forbrug af energi (primært ATP) fra cellens stofskifte. Denne transport betegnes også som primær aktiv transport. "Sekundær aktiv transport bruges desværre ofte i litteraturen i forbindelse med den koblede transport af aminosyrer eller glukose (hexoser) med natrium, fx i tarmceller. Den høje koncentration af natrium i tarmlumen og den lave intracellulære natriumkoncentration medfører en passiv influx af natrium gennem nogle proteiner, som samtidig kobler transport af glukose fra lumen ind i cellerne med natriumtransporten. Da koncentrationen af glukose er lavere i lumen end intracellulært, betød det, at man oprindeligt antog, at denne glukosetransport var aktiv, jvf. definitionen ovenfor. Et eksempel på en fejlfortolkning, når man kun kender halvdelen af sandheden. Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

120 Note 4 til biofysik: Opklarende note om transport Side 2 Simpel diffusion (Ficks lov): α C (1) (2) 2 1 J = D = P C = P ( C - C ) mol m s x Faciliteret diffusion (Michaelis-Menten lignende kinetik): max C 2 1 J = J = Papp C mol m s K 1/2 +C Hvor P app er den apparente (tilsyneladende) permeabilitet. Den betegnes som tilsyneladende, da den er koncentrationsafhængig, jvf. ovenstående figur. Med kompetitiv hæmmer haves: J = K J max C I 1/2 (1+ K I C = P )+ C app, I C mol m Sammenligning mellem simpel og faciliteret diffusion Simpel diffusion Faciliteret diffusion Fluks vs. C Lineær Mætning P=J/C vs. C Konstant Aftager Hæmning Nej Kompetitivt (stofanaloger) Nej Nonkompetitivt Nej Reversibelt/irreversibelt Transportprotein Nej Ja Temperaturafhængighed Oftest kj/mol Oftest kj/mol Opdeling af nogle transportprocesser efter type i erythrocytter Passiv transport Aktiv transport Simpel diffusion Carbondioxid Oxygen Steroide hormoner Alifatiske alkoholer Vand Faciliteret diffusion Uorganiske an- & kationer Organiske ioner Aminosyrer, Nucleosider Hexoser, Glycerol, Urinstof 2 s 1 Kalium Natrium Kalcium (Hydrogen i visse andre celler) Medicinsk Fysiologisk Institut, 20. april 2001

121 BIOFYSIKØVELSE 1 SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER (anion- og kationbyttermembran og blodlegememembran) 1. INTRODUKTION Litteratur MÅLING PÅ SIMPLE ELEKTRISKE KREDSLØB Ohms lov Målinger Serieforbindelse Målinger Parallelforbindelse Målinger Kirschoff s love Målinger REGISTRERINGSAPPARATUR FOR MEMBRANMÅLINGER ELEKTRISKE MÅLINGER PÅ ANIONBYTTERMEMBRANEN Forsøgsopstilling Måling af ligevægtspotential over anionbyttermembranen Forsøgsgang ELEKTRISKE MÅLINGER PÅ KATIONBYTTERMEMBRANEN Forsøgsopstilling Måling af ligevægtspotential over kationbyttermembranen Forsøgsgang Måling af diffusionspotential over kationbyttermembranen Måling af membranens elektriske modstand Målinger Afslutning KLORID- OG BRINTIONLIGEVÆGT OVER ERYTHROCYTMEMBRANEN Forsøgsopstilling (Fig. 9.) Kalibrering Justering af ph-målesystemet med buffere med kendt ph til at vise korrekte phværdier Kontrol af sølv/sølvklorid-elektroden Blodlegemeforsøg Måleresultater Afslutning RAPPORTVEJLEDNING Måling af ligevægtspotential over anionbyttermembran Måling af ligevægtspotential over kationbyttermembran Måling af diffusionspotential over kationbyttermembran Kationbyttermembranens elektriske modstand Klorid- og brintionligevægt over erythrocytmembranen Medicinsk Fysiologisk Institut Københavns Universitet Marts 2002

122 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 2 1. INTRODUKTION Øvelsen indledes med nogle målinger på simple elektriske kredsløb for at genopfriske studentens viden om grundlæggende elektriske principper. Formålet med den biologiske del af øvelsen er at illustrere en membrans evne til at skelne 1) mellem negativt og positivt ladede ioner og 2) mellem forskellige iontyper med samme ladning, to egenskaber, som bevirker, at der kan etableres en potentialforskel over en membran. Disse to former for selektivitet og membranmodstand belyses i forsøg med en kunstig ionbyttermembran, hvor forsøgsbetingelserne kan forenkles i langt højere grad end med biologiske membraner. Til illustration af en biologisk membrans ionselektive egenskaber udføres forsøg med blodlegemer, som er væsentlig lettere gennemtrængelige (permeable) for monovalente anioner end monovalente kationer. 1.1 Litteratur Det anbefales, at man læser de afsnit i lærebogen og noterne ( som omhandler elektricitetslære, membranpotentialer, herunder diffusionspotentialet og den levende celles membranpotential, samt membranens konduktans for ioner. 2. MÅLING PÅ SIMPLE ELEKTRISKE KREDSLØB Denne del af øvelsen har til formål at repetere elementære regler for jævnstrømskredsløb før anden del, hvor der udføres målinger på ionselektive membraner. I øvelsen anvendes nedenstående hjælpemidler/komponenter/apparatur: Fig. 1. Diagram af kredsløb Øverst er disse forsøgt tegnet naturtro, og nedenunder som de symboler, der anvendes i praksis og senere i teksten. Målepladen er en isolerende plastikplade med batteriholdere og klemskruer, hvorpå det elektriske kredsløb monteres. Batterierne er almindelige små 1,5 Volt s batterier. Måleledningerne anvendes til at etablere manglende forbindelser på målepladen og til måleinstrument. Måleinstrumentet er et såkaldt universalinstrument, der kan bruges både som volt-meter til spændingsmålinger, som ampere-meter til strømmålinger og som ohm-meter til modstandsmålinger. Som voltmeter forbindes instrumentet mellem de punkter, hvis spændingsfor- Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

123 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 3 skel ønskes målt. Når instrumentet anvendes som amperemeter til strømmåling, skal det forbindes til kredsløbet således, at den strøm, som ønskes målt, sendes gennem instrumentet. Modstandene (resistanserne), der i øvelsen anvendes i forskellige modstandskredsløb, er, for at lette opbygningen af kredsløbene, monteret på hver sin lille printplade Ohms lov Ohms lov udtrykker proportionalitet mellem spændingsfald over, og strøm gennem en lineær leder (modstand): U R = R I R hvor U R (volt) er spændingsfaldet over modstanden, og I R (ampere) strømmen gennem modstanden, som er karakteriseret ved modstandsværdien, R (ohm). Ordet modstand bruges på dansk både om komponenten og om modstandsværdien, på engelsk hedder dette resistor og resistans. Om spænding bruges udtrykket potential. Fig. 2. Diagram over kredsløb. Indsæt et af batterierne i venstre batteriholder, og monter een af de tre modstande mellem de øverste klem-skruer. Isæt to måleledninger, altså også den punkterede, så kredsløbet er sluttet. Vedtag en positiv omløbsretning, fx med uret Målinger Anvend først instrumentet som voltmeter (V) og mål batterispændingen U B. Mål derefter spændingsfaldet, U R (noter fortegnet) over modstanden, som er det eneste spændingsfald i denne kreds. Med instrumentet som amperemeter (A), måles strømmen I i kredsen ved at erstatte den punkterede måleledning med amperemeteret og således sende strømmen gennem instrumentet. Anvend til sidst instrumentet til modstands-måling (Ohm-meter) og mål modstandsværdien R direkte (forbindelser til modstanden fjernes, så der kun måles på modstanden). Målingerne gentages for de to andre modstande og resultaterne indføres i skemaet. Beregn modstandsværdierne vha. ohm s lov og sammenlign med de direkte målte værdier. U B U R I R (beregn) R(målt) R-nr. V (volt) V (volt) A (ampere) Ω (ohm) Ω (ohm) Serieforbindelse Strømmen rundt i kredsen I må være den samme overalt i en serieforbindelse. I flg. Ohms lov er spændingsfaldene da proportionale med modstandene, og spændingsfaldenes sum må være batterispændingen (se senere om Kirschoff s love): Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

124 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 4 U B = U R1 + U R2 = R 1 I + R 2 I = (R 1 + R 2 ) I = R s I, hvor R s = R 1 + R 2 Erstatningsmodstanden for serieforbundne modstande, R s, er altså lig summen af de enkelte modstande, R 1 + R 2 +. Fig. 3. Diagram af kredsløb. Indsæt batteri, og de to modstande. Isæt to måleledninger, så kredsløbet er sluttet Målinger Mål batterispændingen. Mål spændingsfaldene over hver af de to modstande (noter fortegn). Mål strømmen i kredsen (fx i den punkterede ledning, som da må fjernes for at tvinge strømmen gennem instrumentet). Beregn summen af spændingsfaldene og sammenlign med batterispændingen. Beregn strømmen (benyt de tidligere fundne modstandsværdier). U B U R1 U R2 U R1 + U R2 I (målt) I (beregn) V (Volt) V (Volt) V (Volt) V (Volt) A (ampere) A (ampere) 2.3. Parallelforbindelse I en parallelforbindelse af modstande er den samlede strøm i kredsen I delt mellem modstandene, medens spændingsfaldet over dem er det samme (her lig batterispændingen U B ). UB UB 1 1 UB I=I R +I 1 R = + =U 2 B + = R1 R 2 R1 R 2 Rp hvor 1 = R R R p 1 2 Den reciprokke værdi af erstatningsmodstanden R p for en parallelforbindelse kan altså beregnes som summen af de reciprokke værdier af de parallelle modstande. Anvendes begrebet ledningsevne (konduktans) G ( G= 1 ) i stedet for modstand (resi- R stans) R, fås det simple udtryk: G p = G 1 + G 2, der med ord udtrykker, at konduktansen af en parallelforbindelse er lig summen af de parallelle konduktanser. Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

125 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 5 Fig. 4. Diagram af kredsløb. Indsæt batteri, modstande og måleledninger, så de danner det viste kredsløb Målinger Mål batterispænding U B og spændingsfald U R over de parallelle modstande. Mål sum-strømmen I(sum) i måleledningen længst til højre. Mål strømmen I(R 1 ) gennem R 1 alene i den anden måleledning til højre. Mål strømmen I(R 2 ) gennem R 2 alene i den venstre måleledning. Sammenlign den målte sum-strøm med summen af de målte delstrømme I(R 1 ) og I(R 2 ). Bemærk i hvilken modstand den største strøm løber. Beregn erstatningsmodstanden R p af de kendte værdier for modstandene. Beregn sum-strømmen af batterispænding og den beregnede erstatningsmodstand R p og sammenlign med den målte. U B U R I (sum) I (R 1 ) I (R 2 ) R p (beregn) I (sum) (beregn) V (volt) V (volt) A (ampere) A (ampere) A (ampere) Ω(ohm) A (ampere) 2.4. Kirschoff s love Ud fra fundamentale fysiske principper kan det indses, at summen af strømme til et knudepunkt, regnet med fortegn, er nul (der løber lige så meget til som fra et knudepunkt). Dette udtrykker en af Kirschoff s love. Det kan ligeledes indses, summen af spændinger (og spændingsfald) rundt i en lukket kreds, og regnet med fortegn, er nul. Dette udtrykker den anden af Kirschoff s love, som nærværende simple forsøg omhandler. Fig. 5. Diagram af kredsløb. Indsæt batterier, modstand og måleledninger som vist. Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

126 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side Målinger Vedtag en positiv omløbsretning, fx med uret Mål batterispændinger og spændingsfald over modstanden samt strømmen i kredsen, alle med fortegn. Mål samme størrelser med det ene batteri vendt. Beregn summen af batterispændingerne U(sum) (husk fortegn) og sammenlign med spændingsfald over modstanden U R. Beregn strømmen I (beregn) udfra U(sum) og modstandsværdien og sammenlign med den målte strøm. (1) U B1 U B2 U R I U (sum) I (beregn) V (volt) V (volt) V (volt) A (ampere) V (volt) A (ampere) (2) 3. REGISTRERINGSAPPARATUR FOR MEMBRANMÅLINGER Registreringsapparaturet udgøres af: Computer, en IBM compatibel type, hvori er indbygget en speciel enhed for datakonvertering og ekstern kontrol. Med det aktuelle program viser skærmbilledet enten et Menu -billede eller (efter valg her) princippet for forsøgsopstilling, de aktuelle forsøgsparametre og måleværdier. Kontrolenheden, som er indbygget i computeren, rummer elektronik til styring af en ekstern enhed, til datakonvertering og til dataudveksling med computer. Via et kabel forbindes kontrolenheden til den eksterne enhed. Den eksterne enhed, tilslutningskassen, indeholder yderligere nødvendig elektronik samt bøsninger for tilslutning af de anvendte elektroder. Fig. 6. Diagram af tilslutningskasse. Omskifteren Select skifter mellem tilslutningsbøsningerne: "Select=1": når forreste række bøsninger skal anvendes, "Select=2": når bagerste række bøsninger skal anvendes. Omskifter Current skal kun være on i forsøg 5.4., hvor bøsningerne Current anvendes, ellers skal denne omskifter være off. Styreprogram. Computeren styres af et program, specielt udviklet til øvelsen. Herigennem kontrollerer computeren de tilsluttede enheder på en måde, der er fundet hensigtsmæssig for de enkelte måleopstillinger og forsøg. Programmet er opbygget af dels en programdel for hvert forsøg og dels af et Menu -program, hvor det aktuelle valg foretages. Der er tre Menu -programmer, et for hvert af de tre dele af øvelsen, og skærmbilledet for hvert af disse er vist nedenfor under de respektive dele af øvelsen. Som det vil fremgå af skærmbillederne kan der, under afvikling af de enkelte programdele, anvendes følgende kommandoer fra tastaturet: Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

127 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 7 STORE (S) De aktuelle måleværdier gemmes og vises på skærmen ERASE (E) eller REPEAT (R) Den sidst målte værdi slettes ADJUST (A) Aktiverer/deaktiverer en justeringsfacilitet, hvor vandrette piltaster vælger emnet og lodrette piltaster ændrer justeringen. Esc/MENU Skifter til Menu -programmet efter afslutning af udskriftskemaet PRINT (P) De aktuelle måleværdier udskrives Visse specielle kommandoer er illustreret på skærmbilledet ved de enkelte forsøg. Ved afslutningen af hver menu trykkes escape og man vil blive spurgt, om man vil udskrive resultaterne. Normalt svares her ja og resultaterne udskrives. Det vil ikke være nødvendigt at foretage andre udskrifter i løbet af forsøget. 4. ELEKTRISKE MÅLINGER PÅ ANIONBYTTERMEMBRANEN 4.1. Forsøgsopstilling Fig. 7. Figuren viser forsøgsopstillingen, som består af to målekamre mærket V (venstre) og H (højre), der kan adskilles af en membran. Kamrene fyldes under forsøgene med elektrolytopløsninger af kendt sammensætning. Kalomelelektroderne, som registrerer membranpotentialet, er sat ned i små bægre med mættet KCl på bagsiden af opstillingen og er i elektrisk forbindelse med kamrene gennem elektrolytbroerne med 3 M KCl i agar ( agarbroer ). Agarbroernes spidser sidder 1-3 mm fra membranen (se Fig. 8.). Ag/AgCl-elektroderne er ikke monteret i denne øvelse. Fig. 8. Skematisk snit gennem målekammeret ( Ussing-kammer ). Ved forsøget anvendes en kunstig anionbyttermembran. Membranen er opspændt i en rød ring af PVC. Membranen er opbygget af polyethylen, der indeholder porer med fikserede, Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

128 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 8 kvaternære ammoniumgrupper ( NH 3 + ). Koncentrationen af disse fastsiddende, positive grupper (og deres bevægelige, negative mod-ioner som fx klorid) er høj, ca. 2 M, inde i membranen og danner dermed en effektiv barriere mod kationer, som forsøger at trænge igennem. I denne del af øvelsen undersøges det, om membranen kan karakteriseres som ideel selektiv således, at der skabes et ligevægtspotential over membranen, når elektrolytkoncentrationen varieres på den ene side og fastholdes på den anden side af membranen. Vælg Membranpotentialer i Menu -programmet og forbind kalomelelektrodernes kabelstik til tilslutningskassens forreste række bøsninger ( Select =1) som illustreret på skærmen. Tilstrækkelig effektiv omrøring i systemet opnås ved moderat luftgennembobling, som får væsken til at cirkulere. Det antages, at Voltmetrene er justeret forud for øvelsen, men inden målingerne påbegyndes kontrolleres det, om spændingsforskellen mellem kalomelelektroderne er 0 mv, når elektroderne anbringes i samme bægerglas med 150 mm KCl. Er spændingsforskellen >3 mv, tilkaldes instruktøren, mens mindre afvigelser bortjusteres vha. Adjust -funktionen (A). (Se afsnit 1.3. Styreprogrammet.) 4.2. Måling af ligevægtspotential over anionbyttermembranen Anionbyttermembranen er selektiv permeabel for anioner, det vil sige, at anioner kan permeere membranen, mens kationer ikke kan trænge igennem. Potentialforskellen over membranen, målt som (ψ (V) ψ (H) ), vil være positiv, såfremt koncentrationen af anioner er højere i kammer (V) end i kammer (H). Membranpotentialet måles med forskellige elektrolytopløsninger i kamrene som vist i nedenstående tabel. Kammer (V) Kammer (H) KCl (mm) KCl (mm) logc (H) , , , , , Forsøgsgang Forud for målingen med 15 mm KCl i kammer (H) skal der skylles 2-3 gange med denne opløsning. Ved de efterfølgende målinger, hvor koncentrationen er stigende, er det nok at skylle 1 gang med den respektive elektrolytopløsninger før hver måling. Det er ikke nødvendigt at skylle kammer (V), idet koncentrationen her på 150 mm ikke ændres i dette forsøg. Efter skylningen fyldes kammer (H) med den pågældende opløsning, og måleværdien gemmes ved et tryk på S (Store). En måling kan laves om ved et tryk på R (Repeat) efterfulgt at en ny Store. Oplysningerne om de anvendte opløsninger på udskriften er baseret på rækkefølgen som vist på skærmen. Sammenhold derfor teksten på skærmbilledet med de faktisk anvendte opløsninger. Efter hver måling tømmes kamrene ved åbning af drejeventilerne under kamrene. Når karret neden under med spildopløsninger er fyldt tømmes det i vasken. Efter sidste måling med 150 mm KCl i begge kamre tømmes kamrene kamrene adskilles membranen tages ud og lægges i æsken med 150 mm KCl den kationselektive membran (mørkere og i sort PVC-ring) isættes mellem kamrene, som samles igen og fyldes med 150 mm KCl Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

129 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 9 5. ELEKTRISKE MÅLINGER PÅ KATIONBYTTERMEMBRANEN Ved de efterfølgende forsøg anvendes en kunstig kationbyttermembran. I membranens porer er der en høj, ca. 2 M, koncentration af fastsiddende negative ladninger i form af sulfonsyregrupper ( SO 3 ). De danner en effektiv barriere mod anioner, som forsøger at trænge igennem. I denne del af øvelsen undersøges det 1. om membranen kan karakteriseres som ideel selektiv således, at der skabes et ligevægtspotential over membranen, når samme elektrolytkoncentrationen varieres på den ene side og fastholdes på den anden side af membranen 2. at der opstår et diffusionspotential over membranen, når den adskiller elektrolytopløsninger med forskellige kationer 3. at membranens ledningsevne (reciprok modstand) bl.a. afhænger af hvilken ion, der bærer strømmen gennem membranen 5.1. Forsøgsopstilling Som før. Anionbyttermembranen er udskiftet med kationbyttermembranen, som er lidt mørkere og opspændt i en sort PVC-ring Måling af ligevægtspotential over kationbyttermembranen Kationbyttermembranen er selektivt permeabel for kationer. Såfremt koncentrationen af kationer er højere i kammer (V) end i kammer (H), vil potentialet i kammer (H) (ψ (H) ) være positivt i forhold til potentialet i kammer (V) (ψ (V) ). Potentialforskellen over membranen, målt som (ψ (H) ψ (V) ), vil være positiv. Opretholdes det at måle ψ (V) ψ (H), som blev brugt i målinger med anionbyttermembranen, bliver værdien negativ. Membranpotentialet måles med forskellige elektrolytopløsninger i kamrene som angivet i tabellen nedenfor. Kammer (V) Kammer (H) KCl (mm) KCl (mm) logc (H) , , , , , Forsøgsgang Se oven for under anionbyttermembranen. Efter sidste måling med 150 mm KCl i begge kamre og udskrift af resultaterne, kan de næste målinger, der er beskrevet nedenfor, iværksættes Måling af diffusionspotential over kationbyttermembranen Såfremt den kationselektive membran adskiller to elektrolytopløsninger af samme koncentration, men med forskellige kationer, vil der opstå et diffusionspotentiale over membranen. Membranpotentialet måles med forskellige elektrolytopløsninger i kamrene som angivet i tabellen nedenfor (kolinklorid: CH 3 OH CH 2 CH 2 OHN + Cl ). Kammer (V) Kammer (H) 150 mm KCl 150 mm KCl 150 mm KCl 150 mm NaCl 150 mm KCl 150 mm LiCl 150 mm KCl 150 mm KolinCl Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

130 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 10 I denne forsøgsrække er det vigtigt, at kammer (V) skylles 1 gang med 150 mm KCl mellem hver måling. Kammer (H) skal skylles 2 gange med den opløsning, der skal måles. Efter sidste måling skylles og fyldes begge kamre med 150 mm KCl Måling af membranens elektriske modstand Permeabiliteten for kationer i den anvendte kationselektive membran er høj, og den elektriske modstand er derfor lav, sammenlignet med de fleste biologiske membraner. Da elektrolytbroerne (agarbroerne) ikke er anbragt helt op ad membranen, er det nødvendigt at foretage modstandsmåling både med og uden membran i kammeret, fordi modstanden selv i et tyndt lag af 150 mm KCl er betydelig i forhold til membranens egen modstand. Ved måling uden membran bestemmes modstanden i elektrolytopløsningen mellem broerne. Ved måling med membran bestemmes summen af modstanden i membran og elektrolytopløsning mellem broerne. Membranmodstanden kan dernæst bestemmes som differencen mellem resultatet af de to modstandsmålinger. Vælg Membranmodstand i Menu -programmet. Forbind kalomelelektroderne til måling af membranspænding og platinelektroder til strømkilde som vist på skærmen. Sæt Current -omskifteren på on og kontroller, at potentialet mellem de to kamre, der begge indeholder 150 mm KCl, er 0 mv, når der ikke sendes strøm gennem kamrene. En evt. afvigelse bortjusteres. Kontroller at membranen er isat og dette er vist på skærmen. Ved tryk på M kan membranen vises eller fjernes fra skærmen. Dette vises også i tabellen øverst til højre (2. kolonne) samt i udskriften af data. Ligeledes kan man angive den brugte opløsning ved brug af tasten O, og denne vil så fremgå af boksene ved siden af tegningen af kammeret på skærmen samt i 1. kolonne i datatabellen Målinger Strømmen øges trinvis 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ma ved hjælp af Page Up / Page Down, og resultatet gemmes (tast S ) for hvert trin. NB! På grund af luftudvikling ved de to strømelektroder under forsøget bør strømstyrken indstilles til 0 ma, når der ikke foretages målinger. Kamrene tømmes, membranen udtages og anbringes i æsken med 150 mm KCl. Den sorte PVC-ring uden membran isættes for at bevare samme afstand mellem spidsen af elektrolytbroerne. Kamrene samles igen og membranen fjernes fra skærmbilledet (tast M). Herefter måles (og gemmes) spændingsforskellen ved de samme strømstyrker, som anvendtes før. Forsøget gentages, dog med den forskel at 150 mm KCl erstattes med 150 mm LiCl Afslutning Efter sidste måling sættes Current -omskifteren på off, og ledningerne fjernes. Kamrene adskilles, anionbyttermembranen isættes, og der fyldes 150 mm KCl i begge kamre. Gå ud af menuen ("Escape") og svar ja til en udskrivning af resultaterne. 6. KLORID- OG BRINTIONLIGEVÆGT OVER ERYTHROCYTMEMBRANEN Undersøgelser har vist, at små, uorganiske anioner (som fx klorid og bikarbonat) transporteres væsentligt hurtigere gennem røde blodlegemers cellemembran end kalium og natrium. Man kan derfor med god tilnærmelse opfatte erythrocytmembranen som en ionselektiv membran. () i Når der hersker anionligevægt over cellemembranen, vil koncentrationsforholdet C og ( o) C ekstracellulærvæsken (C (o) ) være konstant og ens for de forskellige anioner (i rapportvejledningen gives en mere detaljeret beskrivelse af, hvorledes ligevægtsfordelingen af de forskellige anioner etableres). Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

131 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 11 Øvelsens formål er at vise, hvorledes ændringer i ligevægtsfordelingen af kloridioner mellem celle og omgivelser vil påvirke den passive ligevægtsfordeling af hydroxylioner (og dermed også brintioner, idet [OH ] [H + ] = ). Kloridkoncentrationen i blodlegemernes suspensionsmedium måles med sølv/sølvkloridelektroden. Hydroxylionkoncentrationen måles ikke direkte, men brintionkoncentrationen måles med en brintionfølsom glaselektrode (ph-elektrode) således, at hydroxylionkoncentrationen kan beregnes. Øvelsen udføres ved at suspendere røde blodlegemer i en ubufret, isoton rørsukkeropløsning, hvor kloridkoncentrationen hæves trinvist ved tilsætning af isoton KCl-opløsning. Med ph-elektroden registreres de ph-ændringer, der optræder som konsekvens af de ændrede kloridkoncentrationsforhold mellem celler og medium. Fig. 9. Måleopstilling til brug ved blodlegemeøvelse Forsøgsopstilling (Fig. 9.) En sølv/sølvkloridelektrode, en glaselektrode (ph-elektrode) og kalomelelektrode er anbragt i 150 mm KCl i målekammeret, som senere skal indeholde blodlegemesuspensionen. Sølv/sølvkloridelektrodens potential over for kalomelelektroden, V AgCl,kal, måles, og potentialforskellen mellem glas- og kalomelelektrode måles med et specielt elektronisk kredsløb (svarende til et ph-meter), som findes i tilslutningskassen med en speciel tilslutning i bagerste række bøsninger. Målekammeret står på en magnetomrører. NB! Undlad at berøre spidsen af elektroderne, specielt ph-elektroden, og sørg for at de er løftet så meget over bægerglassets bund at magnetomrøreren ikke støder på dem. Vælg Erythrocytmembranen i Menu -programmet og forbind elektroderne som antydet på skærmen i bagerste række bøsninger: Select=2. ph-tilslutningsbøsningen er speciel (af elektriske årsager) og fastholder elektrodestikket med en fjeder, som udløses ved et sideværts tryk på bøsningens blanke ring. Kontroller at Current -omskifteren er off Kalibrering Forud for selve erythrocytforsøget er det nødvendigt at kalibrere elektroder og apparatur. phelektroden kalibreres med to ph-buffere (en fosfatbuffer (ph 6,9) og en phthalat-buffer (ph 4,9)), og sølv/sølvkloridelektroden kontrolleres med tre KCl-opløsninger (150 mm, 50 mm og 15 mm KCl). Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

132 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side Justering af ph-målesystemet med buffere med kendt ph til at vise korrekte phværdier Kammeret skylles med ionbyttet vand og dernæst med en fosfatstødpudeopløsning (ph 6,9 ved 20 C) (brug vandsuget). Kammeret fyldes halvt med fosfatstødpuden, således at elektroderne er neddykket 1-2 cm, uden at magnetens bevægelser generes, når omrørermotoren startes. Med tast A aktiveres Adjust -funktionen og med piltasterne indstilles ph-visningen til bufferværdien 6,9. Hvis aflæsningen står på ph 7,0 er det ofte fordi forstærkeren overstyrer, og man skal da blot meget roligt køre nedad med piletasterne (målesystemet reagerer relativt langsomt). Kontroller at skærmbilledet viser den rette opløsning er i målekammeret og gem målingen. Med Repeat, tast R, kan skærmbilledets visning af opløsning rykkes et trin tilbage.) Fosfatstødpuden (ph 6,9) udskiftes nu med en phthalat-stødpude med et ph på 4,9. Indstil ph-visningen til ph 4,9 og gem. Med disse justeringer kan det antages, at ph-visningen er korrekt i det anvendte måleområde Kontrol af sølv/sølvklorid-elektroden Bufferopløsningen suges ud af kammeret og erstattes med en 150 mm KCl opløsning (skyl to gange). Vælg justeringsfunktionen AgCl-zero og juster visningen til 34 mv, som er den korrekte visning. Efter kontrol af skærmbilledet gemmes resultatet (Tast S ). Udfør herefter, uden yderligere justering, en måling med henholdsvis 50 mm KCl og 15 mm KCl i kammeret, idet der skylles 2 gange med den nye opløsning mellem hver måling. Resultaterne, i form af elektrodepotentialændringer ved kendte ændringer i koncentration, kontrolleres af instruktøren for at sikre, at elektroderne fungerer korrekt under blodlegemeforsøget Blodlegemeforsøg Kammeret tømmes og skylles med ionbyttet vand, indtil V AgCl,kal i det ionbyttede vand er over 200 mv (normalt er 2-3 skylninger nok). Derefter skylles kammeret en gang med sukroseopløsning, tømmes helt og påfyldes ca. 20 ml sukrose med en 20 ml sprøjte forsynet med en ca. 5 cm lang plastikslange. Hvis forsøget skal blive vellykket, skal kloridkoncentrationen i sukroseopløsningen være meget lav, når blodlegemerne tilsættes. Kloridkoncentrationen er passende lav, hvis V AgCl,kal > 180 mv. Er Ag/AgCl-elektrodens potential mindre, må kammeret renses yderligere. For at opnå en glidende afvikling af blodlegemeforsøget fyldes de sprøjter, der skal anvendes, forud for selve forsøget. Den fininddelte 1 ml sprøjte (Manteaux-sprøjte), som skal anvendes til de første tilsætninger, monteres med en lang tynd kanyle og fyldes med 150 mm KCl. Ligeledes fyldes en 2 ml sprøjte, der anvendes ved de sidste tre tilsætninger, med 150 mm KCl. I 20 ml sprøjten, som skal anvendes ved tilsætning af blodlegemer, suges ca. 5 ml sukroseopløsning op fra kammeret. Stemplet trækkes herefter lidt længere tilbage således, at væsken står et par cm fra enden af slangen. Kontroller, at V AgCl,kal stadig er større end 180 mv. Er potentialet faldet til mindre værdier, er kammeret kontamineret med Cl, og forsøget bør ikke startes, før opstillingen er renset yderligere. Ved tryk på C -tasten (continuous) udskrives værdierne for ph og V AgCl,kal som en kontinuerlig kurve (som funktion af tiden) på skærmen. Tryk IKKE på C -tasten før sprøjter med KCl-opløsninger og blodlegemer er klar. Hætten fjernes fra et rør med pakkede erythrocytter, der er vaskede i 150 mm KCl og centrifugeret ned i tynde nylonrør således, at der kun er en ringe mængde ekstracellulærvæske mellem cellerne. Den åbne ende af røret sættes ind i slangen på 20 ml sprøjten. Med en skalpel skæres dernæst bunden af røret (tør knivsbladet af straks efter brug). Hvis blodlegemerne Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

133 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 13 presses lidt ud af røret, trækkes sprøjtens stempel lidt tilbage således, at blodlegemerne holdes i nylonrøret og ikke suges op i sukroseopløsningen i sprøjten. Umiddelbart inden tilsætning af blodlegemerne startes kurveudskrivningen (tast C ). Aktuelle talværdier for de målte størrelser gemmes med tast S. Gem begyndelsesværdierne og tilsæt derefter blodlegemerne Måleresultater Ved tilsætning af blodlegemerne falder ph. Når ph er blevet stabilt eller svagt stigende (normalt på mindre end 1 minut), gemmes værdierne (V AgCl,kal og ph) på kurven. Ved de følgende tilsætninger af KCl føres kanylen ned under væskeoverfladen. Umiddelbart efter tilsætningen vil V AgCl,kal falde til en ny værdi, og ph i opløsningen vil stige. ph-stigningen er helt tilendebragt inden for det første minut, men for at få et plateau på den optegnede phkurve, bør der være omkring et minut mellem tilsætningerne. Med 1 ml sprøjten monteret med den lange kanyle og 2 ml sprøjten tilsættes de volumina, der er anført nedenfor (obs. 0,05 ml er kun 1/20 af 1 ml sprøjtens indhold!). Husk at gemme de øjeblikkelige værdier umiddelbart før en ny tilsætning. Når hele forsøget er gennemført, standses udskrivningen ved nyt tryk på C -tasten Afslutning Tilsætninger af 150 mm KCl 1. 0,05 ml 2. 0,1 ml 3. 0,2 ml 4. 0,5 ml 5. 1,0 ml 6. 2,0 ml Tøm kammeret for blodlegemesuspensionen (brug vandsuget), rens det med ionbyttet vand og fyld det med ca. 20 ml 150 mm KCl, således at elektroderne står neddykkede ca. 2 cm i væsken Ryd op! Tøm sugekolbe og rens blodsprøjten 7. RAPPORTVEJLEDNING De kunstige ionbyttermembraner kan bruges til at illustrere en membran, der kan skelne mellem ioners ladning (ionselektivitet). Der kan etableres et ligevægtspotential over den ideelle, ionselektive membran. For ligevægtspotentialet gælder Nernst ligning ( H ) ( V) ( H) Vm =Ψ Ψ = RT ln C ( V ) zf C Holdes C (V) konstant 150 mm, kan ligningen omskrives til ( H ) ( V) ( H) ( H) ( H) Vm =Ψ Ψ = RT ln C = 59( logc log150) = 59logC + 128,6 1F 150 når z= 1 (anionbyttermembran). Er z= +1 (kationbyttermembran) fås tilsvarende ( H ) ( V) ( H) ( H) ( H) Vm =Ψ Ψ = RT ln C =+ 59( logc log150) = 59logC 128,6 + 1F 150 Begge ligninger er af typen y = α x+ b, som er ligningen for en ret linie. Afbildes målte værdier af V m som funktion af logc (H), kan det efterprøves, om de målte membranpotentialer er Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

134 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 14 ligevægtspotentialer, idet den numeriske hældning svarer til den ændring i membranpotentialet (i mv), der sker med en tifold ændring i koncentrationen Måling af ligevægtspotential over anionbyttermembran Opgave 1. Afsæt de målte værdier af V m som funktion af logc (H), og redegør for om den beregnede hældningskoefficient for kurven svarer til den forventede værdi. Opgave 2. Redegør for hvorfor C (V) er konstant Måling af ligevægtspotential over kationbyttermembran Opgave 3. Afsæt de målte værdier af V m som funktion af logc (H), og redegør for om den beregnede hældningskoefficient for kurven svarer til den forventede værdi Måling af diffusionspotential over kationbyttermembran Opgave 4. Kationbyttermembranen bruges også til at illustrere ionspecificitet, dvs. membranens evne til at skelne mellem størrelsen af ioner med samme ladning (kationer). For de anvendte kationer haves følgende oplysninger K + Na + Li + Kolin + Molekylvægt (g mol 1 ) Ionradius r 1 (nm) 0,13 0,10 0,07 0,35 Hydreret ionradius r 2 (nm) 0,23 0,28 0,34 0,35 Angiv ud fra resultaterne hvorfor polariteten af membranpotentialerne bliver som anført. Opgave 5. Angiv rækkefølgen af ionerne efter aftagende evne til at permeere membranen. Opgave 6. Redegør for hvorfor størrelsen af diffusionspotentialerne varierer. Opgave 7. Redegør for, hvilke fysisk-kemiske egenskaber, der ud fra ovenstående tabel ser ud til at være af afgørende betydning for størrelsen af diffusionspotentialet Kationbyttermembranens elektriske modstand Modstanden i membranen (R, ohm) er ligefrem proportional med membranens tykkelse (L, cm) og omvendt proportional med dens areal (A, cm 2 ): R = ρ L A 1, hvor ρ er den specifikke modstand (ohm cm). Arealet af den kunstige membran er 1,77 cm 2. Opgave 8. Udregn middelværdierne af de målte elektriske modstande i de 4 målesituationer med og uden membran i henholdsvis 150 mm KCl og 150 mm LiCl. Udregn heraf værdier for membranen alene. Opgave 9. Angiv hvorledes strømmen transporteres gennem 1) membranen i de to forsøg, 2) gennem kammervæskerne, og 3) ledningerne til platinelektroderne. Opgave 10. Beregn kationbyttermembranens konduktans for 1 arealenhed (reciprok modstand, Siemens cm -2 ) i de to forsøg. Bemærk at i forsøget er den pågældende strømstyrke sendt gennem en membran med arealet 1,77 cm 2. Såfremt membranen kun var på 1 cm 2 (1 arealenhed), ville den samme strømstyrke have et mindre areal at passere og dermed møde en større membranmodstand. Omregning af modstanden for en strømstyrke gennem den pågældende membran til modstanden for en membran med arealet 1 cm 2 sker derfor med at gange modstanden i den aktuelle membran med membranens areal, hvilket umiddelbart kan synes ulogisk. Opgave 11. Afbild i et koordinatsystem, der betegnes et I-V diagram, strømmen (ordinat) som funktion af membranpotentialet (abscisse) i de to forsøgssituationer. Husk at korrigere for modstanden i væskelaget. Beregn konduktanserne ud fra kurvernes hældningskoefficienter. Sammenlign resultaterne med de tidligere udregnede. Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

135 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 15 Opgave 12. Redegør for om ionkonduktanser har betydning for størrelsen af ligevægtspotentialer over en ionselektiv membran. Opgave 13. Membranmodstanden i en hvilende muskelcelle er ca ohm cm 2. Beregn forholdet mellem den specifikke modstand (ohm cm) i ionbyttermembranen og i den hvilende muskelcelle. Tykkelsen af ionbyttermembranen og muskelcellemembranen er henholdsvis og ca cm Klorid- og brintionligevægt over erythrocytmembranen Erythrocytmembranen kan opfattes som anionselektiv, idet et særligt, integralt membranprotein formidler en passiv udveksling af Cl og HCO 3 (faciliteret udvekslingsdiffusion, se fx note 4: Opklarende note om transport, på vores hjemmeside), som er ca. 1 million gang hurtigere end transporten af K + og Na +. Denne udveksling af Cl og HCO 3 (klorid-bikarbonateller Hamburgerskiftet) spiller en central rolle i blodets transport af CO 2 fra væv til lunger (se lærebøger i fysiologi). Ved ligevægt over erythrocytmembranen, vil forholdet mellem Cl i ydermediet (fase (o)) og intracellulært (fase (i)) være bestemmende for potentialforskellen over membranen, fordi Cl er den eneste hurtigt permeerende anion, som findes i betydelig mængde i den intracellulære fase (se note 2: Membranpotentialer ). Ved ligevægt vil HCO 3 ligeledes fordele sig mellem faserne (i) og (o) i et forhold som svarer til kloridfordelingen. Umiddelbart ville man forvente, at transportsystemet også kunne transportere OH passivt gennem erythrocytmembranen. Forsøg har imidlertid vist, at OH ikke transporteres i nævneværdig grad over erythrocytmembranen. OH vil dog, som HCO 3 fordele sig passivt over membranen svarende til kloridfordelingen: () i () i () i + ( o) 3 Cl HCO OH H = = = Cl HCO OH H ( o) ( o) ( o) + ( i) 3 Det er illustreret i Fig. 1.6., at [OH ] kan ændres, uden at der foregår en transport af OH over membranen. Ændres fordelingen af Cl ved at øge f.eks. [Cl - ] (o), transporteres HCO 3 fra fase (i) til fase (o) for at etablere en ny fordeling af HCO 3, som svarer til den ændrede kloridfordeling over membranen. Stigningen af HCO 3 i fase (o) medfører en øget dannelse af H 2 CO 3 gennem association med H +. Kulsyre dissocieres herefter i H 2 O og CO 2, som kan diffundere gennem cellemembranen og deltage i den intracellulære dannelse af OH efter samme skema. Resultatet af en stigning i ekstracellulær Cl er, at såvel HCO 3 som OH i systemet indstiller sig i en ny ligevægt over membranen, som er bestemt af forholdet () i Cl ( o) Cl. Såfremt ydermediet er ubufret, som det er tilfældet med sukroseopløsningen i blodlegemeforsøget, vil en stigning i OH -koncentrationen ikke kunne ophæves af bufferen. Der indtræder derfor et fald i H + -koncentrationen, der kan registreres som en stigning i ydermediets ph. Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

136 BF-1: SELEKTIVT PERMEABLE MEMBRANER Side 16 Fig. 10. Til illustration af den passive anionfordeling over blodlegememembranen Såfremt sølv/sølvkloridelektroden fungerer som en ideel kloridfølsom elektrode 0 RT (o) V AgCl = E AgCl ln[ Cl ] F og glaselektroden som en ideel brintionfølsom elektrode i blodlegemeforsøget, kan man måle en korrekt sammenhæng mellem kloridkoncentrationen og hydroxylionkoncentrationen i cellernes suspensionsmedium. Det må derfor kontrolleres, at glaselektroden kan måle ph korrekt i de to stødpuder, samt at sølvkloridelektroden udviser den rette potentialændring (59 ± 5 mv) - for en tifold ændring af kloridkoncentrationen. Opgave 14. Afsæt i et lineært koordinatsystem sølvkloridelektrodens potential (ordinat) som funktion af ph i sukroseopløsningen (abscisse) og tegn den bedst muligt rette linie gennem de afsatte punkter. Opgave 15. Beregn forholdet ( ordinat)/ abscisse), som har enheden mv/ph og som er hældningskoefficienten for den rette linie. Opgave 16. Glaselektroden er en brintionfølsom elektrode, og elektrodens glasmembran kan opfattes som selektivt permeabel for brintioner. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser af de selektive, kunstige ionbyttermembraner vil elektrodens potential ændres med ca. 59 mv ved en tifold ændring af brintionkoncentrationen (svarende til en ændring på 1 phenhed). Ændringen af glaselektrodens potential ved måling af to ph-værdier (ph (a) og ph (b) ) er således (ved 25 C): + H + ( a) ( a) ( b) ph ph 59log H + ( b) V =Ψ Ψ = Diskuter den eksperimentelt bestemte størrelse af V AgCl V H + H i forhold til den teoretiske værdi på 1,0. Opgave 17. Redegør for at superskripterne i ligning (1), der betegner faserne, er vendt om for H + i forhold til superskripterne for Cl, HCO 3 og OH. Medicinsk Fysiologisk Institut; 1. marts 2002

137 BF-2: NERVEØVELSEN Side 1 BIOFYSIKØVELSE 2 NERVEØVELSEN 2.0 RESUMÉ AF FORSØGSGANG INDLEDNING MODELLER AF DEN PASSIVE CELLEMEMBRAN Forsøg A: DEN KUGLEFORMEDE CELLE Forsøg B: DEN CYLINDERFORMEDE CELLE REGISTRERING MED EKSTERNE ELEKTRODER FORSØGSAPPARATUR UNDERSØGELSE AF ET ENKELT AXON I EN REGNORM Forsøg 1: "ALT ELLER INTET" - LOVEN Forsøg 2: SUMMATION AF SUBLIMINALE STIMULI Forsøg 3: REFRAKTÆRPERIODE UNDERSØGELSE AF FRØNERVE MED MANGE AXONER Forsøg 4: ADDITION AF AKTIONSPOTENTIALER Forsøg 5: DET DIFASISKE AKTIONSPOTENTIAL Forsøg 6: NERVELEDNINGSHASTIGHED Forsøg 7: DET MONOFASISKE AKTIONSPOTENTIAL Forsøg 8: MONOFASISK OG DIFASISK AKTIONSPOTENTIAL RAPPORTVEJLEDNING TABELLER TIL FORSØGSRESULTATER ADDENDUM 1: KALIUM- OG CALCIUMIONERS BETYDNING FOR EXCITABILITET ADDENDUM 2: EL-LÆRE Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

138 BF-2: NERVEØVELSEN Side RESUMÉ AF FORSØGSGANG 1. Start computerprogrammet Fysik-el 2. Udfør forsøg A (side 4) og B (side 6) med de to membranmodeller 3. Start programmet Nerve på computeren 4. Hent et regnormepræparat. Tilslut de midterste fem elektroder (vist på Fig 2.13, side 13) 5. Udfør forsøg 1 (side 14), forsøg 2 (side 15) og forsøg 3 (side 16). 6. Aflever regnormen. Hent en frønerve, der tilsluttes som angivet på side Udfør forsøgene 4 (side 20), 5 (side 21), 6 (side 21), 7 (side 22), og 8 (side 24) 8. Aflever frønervepræparatet 2.1. INDLEDNING Forberedelse. Som forberedelse til øvelsen læses om Nerveimpulsen samt punkterne formål og princip i øvelsesvejledningen under de enkelte forsøg samt Addendum 1 og evt. Addendum 2. Det forventes, at studenten er i stand til at diskutere hvilke forskelle der er på det intracellulært og ekstracellulært registrerede aktionspotential ved indledningen til øvelsen. Formål. Øvelsens formål er at illustrere nogle egenskaber ved den passive cellemembran og ved impulsledningen i den perifere nerve, og at lette forståelsen af hvorledes aktionspotentialet kan registreres med ekstracellulære afledningselektroder. Aktionspotentialer måles så godt som altid med ekstracellulært placerede måleelektroder, når man under praktiske forhold, f. eks. i undersøgelser af patienter, registrerer impulser i nerver. Det er også det hensigten med øvelsen, at bringe nogle af de observerede fænomener i relation til de forhold og mekanismer, som ligger til grund for nerveimpulsen (ion-bevægelserne under aktionspotentialet). Øvelsen falder i tre hovedafsnit: 1. Først undersøges nogle egenskaber ved den ikke-excitable (passive) cellemembran ved at forbinde måleudstyret til to elektriske modeller af en cellemembran 2. Til belysning af begreberne tærskelstimulus, "alt eller intet" -lov og refraktærperiode afledes aktionspotentitialet fra ét enkelt axon i en regnorm. 3. Dernæst måles aktionspotentialer fra en hel nerve bestående af et stort antal axoner i en frønerve. Dette præparat tillader en veldefineret placering af afledningselektroderne. I denne del af øvelsen bestemmes nerveledningshastighed. Desuden demonstreres to afledningsformer, som giver anledning til henholdsvis et difasisk og et monofasisk aktionspotential MODELLER AF DEN PASSIVE CELLEMEMBRAN Fortrolighed med kapacitetsbegrebet er en af forudsætningerne for at forstå hvorledes aktionspotentialer og synaptiske potentialer udbredes i nerveceller. Den første del af nærværende øvelsesvejledning omhandler kapacitetsbegrebet. Det er tilstræbt at gøre emnet Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

139 BF-2: NERVEØVELSEN Side 3 let forståelig, snarere end fysisk korrekt. En grundigere gennemgang findes i Addendum 2. For at anskueliggøre det elektriske kapacitetsbegreb drages analogi i Fig 2.1 mellem en væskebeholder og en elektrisk kondensator, som udgøres af to ledende planer (plader) i et isolerende medie. Fig 2.1 Til venstre en beholder med kapaciteten C. Til højre en kondensator med kapaciteten C. I væskebeholderen afhænger væskehøjden U af den påfyldte mængde Q og af beholderens kapacitet C, således at: Q = C U eller U = Q C -1 Den elektriske kondensator til højre er opladet med Q ladninger ved at flytte Q positive ladninger fra nederste plade (der bliver negativ) til den øverste (som bliver positiv). Der opstår en spændingsforskel mellem pladerne på U volt, således at: Q = C U eller U = Q C -1, hvor C benævnes kapaciteten. Bemærk, at hvis kapaciteten er stor bliver spændingsforskellen mellem kondensatorpladerne lille. Kapaciteten C beskriver, hvor stor en ladning kapaciteten skal oplades med for at opnå en given spændingsforskel mellem pladerne. Enheden kaldes farad, og skrives F. Forbindes flere kondensatorer parallelt bliver den samlede kapacitet summen af de enkelte kapacitetsværdier som vist i Fig 2.2. Fig 2.2. Tre kapaciteter, hver af størrelsen C svarer til én kapicitet på 3C. Man er ofte interesseret i den hastighed, hvormed U (vandstanden i beholderen eller spændingen mellem kondensatorpladerne) kan ændres. I vandmodellen bestemmes stigehastigheden af vandstrømmen fra den vandpumpe, hvormed der påfyldes væske (volumen pr tidsenhed). Ved opladning af den elektriske kondensator (Fig 2.3) må der etableres et ydre kredsløb med en pumpe (generator eller batteri), hvormed ladninger transporteres rundt fra kondensatorens ene side til den anden. Den elektriske strøm i kredsløbet kaldet ladestrømmen. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

140 BF-2: NERVEØVELSEN Side 4 Fig 2.3. Opladning af en kapacitet C med en ladestrøm I. Sammen med kapaciteten C er det altså ladestrømmen I (ladninger per tidsenhed), der bestemmer kondensatorspændingens ændringshastighed U t -1 (spændingsændring pr tidsenhed), således at en større strøm medfører en større hastighed, mens større kapacitet medfører lavere hastighed: U t -1 = I C -1. Måling på membranmodeller Biologiske membraner er i vekslende grad permeable for ioner. Et mål for permeabiliteten er membranens elektriske konduktans, G m, som er den reciprokke membranmodstand; altså: G m = R m -1. Membranmodstanden bestemmes ved at måle ændringen i membranpotential V m mellem membranens to overflader (inderside og yderside), fremkaldt af strømmen I m gennem membranen. Membranmodstanden R m er da defineret ved Ohms lov: V m = R m I m. Cellemembranen har en betydelig elektrisk kapacitet. Denne kapacitet C er defineret af ligningen Q = C V m, hvor Q er det antal ladninger, der skal flyttes fra yderside til inderside for at skabe membranspændingen V m Forsøg A: DEN KUGLEFORMEDE CELLE. Formål: I den første del af øvelsen studeres en model, som efterligner nogle elektriske egenskaber ved en kugleformet celle. Formålet er at studere faktorer, der er bestemmende for det tidsmæssige forløb af en membranpotentialændring. Fig 2.4. Kugleformet celle og et simpelt elektrisk diagram med samme elektriske egenskaber. Til venstre i Fig 2.4 illustrerer en kugleformet celle og dennes membran. En strømkilde er Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

141 BF-2: NERVEØVELSEN Side 5 anbragt i cellens centrum. Herfra vil strømmen I m fordele sig ligeligt i alle retninger og dels passere gennem membranmodstandene, dels oplade membrankapaciteterne for tilsidst at blive opsamlet af en ekstern elektrode (ikke vist). På grund af symmetrien kan de elektriske forhold beskrives ved den simple model, vist på figuren til højre, hvor membranens jævnt fordelte modstande og kapaciteter er samlet i een enkelt modstand R m og een enkelt kapacitet C m. Hvis modelkredsløbet ikke rummede en kondensator ville der, straks når strømmen sluttes, dannes en potentialforskel over membranen i overensstemmelse med Ohms lov: V m = R m I m. Når membrankapciteten medregnes, kan membranspændingen ikke dannes momentant, og strømmen vil dels oplade kapaciteten, dels løbe i modstanden. I selve startøjeblikket vil al strømmen være ladestrøm og spændingen stiger hurtigt. Senere, efterhånden som spændingen vokser, vil mere og mere strøm løbe i modstanden, og kapaciteten oplades langsommere af reststrømmen, lige indtil spændingen V m er nået, hvor al strømmen løber i modstanden. En vandmodel af modelkredsløbet kunne være en beholder, der fyldes med en konstant væskestrøm. Tæt ved bunden findes et hul, som væsken vil løbe ud af, mere og mere, jo højere væskestanden i beholderen er. I starten vil væskestanden stige hurtigt, da der ikke løber meget ud. Senere, efterhånden som væskestanden stiger vil mere og mere løbe ud gennem hullet, lige indtil der løber lige så meget ud, som der fyldes med. Stigehastigheden (for væske eller potential) vil derfor være aftagende, og den viser sig at få et eksponentielt forløb, asymptotisk mod den stationære værdi (som teoretisk aldrig nås). Man kan derfor ikke beskrive forløbet ved den tid det varer at nå den stationære værdi, men vælger (af praktiske grunde) den tid det tager at vokse til ca. 63% af slutværdien (eller mere nøjagtigt [1-1 e -1 ] af slutværdien, hvor e er grundtallet til den naturlige logaritme). Dette er den såkaldte tidskonstant tau. Man kan beregne at tau = R C. Udførelse: Med måleledninger forbindes modellen (lille grønne kasse) til registreringssystemets tilslutningsbox til bøsningerne mærket Stim og Preamp. Fig 2.5. Forbindelser og indstilling af systemet Registreringssystemets parametre indstilles som vist nederst på Fig 2.5. En registrering gemmes på skærmen med Store-funktionen ( S -tast). En kopi af skærmbilledet udprintes med Print-funktionen ( P -tast). Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

142 BF-2: NERVEØVELSEN Side 6 Hvis der anvendes 1 V som stimulusspænding, kan man antage, at membranstrømmen med tilnærmelse er konstant lig én mikroampere (10-6 A) a) Bestem R m af kurven (brug slutværdien ved stimulationen). (Husk V m = I m R m ) b) Bestem tidskonstanten tau og membrankapaciteten C m. (Husk tau = R m C m ) Forsøg B: DEN CYLINDERFORMEDE CELLE. Formål. I denne del af øvelsen studeres et membranpotentials udbredelse langs en cylinderformet cellemembran, f. eks. en nervefiber. På Fig 2.6 er øverst til venstre er skitseret en meget simpel model, der viser indre modstande (axoplasmaet) og membranmodstande. I modellen er membran-kapaciteterne udeladt, og der tages således ikke hensyn til det tidsmæssige forløb på det enkelte sted. Med en passende elektrode, påtrykkes nervens indre en stimulusspænding i forhold til det uendelig godt ledende ydermedie. Denne spænding udbreder sig i cellens indre, men på grund af modstanden i axoplasma og membran vil membranspændingen aftage med voksende afstand fra stimulusstedet. Denne dæmpning undersøges ved måling af spændingen i nervens indre (ved stimulationsstedet og ved punkterne 1 til 4) i forhold til det ydre (punkt 0). Fig 2.6. Måleopstilling for Forsøg B Udførelse: Registreringssystemets parametre indstilles som vist nederst på Fig 2.6. Med måleledninger forbindes modellen (lille grønne kasse) til registrerings-systemets tilslutningsbox til bøsningerne mærket Stim og Preamp. For at anskueliggøre membranmodstandens indflydelse på udbredelsen af stimulus foretages to måleserier som beskrevet nedenfor: Membranspændingens udbredelse bestemmes ved at måle fem steder i det indre i forhold til det ydre med voksende afstand fra stimulusstedet. Dette gøres ved at registrere fem spor Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

143 BF-2: NERVEØVELSEN Side 7 oven i hinanden på samme skærmbillede (brug Store ), hvor måleelektroden (den tynde røde ledning) anbringes ved stimulationsstedet og ved punkt 1 til 4. Skærmbilledet udprintes ved flg. målebetingelser: i) Uden forbindelser ved 1, 2, 3 og 4, således at der simuleres en perfekt isolerende membran (R m uendelig stor), hvor ingen strøm kan flyde ud gennem membranen. ii) Med forbindelse ved alle punkterne 1, 2, 3 og 4. Her aftager den indre strøm gradvist (efterhånden som den løber ud gennem membranen) og membranspændingen aftager derfor tilsvarende og får tilnærmelsesvist et eksponentielt aftagende forløb. Hvis nerven var uendelig lang, kan det beregnes, at den indre strøm reduceres med samme faktor pr. længdeenhed bort fra stimulusstedet. Dette medfører samme relative reduktion af det indre spændingsfald, og resulterer i et membranpotential, der aftager eksponentielt med afstanden fra stimulusstedet og som teoretisk aldrig når nul. Man kan altså ikke beskrive udbredelseslængden ved den længde, hvor membranspændingen er reduceret til nul. Man vælger (af praktiske grunde) at beskrive udbredelsen ved længdekonstanten lambda, som den længde (afstand fra stimulussted) hvor membranspændingen er reduceret til 37% af begyndelsesværdien (egentlig til e -1 af begyndelsesværdien, hvor e er grundtallet til den naturlige logaritme). a) Angiv længdekonstanten, når membranen antages at være fuldstændig isolerende. b) Bestem længdekonstanten lambda, når det antages, at målepunkterne har en indbyrdes afstand på 2mm. c) Angiv hvorledes henholdsvis den indre modstand og membranmodstanden vil påvirke længdekonstanten lambda REGISTRERING MED EKSTERNE ELEKTRODER Intracellulært placerede elektroder er vanskelige at arbejde med. Derfor benytter man ofte eksternt placerede elektroder til at undersøge nervers funktion. Elektroderne kan bruges til både stimulation og til registrering af aktionspotentialer Det difasiske aktionspotential. Når natriumkonduktansen g Na under aktionspotentialets udvikling vokser, bliver membranen praktisk taget selektiv for Na + i ca. 0,5 ms. Herunder passerer Na + ind gennem membranen og efterlader et overskud af negative ioner udenfor. Derfor optræder det propagerende aktionspotential som et negativt område, der løber uden på axonet. Dette betyder, at man kan registrere aktionspotentialet med eksterne elektroder anbragt langs nerven. Hvis man som her i øvelsen bruger to måleelektroder forbundet til en differentialforstærker, der trækker signalerne fra de to elektroder fra hinanden, får man et difasisk aktionspotential (Fig 2.7, A). Under første fase passerer det negative område på axonet + måleelektroden og bliver registreret som et negativt udslag, mens det under anden fase Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

144 BF-2: NERVEØVELSEN Side 8 Fig 2.7. Registrering af et aktionspotential med eksterne afledningselektroder. A: Difasisk aktionspotential, når aktionspotentialets rumlige udbredning er større end afstanden mellem måleelektroderne. B: To monofasiske aktionspotentialer med modsat fortegn når udbredningen er mindre end elektrodeafstanden. C: Et monofasisk aktionspotential, målt mellem en elektrode på intakt nerve og en elektrode på ødelagt nerve til højre (Efter Mountcastle (1980): Medical Physiology) passerer - måleelektroden og derved registreres med modsat fortegn. Det difasiske aktionspotential anvendes ved øvelsen til flere formål: (i) Demonstration af alt eller intet -loven på et enkeltaxon. Ved gradvis øgning af stimulusstyrken, nås et bestemt tærskelstimulus, hvor aktionspotentialet netop udløses. Uanset hvor meget man herefter øger stimulusstyrken ud over tærskelværdien, forbliver aktionspotentialets amplitude uforandret. Det stemmer overens med, at et udløst aktionspotential altid må have samme amplitude, fordi denne bestemmes af systemets konstanter: ligevægtspotentialerne for Na + og K + samt ændringerne i g Na og g K. (ii) Demonstration af local response ved summation af subliminale stimuli. Stimuleres et axon med et subliminalt stimulus (tæt under tærskelværdien) udløses ikke noget aktionspotential. Stimuleres der så igen efter kort tid (< 1 ms), kræves kun en relativ svag stimulusstyrke for at udløse et aktionspotential. Denne summation af subliminale stimuli skyldes, at axonet er hyperexcitabelt efter det første stimulus, idet det tager nogen tid inden den opnåede depolarisering forsvinder. Depolariseringen forekommer lokalt ved stimuluselektroden og kaldes et local response. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

145 BF-2: NERVEØVELSEN Side 9 Fig 2.8. Hastighedsmåling ved ekstern stimulation og afledning. A: Nerve, elektroder og difasisk aktionspotential. B: Relationen mellem propageringens vej og tid. (iii) Måling af nerveledningshastigheden sker ved måling af propageringstiden fra stimulationselektrode til registreringselektrode. Varieres afstanden mellem elektroderne fås en relation mellem propageringens vej og tid, som er vist i Fig 2.8. Relationen er retlinet, d.v.s. at hastigheden (= den reciprokke hældning af linien = vej tid -1 ) er konstant gennem nerven. Ved ekstrapolation af kurven til tiden 0 ms fås i tilgift det sted på nerven, hvor aktionspotentialet starter (udløses). Det viser sig at være ved katoden, der er den stimuluselektrode, der depolariserer nervemembranen. Anoden hyperpolariserer membranen og kan udløse anodeblokade, så aktionspotentialet kun udbreder sig en vej ad nerven: den vej hvor katoden sidder. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

146 BF-2: NERVEØVELSEN Side FORSØGSAPPARATUR Registreringsapparaturet udgøres af: Fig 2.9. Registreringsapparatur Computeren, i hvilken der afvikles et program, som er specielt skrevet til de aktuelle apparater og eksperimenter. Fig Skærmkasse Kontrolenheden, som er indbygget i computeren, og som rummer elektronik til styring af en ekstern enhed (se Fig 2.9) og til konvertering af data til og fra denne. Via et såkaldt multikabel forbindes kontrolenheden til den externe enhed. Displayet, en skærm, der viser forsøgsparametre og registreringer. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

147 BF-2: NERVEØVELSEN Side 11 Keyboardet, et tastatur, hvor komandoer indtastes. Printeren, til udskrift af registreringer og forsøgsparametre. Den eksterne enhed ("skærmkassen", Fig 2.10) er forbundet til computerens enhed for kontrol og datakonvertering. Måleobjektet er anbragt i "kassen", der virker som delvis afskærmning mod udefrakommende elektriske forstyrrelser. I "kassen" er tillige anbragt de nødvendige elektroniske kredsløb dels til for-forstærkning af de svage elektriske signaler fra måleelektroderne dels til generering af de nødvendige stimulationsspændinger. Forforstærker Fig Skærmbillede og stimulatorudgang er specielt konstrueret med henblik på at opnå minimale forstyrrelser i registreringen fra de relativt store stimulusspændinger og fra udefra kommende elektriske forstyrrelser. Stimulusspændingen fremkommer mellem den (positive) røde (S(+)) og den (negative) blå (S(-)) ledning i kassens venstre side. Den gule ledning (J) er en såkaldt jordledning. Den forbindes til måleobjektet og bevirker, at dets potential holdes nær nul og medvirker dermed yderligere til at minimere elektriske forstyrrelser. I kassens højre side findes to sorte ledninger A(+) og A(-) med henholdsvis rødt og hvidt bananstik. Disse er indgang til forforstærkeren. Spændingen mellem disse ledninger registreres af målesystemet. Fig 2.11 viser et typisk skærmbillede: Kurven på øverste del af skærmen angiver spændingen mellem A(+) og A(-) som funktion af tiden (det registrerede Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

148 BF-2: NERVEØVELSEN Side 12 signal). Kurven er over 0-linien når A(+) er positiv i forhold til A(-). Det til registreringen svarende tidsmæssige stimuleringsforløb vises i feltet nedenfor. Nederst på skærmen vises de aktuelle forsøgsparametre. Det er her tillige vist hvilke taster, der skal anvendes for at ændre parametre eller udløse funktioner. Med tastaturets "vandrette" piltaster udvælges den parameter, som skal ændres. Med de "lodrette" piltaster ændres værdien. ("Page-up" og "Page-down" kan anvendes for større ændringer i stimulationsparametrene.) "S"-tasten vil lagre den efterfølgende registrering og standse videre registrering (og stimulering). En vilkårlig anden tast vil genoptage registreringen (og stimuleringen). "E"- tasten fjerner sidst lagrede registrering. (Op til ti spor kan lagres.) "P"-tasten starter udskrift på printeren, når registreringerne er lagrede (og registrering og stimulering dermed standset). Fig Tvæ rsnit af regnorm 2.5. UNDERSØGELSE AF ET ENKELT AXON I EN REGNORM. Præparat. Fig 2.12 viser en skitse af et tværsnit af regnormen. Dorsalt i buggangliekæden findes tre kæmpeaxoner. Det mediane axon er mikrometer i diameter, de laterale kan blive op til 50 mikrometer. Mellem de to laterale axoner går anastomoser, der medfører, at de to axoners aktivitet synkroniseres. Indledende procedurer: Øvelsens instruktører har forberedt denne øvelse på følgende måde: Kammer: Regnormen er i forvejen bedøvet ved at ligge et par minutter i 15% metylalkohol. Herefter er den placeret på bunden af nervekammeret, og fem nåleelektroder (metalkanyler) er stukket gennem ormen og ned i paraffinen, som vist skematisk på Fig Det tilstræbes, at det mediane axon ikke læderes. For at undgå udtørring er ormen overhældt Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

149 BF-2: NERVEØVELSEN Side 13 med paraffinolie. Fig Længdesnit af regnormekammer NB! Inden nervekammeret forbindes sættes stimulationsamplituderne (PULSE1 og PULSE2) til 0 Volt!! Ledningsføring: Nervekammeret anbringes i skærmkassen, og bananstikkene på skærmkassens ledninger stikkes løst ned i kanyle-hovederne som angivet på Fig Polaritet: Som nævnt er apparaturet indrettet således, at udslag opad på skærmen svarer til, at elektrode A(+) er positiv i forhold til elektrode A(-). For at registrere den initiale potentialændring som et nedadgående spor på skærmen, må A(+) og A(-) anbringes som vist på figuren. Forsøgsparametrene indstilles som vist på Fig 2.14: Fig Indstilling på display Forsøgsgang: Før hvert forsøg er det enkelte forsøgs formål og princippet i forsøgsgangen beskrevet. Disse afsnit skal læses og forstås (evt med hjælp fra instruktøren) inden forsøget udføres. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

150 BF-2: NERVEØVELSEN Side Forsøg 1: "ALT ELLER INTET" - LOVEN Formål: Regneormeøvelsens hovedformål er at vise, at i et enkelt axon er der en skarp grænse mellem de stimulusstyrker, der er i stand til at udløse en nerveimpuls og de stimulusstyrker, der ikke er i stand dertil. Dette forhold berettiger til indførelsen af begrebet tærskelstimulus, d.v.s. den stimulusstyrke, der netop kan udløse et aktionspotential ved en given varighed af stimulus. Endvidere vil det ses, at aktionspotentialets størrelse er uafhængig af stimulusstyrken for alle stimuli, der er over tærskelværdien: "Alt eller intet"- loven. I tilslutning hertil undersøges sammenhængen mellem tærskelstimulus styrke og dets varighed. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002 Fig Aktionspotentialer fra regnorm Princip: Tærskelstimulus bestemmes for det mediane axon ved gradvis at øge stimulationsstyrken, indtil der fremkommer et aktionspotential på skærmen efter hver stimulation. Derefter mindskes stimulationsstyrken til en værdi, hvor et aktionspotential af og til falder ud. Denne stimulationsstyrke er tærskelstimulus. Øges stimulationsstyrken ses fremkomsten af endnu et aktionspotential, bredere og mere uregelmæssigt og beliggende på et senere tidspunkt (se Fig 2.15). Dette andet aktionspotential hidrører fra de laterale axoner. Udførelse: Der stimuleres med en enkelt impuls med varighed på 0.1 ms (kontroller: RANGE = 1000 mikrovolt, TIME = 10 ms, PULSE2 = 0 og WIDTH = 0.1 ms). Stimulusamplituden (PULSE1) øges (brug evt. "Page-up"), indtil et difasisk

151 BF-2: NERVEØVELSEN Side 15 aktionspotential ses på skærmen. Registreringsfølsomheden (RANGE) tilpasses (størst udslag, inden for skærmområdet). Bestem tærskelstimulus som beskrevet ovenfor. Ved øget stimulationsstyrke iagttages aktionspotentialet fra de laterale axoner. De skal ikke undersøges nøjere her. Repetitioner fra det mediane axon kan give forstyrrelser, og i så fald tilkaldes instruktøren. Stimulusstyrken øges nu kortvarigt til dobbelt styrke ("Page-up" og "Page-down"). Det bemærkes, at aktionspotentialernes udseende og størrelse ikke ændrer sig med den øgede stimulationsstyrke. Stimulationsvarigheden (WIDTH) ændres nu til henholdsvis 0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5 og 1.5 ms. Tærskelstimulusstyrken for det mediane axon bestemmes igen for hver varighed, og værdien noteres i Tabel 2.1. Afslutning: Stimulusamplituden (PULSE1) sættes på 0.00 og stimulusvarigheden (WIDTH) på 0.1 ms Forsøg 2: SUMMATION AF SUBLIMINALE STIMULI Formålet er at undersøge de ændringer i axonets excitabilitet, der indtræder i umiddelbar tilslutning til en stimulation af axonet med et stimulus, hvis styrke er lige under tærskelværdien: et subliminalt stimulus. Princip: Nerven stimuleres med to, kort efter hinanden, følgende stimuli. Det første stimulus, det konditionerende stimulus, vælges lidt under tærskelværdien. Kort herefter appliceres det andet stimulus, teststimulus, og tærskelværdien herfor bestemmes ved forskellige intervaller mellem de to stimuli. Ændringerne i størrelsen af tærskel for teststimulus vil afspejle ændringer (og deres varighed) i nervens excitabilitet fremkaldt af det først applicerede, konditionerende stimulus. Udførelse: Indstil registreringstid (TIME) til 5 ms, impulsafstanden (INTERVAL: afstanden mellem impulsernes start) til 0.12 ms og kontroller at stimulusvarigheden (WIDTH) er 0.1 ms. Proceduren er herefter som følger: a) Amplituden for første stimulus (PULSE1) øges, tærsklen for det mediane axon findes, og værdien noteres i TABEL 2.2. b) PULSE1 reduceres til 90 % af tærskelstimulus størrelse. Man venter et øjeblik for at sikre, at den nye, lavere stimulusstyrke ikke udløser aktionspotentialer. Værdien af denne stimulusstyrke noteres i Tabel 2.2. c) Andet stimulus (PULSE2) øges, indtil aktionspotentialet atter viser sig på skærmen. "Tærsklen" for dette teststimulus findes på samme måde som tidligere, og værdien noteres i Tabel 2.2. som tærskel 2. Denne er mindre end tærsklen ved én stimulation. d) PULSE2 sættes ned til e) Som kontrol for at forsøgsbetingelserne har været stabile bestemmes tærskelværdien for Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

152 BF-2: NERVEØVELSEN Side 16 første stimulus (PULSE1) igen, og værdien noteres i Tabel 2.2. Hvis de to bestemmelser af tærsklen for eet stimulus (PULSE1) (før og efter applicering af det subliminale stimulus) har ændret sig mere end ca. 10%, må man regne med, har tærsklen ændret sig væsentligt under forsøget. Det må derfor gentages! (Det er en fordel at udføre forsøget hurtigt.) Intervallet mellem de to stimuli øges til henholdsvis 0.16 og 0.30 ms (INTERVAL, som angiver afstand mellem impulsstart), og procedure a-e gentages for hvert tidsinterval. Afslutning: PULSE1 og PULSE2 stilles på Forsøg 3: REFRAKTÆRPERIODE Formålet er at undersøge de ændringer i axonets excitabilitet, der indtræder umiddelbart efter udløsningen af en nerveimpuls. Princip: Nerven stimuleres med to kort på hinanden følgende stimuli og således, at begge stimuli er større end tærskelstimulus. Når intervallet mellem de to stimuli mindskes successivt, vil man bemærke, at aktionspotentialet udløst af stimulus nummer 2 ved et vist interval begynder at aftage i amplitude for til sidst helt at forsvinde. Ved det pågældende interval kan axonet ikke reaktiveres, selvom styrken af stimulus 2 øges til maksimum: Axonet er absolut refraktært. Udførelse: Registreringstiden (TIME) sættes til 25 ms, impulsbredden (WIDTH) til 0,10 ms, impulsafstanden (INTERVAL) til 10 ms. PULSE1 øges, og tærskelværdien bestemmes. PULSE1 og PULSE2 sættes herefter begge på 120% af tærskelværdien. To ens aktionspotentialer, svarende til de 2 stimuli, skal nu ses på skærmen. En karakteristisk registrering lagres (tast "S" for Store). Registreringen (og stimulering) genoptages med mellemrumstasten. Impulsafstanden (INTERVAL) mindskes herefter med to tryk på Page-down, og endnu et spor lagres. Gentag denne procedure indtil aktionspotential nr 2 forsvinder. Når en serie tilfredsstillende spor er lagret, foretages en udskrift på printeren (tast "P" for Print). Notér den værdi i ms af INTERVAL, der medfører en synlig reduktion af aktionspotential nr. 2 i Tabel 2.3., og notér ligeledes den værdi hvor aktionspotential nr. 2 helt forsvinder. For at vise, at aktionspotential nr. 2 forsvinder, fordi der stimuleres kort tid efter aktionspotential nr. 1, mindskes PULSE1 et øjeblik ned under tærskel. Man ser da, at aktionspotential 2 springer op på sin normale størrelse. Det lagrede slettes. Skriv forsøgsnummer på udskriften! PULSE1 sættes igen til 120% af tærsklen og PULSE2 ændres hurtigt ("Page-up") op til maksimum og ned til 0.00, og man vil se, at axonet selv ved maksimalt stimulus 2 ikke kan reaktiveres. NB! Ved denne stimulationsstyrke vil tærsklen for de laterale axoner overskrides, og Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

153 BF-2: NERVEØVELSEN Side 17 aktionspotentialer fra disse vil også registreres. De er imidlertid mere uregelmæssige og bredere end aktionspotentialet fra det mediane axon og optræder på et senere tidspunkt, hvorfor de skulle være lette at identificere. Afslutning: PULSE1 og PULSE2 sættes på Kammeret bringes til instruktørrummet, hvor der udleveres en frønerve anbragt i frønervekammeret. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

154 BF-2: NERVEØVELSEN Side UNDERSØGELSE AF FRØNERVE MED MANGE AXONER Præparat. Opbygningen af frøens n. ischiadicus er groft skitseret i Fig For kun at aktivere de axoner, der strækker sig i hele nervens længde, stimuleres nerven i den distale ende. Fig Frøens n. ischiadicus og skitse af nervekammeret Indledende procedurer Kammer: Den uddissekerede frønerve anbringes af instruktøren i et nervekammer som afbildet i Fig 2.16 og Fig Præparatet, n. ischiadicus med tilhørende rødder og endegrene, ligger i det rør-formede kammer med den distale ende (n. peroneus og n. tibialis) til venstre. Nerven er fikseret ved hjælp af et par silketråde, der er bundet om nerven i begge ender og fæstnet i de to klemskruer i hver ende af måleopstillingen. Nervekammeret er fyldt med Ringers opløsning (en simpel efterligning af normal ekstracellulærvæske), der kan udskiftes gennem tilløbene i hver ende af kammeret. Tilløbet midt på kammeret benyttes, når de to kammerhalvdele skal gennemskylles med hver sin væske. Tilløbene står gennem hanerne mærket 1, 2 og 3 i forbindelse med tre aftagelige glassprøjter, den til højre med farvet 120 mm KCl, de to andre med Ringers opløsning. De ringformede guldelektroder er i deres centrale del i kontakt med Ringer-opløsningen, medens en udløber af hver elektrode er i ledende forbindelse med en målebøsning nederst i opstillingen. Kammeret anbringes stående løst i skærmkassen. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

155 BF-2: NERVEØVELSEN Side 19 Fig Nervekammeropstilling Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

156 BF-2: NERVEØVELSEN Side 20 Ledningsføringen til elektroderne er som i forrige forsøg. Bøsningerne 1-3 i kammeret anvendes til stimulation: 1 til S(+) (=rød), 2 til S(-) (=blå), 3 til jordforbindelse (=gul) og afledningselektroderne: 4 til A(+) (=rød) og 5 til A(-) (=hvid). (Afledningselektroderne er anbragt således, at den initiale potentialændring vises nedadgående på skærmen.) Forsøg 4: ADDITION AF AKTIONSPOTENTIALER Formål: Størrelsen af det aktionspotential, der afledes fra overfladen af en hel nerve, afhænger af, hvor mange axoner der er aktiveret samtidig. Fig Aktionspotential fra en frønerve Formålet med dette forsøg er at illustrere, at aktionspotentialet fra en hel nerve vokser mod en maksimalværdi, når nerven stimuleres med stigende stimulationsstyrker. Dette er ikke i modstrid med "alt eller intet"-loven, men hidrører blandt andet fra det forhold, at stimulationsstrømmen mellem stimulationselektroderne S(+) og S(-) ikke er ensartet fordelt over nervens tværsnit. Tærskelstimulus bliver derfor ikke er det samme for de forskellige axoner i nerven. F. eks vil den elektriske stimulation først ramme de overfladisk beliggende axoner, som derved får det laveste tærskelstimulus. Med stigende stimulationsstyrke vil dybere beliggende axoner efterhånden aktiveres og bidrage til aktionspotentialet, der vil vokse, indtil samtlige axoner i nerven er blevet aktiverede. Fig 2.18 viser et typisk aktionspotential fra en frønerve, fremkaldt ved elektrisk stimulation. Stimulationsstedet ligger et stykke fra afledningsstedet, men en lille "rest" af Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

157 BF-2: NERVEØVELSEN Side 21 stimulationsstrømmen på afledningsstedet ses som det såkaldte stimulusartefakt. Det fremkommer på afledningsstedet samtidig med stimuleringen. Princip: Stimulationsstyrken (PULSE1) øges gradvis, og med mellemrum aflæses sammenhørende værdier af stimulationsstyrken og aktionspotentialets amplitude, som den nedadgående fases maksimale udslag fra grundlinien, aktionspotentialets amplitude. UDFØRELSE: Der vælges en registreringstid (TIME) på 5ms. WIDTH sættes til 0,1 ms. Aflæsningerne af aktionspotentialets amplitude foretages, når PULSE1 (stimulusstyrken) øges fra 0.0V til værdierne, som er angivet i Tabel 2.4. Aflæsninger, hvor intet aktionspotential ses, betegnes med et -. Man noterer sig, om det registrerede aktionspotential ændrer form og størrelse. Afslutning: PULSE1 drejes ned til Forsøg 5: DET DIFASISKE AKTIONSPOTENTIAL Formålet er at undersøge, hvorledes det difasiske aktionspotentials størrelse og form afhænger af afstanden mellem de to afledningselektroder. Princip: Elektrodeafstanden øges ved, at afledningselektrode A(-) trinvis flyttes bort fra elektrode A(+) (d.v.s. længere til højre). Der registreres og lagres et aktionspotential svarende til hver elektrodeafstand. Udførelse: I resten af øvelsen anvendes en stimulationsstyrke, der giver et aktionspotential på omkring halvdelen af det maksimale aktionspotential, og som samtidig giver en optimal udnyttelse af skærmen. Indstil PULSE1 og RANGE i overensstemmelse hermed! Registreringstiden (TIME) uændret 5 ms. Proceduren er følgende: a) Afledningsstikket A(-) flyttes til bøsning A. b) Når registreringen er stabil lagres aktionspotentialet (tast "S" (Store)). Registreringen (og stimulationen) genoptages ved tryk på en vilkårlig tast (f. eks. "Mellemrum"). Er registreringen ikke tilfredsstillende fjernes sidste registrering med tast "E" (Erase). Proceduren gentages, idet A(-) flyttes til henholdsvis bøsning B, C, 5, 6, 7 og 8. (NB! Tidsintervallet mellem registreringerne øges jo flere spor, der lagres. Dette har ingen betydning for forsøget, men kræver lidt tålmodighed.) Når samtlige registreringer er udført (og lagret på samme skærmbillede), foretages en udskrift på printeren (notér forsøgsnr. på udskrift). Heraf aflæses (evt. senere) størrelsen af aktionspotentialets nedadgående fase svarende til de forskellige placeringer af stikket A(-), og værdierne indføres i Tabel 2.5. Afslutning: De lagrede registreringer fjernes (Erase, flere gange), og stikket A(-) flyttes til bøsning 5. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

158 BF-2: NERVEØVELSEN Side Forsøg 6: NERVELEDNINGSHASTIGHED Formålet er at bestemme en gennemsnitlig impulsledningshastighed for axonerne i nerven. Princip: Der registreres en serie af aktionspotentialer, hvor afledningsektrodeparret A(+) og A(-) med fastholdt indbyrdes afstand flyttes trinvis bort fra stimulationselektroderne. Tiden for passagen af nerveimpulsen fra stimulationselektroderne til afledningselektroderne bestemmes og sammenholdes med afledningselektrodernes afstand fra stimulationselektroderne. Registreringerne lagres på samme skærmbillede. Udførelse: Proceduren er nu følgende: Registreringstiden (TIME) sættes til 5 ms. Der foretages en registrering af aktionspotentialet (og lagring) i hvert af målepunktparrene: 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9 på samme skærmbillede. Den tiltagende forsinkelse iagttages. Der foretages en udskrift heraf. (Noter forsøgsnr. på udskrift!) Udmåling: (evt. senere) På udskriften udmåles følgende tider: Tiden fra stimulationsartefaktets begyndelse til et punkt svarende til skæringspunktet mellem grundlinien og forlængelsen af den retlinede del af potentialets initiale nedadgående fase (benævnt fodpunktet, se Fig 2.18). De ovennævnte værdier udmåles for hvert aktionspotential, og værdierne indføres i Tabel 2.6, svarende til de anvendte placeringer af A(+) og A(-). Hvis det sidste aktionspotential afviger meget fra de øvrige, udelades dog dette. Afslutning: De lagrede registreringer fjernes (Erase) og registreringen genoptages Forsøg 7: DET MONOFASISKE AKTIONSPOTENTIAL Formål: De elektriske strømme, som nerven frembringer under impulspassagen, omfatter en så stor del af nervens længde, at det med de nervelængder, der er til rådighed, sjældent er muligt at opnå, at hele det aktiverede område på noget tidspunkt befinder sig mellem de to afledningselektroder A(+) og A(-). Det er dette forhold, der giver anledning til, at der registreres et difasisk aktionspotential, som i virkeligheden er to overlappende monofasiske registreringer med modsat fortegn. I dette forsøg skal selve den potentialændring, der fremkommer på nervens overflade i forbindelse med nerveimpulsens udbredning, undersøges. Denne potentialkonfiguration betegnes det monofasiske aktionspotential og svarer til den potentialændring, der ville kunne registreres fra elektrode A(+), hvis elektrode A(-), på en meget lang nerve, var anbragt så langt væk, at afledningselektroderne ikke på samme tid kunne registrere potentialændringer fra nerveimpulsen. Princip: For at kunne registrere et monofasisk aktionspotential er det nødvendigt at anvende et kunstgreb. Dette består i at forhindre nerveimpulsen i at passere elektrode A(-). Denne eksperimentelle situation opnås ved at blokere nerveimpulsens udbredning over nerven fra et sted mellem de to afledningselektroder. Elektroden A(+) vil da registrere potentialændringerne fra nervens overflade under Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

159 BF-2: NERVEØVELSEN Side 23 impulsudbredningen målt i forhold til en referenceelektrode, A(-), placeret det sted på nerven, som ikke aktiveres og derfor ikke undergår nogen potentialændring. Blokeringen frembringes ved at depolarisere nervemembranen, d.v.s. reducere dennes membranpotential til omkring 0 mv over den ovennævnte strækning. Depolariseringen sker ved at udskifte Ringer-opløsningen omkring højre del af nerven med en opløsning indeholdende 120 mm KCl. Udførelse: Inden depolariseringen flyttes stikket A(+) til bøsning 4 og stikket A(-) til bøsning 8. Depolariseringen følges ved at iagttage reduktionen af den opadgående fase. Man kan i denne del af forsøget øge registreringsfølsomheden (RANGE), således at det nedadgående udslag bliver passende stort. Registreringstiden (TIME) sættes til 5ms. Opstillingen er i forvejen forberedt til, at depolariseringen omkring elektrode A(-) (bøsning 8) umiddelbart kan foretages. Men for at undgå at ødelægge præparatet er det bedst, at instruktøren tilkaldes. (Det vil være hensigtsmæssigt at kende den efterfølgende procedure inden instruktøren tilkaldes). Depolarisering: Denne sker ved at gennemskylle partiet mellem hane 2 og 3 med den farvede KCl, hvorefter hanerne lukkes, og forsøget kan begynde. Klokkeslettet skal noteres i Tabel 2.7. Størrelsen af det difasiske aktionspotentials opadgående fase aflæses, og værdien noteres i Tabel 2.7. (Registreringen kan evt lagres og registreringen straks derpå genoptages ("Mellemrum"-tasten)) Man vil se, at den opadgående fase begynder at formindskes, og når den er formindsket med 20-30% af begyndelsesværdien, foretages en ny aflæsning af klokkeslet og den opadgående fases størrelse. Begge værdier noteres. (Evt lagring påny.) Når den opadgående fase atter er formindsket med yderligere 20-30% af begyndelsesværdien, aflæses størrelsen atter, og værdien indføres i Tabel 2.7. sammen med klokkeslettet. Således fortsættes, indtil den opadgående fase er forsvundet, d.v.s. indtil nerveimpulsen ikke mere propagerer forbi elektrode A(-). Herefter kan det monofasiske aktionspotential studeres. Lagrede registreringer kan udskrives (husk forsøgsnr.) og derefter fjernes Registrering af monofasiske aktionspotentialer: Registreringsfølsomheden tilpasses til det monofasiske aktionspotential. Udførelse: Med A(-) i målepunkt 8 foretages, med A(+), en registrering (og lagring) af potentialet i målepunkterne 4,A,B,C og 5. Herved fås en samlet registrering af de fem monofasiske aktionspotentialer, optaget med 2.5 mm's afstand mellem hver afledningssted. Det undersøges, om aktionspotentialerne er nogenlunde lige store, og om afstanden imellem dem Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

160 BF-2: NERVEØVELSEN Side 24 er omtrent den samme. Desuden noterer man sig aktionspotentialernes udseende. Hvis der er stor (en faktor 3) forskel på første og sidste aktionspotential, må instruktøren tilkaldes. Dette gælder også, hvis farven i kammerets højre del når over til elektrode nr. 5. Det først registrerede monofasiske aktionspotential udprintes, idet de 4 sidst registrerede først fjernes (Erase 4 gange). (Husk forsøgsnr. på udskrift) Forsøg 8: MONOFASISK OG DIFASISK AKTIONSPOTENTIAL Formålet med forsøget er at vise, at det difasiske aktionspotential fremkommer som en differens mellem de varierende potentialværdier registreret to steder på den excitable nerves overflade. Princip: Der registreres to monofasiske aktionspotentialer fra hvert sit sted på nervens overflade og de sammenlignes med et difasisk registreret mellem disse steder. Udførelse: a) Der afledes et monofasisk aktionspotential med A(+) i bøsning 4 og A(-) i bøsning 8. Potentialet lagres. b) Der afledes endnu et monofasisk aktionspotential med A(+) i bøsning 5, og med A(-) i bøsning 8. Potentialet lagres. c) Der afledes et difasisk aktionspotential med A(+) i bøsning 4 og A(-) i bøsning 5. Potentialet lagres. Resultatet udprintes. (Noter forsøgsnr. på udskrift!) Det kontrolleres ved inspektion af udskriften, at det difasiske aktionspotential er fremkommet som differensen mellem de to monofasiske aktionspotentialer. Afslutning: Nervekammeret bringes til instruktørrummet. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

161 BF-2: NERVEØVELSEN Side RAPPORTVEJLEDNING Rapporten består af bearbejdning og forklaring af data fra forsøgene med enkeltaxonet og den sammensatte frønerve. Resultaterne fra undersøgelserne af membranmodellerne beregnes og diskuteres ved selve øvelsen. Visse spørgsmål i det følgende lægger op til svar, som findes i lærebøger, noter, pensumbeskrivelse eller i øvelsesvejledningen, og det kan måske derfor forekomme nogle for overflødigt at skulle formulere svarene her. Det er imidlertid en tilbagevendende erfaring, at forståelsen øges væsentligt under forsøg på formulering af svarene på egen hånd. Stil rapporten overskueligt op. Skriv gerne med blyant, men med god linieafstand og kun på den ene side af papiret. Graferne kan godt udføres på almindeligt kvadreret papir, mmpapir kan dog være en lettelse. Forsøg 1: "ALT ELLER INTET"-LOVEN a) Hvilken betydning har membranmodstanden (r m ), axonets indre modstand (r i ), den ydre modstand langs axonet (r y ) og modstanden mellem stimuluselektroder og membran (r s ) på, hvor stor spændingen fra stimulatoren skal være for at opnå et aktionspotential? (Brug evt. Fig 2.20 i overvejelserne). b) Angiv hvilke ioner, der i det væsentlige bærer stimulationsstrømmen ekstra- og intracellulært. c) Skitsér de membranpotentialændringer, som opstår i axonet ud for de to stimulationselektroder under stimulation med et subliminalt stimulus, der kun er lidt mindre end tærskelstimulus. d) Beskriv de konduktanssændringer, der fremkommer i membranen ved anode og katode i umiddelbar tilslutning til den subliminale stimulation. e) Angiv hvilken stimuluselektrode, der udløser nerveimpulsen, når stimulus er gjort større end tærskelstimulusstyrken? f) Beskriv "alt eller intet"-loven. g) Redegør for, ud fra kendskabet til den grundlæggende mekanisme bag membranexcitabilitet, hvorfor det propagerede aktionspotentials amplitude er uafhængig af stimulationsstyrken. Tabel 2.1. Spændings-varigheds diagrammet Optegn på grundlag af resultaterne i Tabel 2.1. sammenhængen mellem tærskel-stimulus størrelse og dets varighed, og redegør for hvorfor kurven ser ud som den gør. Forsøg 2: SUMMATION AF SUBLIMINALE STIMULI a) Anvend resultaterne indeholdt i Tabel 2.2. til at angive størrelsen og varigheden af de ændringer, der kunne observeres på regnormenerven efter ophør af det første subliminale stimulus (konditionerende stimulus). Som mål for tærskelændringerne udregnes forholdet mellem tærskel 2 og tærskel 1 i procent og indføres i Tabel 2.2, sidste afsnit. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

162 BF-2: NERVEØVELSEN Side 26 b) Redegør for det forhold, at nerven udviser en fase med en forbigående øget excitabilitet umiddelbart efter stimulation med et stimulus, hvis styrke er lige under tærskelstimulusstyrken (subliminalt stimulus). Anvend kendskabet til nervemembranens "local response" Forsøg 3. REFRAKTÆRPERIODE a) Fra udskriften udmåles størrelsen (amplituden) af aktionspotentialet, der afledtes fra regnormeaxonet. Resultat indføres i Tabel 2.3. b) Angiv den omtrentlige størrelse af den absolutte og den relative refraktærperiode hos regnormen (Tabel 2.3). Forsøg 4. ADDITION AF AKTIONSPOTENTIALER. (SAMMENSAT NERVE) a) Tegn i et koordinatsystem sammenhængen mellem det eksternt afledte potentials amplitude og stimulusstyrken ud fra værdierne i Tabel 2.4. b) Angiv stimulusstyrken for det axon, der når tærskel ved mindst stimulus. c) Redegør for, om denne sammenhæng mellem det eksternt afledte aktionspotential og stimulusstyrken (for den sammensatte frønerve) er forenelig med "alt eller intet"-loven (for enkeltaxonet)? Forsøg 5, 6, 7 og 8: Først når resultaterne fra forsøg 5-8 sammenholdes, bliver det muligt at fornemme det fysiske grundlag for forsøgsresultaterne, hvorfor disse forsøg til dels behandles samlet i det følgende: Depolarisering a) Hvorledes påvirkes axonernes membranpotential, når nervens normale ydermedium i kammerets højre del erstattes med 120 mm KCl, således at den ekstracellulære K + - koncentration svarer til den cytosolære (forsøg 7)? b) Hvorfor kan membranerne i dette område ikke længere exciteres, d.v.s. ikke længere generere et aktionspotential? c) Hvorfor tager det som regel nogen tid (jvf. Tabel 2.7.), før alle nervens axoner er blokerede? Når impulsledningen er blokeret i højre nervedel, vil der her ikke længere indtræffe nogen aktionspotentialbetinget potentialændring ved nervens overflade. En elektrode anbragt her kan derfor betragtes som referenceelektrode, og den kan tillægges potentialet 0. Monofasisk versus difasisk aktionspotential: d) Angiv på udskriften fra forsøg 8, hvorledes de 3 potentialkonfigurationer er målt, altså som følgende 3 potentialforskelle: A(+) i bøsning 4 minus A(-) i bøsning 8 (reference) A(+) i bøsning 5 minus A(-) i bøsning 8 og A(+) i bøsning 4 minus A(-) i bøsning 5. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

163 BF-2: NERVEØVELSEN Side 27 Kontrollér, at det difasiske potential fremkommer som differencen mellem de to monofasiske potentialer; undersøg f.eks. om amplituden af de monofasiske potentialer er ens svarende til det tidspunkt, hvor det difasiske skærer grundlinien. Bestemmelse af nerveledningshastighed Måleresultaterne i Tabel 2.6. vedrørende tidsintervallerne mellem stimulationstidspunktet og tidspunktet for registrering af aktionspotentialets fodpunkt udregnes i millisekunder. Resultaterne indføres i Tabel 2.6. Det ses, at jo længere aktionspotentialet er propageret, desto større er det målte tidsinterval eller ledningstiden (se Fig 2.16 for afstand mellem elektroder). e) Afbild, evt. på mm-papir, ledningstiderne for aktionspotentialets fodpunkt som funktion af de afstande, aktionspotentialet har propageret d.v.s. afledningselektrodernes afstande fra stimulationselektroderne: Ud ad abscissen afsættes kammerets bøsningsnumre med lige stor afstand imellem, f.eks. 2 cm. (OBS: I nervekammeret er elektrodeafstanden 1 cm mellem de nummerede elektroder). Elektrode nummer 1 (anode) afsættes i nulpunktet, derefter elektrode nummer 2 (katode) og nummer 3 (jordelektroden). Derefter afsættes de samhørende værdier mellem tidsinterval (ordinaten) og placeringen af afledningselektroden, A(+), som er nærmest stimulationselektroderne. Gennem punkterne tegnes nu den bedst placerede rette linie, som forlænges til skæring med abscissen. Aflæs ledningshastigheden for aktionspotentialet. Hastigheden angives i m s -1 eller mm ms -1 (se også Fig 2.8). f) Angiv stedet, hvor linien skærer abscissen (d.v.s. stedet svarende til forsinkelsen nul), og kommentér stedets beliggenhed. Monofasisk aktionspotential g) Aktionspotentialets rumlige udbredning. Udskriften fra forsøg 7 viser tidsforløbet af det monofasiske aktionspotential, d.v.s. potentialvariationen som funktion af tid ét sted på nerven, nemlig hvor aktionspotentialet passerer første elektrode. Man kan også angive aktionpotentialet som funktion af sted på nerven og derved få et billede af dets udbredning på langs af nerven til en bestemt tid: I det tidsrum (t ms) hvor aktionspotentialet passerer måleelektroden, vil aktionspotentialets front være nået X mm frem forbi elektroden. X afhænger af nerveledningshastigheden v (= X t -1 ), som allerede er blevet bestemt. Beregn udbredningen (X) af aktionspotentialet og lav en skitse af en axonmembran med udbredelsen af et intracellulært registreret aktionspotential med angivelser af størrelsesforhold. h) Angiv på skitsen af membran og aktionspotential de ændringer i membranens natrium- og kaliumkonduktanser, der ligger til grund for aktionspotentialet. De transmembrane ionbevægelser, som sker i takt med membranens konduktansændringer, bevirker, at elektrotoniske strømme udbreder sig i axoplasma fra det aktiverede område ind i ikke-aktive naboområder. Her krydser strømmen membranen og vender tilbage til ydersiden af det aktiverede membranområde via nervens ydermedium idet dette område har den laveste ekstracellulære potentialværdi fordi Na + er forsvundet ind i axoplasma herfra. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

164 BF-2: NERVEØVELSEN Side 28 Denne strømsløjfe er årsag til at aktionspotentialet udbreder sig langs axonmembranen. Den elektrotone strøm inde i axonet depolariserer (og exciterer) nemlig naboområder til det aktive membranområde. i) På skitsen fra punkterne g) og h) tegnes i og omkring axonmembranen de ovenfor nævnte "strømsløjfer" med angivelse af strømretningen. j) Angiv de områder, hvor strømmen fortrinsvis bæres af Na + og Cl -, og hvor den fortrinsvis bæres af K +. Angiv retningerne for ionstrømmene. k) Tegn ud fra resultaterne i Tabel 2.5, amplitude som funktion af elektrodeafstand. Redegør for, hvorfor amplituden af det difasiske aktionspotential vokser med afstanden mellem afledningselektroderne indtil et maksimum. l) Angiv på abscissen den mindste elektrodeafstand, som giver maksimal amplitude nedad af det difasiske aktionspotential. m) Angiv den elektrodeafstand, som vil bevirke, at aktionspotentialets to faser klart skiller sig ud fra hinanden ved en vandret grundlinie, den isoelektriske fase. Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

165 BF-2: NERVEØVELSEN Side TABELLER TIL FORSØGSRESULTATER. Tabel 2.1. Forsøg 1: "ALT ELLER INTET"-LOVEN Stimulusvarighed Tærskelstimulusstyrke (Stimulatorens WIDTH) (med. axon) ms V Tabel 2.2. Forsøg 2: SUMMATION AF SUBLIMINALE STIMULI INTERVAL Tærskel 1 PULSE1 Tærskel 2 Tærskel 1 før test 90% af efter test tærskel 1 ms V V V V Udfyldes i forbindelse med rapporten: Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

166 BF-2: NERVEØVELSEN Side 30 Interval mellem stimuli * (Tærskel 2) (Tærskel 1) -1 i procent ms * Et stimulus varer 0.1 ms Tabel 2.3. Forsøg 3: REFRAKTÆRPERIODE Aktionspotential 2 formindskes lidt, men synligt ved INTERVAL =..... ms Aktionspotential 2 forsvinder ved INTERVAL =... ms Aktionspotentialets maksimale (negative) udslag fra grundlinien =... mikrovolt Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

167 BF-2: NERVEØVELSEN Side 31 Tabel 2.4. Forsøg 4: ADDITION AF AKTIONSPOTENTIALER Stimulusstyrke (PULSE1) V Aktionspotentialets (negative) amplitude mikrovolt Tabel 2.5 Forsøg 5: DET DIFASISKE AKTIONSPOTENTIAL A(+) A(-) Afstand Amplitude i bøsning i bøsning mm 4 A 2½ 4 B 5 4 C 7½ mikrovolt Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

168 BF-2: NERVEØVELSEN Side 32 Tabel 2.6 Forsøg 6: NERVELEDNINGSHASTIGHED A(+) A(-) Tid fra artefakts i bøsning i bøsning (9) beg. til fodpunkt ms Tabel 2.7 Forsøg 7: DET MONOFASISKE AKTIONSPOTENTIAL DEPOLARISERING Klokkeslet Tid fra hanernes lukning Difasiske aktionspotentials opadgående fase Kl. min mikrovolt 0 Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

169 BF-2: NERVEØVELSEN Side ADDENDUM 1: KALIUM- OG CALCIUMIONERS BETYDNING FOR EXCITABILITET Det er velkendt fra klinikken, at forstyrrelser i kroppens kalium- og calciumbalance medfører symptomer fra især det neuromuskulære system og fra hjertet, altså fra vigtige excitable væv. Symptomerne er i visse tilfælde alvorlige og kan ubehandlet medføre døden. Høj ekstracellulær kaliumkoncentration. Under øvelsen vises det, at en meget høj ekstracellulær K + -koncentration medfører depolarisering af cellemembranerne, og at denne depolarisering inaktiverer Na + -kanalerne, således at excitabiliteten forsvinder. Så kraftige forstyrrelser i kroppens K + -koncentration medfører altid døden. Intravenøs K + -injektion er den foretrukne henrettelsesmetode i adskillige amerikanske stater. Små forøgelser i den ekstracellulære K + -koncentration depolariserer kun de excitable membraner nogle få millivolt. Denne depolarisering kan medføre en øget excitabilitet, men sagen kompliceres af, at depolariseringen i nogle celler øger membranens g K, og dette virker som en shunt, således at excitabilitetsøgningen ikke bliver så stor, som man ellers kunne forvente. Desuden vil øgning af den ekstracellulære K + -koncentration medføre, at E K bliver mere positiv. Det nedsætter repolarisering og efterhyperpolarisering og herved nedsættes fjernelsen af inaktiveringen af de spændingsafhængige Na + -kanaler. Også dette modvirker excitabilitetsøgningen. Symptomerne på hyperkaliæmi er først og fremmest kardiale: rytmeforstyrrelser, evt med ventrikelflimmer. Lav ekstracellulær kaliumkoncentration. En reduktion af den ekstracellulære K + - koncentration vil gøre E K mere negativ og dermed hyperpolarisere cellemembranerne så excitabiliteten falder. De vigtigste kliniske fund er nedsat kraft i muskulaturen, nedsat tarmmotilitet og i sjældne tilfælde egentlige pareser. Lav ekstracellulær calciumkoncentration. Calciumioners betydning for synaptisk transmission og for excitations-kontraktionskoblingen i muskulatur er velkendt, og man kunne forvente, at nedsat ekstracellulær Ca 2+ -koncentration ville medføre lavere excitabilitet. Dette er imidlertid helt forkert. Excitabiliteten øges ved hypocalcæmi og de kliniske symptomer i lettere tilfælde er paræstesier og karpopedalspasmer - mest udtalt i hænderne. I sværere tilfælde ses egentlige kramper og epileptiforme anfald uden bevidstløshed samt hjertearrytmier med hjerteinsufficiens. Akut calciummangel er livstruende og kræver hurtig intravenøs tilførsel af calciumioner. Symptomer på lav ekstracellulær Ca 2+ -koncentration optræder allerede når (den frie) calciumkoncentration falder til under 1,15 mm. Dette er ikke nok til at den synaptiske transmission eller excitations-kontraktionskoblingen påvirkes. Den øgede excitabilitet i nerve- og muskelceller skyldes, at calciumioner under normale forhold binder sig til - eller i hvert fald tiltrækkes af og opholder sig tæt ved membranproteiner, der er negativt ladede på den del af proteinet, der vender mod cellemembranens udside. De positivt ladede calciumioner kan derved neutralisere de negativt ladede membranproteiner, og det har betydning for den potentialgradient, der ligger over selve cellemembranen. Calciumionernes Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

170 BF-2: NERVEØVELSEN Side 34 afskærmning af de negative ladninger på membranprotinerne kaldes for charge screening. Fig 2.19 viser forholdende omkring en cellemembran i tre situationer. I den første (A) er der en høj Ca 2+ -koncentration på ekstracellulærsiden af membranen. De negative ladninger på Fig Calciumioners virkning på potentialgradienten gennem en excitabel membran (charge screening). A: Ved høj ekstracellulær calciumkoncentration afskærmes alle negative ladninger på membranproteinerne og den transmembrane potentialgradient bliver stejl. B: Ved normal calciumkoncentration er enkelte negative ladninger på proteinerne frie. Det nedsætter stejlheden af den transmembrane potentialgradient og noget af gradienten ligger uden for membranen. C: Ved lav calciumkoncentration er mange negative ladninger frie. Potentialgradienten er affladet og en betydelig del af potentialforskellen ligger uden for cellem embra nen. membranproteinerne er alle afskærmet af calciumioner og potentialgradienten (den stiplede linie) gennem membranen bliver stejl. Det medfører, at hele potentialforskellen mellem intracellulærrummet (med et potential på -70 mv) og ekstracellulærrummet (med et potential på 0 mv) kommer til at ligge over selve membranen. De spændingsafhængige ionkanaler (bl.a. Na + -kanalerne) udsættes for den fulde potentialforskel, og der skal en stor depolarisering til for at aktivere dem og dermed udløse et aktionspotential. I en situation med normal Ca 2+ -koncentration (B) er enkelte negative ladninger på membranproteinerne frie og potentialgradienten gennem membranen er nu mindre. Det betyder, at de spændingsafhængige kanaler i membranen er lettere at aktivere og membranen er derfor mere excitabel. Når Ca 2+ - koncentrationen er lav (C) ligger en væsentlig del af potentialgradienten uden for membranen, fordi de frie negative ladninger på membranproteinerne reducerer stejlheden af potentialgradienten inde i membranen. Ionkanalerne i membranen udsættes for en mindre potentialforskel end normalt. Det betyder, at de er nær aktivering, og membranen er hyperexcitabel. Høj ekstracellulær calciumkoncentration. Som det fremgår af ovenstående, er Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

171 BF-2: NERVEØVELSEN Side 35 hypercalcæmi en tilstand hvor excitabiliteten er nedsat. De kliniske symptomer er hypotoni med svækkede reflekser, nedsat motilitet i tarmkanalen, depression, konfusion og overledningsblok i hjertet og eventuelt asystoli. Andre divalente kationer. Magnesiumioner virker som calciumioner på excitabiliteten. I klinikken er det kun Mg 2+ -forstyrrelser, der har praktisk betydning, idet andre divalente kationer fælder ud med anioner, som er til stede i ekstracellulærrummet. Den frie koncentration af disse ioner vil derfor altid være lav. Forøgelse af Mg 2+ -koncentrationen anvendes af og til eksperimentelt til at hæmme excitabilitet i nervesystemet. Høj Mg koncentration virker anæstetisk ADDENDUM 2: EL-LÆRE Hvilken betydning har stimulationselektrodernes placering i forhold til nervemembranen for sammenhængen mellem den spænding, stimulatoren påtrykker stimulationselektroderne og den deraf følgende forskydning af membranpotentialet?" Dette spørgsmål kan besvares ved at betragte en model af den hvilende nervemembran i form af en elektrisk model (Fig 2.20). Fig Ækvivalensdiagram for den hvilende nerve At modellen er repræsentativ for den hvilende nervemembran er underbygget gennem mange års elektrofysiologiske undersøgelser. Disse har godtgjort, at den hvilende nerve i elektrisk henseende har egenskaber som et dårligt ledende og dårligt isoleret elektrisk kabel. Der er dog en vigtig forskel: i den hvilende nerve findes et batteri (Vm) i membranen. Kablets indre leder, som har en vis modstand per længde-enhed, den indre længdemodstand, r i (ohm m -1 ), svarer til axoplasma. Den omgivende isolator repræsenterer nervemembranen, der har to vigtige fysiske egenskaber til fælles med kablets isolator. For det første har membranen en membran- Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

172 BF-2: NERVEØVELSEN Side 36 kapacitet med kapaciteten, c m, per længdeenhed nerve (F m -1 ) (enheden F hedder "Farad"). For det andet er nervemembranen ingen ideel isolator, idet membranmodstanden, r m (udtrykt i ohm m), er af endelig størrelse. Hvilemembranpotentialet, V m, repræsenteres af et batteri anbragt i serie med membranmodstanden. Nerven er altid placeret i et elektrisk ledende medium enten in situ (regnormen) eller i Ringervæske (frønerven),og det omgivende mediums modstand repræsenteres i modellen ved den ydre længdemodstand, r y (ohm m -1 ). Da stimulationselektroderne ikke kommer helt tæt på nervens overflade, vil der mellem hver stimulationselektrode og membranen være en vis elektrisk modstand, som i modellen er repræsenteret ved de to seriemodstande, r s (ohm). Ved stimulation gælder det om, at så meget af stimulusstrømmen som muligt løber gennem r m, idet denne del af strømmen vil kunne ændre Vm (d.v.s. depolarisere membranen). Det betyder at r y helst skal være stor (stimulatorstrømmen må ikke kortslutte) og r s skal være lille (ellers når stimulusstrømmen ikke membranen). Hvis r i er lille (et tykt axon) og r m er stor (membranen ikke shuntet) bliver spændingsændringen (depolariseringen) stor (jfr. Ohms lov: V = R I, hvor V er depolarisering, R membranmodstand og I stimulusstrøm). Revideret efterår 2001 af Henrik Jahnsen Medicinsk Fysiologisk Institut; 17. oktober 2002

173 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 1 BIOFYSIKØVELSE 3 VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (Impulsmønstre i axonet fra en sensorisk receptor) 3.1. INTRODUKTION Som forberedelse læses de følgende afsnit om formål, sensoriske receptorer, præparatet, metode og apparatur Formål. Formålet med øvelsen er at demonstrere væsentlige forhold vedrørende sanseorganer og især funktionen af den enkelte sensoriske enhed, idet man studerer en sansecelles (her en strækreceptor) reaktion på relativt veldefinerede stimuli. Reaktionen registreres som impulsaktiviteten (impulsfrekvenser og impulsmønstre) i det tilhørende sensoriske axon. I den første række forsøg (3.4) undersøges sammenhængen mellem stimulusstyrke (receptorens strækningsgrad) og fyringsfrekvens. Herved demonstreres, at frekvensen stiger med stimulationsstyrken og endvidere, at frekvensen ændres med tiden trods fastholdt stimulusstyrke. Det sidstnævnte fænomen, adaptation, har en afgørende indflydelse på sansecellens reaktioner på både vedvarende og transiente stimuli. I den anden række forsøg (3.5) stimuleres receptoren dynamisk ved at vingen føres regelmæssigt op og ned i en tilnærmet sinusbevægelse. Herved ses, at det fremkomne periodiske impulsmønster er kodet, så det sideløbende indeholder en række informationer om vingens bevægelsesfrekvens og positionsområde. Observationerne fra den første forsøgsrække (3.4) kan anvendes til at forklare og forudsige impulsmønstrene under dynamisk stimulation Sensoriske receptorer. En sensorisk receptor er en biologisk transducer, som omsætter et indkommende signal (energi under en eller anden form) til nerveimpulser i den tilhørende sensoriske nerve. Den enkelte nerveimpuls er stereotyp, hvorfor det indkommende signal indkodes som en frekvens af nerveimpulser. En receptorcelle er specielt følsom for en bestemt fysisk eller kemisk påvirkning, dens adækvate stimulus. På grundlag heraf kan man skelne mellem f.eks. mekano-, kemo-, thermo- og fotoreceptorer. Sanseorganer er i reglen opbygget af sensoriske receptorceller og accessoriske strukturer, bl.a. støtteceller. De accessoriske strukturer er ofte væsentlige for sansning ved at regulere (evt. forstærke) påvirkningen af receptorcellerne. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

174 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 2 En sensorisk receptor kan opfattes som bestående af to elementer, en modtagerdel, hvor stimulusenergien absorberes og omsættes til elektrisk energi i form af et receptorpotential eller generatorpotential, og en afsenderdel, hvor generatorpotentialet transformeres til nerveimpulser. I én-celle-receptorer, primære receptorer, hvortil den valgte receptor hører (se ovenstående fig.), er begge elementer knyttet til samme celle, selve det sensoriske neuron. I to-celle-receptorer, sekundære receptorer, opstår receptorpotentialet i en specialiseret receptorcelle, som er synaptisk forbundet med det sensoriske neuron, og det præsynaptiske receptorpotential transmitteres til et postsynaptisk generatorpotential, som medfører impulsudløsningen. (Receptor- og generatorpotential havde oprindelig disse betydninger, men udtrykkene bruges nu i flæng.) I retina findes tertiære receptorer, hvor bipolære celler er indskudt mellem receptorcellerne (tappe og stave) og de sensoriske neuroner. (Se Alberts et al., The Cell, 3.udg. Fig. 22-6). Modtagedelen er i den valgte receptor knyttet til dendritter (evt. soma). Generelt gælder det, at stimulationen medfører en ændring af forholdet mellem cellemembranens ionkonduktanser, og at den resulterende ændring af membranpotentialet, (receptor- eller generatorpotentialet), er et gradueret respons, som afspejler stimulationsstyrken. Der er i reglen tale om en depolarisering forårsaget af øget Na + -konduktans ved åbning af særlige natriumkanaler. Depolariseringen medfører en elektrisk strøm i cellen, generatorstrømmen, fra modtagerdelen til naboområderne, som derved depolariseres. Afsenderdelen er knyttet til det naboområde, som har lavest tærskel for fyring af aktionspotentialer. Det kan fx være membranen i Ranvier'ske indsnøringer tæt ved det område, hvor generatorpotentialet opstår. I den valgte receptor er afsendedelen knyttet til axonhøjen (se ovenstående fig.). Når gene- Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

175 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 3 ratorstrømmen har bragt afsenderdelens membranpotential over tærskelværdien, fyres nerveimpulser med en frekvens, der stiger som funktion af generatorstrømmen og i reglen ligger i frekvensbåndet Hz. Den øvre grænse på 300 Hz er bestemt af axonets refraktærperiode. Den nedre grænse er bestemt af membranens kaliumkonduktans, G K, i tiden mellem to aktionspotentialer: Jo større G K er, jo større er tendensen til, at membranpotentialet tilnærmes kaliums ligevægtspotential, og jo mere forsinkes generatorstrømmens depolariserende effekt (jvf. afsnit om repetitiv fyring i noten om nerveimpulsen). For at muliggøre en lav sendefrekvens, besidder afsendermembraner (indkodningsmembraner) særlige kaliumkanaler ud over de spændingsafhængige kaliumkanaler, som medvirker til repolariseringen under nerveimpulsen. En sådan kanaltype vil blive omtalt neden for i forbindelse med adaptation. Adaptationsmekanismer Stimuleres en sensorisk receptor med et fastholdt, kontant stimulus, vil den som nævnt svare med en afferent impulsfrekvens, som afhænger af stimulationsstyrken. Dernæst vil frekvensen imidlertid falde med tiden. Hvis denne adaptation er fuldstændig, således at impulsfyringen ophører, kaldes receptoren fasisk. Fasiske receptorer sender derfor overvejende information om ændringer i omgivelserne. Hvis adaptationen er ufuldstændig, således at impulsfrekvensen falder til en konstant værdi, kaldes receptoren tonisk (eller fasisk-tonisk). Den relativt høje impulsfrekvens ved stimulationens begyndelse (dynamisk stimulationsfase) afhænger både af stimulationsstyrken og af den hastighed, hvormed stimulus sætter ind, mens den endelige toniske frekvens (stationær stimulationsfase) i reglen kun afhænger af stimulationsstyrken. Foruden en særlig høj følsomhed for ændringer, har toniske receptorer altså tillige den egenskab at informere om stationære tilstande. Adaptation kan bero på mekanismer knyttet til både modtagerdelen og afsenderdelen (samt feedback mekanismer i samspil med centralnervesystemet): Adaptation i modtagerdelen medfører ændringer i sammenhængen mellem stimulus-styrke og generatorpotential. Det kan fx bero på mekaniske egenskaber i de strukturer, der omgiver receptoren, spaltning af rhodopsin i retina, inaktivering af de kanaler, der betinger generatorpotentialet m.m. Fælles for dem alle er, at det mindskede generatorpotential alt andet lige medfører faldende generatorstrøm og dermed faldende fyringsfrekvens. Adaptation i afsenderdelen ses som ændringer i frekvensen trods fastholdt generator-strøm. Årsagen til denne type adaptation er i reglen en langsom forøgelse af kalium-konduktansen, som virker hyperpolariserende, hvorfor depolarisering til fyringstærkslen alt andet lige forsinkes. Denne form for adaptation skyldes ofte særlige "Ca 2+ -kontrollerede kaliumkanaler", hvis åbning afhænger af den intracellulære Ca 2+ -ionkoncentration, [Ca 2+ ] i. Ved hvert aktionspotential strømmer en smule Ca 2+ passivt ind i cellen (depolarisering medfører kortvarigt en øget Ca 2+ -permeabilitet), og da fjernelsen af kalciumionerne ved aktiv transport kan være relativ langsom, kan [Ca 2+ ] i stige og bevirke en øget kaliumkonduktans ved åbning af de anførte K + -kanaler. Fyringsfrekvensen vil nu falde og kan tænkes at nå et konstant niveau, hvis den øgede [Ca 2+ ] i bliver konstant på grund af en ligevægt mellem passiv influks og aktiv effluks af Ca 2+. Dynamikområde Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

176 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 4 Ved en receptors dynamikområde forstås forholdet mellem den laveste og højeste stimulationsenergi, som receptoren kan håndtere. Den anvendte receptor har som strækreceptorer i almindelighed et begrænset dynamikområde, der umiddelbart kan indkodes i førnævnte frekvensbånd på Hz. Store dynamikområder, fx de øvre ekstremer på 1:10 10 og 1:10 11 for hhv. fotoreceptorer og akustiske mekanoreceptorer, kan ikke umiddelbart indkodes i det relativt snævre frekvensbånd og kræver en bl.a. centralt betinget "volumenkontrol" (udtryk lånt fra radioteknikken), der fx udøves via accessoriske strukturer (jvf. øjets pupilreaktioner) Præparatet. På en vandregræshoppe, schistocerca gregaria, isoleres thoraxpartiet, hvorpå de 6 ben og 4 vinger er placerede. Thorax falder i 3 segmenter (benævnt pro-, meso- og metathorax), som hver især har tilknyttet et benpar. Mesothorax bærer desuden forvingerne og metathorax bagvingerne. Ved præparationen fjernes hoved og prothorax, alle benene samt størstedelen af abdomen og hele tarmkanalen. Desuden fjerner man tre af vingerne; kun højre forvinge bevares. Det anvendte præparat frembyder en enestående mulighed for at studere en isoleret, sensorisk enhed. Det er for de fleste sanseorganers vedkommende forbundet med betydelige tekniske vanskeligheder at isolere enten receptoren eller det tilhørende axon. Hos græshoppen er der ophængt en strækreceptor lateralt i thorax ved hvert af de fire vingeled. Denne mekanoreceptor består af et enkelt sensorisk neuron i forbindelse med en bindevævsstreng. Sansecellen er, som almindeligt hos invertebrater, af den primære type (se tidligere halvskematiske fig. af denne strækreceptor). Receptoren, dvs. bindevævsstreng med sansecelle, strækkes under vingeopslag og afslappes under nedslaget. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

177 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 5 Receptorens reaktion er typisk fasisk-tonisk, dvs., at under en strækning svarer receptoren initialt med en høj frekvens, der i løbet af nogen tid (ca. 1 min.) falder til en næsten konstant værdi. Ved en forkortning, fx efter et stræk, kommer svaret nærmest som et spejlbillede: Initialt falder frekvensen brat og som regel til nul (post-excitatorisk pause), men fyringen gentoptages og frekvensen stiger efterhånden til en konstant værdi svarende til deformationsgraden. Der er her naturligvis tale om de samme mekanismer som under den tidligere beskrevne adaptationsfase. I modtagerdelen vil de mekanismer, der før fik generatorpotentialet til at falde, nu gøre generatorpotentialet endnu mindre, når stimulus mindskes; og i afsenderdelen vil adaptation under den forudgående større strækning (fx en relativ høj [Ca 2+ ] i og dermed høj kaliumkonduktans) medføre, at nedsat generatorstrøm ikke kan give depolarisering til tærskel. Ca 2+ kan imidlertid nu fjernes fra afsenderdelen, og kaliumkonduktansen falder. Herved kan generatorstrømmen igen begynde at aktivere impulsudløsningen. Om vingeledsreceptorens funktion hos græshoppen skal kun bemærkes, at den er aktiv under normal flugt og har indflydelse på vingeslagsfrekvensen, idet denne falder til mindre end halvdelen af den normale værdi (17 vingeslag/s) efter destruktion af alle fire strækreceptorer. Ved siden af strækreceptorerne sidder et såkaldt chordotonalorgan, som hovedsagelig fyrer under nedslaget. Det sender nerveimpulser igennem betydeligt mindre axoner end strækreceptoren, og dets svar observeres derfor kun i enkelte præparater. (Chordotonalorganer er en særlig type af sanseorganer hos leddyr, karakteriseret ved udformningen af dendritternes støtteceller; de forekommer hyppigst som strækreceptorer eller lyd- og vibrationsmodtagere). Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

178 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side METODE OG FORSØGSOPSTILLING Præparatet fastsmeltes med voks (bivoks og hapiks 20:9) til præparatbordet på en simpel vingemanipulator. Thoraxpartiet befinder sig her ud for centrum af en vinkelmåler, og langs med dennes skala kan vingespidsen føres med en bevægelig arm. På vinkelmåleren findes forskydelige stopklodser, som gør det muligt at flytte vingen i hurtige, præcise "ryk" fra den ene stilling til den anden (stepstimuli). Man bør undgå at føre vingen højere end ca. 40 o over vandret stilling. Ved større vinkler kan der ske en utilsigtet bevægelse af de strukturer, hvortil receptoren hæfter, så receptorens deformation ikke svarer til vinklen. Ved høje vingestillinger kan der desuden være tale om en ufysiologisk overstrækning. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

179 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 7 Med en såkaldt "vingemaskine", kan strækreceptoren påvirkes periodisk. Vingen løftes af maskinen via et stykke sytråd og de mellemliggende vingenedslag besørges af vingesegmentets egen elasticitet, om end tråden ofte slækkes i den nederste stilling af vingemaskinen. På denne måde får receptoren et tilnærmet sinusoidalt "input". Man kan, vha. en motorstyringsenhed, variere frekvensen, og ved at hæve eller sænke vingemaskinen kan den gennemsnitlige strækningsgrad (vingeslagets amplitude) gøres større eller mindre. Hver gang vingen er løftet til den valgte topposition, afgiver maskinen en kortvarig spændingsimpuls, som kan registreres og styre registreringssystemet (trigning). Aktionspotentialerne afledes med en elektrode fra den nerve, som indeholder axonet fra receptoren. Nerven ligger på thoraxvæggens inderside og løber ned til den tilbageværende del af den centrale gangliestreng (CNS), som hos disse insekter befinder sig i den ventrale del af kroppen. På spidsen af den differente elektrode "fiskes" nerven forsigtigt frem (et hårdhændet træk kan føre til overstrækning). Den indifferente referenceelektrode anbringes et tilfældigt sted i abdominalresten. De svage elektriske signaler fra elektroderne føres via en forforstærker til registreringssystemet. Til udgangen på forstærkeren er en højttaler forbundet. Dette giver mulighed for at lytte til de varierende frekvensmønstre af aktionspotentialerne. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

180 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 8 Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

181 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 9 Registreringsapparaturet udgøres af: Computer, i hvilken der afvikles et program, specielt skrevet til de aktuelle apparater og eksperimenter. Kontrolenheden, som er indbygget i computeren, rummer elektronik til konvertering af data fra det eksterne måleudstyr. Display, skærm, der viser forsøgsparametre og registreringer. Keyboard, tastatur, hvor kommandoer indtastes. Printer, til udskrift af registreringer og forsøgsparametre. De eksterne måleapparater, som er beskrevet foran, forbindes via en "samlekasse" til kontrolenheden. I kassen findes en omskifter, der skifter signalet til registreringen mellem elektrode- og markeringssignal (markerer tiden, når vingen er i topposition). Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

182 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 10 Figuren viser et typisk skærmbillede. På skærmens hvide del vises de registrerede signaler, og nederst de aktuelle registreringsparametre. Andre funktioner er markeret til højre på skærmen. Med "vandrette" pilknapper vælges og med de "lodrette" ændres parametrene. RANGE viser måleområdet for registreringerne. TIME viser registreringstiden. Registreringer i MODE = Cont. sker næsten umiddelbart efter hinanden. Med MODE = Trig. påbegyndes registreringerne derimod når et registreret signal når ned under den rødstiblede linje på skærmen. Betegnelsen "registreringerne trigges" anvendes. Med denne metode kommer registreringerne til at stå under hinanden til venstre i skærmbilledet. Ved tryk på "S"-tasten skifter MODE til "Store" og registreringen lagres til senere bearbejdning. Op til 12 spor kan lagres. Det lille "stopur" viser tid fra det første tryk på "S". De nøjagtige registreringstidspunkter lagres tillige og vises øverst t.h. på skærmen. Lagrede spor vises grå, og feltet "TRACK" viser antallet. RANGE og TIME kan ikke ændres, når "lagring" er påbegyndt. Med "E"-tasten (ERASE) fjernes lagrede spor (et af gangen). "Mellemrum"-tasten skifter MODE tilbage fra "Store" til registrering og ur nulstilles. Før udskrift skal sporene (evt.) "redigeres", hvilket sker ved valg af en af de tre parametre til højre. (MODE skifter herved til "Recall"). Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

183 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 11 Med TRACK vælges et spor, som med HOR. POS og VER. POS kan forskydes horisontalt mod venstre eller vertikalt. (Ved store ændringer kan "Page-up" og "Page-down" anvendes i stedet for lodrette pilknapper.) Sporene kan udelades med SKIP (eller efterfølgende alligevel beholdes med KEEP). REDRAW gentegner de beholdte spor. Med SIZE kan amplituderne (for alle spor) ændres en faktor 2 nedad og tilbage igen. Med PRINT foretages udskrift. Når parametervalget, efter udskrift, føres tilbage til MODE fjernes lagrede spor, og sportælleren nulstilles og systemet er klar til nye registreringer. De lagrede spor fjernes dog først definitivt, når nye lagringer påbegyndes. Dette kan være hensigtsmæssigt, hvis man ved et uheld, under "redigeringen" af lagrede spor får skiftet MODE INDLEDENDE PROCEDURE Der er en opstilling for hver 2-4 studenter, og øvelsen varer ca. 3 timer. Instruktøren fremstiller præparatet, fastgør det til vingemanipulatoren og anbringer afledningselektroderne. Det kan nu høres fra højttaleren og ses på skærmen, at strækreceptoren til stadighed afgiver impulser, blot med forskellig hyppighed alt efter den stilling vingen holdes i. Bemærk at den nøjere placering af den differente elektrode har stor betydning for potentialets størrelse (afledning fra eksternt placerede elektroder). Der skrues op eller ned for højttaleren alt efter behovet for at lytte Registrering af et aktionspotential (AP). Man gør sig først bekendt med forsøgsopstillingens komponenter og hvorledes de er forbundet. Registreringsapparaturet indstilles til registrering af et enkelt aktionspotential: Med RANGE vælges en værdi, hvor AP's amplitude er passende (2-3 cm). TIME vælges til 20 ms. MODE = I trig AP'er skal nu registreres ved to stimulusstyrker, 15 o og 25 o. Før vingen op til 15 o og med "S"-tasten lagres hurtigt 3 spor med AP'er. Registreringer uden AP'er fjernes efterhånden med "E"-tasten. Registrering genoptages med "mellemrums"-tasten. Før herefter vigen tilbage til udgangspositionen (0 ) og lad den hvile i et minut. Før dernæst vingen op til 25 o og registrer yderligere 3 spor med AP'er. De lagrede spor kan herefter "redigeres" før udskrift, men dette er kun nødvendigt, hvis de ikke står pænt over hinanden i venstre side af skærmen: Redigeringen foregår under Mode = Edit Efter valg på TRACK kan registreringerne individuelt forskydes lodret (VER.POS.), så sporene fra de to stimulationsstyrker adskilles. (Ved store ændringer anvendes "Page-up" og "Page-down"). Der foretages en udskrift ("P"-tasten). Dette er kun muligt i Edit-mode. Husk at skrive forsøgsnr og stimulusstyrker (vingepositionsændring i grader) på udskriften. MODE sættes tilbage til "I trig". Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

184 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side REAKTION PÅ TRINVIS ÆNDRING AF VINGESTILLINGEN ("Stepstimuli") I denne række forsøg registreres impulsfrekvensen som funktion af tiden under konstante stimuli, dvs. bestemte strækningsgrader defineret som vingens stilling i forhold til en referenceposition. Reaktioner for såvel forøgelse som formindskelse af strækningsgraden registreres. Gennemførelse Efter følgende afsnit er gennemlæst, tilkaldes instruktøren, der vil assistere under indøvelse af proceduren. Registreringsområdet RANGE øges, så aktionspotentialets amplitude bliver ca. 1-1,5 cm. Registreringstiden TIME ændres til 200 ms. Nederste stopklods for vingedrejningen fastgøres ved 0 og den øverste i første omgang ved 10. Vingen placeres ved 0. Vinkelmålerskiven løsnes, og ved forskydning af denne og vingen vælges en referenceposition (0 ) af vingen, hvor den toniske frekvens ikke er alt for langsom og uregelmæssig. En frekvens på 6-10 impulser pr. sekund (2-3 AP'er på skærmen hver gang) vil være passende og opnås i de fleste præparater med vingen nær vandret position. Vinkelmålerskiven fikseres. a - c. Stepstimuli på 10, 20 og 30 ændring af vingeposition Når præparatet er "faldet til ro" (nogenlunde stationær frekevens) med vingen i udgangspositionen (0 ), lagres 4-6 registreringer ("S"-tasten). Heraf bestemmes en gennemsnitlig værdi for den toniske stationære impulsfrekvens, som indføres i TABEL 3.1. øverst i første kolonne. Sporene fjernes med flere tryk på "E"-tasten. Impulsfrekvensen skal nu bestemmes til følgende omtrentlige tider : 0, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 og 90 sekunder efter at vingen pludseligt (forsigtigt, men alligevel hurtigt) er ført op til den øverste stopklods. Til tidsbestemmelse anvendes uret på skærmen (eller et stopur hos en hjælper, som kan diktere tiderne). Uret på skærmen starter ved registrering af første spor. Registreringen af impulsfrekvensen foretages af én person, mens en anden passer vingemanipulatoren: vingen føres op, og der lagres straks derefter en registrering (skærmuret starter). Derefter lagres registreringer svarende til hvert af ovennævnte tidspunkter. De nøjagtige tidspunkter vises på skærmen. Inden for et halvt minut efter sidste registrering føres vingen hurtigt ned til udgangspositionen 0. Herved kommer en pause i fyringen, den postexcitatoriske pause (PP), som i de forskellige forsøg kan vare fra under et sekund til hen mod et minut eller mere. Pausen måles lettest ved at føre vingen ned når skærmuret står på 100 sekunder, hvorefter man lytter til højttaleren og kigger på uret, når man hører det første aktionspotentiale i højttaleren. Tiden for PP noteres (Tabel 3.1). I perioden herefter kan man tydeligt høre, at frekvensen igennem nogen tid er jævnt stigende mod det stationære niveau for 0. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

185 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 13 Pga. en fejl i programmet bliver det sidst lagrede spor ofte forskudt mod højre. Under Mode = Edit, Track = 12 kan sporet flyttes hen under de andre spor vha. pil-op/pil-ned tasterne. De lagrede spor kan herefter yderligere "redigeres", hvis det skønnes nødvendigt. Der foretages herefter en udskrift. Skriv forsøgsnr 3.4 (a) på udskrift. Sæt MODE tilbage til "I trig". Når aktiviteten efter typisk et til to minutter synes stationær, registreres den igen et par gange med henblik på at konstatere, om den toniske impulsfrekvens i udgangspositionen er reproducerbar (metode beskrevet tidligere). Noter frekvensen nederst i tabel 3.1. Hele den beskrevne procedure gentages nu med øverste stopklods fastgjort ved henholdsvis 20 og 30, men med nederste stopklods stadig på 0. Noter forsøgsnr. 3.4 (b) og 3.4 (c) på udskrifterne. Herved fås i alt tre serier af resultater, nemlig bevægelserne 0 10, 0 20 og d - e. Stepstimuli i trin på 10 o fra forskellig udgangsposition. Hidtil har udslagene været af forskellig størrelse, men med samme udgangspunkt. Her gentages proceduren, nu med samme udslag (10 ) men forskelligt udgangspunkt. Da forsøge 0 10 allerede er gennemført, mangler kun to nemlig og Den øverste stopklods fastgøres ved 20. Vingen og nederste stopklods føres op til 10. Når receptorens aktivitet er blevet stationær, bestemmes frekvensen på grundlag af nogle lagrede spor og noteres (Tabel 3.1, kolonne d og e øverst), hvor det så vil fremgå, hvorvidt den toniske frekvens i denne vingestilling er reproducerbar (samme som stationære værdier nederst i kolonne a og b). Alle sporene på skærmen fjernes ("E"-tast), og impulsaktiviteten registreres som før 12 gange i løbet af 90 sekunder efter opføring af vingen (nu ) Lad uret fortsætte til 100 sekunder og mål som før den postexitatoriske pause (vingen føres helt ned til 0 ). Sammenlign den med resultatet fra det tidlige "nedslag" fra 20 til 0. Hvert spor redigeres herefter som før med et AP helt til venstre på skærmen, og der foretages en udskrift, som mærkes 3.4 (d). Den stationære slutfrekvens udregnes og noteres for neden i tabel 3.1. Bemærk hvorvidt denne frekvens er i overensstemmelse med den stationære frekvens ved 20 i forrige forsøgsrække (0 20 ). Herefter udføres nøjagtig samme forsøg med øverste stopklods på 30, og hvor man starter med vingen på 20. Husk igen at måle og notere (Tabel 3.4 (e)) PP (30-0 ) til sammenligning med den tidligere målte værdi. Registreringer udskrives og mærkes 3.4(e). Overvej om resultaterne (initialfrekvens, slutfrekvens og PP) fra forsøg c og e stemmer overens med jeres forventninger. Forklar til jeres instruktor. f. "Omvendt" adaptation efter afslapning Forsøget skal illustrere to forhold: (i) PP's afhængighed af hvor længe et 30 's stræk har varet (her 5 sekunder til sammenligning med den tidligere observation efter mere end 1 min.) og (ii) impulsfrekvensens tiltagen fra PP til stationær frekvens ved 0. Stopklodserne skal fremdeles stå på 0 og 30. Når impulsfrekvensen (ved 0 ) er nogenlunde stationær lagres et spor, og ved sporets fremkomst på skærmen føres vingen op til 30. Efter 5 sekun- Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

186 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 14 der ved 30 føres vingen hurtigt ned igen, og der lagres straks et spor, hvorefter fortsatte lagringer sker ved ca. 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70 og 90 sekunder efter vingens nedførsel (brug eget stopur!). OBS: Lyt til højttaleren efter vingens nedførsel, for at måle PP, der indføres i Tabel 3.2. Registreringerne udskrives og mærkes 3.4 (f). Plot frekvensen efter vingens nedførsel som funktion af tiden. Overvej hvorfor øvelsen hedder omvendt adaptation. g. Receptorens svar på langsom dynamisk fase I tabel 3.2 indføres endelig receptorens svar, når vingebevægelsen (0-30 ) foretages betydeligt langsommere end før (blot 1-2 grader pr. sekund), både under opslaget og nedslaget. De to frekvenser bestemmes ud fra eet spor lagret umiddelbart efter opføring (ved 30 ) og 6-8 hurtigt lagrede spor umiddelbart efter nedføring (ved 0 ). Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

187 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side REAKTION UNDER RYTMISKE VINGESLAG (dynamisk stimulation) Instruktøren vil forklare og demonstrere vingemaskinen samt metoden for registrering. Det tilsigtes at demonstrere receptorens naturlige funktion gennem registrering af dens svar på fire situationer: lav og høj vingeposition, begge ved to forskellige vingeslagsfrekvenser. Inden alle disse observationer foretages, prøver man - på baggrund af forsøg at give en kvalitativ forudsigelse af resultaterne. Indstillinger MODE = "Trig". TIME = 200 ms. Nederste stopklods sættes ned i position P. Vingen frigøres fra vingeholderen, som derefter drejes nedad, bort fra vingen. En sytråd bindes på vingespidsen og fæstnes derefter på maskinens arm således, at vingen har et udslag på ca. 20, når maskinens arm er i topposition. Udførelse Der skal lagres registreringer fra fire forsøgssituationer ((i) - (iv)), to forskellige toppositioner af vingen, hver ved to forskellige vingeslagsfrekvenser. (i) Som udgangspunkt vælges en relativ lav hastighed af vingemaskinen og en passende, relativ lav vingestilling, vurderet efter impulsfrekvensen i vingens topstilling: På samlekassen vælges registrering af markering (af tidspunkt for topposition). Maskinen startes. Hastigheden justeres til lidt over 5 omdrejninger pr. sekund (knapt 200ms afstand mellem to markeringer på skærmen). Markeringssporet lagres! Registrering genoptages ("mellemrums"-tast). På samlekassen ændres til registrering af impulser. Vingemaskinens højde justeres, så der fremkommer 4-6 impulser i hvert impulstog. To registreringer fra denne situation lagres. Evt. dårlig (støj) registrering erstattes. Registrering genoptages. (ii) Vingemaskinen højde øges ca. 5 mm, så den gennemsnitlige vingestilling bliver højere oppe, mens omdrejningshastigheden forbliver uændret. To registreringer lagres! Registrering genoptages. ("Mellemrums"-tast) (iii) Registrering af markering vælges på samlekassen, og omdrejningshastigheden øges til ca. det dobbelte med vingepositionen uændret. Registrering af markering lagres! Registrering af impulstog vælges på samlekassen, og to registreringer lagres! (iv) Endeligt føres maskinen og dermed vingen ned til den første position, men stadig med den dobbelte hastighed. To registreringer lagres! Herefter "redigeres" sporene, således at der bliver mellemrum mellem de fire parvist registrerede situationer (VER.POS). Bemærk reproducerbarheden af impulsmønstrene indenfor hvert par registreringer. Der foretages en udskrift, som mærkes Forsøg 3.5. På udskriften noteres ud for de fire situationer, hver repræsenteret ved to spor: (i) lav vingeposition, (ii) høj vingeposition, (iii) høj vingeposition, (iv) lav vingeposition. Lav ((i) og (ii)) og høj ((iii) og Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

188 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 16 (iv)) vingeslagsfrekvens fremgår allerede af de to spor, som markerer tidspunkterne for vingens topposition RAPPORTVEJLEDNING Indledning. Formålet med øvelsen formuleres kortfattet. Resultaterne beskrives som kommentarer til forsøgsudskrifterne, som skal vedlægges. (i) Aktionspotentialet Vedr. udskrift fra forsøg : Det beskrives, hvorvidt (i) stimulationsstyrke og (ii) elektrodeplacering har indflydelse på de målte aktionspotentialers størrelse, og om disse observationer ved registrering med ekstracellulære elektroder er i overensstemmelse med Alt-eller-intet loven. Forklar yderligere AP ets tilsyneladende tri-fasiske udseende (stikord: strømsløjfer). (ii) Stimulation ved trinvis ændring af vingeposition Fra udskrifterne fra forsøg 3.4.a-e udmåles og beregnes resultater til Tabel 3.1). Desuden anskueliggøres de fem reaktionsforløb (1-90 s) i Tabel 3.1 på millimeterpapir i et enkelt koordinatsystem med tiden i sekunder som abscisse (x-akse) og fyringsfrekvensen i Hz som ordinat (y-akse). De fem kurver tegnes jævnt som middelforløb efter bedste øjemål. Anvend særskilt signatur eller farve for hver kurve. Ved de enkelte kurver anføres den relevante ændring af vingepositionen. Udfra ovennævnte figur beskrives kort receptorens reaktioner på trinvise, fastholdte stimulationer. Herunder påpeges også, hvorvidt receptorens initiale reaktioner på 10 's strækning fra forskellige udgangspositioner synes ensartede, eller om de tillige synes relaterede til vingepositionen. Endvidere kommenteres ud fra ud fra de kurver, hvor adaptationen er særlig udtalt (i reglen strækning til 20 og 30 ), om stimulationsstyrken har væsentlig indflydelse på adaptationens tidsforløb: Det er umuligt at afgøre, hvornår adaptationen er tilendebragt, men (forudsat en eksponentiel frekvensaftagen mod stationær værdi) kan tidsforløbet karakteriseres ved adaptationens halveringstid, T½, dvs. den tid efter stimulationens begyndelse, hvorunder fyringsfrekvensen (F Hz) falder til halvdelen (F T½ ) af forskellen mellem den initiale frekvens og det sluttelige, stationære frekvensniveau. Svarende til F T½ aflæses T ½ på figurens abscisse. Angiv en eventuel forskel mellem receptorens initiale svar på hurtig og på langsom strækning (hævning af vingepositionen 30 (Tabel 3.1 og 3.2)). Beskriv kort den postexcitatoriske pauses (PP) afhængighed af den forudgående stræknings størrelse, af stimulus' varighed, og af hastigheden, hvormed receptoren slappes (Tabel 3.1 og 3.2). Endelig kommenteres kort (udskrift 3.4 f), om den "omvendte adaptation efter vingens nedslag viser principielle ligheder (tidsforløb, stationær slutfrekvens) med adaptation efter vingens opslag. (iii) Dynamisk stimulation ved rytmiske vingeslag Udskrift 3.5 giver (hvis det er lykkedes at få det hele med) billede af impulsmønstret i fire situationer til illustration af mønstrets afhængighed af vingeslagsfrekvensen og vingeslagsamplituden. Registreringer af to spor i den enkelte situation tjener til illustration af mønstrets reproducerbarhed, dvs. grad af ensartethed som udtryk for hvor præcist receptoren indkoder situationen i sit budskab til centralnervesystemet. Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

189 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 17 Angiv omkring hvilken vingeposition impulstogene viser sig. Angiv omtrentligt impulstogenes varighed i de undersøgte situationer. Impulsfrekvensen under impulstogene skal ikke nødvendigvis angives. Det er vigtigere at gøre opmærksom på, i hvilke situationer impulsfrekvensen er relativt høj og relativt lav (afhængighed af vingeslagsamplitude og vingeslagsfrekvens). Beskriv om impulsfrekvensen er konstant under et impulstog, eller om man tillige kan ane indkodede informationer om, hvorvidt vingen er på vej op eller ned. Angiv om receptorens svar var mest reproducerbart under stepstimuli eller under rytmiske vingeslag. Diskussion af resultaterne Tegn i samme koordinatsystem relationerne mellem stimulus (gradtallet for øverste stopkods) som abscisse og (1) det endelige stationære frekvensniveau for alle fem forsøg i tabel 3.1, (2) den initiale frekvens efter de tre strækninger fra 0. Indsæt tillige med særskilt signatur de initiale reaktioner på 10 's strækning (10 20 og ). Diskuter om figuren giver støtte til den antagelse, at den stationære frekvens alene er bestemt af strækningsgraden, og om figuren også illustrerer det almindelige forhold, at den initiale frekvens tillige indeholder information om ændringernes størrelse. Forklar hvorfor den initiale frekvens efter stimulation (0 30 ) og PP efter afslapning (30 0 ) kan afhænge af (og dermed informere om) vingebevægelsens hastighed. (Kan forklaringen være en vis grad af adaptation allerede under en langsom vingebevægelse?) Prøv at forklare, hvilke begivenheder i receptoren (bindevævsstreng og sansecelle) der må formodes at ligge til grund for impulsfrekvensens stigning i tilslutning til stimulationen (strækning), og hvilke ændringer der kan tænkes at betinge såvel adaptationen under fastholdt stimulus som den postexcitatoriske pause efter afslapning. På grundlag af receptorens reaktioner på stepstimuli gives en mulig forklaring på det almindelige impulsmønster under dynamisk stimulation og på de modifikationer, som ses efter ændringer af vingeslagets frekvens og amplitude. (Hvis man har lyst og tid dertil, kan man i forbindelse hermed prøve at diskutere, hvilken betydning adaptationsmekanismerne kan have under rytmiske vingeslag, hvor de enkelte impulstog er meget kortvarige i forhold til adaptationens tidsforløb under stepstimuli: Hvis adaptationsmekanismen fx beror på ændringer af [Ca 2+ ] i (i axonhøjens cytosol), og [Ca 2+ ] i jo er en balance mellem passiv Ca 2+ -influks under aktionspotentialer og aktiv effluks under PP, må den rytmiske vekslen mellem impulstog og PP medføre en vis middelværdi af [Ca 2+ ] i og dermed spille en rolle for impulsmønstrene). Som konklusion angives, hvilke korrektioner af vingefunktionen centralnervesystemet kan foranledige på grundlag af information fra receptoren. Litteraturhenvisninger: 1. Gettrup, E. (1962). Thoracic Proprioceptors in the Flight System of Locusts. Nature, 193, Wilson, D.M. (1968). The Flight-Control System of the Locust. Sci. Amer. 218, Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

190 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 18 Vingeledsreceptor TABEL 3.1 REAKTIONER PÅ STEPSTIMULI stepstimulus a 0 10 b 0 20 c 0 30 d e stationær frekvens (Hz) ved udgangsposition Impulsfrekvens (Hz) til tiden t (sek.) efter stræk t Hz t Hz t Hz t Hz t Hz 1 ca. 0 s ca. 2 s 3 ca. 5 s 4 ca. 10 s 5 ca. 20 s 6 ca. 30 s 7 ca. 40 s 8 ca. 50 s 9 ca. 60 s 10 ca. 70 s 11 ca. 80 s 12 ca. 90 s P-P tid (sek.) Stationær frekvens ved 0 efter forsøg T 1/2 (sek) Frekvens v. T 1/2 TABEL 3.2. Forsøg F: PP efter strækning 0-30 i ca. 5 sekunder: Forsøg G:Frekvens efter langsom strækning 0-30 : Frekvens efter langsom nedførsel 30-0 : s Hz Hz Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

191 BF-3: VINGELEDSRECEPTOR HOS GRÆSHOPPEN (impulsmønstre i axonet fra sensorisk receptor) Side 19 Medicinsk Fysiologisk institut; 10. september 2002

192 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 1 BIOFYSIKØVELSE 4 KONTRAKTION I TVÆRSTRIBET SKELETMUSKULATUR (Isometrisk og isotonisk kontraktion) 4.1. INTRODUKTION 4.2. FORSØGSOPSTILLING 4.3. ISOMETRISK ENKELTKONTRAKTION 4.4. DET ISOMETRISKE LÆNGDE-SPÆNDINGSDIAGRAM 4.5. SUMMATION 4.6. KRAFTKURVE UNDER TETANUS MED ISOTONISK FASE 4.7. ISOTONISK KONTRAKTION 4.8. KONTRAKTION MED NEGATIV HASTIGHED (EXCENTRISK KONTRAKTION) 4.9. RAPPORTVEJLEDNING RAPPORTENS UDFÆRDIGELSE SPØRGSMÅL TABELLER 4.1. INTRODUKTION Formålet med øvelsen er at illustrere nogle mekaniske egenskaber ved den tværstribede muskel under isometriske og isotoniske kontraktioner. Under isometrisk kontraktion undersøges det tidsmæssige forløb af kontraktionskraftens udvikling. Endvidere undersøges kontraktionskraftens afhængighed af musklens strækningsgrad og af stimulationsfrekvensen. Under isotonisk kontraktion, hvor kontraktionskraften er konstant, undersøges belastningens indflydelse på musklens forkortningshastighed og ydre arbejde FORSØGSOPSTILLING b m t m s Muskelpræparatet Musculus semitendinosus (caput longum) (m) fra frøen Rana Pipiens (Leopardfrø) har ca omtrent lige lange, parallelt arrangerede fibre. Musklen er på forhånd udpræpareret og forsynet med små trådløkker på senerne, og vil af instruktøren blive ophængt i muskelkammeret mellem krogene på den isometriske og den isotoniske transducers vægtarm.

193 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 2 T1 B S E A L T m K l Muskelkammeret (k), er fyldt med en "fysiologisk" saltopløsning (Ringers opløsning) Den isometriske krafttransducer (A) genererer en elektrisk spænding (T2). Ændring af muskellængden udføres ved forskydning af transduceren med stilleskruen (l). Den isotoniske bevægelsestransducer (B) genererer en spænding (T1). Musklen kan v. h. a. et snoretræk og vægtarmen (1:15) belastes med lodderne (L). Stimuluselektroderne (E) sender strøm gennem kammeret til samtidig aktivering af alle fibre. Samlekassen indeholder en "stimulator" og en omskifter til registrering fra de to måletransducere. En kraftpåvirkning på 1 N (Newton) resulterer i en udgangsspænding på 100 mv. Bevægelsestransduceren afgiver en spænding på 1 mv for 1 mm. Transducerne er hver forsynet med en 0-stillingsknap. Recording St imu lation E Erase P Print X Exita te Se lect/cha nge RANG E RECORD ER STIMULATOR TIME OFFSET PULSE INT ERVAL MODE Pa ra meters Sk æ rmb illede. På skærmen vises udgangssignalet fra den transducer, der er valgt (Recording) og stimulationsforløbet (Stimulation). Varigheden af de enkelte impulser er altid 1 ms. Nederst på skærmen vises de aktuelle forsøgsparametre, som udvælges med "vandrette" piltaster; med "lodrette" piltaster eller "Page-up" og "Page-down" ændres værdien. RANGE=måleområde (=forstærkning) TIME=registreringstid OFF-SET =grundlinieforskydning PULSE=stimulationsamplitude

194 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 3 INTERVAL =impulsafstand MODE=stimulusmønster. "E"-tasten fjerner den sidst lagrede registrering. (max 10 lagrede registreringer). "X"-tasten udløser stimulus og den dertil hørende registrering lagres. En hvilken som helst anden taste, f.eks. "Mellemrum"-tasten, ("any key to continue") genstarter registrering. "P"-tasten udskriver på printeren de lagrede registreringer og tilhørende parametre. Udskrivning er kun muligt efter "X". En forudsætning for at opnå reproducerbarhed og sammenlignelige resultater er, at flere registreringer i et forsøg udføres så hurtigt som muligt efter hinanden. Unødig stimulering af musklen bør undgås. 4.3 ISOMETRISK ENKELTKONTRAKTION Registreringsparametrene indstilles som vist nedenfor: RECORDER STIMULATOR 50 mv 100 ms 0.00 V 0.00 V 90 ms SINGLE RANGE TIME OFFSET PULSE INTERVAL MODE Bemærk at intervallet ved enkeltstimuli er uden betydning. De angivne indstillinger er kun vejledende og må (og skal!) ændres afhængig af den undersøgte muskels egenskaber, således at registreringskurven bliver så stor som mulig og at skærmen udnyttes. Vægtarmen på den isotoniske myograf skal være fikseret ved belastning med alle (10-12) lodder (som musklen normalt ikke kan løfte). Med omskifteren på "samlekassen" vælges målesignal kommende fra den isometriske myograf (kraftransducer) (omskifter pegende mod dennes tilslutning). Kontrol af transducer Da transducerens udgangssignal uden kraftpåvirkning skal være nul, forskydes krafttransduceren mod venstre ved hjælp af stilleskruen, indtil musklen er tydeligt slap. Registreringssporet bør ligge på skærmens 0-linie. Hvis ikke, skal transduceren nul-stilles således at registreringssporet ligger på nullinien. Transducerens 0-stillingsknap er meget følsom og skal betjenes med rolig hånd, fordi grundlinien helt kan forsvinde. Derefter strækkes musklen lidt, indtil registreringssporet viser et svagt udslag på 0,5-1,0 mv (normalt 2-3 mm mere end "ligevægtslængden", dvs. den længde, hvor musklen ikke mere hænger slap, men hvor grundlinien endnu ikke har flyttet sig ). Den optimale stimulationsstyrke bestemmes derefter ved at stimulere musklen under gradvis forøgelse af stimulationsstyrken efter følgende procedure. 1. Stimulationsamplitude (PULSE) øges fra 0 til 4V. 2. Stimuler musklen ved tryk på "X"-tasten. 3. Genoptag registrering med "Mellemrum"-tasten. Sekvensen 1-3 gentages, idet stimulusamplituden (PULSE) øges i spring på 2V, indtil muskelkontraktionen på skærmen ikke mere forøges. Nu er stimulationsstyrken antagelig større end nødvendigt, hvorfor amplituden trinvis nedsættes med 1V indtil kurvens højde aftager. Derefter øges stimulusstyrken med 1-2 V ad gangen indtil denne bliver netop "supramaksimal". Registreringsfølsomheden RANGE bør tilpasses således at udslaget fylder omkring 2/3 dele af skærmen. Indstilling af optimal muskellængde (længden, som giver maksimal kontraktionskraft). Ved tiltagende strækning fra ligevægstslængden stiger enkeltkontraktionens kraft, derefter forbliver den mere eller mindre konstant, og ved stærkere strækningsgrader falder den med aftagende overlapning af filamenterne til nul (se figur). Kurvens eksperimentelt bestemte form adskiller sig fra den form af længde-spændings-diagrammet, som er teoretisk baseret på aktin og myosinfilamenternes overlapning, dvs. kurven har ikke et maksimum men et plateau. Årsagen er bl.a. at ikke alle sarkomerer i en muskelfiber har den samme længde, og at fibrenes længde varierer. Formålet med forsøget er at finde overgangen fra den opadgående del af kurven til plateauet, dvs. den mindste strækning som giver maksimal eller næsten maksimal kraft. Kurvens nøjagtige forløb bestemmes senere.

195 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 4 I første omgang undersøges, om muskellængden fra forrige forsøg er kortere eller længere end den optimale muskellængde. På skærmen findes allerede en enkeltkontraktion fra sidste forsøg. Musklen strækkes yderligere 0,5-1 mm og stimuleres. Bemærk at grundlinien har flyttet sig opad. Hvis amplituden af den nye kontraktion bliver større, strækkes musklen endnu 0,5-1 mm og stimuleres. Strækningen og stimuleringen gentages indtil kontraktionskraften ikke mere stiger. Hvis kraften ikke stiger ved strækning eller endda falder, afslappes musklen i trin på 0,5 mm indtil kraften begynder at aftage. Den korteste længde, som giver maksimal kontraktionskraft (optimal længde) markeres ved længde-indstillingskrue: den lille messingplade, som findes på transducerens sokkel skubbes forsigtigt med en stift, så dens lodrette streg befinder sig ud for stregen 0 eller 10 eller 20 på millimeterskalaen. Pas på at transducerindstillingen ikke ændres! Tilkald i givet fald instruktøren inden transduceren bliver forskudt ved et uheld. Messingpladens position bibeholdes til det følgende forsøg. Muskelbugens længde (uden sener) i millimeter måles omtrentligt med en målepasser og noteres i Tabel 4.1. For igen at kontrollere transducerens 0-stilling, afslappes musklen. Hvis grundlinien derefter ikke er på 0-linien, indstilles den med transducerens 0-stillingsknap. Derefter strækkes musklen igen til dennes optimale længde ved hjælp af markeringen fra før. Grundlinien bringes derefter til 0-linien med OFF-SET således at der kompenseres for musklens hvilespænding. Alle lagrede registreringer slettes. Stimuler igen musklen. Der skulle nu være optegnet en isometrisk enkeltkontraktion. Der foretages en udskrift ("P"-tasten). Senere indføres i Tabel 4.2 følgende tider, angivet i ms: 1. Latenstiden, dvs. tidsafstanden mellem stimulation og kontraktionens begyndelse. 2. Tiden for udvikling af maksimal kontraktion (efter latenstiden). 3. Hele kontraktionsforløbets varighed (hvis den kan aflæses). I Tabel 4.3. indføres enkeltkontraktionens kontraktionskraft (toppunktet) DET ISOMETRISKE LÆNGDE-SPÆNDINGS-DIAGRAM Princippet: Forsøget går ud på at måle musklens kraft i relation til strækningsgraden. Den passive spænding (hvilespænding) ved de forskellige strækningsgrader (længder) aflæses som OFF-SET, når registreringssporet er bragt tilbage til 0-linien, og kontraktionskraften (ekstra-kraft), aflæses på registreringssporets udslag. Musklen afslappes trinvis indtil kraftudviklingen ved stimulation falder brat, men den må ikke strækkes mere end til en længde, hvor kontraktionskraften er faldet til ca. 1/3 af den maksimale værdi. Først stimuleres musklen ved den længde, som giver maksimal kontraktion, og derefter udføres forsøget ved forskellige muskellængder i den rækkefølge, som er skitseret på figuren. Antallet af nødvendige registreringer afhænger af musklen, dvs. der kan være flere eller færre registreringer end anført i figuren og i Tabel 4.4. Ved at følge dette system fås to målinger for hver muskellængde. Det er vigtigt, at musklens optimale længde er markeret med den lille messingplade, som markerer transducerposition 0 (Tabel 4.4). På skærmen findes allerede værdierne til måling 1; disse indføres i Tabel 4.4. Der indføres kun målinger i mv; omregningen i Newton foretages senere. Forsøget bør udføres uden afbrydelse. Forsøgets enkelte trin: A. 1. Musklen afslappes 1 mm ad gangen, transducerpositionen (-1,-2,-3 etc., ) noteres i Tabel 4.4, OFF-SET justeres hver gang og noteres i Tabel Musklen stimuleres efter hver ændring af længden. 3. Kontraktionskraft aflæses på skærmen og indføres i Tabel 4.4. Afslapning af musklen foretages indtil kraften falder til næsten nul B. 1. Musklen strækkes igen 1 mm ad gangen, transducerpositionen (-4,-3,-2,-1, 0,+1 etc., ) noteres i Tabel 4.4, OFF-SET justeres og noteres i Tabel Musklen stimuleres efter hver ændring af længden. 3. Kontraktionskraft aflæses på skærmen og indføres i Tabel 4.4. Strækningen af musklen foretages indtil kraften er faldet til 1/3 af max

196 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 5 C. 1. Musklen afslappes igen 1 mm ad gangen indtil stilling 0, transducerpositionen noteres i Tabel 4.4, OFF-SET justeres og noteres i Tabel Musklen stimuleres efter hver ændring af længden. 3. Kontraktionskraft aflæses på skærmen og indføres i Tabel 4.4. Længe-spændings-diagram. Tallene angiver målingernes rækkefølge SUMMATION Summation efter to stimuli. TIME: 250 ms. RANGE øges, således at der er plads til to enkeltkontraktioner oven på hinanden. MODE : DOUBLE. INTERVAL.: 110 ms. Musklen stimuleres. Hvis registreringen passer til skalaen (kontraktionsudslaget må ikke overstige 1/2 af skærmen), bevares registreringen, og de følgende kontraktioner udløses med INTERVAL 90 ms, 70 ms, 50 ms, 30 ms, 20 ms, 15 ms og 10 ms. Kurvens initiale fase flyttes dermed til venstre, dvs. den bliver stejlere og stejlere. Prøv også 8 ms INTERVAL og undersøg, om den initiale fase bliver endnu stejlere end ved 10 ms INTERVAL. Hvis kurven ved 8 ms INTERVAL ikke adskiller sig fra kurven med 10 ms INTERVAL, slettes den sidste kurve. Der foretages en udskrift. (Skriv forsøgsnr ) på udskriften) Senere aflæses til Tabel 4.3: Tidsafstanden mellem stimuli (INTERVAL) for summationskurven som er stejlest på opadstigende fase. Beregn frekvenserne svarende til 10 ms og 8 ms INTERVAL. Tetanisk kontraktion Dette forsøg skal belyse, hvordan musklen opbygger en tetanisk kontraktion, hvis frekvens trinvist øges. MODE: TRAIN. Herved afgiver stimulatoren et tog af impulser. TIME: 500ms. RANGE således at den er 4-6 gange større end enkeltkontraktionskraften. INTERVAL sættes først svarende til en stimulationsfrekvens på 20 Hz. Grundlinien bringes til 0-linien ved hjælp af OFF-SET (værdien af OFF-SET skal ikke noteres).

197 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 6 Musklen stimuleres. Hvis kurven viser stærkt stigende tendens, skal musklen muligvis afslappes 1-3 mm, fordi den optimale længde for tetaniske kontraktioner er i reglen 10-15% kortere end for enkeltkontraktioner. Hvis første og sidste udslag er nogenlunde lige store skal længden ikke ændres. Spørg en instruktør. Der skal nu på samme skærmbillede optegnes yderligere kurver af tetaniske muskelkontraktioner med stimulations-frekvenser 33 og 100 Hz. Hvis kurven for to stimuli med 8 ms INTERVAL i det foregående forsøg var stejlere end kurven for 10 ms INTERVAL registreres endnu en tetanisk kontraktion med 125 Hz (efter 1 minuts pause). Hvis musklen under stimulation med højeste frekvens er i stand til at løfte lodpanden med alle lodderne, fås en isotonisk i stedet for en isometrisk tetanus. Det ses ved, at tetanuskraften (kurven) efter et skarpt knæk bliver konstant (vandret, se forsøg 4.6.). Ved mistanke herom stimuleres musklen igen, idet man sikrer isometriske forhold ved at fiksere den bevægelige arm ved at fastholde den med fingeren let mod stopskruen. Der skulle nu være 3 eller 4 kurver, som muliggør en sammenligning af "takket" og "glat tetanus". Frekvensen som giver både glat tetanus og maksimal kraft betegnes som fusionsfrekvens. En yderligere forøgelse af stimulationsfrekvensen vil ikke forøge kraften. Der foretages en udskrift. Indfør senere i Tabel 4.3. det maksimale udslag i mv for den glatte tetanus (kraft P 0 ) til sammenligning med kontraktionskraften ved enkeltkontraktion. Efter at en instruktør har set kurvesættet slettes registreringerne KRAFTKURVE UNDER TETANUS MED ISOTONISK FASE Der udløses igen en glat isometrisk tetanus (evt. skal transducerens arm holdes mod stopskruen, se sidste forsøg). Bevar registreringen. Fjern 4-9 lodder fra lodpanden (færre ved stærke og flere ved svage muskler), og stimuler musklen igen. Foretag en udskrift (Husk forsøgsnr på udskrift!) Læg mærke til, at anden kontraktion indledes med en isometrisk fase, identisk med første kontraktion, og at kraften dernæst er konstant (isotonisk) svarende til belastningen i den fase, hvor musklen forkorter sig og løfter lodderne ISOTONISK KONTRAKTION Forkortning af musklen kræver mere energi end kraftudvikling uden forkortning, da der udover kraft præsteres et ydre arbejde. For at sikre optimal ATP-forsyning under alle kontraktioner bør unødig stimulation derfor undgås, og musklen skal hvile mindst et minut mellem kontraktionerne. Forsøgene har to formål. i) Ved registrering af den initiale kontraktionshastighed under både enkeltkontraktion og glat tetanus undersøges, om kontraktionshastigheden er påvirket af stimulationsfrekvensen. ii) Dernæst undersøges belastningens indflydelse på forkortningshastighed, ydre arbejde og effekt. TRANSDUCERSKIFT TIL ISOTONISKE TRANSDUCER. TIME: 500ms. RANGE: 10mV. MODE: TRAIN. INTERVAL: svarende til 100 Hz (evt. 125 Hz). Fjern alle lodderne fra lodpanden. Dermed kan musklen forkorte sig (næsten) uden belastning. Musklens strækning skal være maksimal uden at den trækker vægtarmen fra stopskruen - tilkald instruktøren. Registreringssporet bør være på 0-linie. Små afvigelser kan rettes med OFF-SET. Nulstillingsskruen på denne transducer er særligt følsom. Der stimuleres! Kontraktionskurven skal udfylde skærmens højde mest muligt, hvorfor RANGE eventuelt må korrigeres. I givet fald kan grundlinien lægges helt i bunden af skærmen. Bemærk dog, at aflæsningen fra y-aksen i så fald skal korrigeres Registreringen bevares.

198 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 7 Den initiale forkortningshastighed efter ét stimulus og under tetanisk stimulation. MODE: SINGLE Kontroller om grundlinien er samme sted som før, ellers trykkes vægtarmen forsigtigt mod stopskruen. Musklen stimuleres. På skærmen ses en isotonisk tetanus og en isotonisk enkeltkontraktion. Udskrift. Registreringen af enkeltkontraktion slettes, men den tetaniske kurve bevares. (skriv forsøgsnr på udskrift). Hastigheds-belastningsrelation MODE: TRAIN Forsøget gennemføres med stigende belastning (1 lod at gangen) og bevarelse af alle kurver. Belastningen noteres i Tabel 4.5. Første kontraktion under belastning med lodpanden alene (0,015 N) findes på skærmen. (Hvert lod belaster musklen med 0,04 N) Vent mindst 1 minut mellem kontraktionerne, og belastningen øges trinvis. Musklen stimuleres igen. Når belastningen bliver så stor, at musklen ikke længere forkortes ved stimulation, foretages en udskrift (skriv forsøgsnr på udskrift) Forkortning S 1 S 1 S n X 1 S 0 X Tid n n Forsinkelse for n te kontraktion 4.8. KONTRAKTION MED NEGATIV HASTIGHED (EXCENTRISK KONTRAKTION) (DEMONSTRATION SOM UDFØRES AF EN INSTRUKTØR) Muskler med ikke mere en 40 mv max. tetanisk kraft er bedst egnede. Alle lodder sættes på. TRANSDUCERSKIFT TIL ISOMETRISK TRANSDUCER. RANGE: 100 mv TIME: 500 ms INTERVAL: svarende til 100 Hz MODE: TRAIN Krafttransduceren forskydes således, at stimulation igen frembringer en isometrisk tetanisk kurve som i forsøgene 4.5. eller 4.6.

199 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 8 Længdetransducerens arm forskydes med venstre pegefingerens spids 3-6 mm til højre, således at fingeren erstatter stopskruen. Fingeren skal holdes helt stille. Krafttransduceren forskydes tilsvarende til højre, således at en ny tetanus svarer nogenlunde til den først udløste. Muligvis er flere forsøg nødvendige for at finde den rigtige transducerposition. Fingeren må ikke røres. Bemærk at kontraktionen kan føles i fingerspidsen. Der udløses endnu en tetanus og fingeren fjernes hurtigt så snart kontraktionen kan føles. Loddernes fulde last skal strække musklen midt under kontraktionen. Den nye kurve burde vise en stejl stigning af kraften ca. 200 ms efter kurvens begyndelse. Hvis dette ikke er tilfældet, fjernes den sidste kurve og forsøget gentages (evt. med en instruktør med kortere reaktionstid). Kurven udskrives til alle hold som overværer demonstrationen RAPPORTVEJLEDNING (A) (O) (B) (C) Isometrisk kontraktion Isotonisk kontraktion Isotonisk kontraktion under belastning KE KE KE KE SE SE SE SE Indspændt. Frit bevægelig Belastet. SE : Det serieelastiske element. KE : Det kontraktile element. : Kontraktion. Teoretisk grundlag for rapportens udfærdigelse For at lette forståelsen af de isometriske og isotoniske kontraktionsforløb samt den indbyrdes sammenhæng mellem disse to kontraktionstyper er det bekvemt at betragte den tværstribede muskel i form af en simpel mekanisk analog, bestående af et kontraktilt element (KE) i serieforbindelse med et ret stift elastisk element, det serieelastiske element (SE). Figuren er en funktionel men på ingen måde en strukturel analog. Det kontraktile element er afbildet som en vinkel, der symboliserer de glidende filamenters position og bevægelse i forhold til hinanden: Vinklen formindskes (=sarkomerforkortning) under kontraktion og kan åbnes i hvile under passiv strækning. Det serieelastiske element er vist som en spiralfjeder, der symboliserer elasticiteten af sener samt selve myofibrilstruktur. Disse strukturer udstrammes, når musklen kontraheres mod en ydre belastning. Kontraktion Ved muskelaktivitet sker der under alle omstændigheder en forkortning af det kontraktile element, hvorimod muskelbugen som helhed ikke behøver at forkortes (isometrisk kontraktion). Graden af forkortning bestemmes af belastningens størrelse, og de mekaniske egenskaber, som modellen skal illustrere, ses bedst ved først at betragte to ekstreme situationer ved aktivitet: (I) Kontraktion uden ydre belastning (maksimal forkortning af muskelbugen). (II) Kontraktion med fikserede seneenheder (forkortning af musklen er ikke mulig. (i) Maksimal forkortningshastighed (V max ) og minimal kraftudvikling. (Foranstående figur, 0 B). Når musklen kontraherer sig uden ydre belastning, altså uden ydre modstand, sker der en maksimal forkortning med maksimal hastighed. Det ubelastede serieelastiske element følger med uden udstramning, dvs. at der ikke opstår nogen ekstra mekanisk spænding i dette. Det kontraktile element udfører under disse betingelser ikke andet arbejde, end der kræves til at overvinde en svag indre modstand ved muskelbugens formændring.

200 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 9 (II) Maksimal kraft (P 0 ), ingen muskelforkortning. (Foranstående figur, 0 A) Når musklen kontraheres uden mulighed for forkortning af musklen som helhed, vil forkortningen af det kontraktile element resultere i en tilsvarende udstramning af det serieelastiske element. S er meget stift elastisk, og udspændingsgraden er stærkt overdrevet på figuren. Den tilsyneladende forkortning af KE under isometrisk kontraktion (A) er ligeledes stærkt overdrevent tegnet; normalt er den kun ca. 2%. Ved den isometriske kontraktionskurves toppunkt er forkortningen af det kontraktile element og udstramningen af serieelasticiteten netop ophørt, og kraften i det kontraktile element er da i ligevægt med serieelasticitetens spænding. Kraften P 0 registreres ved isometrisk tetanus ved stimulation med fusionsfrekvens. Betragtes herefter en gradvis overgang mellem disse to ydersituationer, dvs. muskelkontraktioner med stigende efterbelastning (belastning, som ikke medfører strækning af den hvilende muskel, hvilket i øvelsen er sikret med stopskruen bag den bevægelige arm), ses følgende: Når musklen er i stand til at forkorte sig mod den ydre belastning P (Foranstående figur, 0 C), vil den først kontraheres uden forkortning, altså isometrisk, indtil muskelkraften (= spændingen i serieelasticiteten) bliver lige så stor som den ydre belastning. Kraften kan stige over P 0, hvis forkortningshastigheden bliver negativ, dvs. hvis en maksimal kontraheret muskel bliver yderligere belastet og dermed strakt. Dette betyder, at musklen han "holde" en højere spænding end den selv kan udvikle. Sådanne "excentriske" kontraktioner er hyppige ved normal brug af muskulaturen, og de kan beskadige muskulaturen eller senerne (fibersprængning, seneruptur). Hvilespænding En hvilende muskel yder en passiv elastisk modstand, hvis den bliver strakt. Hvilespændingen stiger ikke lineær med strækningsgraden, men kurvens stigning forøges ved tiltagende muskellængde. Denne modstand, som tilskrives det parallel-elastik element,pe, er parallel med kæden kontraktil element (KE) - serieelastisk komponent(se) (se figur nedenfor). PE forkortes under kontraktionen og spiller derfor ingen rolle ved isometrisk eller isometrisk kontraktion. Denne operationelle definition af PE siger ikke noget om, hvilke strukturer i musklen der yder modstand ved passiv strækning. Principielt kunne denne modstand bestå i, at myosin- og aktinfilamenterne også i hvile var bundet til hinanden, men man ved, at A- og I-filamenter glider let i forhold til hinanden så længe musklen ikke er aktiveret. Man har tidligere påstået, at den passive hvilespænding (som måltes som OFF-SET ved bestemmelse af længde-spændings-diagrammet) beror på udspænding af sarkolemma og det interstitielle bindevæv. Det er dog vist, at hvilespændingen ikke ændrer sig, hvis man fjerner bindevæv og sarkolemma fra en muskelfiber, og i dag menes generelt at det parallelelastiske element ligger i titin-filamenterne. Disse filamenter forbinder A-filamenterne med Z-skiverne (se Alberts). KE KE PE SE PE SE

201 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side RAPPORTENS UDFÆRDIGELSE Definer begreberne isometrisk og isotonisk kontraktion. A. Isometrisk kontraktion a. Udvikling af isometrisk kraft (P Newton). Beskriv det tidsmæssige forløb af enkeltkontraktionen fra udskrift fra forsøg 4.3 og data i Tabel 4.2. og angiv hvilken proces latenstiden dækker over. Ud fra udskriften af isometrisk enkeltkontraktion og tetanus beregnes og sammenlignes den maksimale kraftudviklingshastighed, dp/dtmax (N s 1 ). Dette er den stejleste hældning af den opadstigende kurvegren for isometrisk enkeltkontraktion og for glat isometrisk tetanus. Kommenter forholdet mellem de to størrelser. Hvis det kontraktile system i skeletmuskulatur aktiveres fuldstændigt efter ét aktionspotential, burde dp/dtmax være omtrent ens for enkeltkontraktion og glat tetanus: dp/dt er udtryk for hastigheden, hvormed det kontraktile element (KE) udspænder det serieelastiske element (SE). dp/dt max er ved tetanus hyppigt væsentligt større end ved enkeltkontraktion; dette skyldes at aktiveringen under enkeltkontraktionen er komplet kun i frømuskler undersøgt ved 0 C. b. Kontraktionskraftens afhængighed af musklens strækningsgrad. Med data fra Tabel 4.4 tegnes et længde-spændings-diagram på millimeterpapir. Afsæt i samme koordinatsystem med muskellængden ud af x-aksen og kraften op ad y-aksen punkterne til følgende tre kurver, idet man først kun anvender målingerne fra den del af forsøget, hvor musklen gradvist strækkes fra mindste til største længde: 1. hvilekraften (hvilespænding), 2. kontraktonskraft og 3. total muskelkraft (1 + 2). Tegn de tre kurver op. Sæt derpå resten af punkterne på kurve 1 og 2 med særlige symboler, hvorved man i koordinatsystemet får to målinger af begge kraftbidrag ved hver undersøgt muskellængde. Angiv, hvilket kraftbidrag - hvilespænding eller kontraktionskraft - der bedst reproduceredes ved højere strækningsgrader. Kommenter observationen. Normalt falder kontraktonskraften næsten lineært mod nul ved strækning. Find ved ekstrapolation, hvor mange procent længde-forøgelse der vil medføre kontraktionskraft 0 regnet fra optimal længde (Lo), som giver maksimal kontraktionskraft. Som illustration af kontraktionskraftens afhængighed af sarkomerlængden tegnes to skitser af de glidende filamenters indbyrdes position 1) ved den længde, som medfører størst kontraktionskraft og 2) ved den længdeforøgelse, hvor kontraktion ikke mere er mulig. Den optimale sarkomerlængde ved Lo angives normalt som 2,2-2,5 µm, og ved en sarkomerlængde på 3.6 µm bliver kraften 0. Derfor burde en længdeforøgelse på 40-60% medføre ophør af kontraktionskraftudvikling. Den fundne værdi er ofte mindre. Beregn udfra de målte størrelser sarkomerlængden ved den undersøgte muskels optimal længde (se figuren på side 4-8). c. Kontraktionskraftens afhængighed af stimulationsfrekvensen (Udskrift fra forsøgene 4. samt data i Tabel 4.3). Angiv forholdene mellem den maksimale tetanuskraft og enkeltkontraktionskraften, hvilket er udtryk for forholdet mellem den største og mindste kraft, som en muskelfiber kan levere afhængig af stimulationsfrekvensen (innervationsfrekvens ).

202 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 11 Find ved betragtning af summationskurverne (to stimuli; forsøg 4.5.1) tidsrummet mellem stimulation og begyndende inaktivering af det kontraktile system under enkeltkontraktionen. Inaktiveringen begynder når enkeltkontraktionskurven afviger (falder) fra summationskurven med kortest interval. Tiden fra begyndelsen af kraftudvikling (efter latenstiden) til begyndende inaktivering bestemmer det maksimale interval mellem stimuli som kan opretholde fuld aktivering (fusionsfrekvens ved tetanisk kontraktion). Angiv ud fra dette tidsrum den mindste stimulationsfrekvens, der kræves for at opretholde fuld aktivering af det kontraktile system. Angiv tillige, om den fundne frekvens er i rimelig overensstemmelse med den frekvens, som medførte glat (maksimal) isometrisk tetanus. Prøv at forklare årsagen til at det tager tid for musklen at opbygge isometrisk kraft, således at maksimal kraft ikke opnås efter et eller to stimuli (tænk på samspillet mellem det "kontraktile element" og det "serieelastiske element). d. Musklens maksimale specifikke kraft Beregn ud fra data i Tabel 4.1 og 4.3 musklens specifikke kraft, dvs. den maksimale isometrisk tetaniske kraft per tværsnitsarealenhed ved optimal muskellængde angivet i newton cm 2 (N cm 2 ). (Normalt udvikler næsten alt kontraktilt væv en specifik kraft på N cm 2 ). B. Kontraktion med forkortning af musklen. a. Kraftudvikling under kontraktion med muskelforkortning Beskriv sammenhængen mellem de to kurver på udskrift fra forsøg 4.6, som illustrerer kraftudviklingens forløb under en glat isometrisk tetanus og under en tetanus, som omfatter en isotonisk fase. Normalt har begge kurver samme initiale forløb, men forskellige maksima. Forklar hvorfor. Illustrer denne sammenhæng ved at tegne tre kraftudviklingskurver: 1. En kurve, som angiver en fuldstændig isometrisk tetanus med det maksimale kraftniveau på 0,5 N. 2. En kurve, som angiver kraften ved den kontraktion uden ydre belastning. 3. En kurve, som angiver kraften under kontraktion med forkortning mod en belastning på 0,3 N. b. Kontraktionshastigheden under isotonisk enkeltkontraktion og tetanus Beskriv på grundlag af udskriften fra forsøg den isotoniske enkeltkontraktion og den isotoniske tetanus med hensyn til maksimal forkortningshastighed (initial hældning af kurvernes opadstigende del) og forkortning (maksimalt udslag). c. Relationen mellem forkortningshastighed og belastning (Hastighed - belastnings-diagrammet) Udfyld Tabel 4.6 ud fra data og omregninger i Tabel 4.5. t og S til bestemmelse af maksimal hældning (hastighed) samt forkortningsveje kan måles på udskriften fra forsøg af forkortningskurverne ved forskellige belastninger. På millimeterpapir tegnes i et koordinatsystem med hastigheden (V) op ad y-aksen og belastningen (P) ud ad x-aksen den bedste kurve gennem de fundne koordinater for hastighedsbelastningsrelationen. Kurven skærer x aksen i punktet (P 0, 0), hvor P 0 er musklens isometriske tetaniske kraft (forkortningshastigheden er da nul). Værdien aflæses på kurven fra forsøg 4.6. Kurven skærer y aksen ved V max ; dette punkt skal findes ved ekstrapolation, fordi belastningen ved forsøget på grund af lodpanden ikke var 0. d. Musklens arbejdsydelse og effekt. Tegn to kurver for muskelns arbejde og effekt (Y-aksen) som funktioner af belastningen (X-aksen). Angiv i hvor stor en del af belastningsområdet arbejde og effekt er over 50% af maksimum, samt ved hvilke belastninger (i procent af P 0 ) effekten og arbejdet er størst. C. Kontraktion med passiv strækning (excentrisk kontraktion med negativ hastighed). Kommenter kurvens udseende og angiv hvor meget kraften i kurvens sidste del overstiger P 0. Skitser situationen i et kraft-hastigheds-diagram og angiv had der er sket i myofibrillerne. Benyt forsøgets resultat for at forklare mekanismen ved fibersprængning og muskel- eller senerupturer.

203 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side SPØRGSMÅL 1. Kan en forøgelse af stimulationsfrekvensen fra 1 til 100 per sekund medføre forøget isometrisk kontraktionskraft? 2. Vil en stimulationsfrekvens bestemt af et tidsinterval (periodetid) på størrelse med tiden mellem enkeltkontraktionens start og toppunkt kunne medføre glat tetanus? 3. Hvad sker der med det serieelastiske element ved: a. Isometrisk kontraktion? b. Kontraktion uden ydre belastning? c. Isotonisk kontraktion mod en belastning på 0,1 N? 4. Hvor stor en masse (kg) kan en normal muskel med et tværsnitsareal på 1 cm 2 og en specifik kraft på 40 N.cm -2 maksimalt løfte? 5. Hvorledes kan kontraktionskraftens nedsættelse ved forkortet hvilelængde forklares ved de glidende filamenters position? 6. Udspændes det serieelastiske element ved strækning af den hvilende muskel? 7. Hvilken principiel, funktionel forskel er der på latenstid for isometrisk kraftudvikling og "latenstid" (forsinkelse) for muskelforkortning? 8. Hvorledes afhænger forkortningshastigheden af muskelbelastningen ved isotonisk kontraktion? Angiv om relationen er lineær. 9. Hvad ville den i øvelsen anvendte forsøgsmuskels forkortningshastighed (cm s 1 ) omtrentligt have været ved isotonisk kontraktion uden belastning (V max )? 10. Hvornår bliver kraften i en muskel større end P o? 11. Angiv hvordan musklens kraft reguleres in situ og hvilket af forsøgene der illustrerer en af mekanismerne.

204 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 13 Tabel 4.1. Mål for musklens størrelse ved den strækningsgrad, som giver maksimal kontraktionskraft. (Forsøg 4.3.) MUSKELBUGENS LÆNGDE, MM Muskelbugens vægt, mg 30 *Tværsnitsareal, cm 2 *Beregnes ud fra længde og vægt under antagelse af, at musklen har vægtfylden 1.0 og samme tværsnitsareal i hele muskelbugens længde. Tabel 4.2 Reaktionstider for isometrisk enkeltkontraktion ved stuetemperatur. (Forsøg 4.3.) Latenstid ms Tid for udvikling af maksimal kontraktionskraft Enkeltkontraktionens fulde varighed Tabel 4.3. Stimulationsfrekvens og isometrisk kontraktionskraft. (Forsøg 4.3. og ) Enkeltkontraktion Summation af to stimuli (maksimal) Glat tetanus Stimulationsfrekvens *Tidsafstand mellem stimuli ms Hz - - Kontraktionskraft Aflæst i mv ** Omregnet til newton * Tidsafstanden mellem stimulationerne er lig med INTERVAL ved både summation efter 2 stimuli og ved tetanus. ** Krafttransducernes udgangssignal er 100 mv N 1.

205 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 14 Tabel 4.4 (Forsøg 4.4.) Måling Ændring af Nr. muskellængde Transducerpo- sition L mm 1 0 Hvilekraft (OFFSET) Aflæsning i mv Omregning til newton* Kontraktionskraft registrering Omregning til mv newton *Transducerens udgangssignal er 100 mv/newton

206 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 15 Tabel 4.5 Isotonisk kontraktion (Forsøg 4.7.2) Kontraktion M Å L I N G E R O M R E G N I N G E R A B C D E Forkortning * Belastning af Forkortning Hastighedskoordinater Kontraktionsfor- musklen sinkelse L (S) S X mm Nr. N mv mv ms ms Isometrisk P 0 **) = Hastighedskoordinater S 1 X 1 mm ms * ** Transducerens udgangssignal er 1 mv/mm forkortning. P 0 overføres fra Tabel 4.3, glat tetanus.

207 Biofysikøvelse 4: kontraktion i tværstribet skeletmuskulatur Side 16 Tabel 4.6 Beregnet forkortningshastighed, arbejde og effekt under isoton tetanisk kontraktion Kontrak- Muskel- Forkortnings- Udført ydre Maksimal tion belastning hastighed arbejde effekt P V W E Nr. [N] [cm s -1 ] [N cm] [N cm s -1 ] P overføres direkte fra Tabel 4.5. V = y / x 100 [cm s -1] W = L P 0,1 [N cm] E = P V [N cm s -1 ]