Højopløst mikroskopi til karakterisering af partikeloverflader Morten Christensen Center for Membran Biofysik Institut for fysik kemi og farmaci Syddansk Universitet Morten.christensen@memphys.sdu.dk 1
Oversigt Introduktion Teknikker til partikel karakterisering Parametre til morfologiske målinger Karakterisering af overflader af små partikler <1µm Højopløst mikroskopi til karakterisering af kaseinmiceller Visualisering med elektron mikroskopi Visualisering med AFM Kvantitativ overflade analyse Konklusion 2
Teknikker til partikel karakterisering Spørgsmålet er: hvilke parametre giver information om ændringer i partikler? 3
Parametre til at se morfologiske ændringer Ændringer i Partikel morfologi: Måling af ændringer i form (mikroskopi): P O = 4πA P K Scattering: R hydrodynamisk Mikroskopi: A eller V Circularitet (C) = P O konveksitet(k) = K P 4 Problemstilling: - Ændringer kan være skjult ved at se på gennemsnitlige parametre - Det kan være svært at analysere parametre - Ændringer i konveksitet/cirkularitet kan dække over ændringer i alle længdeskalaer
Karakterisering af overflader af små partikler <1µm Overflade karakterisering af små partikler: AFM, Elektron mikroskopi Grunden til at anvende mikroskopi er at få adgang til topografisk information for en detaljeret beskrivelse af overfladen Topografisk output fra målinger: SEM Pseudo3D AFM 3D 5
Højopløst mikroskopi af kasein miceller Højopløst mikroskopi til karakterisering af kaseinmiceller Værktøjer til kvantitativ analyse af 3D topografi 6
Kaseinmicelle modeller Radius ~30-150 nm SAXS Tidligere studier: Kvantitative struktur beskrivelser Lys Kvalitative spredning, struktur NMR, MS beskrivelser SEM, TEM, AFM TEM SEM SANS/SAXS Der er brug for værktøjer til kvantitativ analyse af partikler <1µm Med ikke-triviel overfladestruktur 7
Visualisering af kaseinmiceller med EM Kaseinmicelle i SEM 1 Kaseinmicelle i TEM 2 Fordele: Høj opløsning Nemt at anvende 100 nm Ulempe: Krævende prøve forberedelse Pseudo 3D opløsning (kun kvalitativ 3D) 1 Dalgleish et al. International Dairy Journal 14.12 (2004): 1025-1031. 2 McMahon et al. Journal of dairy science 91.5 (2008): 1709-1721. 8
Eksempel: Effekt af tørring 1 Spray tørrede kaseinmicelle partikler En hurtig fjernelse af vand kan ændre den overordnede form 2 Kaseinmicelle partikler lavet i oktanol: Langsom fjernelse af vand kan ændre den detaljerede overfladestruktur 9 Tilstedeværelsen af vand kan ødelægge strukturen under scanning Konklusion: SEM er bedst til tørre prøver Overflade ladning forhindrer præcis 3D kvantitativ strukturel information Der er brug for værktøjer til at adskille ændringer i den overordnede og detaljerede overfladestruktur
Visualisering af kaseinmiceller med AFM Hydreret kasein micelle Kontakt mode Tapping mode Fordel: Præcis 3D topografi Kan bruges tør/hydreret Ulempe: Overflade immobilisering Kræver nogen øvelse 10 Ouanezar et al. Langmuir 28.11 (2012): 4915-4919.
Eksempel: Større strukturer med AFM Poly styren kugler Valle protein partikel Konklusion: AFM giver præcis topografisk information fra enkelte partikler Begrænsninger i anvendelse ved større strukturer Næste skridt: Kvantitativ analyse af partikel overfladerne oste koagel 11
Overflade immobilisering af kasein miceller Elektrostatisk immobilisering kovalent immobilisering 1 µm 1 µm 1 µm Andre muligheder: Centrifugering Tørring 12
13 Indsamling og processering af data
Enkelt partikel topografisk analyse Partikel topografi Sfære fitning Overflade topografisk kort 14
Kaseinmicelle overflade topografiske kort Partikel billeder Overflade topografiske kort 15
Kvantitativ overflade analyse Størrelses parametre Gennemsnit R area R vol Radius (baseret på partikel 2D areal) 25.9 nm Radius (baseret på partikel volumen) 15.2 nm R area = A/π R vol = 3 3 4π V A V Kompressions parametre Gennemsnit C height C curve Kompression (baseret på højde) 0.46 Kompression (baseret på kurvatur) 0.21 h C height = 2R area C curve = h 2R 16
Kvantitativ overfladeanalyse Ruheds parametre Gennemsnit R q A r Root-mean-square ruhed (højde variation) 1.26 nm Overflade areal ruhed (3D circularitet) 0.2 R q = 1 n z 2 A r = A topography map A projected map Orienterings parametre f flatness θ Orientering Gennemsnit 0.20-69.1 ο 17
Konklusion Erfaringer fra projekt: Mikroskopiteknikker til overflade analyse af små partikler 10nm 1µm AFM: Præcis topografisk information Minimal prøve forberedelse Kan gøres under tørre og hydrerede forhold SEM God til kvalitativ analyse Nemt at anvende Kan anvendes til tørre prøver uden omfattende prøve forberedelse Parametre anvendelige for overfladeanalyse Tilgængelige parametre: Areal(AFM,SEM), volumen(afm) 2D: cirkularitet, conveksitet 3D: Overflade ruhed: R q, A r Kompression C height, C curve Flatness Orientering 18
Tak for opmærksomheden! Projekt samarbejde: Morten Christensen, SDU Adam Cohen Simonsen, SDU Richard Ipsen, KU Jan Trige Rasmussen, AU Horst G. Rubahn, SDU Del af PhD-projektet: Struktur og aggregering af kaseinmiceller, udført med støtte fra: 19