Key note lecture Tom van Gool. (TvG)

1 Referat af Parasitologisk workshop, afholdt på Rigshospitalet 5. november 2012 Deltagerne startede med at præsentere sig selv. Key note lecture Tom van Gool. (TvG) TvG startede med en introduktion til parasitologiens historie i Holland, hvor parasitologien havde en stor bevågenhed under kolonitiden, og hvor, mange af de store parasitologer var ansat af Tobaksfirmaer. Efter dekoloniseringen blev parasitologien et mindre område i Holland, men fik sin opblomstring under AIDS epidemien, og igen med den store rejse og indvandreraktivitet, der er i landet. Aktuelt er TvGs afdeling en stor afdeling med 150 ansatte, 5 sektioner. Parasitologien alene har 11 ansatte, 2,5 bioanalytikere ansat i forskning, 5,5 bioanalytikere i rutinefunktioner, 2 akademikere, 1 MD og 1 phd. Afdelingen modtager mange prøver. De ser i gennemsnit 2 tilfælde/ugen med cutan leishmaniasis. De ser mange tilfælde med Isospora og Cyclospora Generel indledning om hvilke teknikker benyttes bedst i moderne parasitologi: Mikroskopi, dyrkning, antigen tests, serologi og molekylær diagnostik. Hver metode har sine fordele afhængig af hvilke parasitter, prøvemateriale og sygdomme der er tale om. Der findes meget få kommercielle serologi tests. På TvGs laboratorium har de udviklet deres egen ELISA til påvisning af schistosomaantistoffer og benytter desuden en fransk IHAT? Malariadiagnostik Ved malariadiagnostik er mikroskopi stadig den bedste metode, suppleret af nyere typer diagnostiske tests. Mikroskopi kan give et hurtigt svar indenfor en time. I vagten i benytter de typisk en kombination af en hurtigtest og udstrygningspræparat. Sidstnævnte er let at lære og specifik, i modsætning til dråbepræparat, der er sværere at mikroskopere for den uøvede. Den klasssike farvemetode er Giemsa, hvor præparatet farves 20-30 minutter med en 4% og 8% koncentration. Der findes flere hurtige farvemetoder: Fields stain, der farver dråbepræparat på 2 minutter og Diff Quick Stain, der egentlig er en farvemetode fra hæmatologien, der kan farve udstrygningspræparater på 1 minut og efterfølgende tørres med hårtørrer. QBC er en meget følsom hurtigmetode, der er brugbar, hvis man har mange malariaprøver. Metoden benytter antikoaguleret blod opsamlet i kapillærrør, som efterfølgende centrifugeres. Røret indeholder acridinorange, som farver kerneholdige celler, dvs. leukocytter og røde blodlegemer

2 inficeret med malariaparasitter. Efter centrifugering kan man se en lysende orange buffycoat og små prikker i den røde del af røret, hvis der er malariaparasitter. Følsomheden er 1 parasit/ul. Testen kan udføres på 5 minutter og er 100 % specifik.. Dog ingen speciesidentifikation. Han omtalte herefter studie af sensitivitet af malaria mikroskopi kombineret med de forskellige metoder. Hvis 100 felter i tykdråbe præp sv 0,3 ul blod ses på 3 minutter og gold standard sættes til 800 felter sv. 2,4 ul blod set på 24 minutter fås som illustreret nedenfor Tykdråbe præp: Ved 200 felter farvet med Fields findes 98% pos. 100 felter farvet med Giemsa findes 98% 200 felter farvet med Giemsa fandt 100 % Udstrygning 5 min 94% QBC 100 %. Udstrygning finder typisk 150 parsitter/ul Ag tests: to bånd 1 specifikt falcifarum bånd: HRP2 og et allround malaria bånd med acceptabel følsomhed for P. vivax? LDH ICT (AG) Overordnet 91% P.falcifarum 99% P. vivax 75% Der findes mange forskellige AG-tests på markedet Overordnet set er man hos TvG nået frem til at malariamikroskopi i vagten bedst udføres med en kombination af Binax (Ag-test) og 5 minutters gennemsyn af tyndt udstrygningspræp, hvilket giver en sensitivitet på 99%, der skal sammenlignes med en sensitivitet på 91 % for Ag-test alene. PCR har kun begrænset rolle ved malaria diagnostik, primært ved dobbeltinfektion, ved lave parsitæmigrader, og hvor der skal skelnes mellem P. malariae og P knowlesi. TvG stilllede spørgsmål om, den herskende opfattelse at P. knowlesi, har en vis mortalitet overhovedet er korrekt, idet de artikler, der omtaler mortaliteten referer til hinanden, og når man går tilbage til den oprindelige artikel, har forfatterne ikke tilstrækkelig god separation mellem P. falcifarum og P. knowlesii infektioner. Al malariadiagnostik udført i vagten anbefales re-testet dagen efter, af en erfaren mikroskopør.

3 Fæcesparasitter Skal vi fortsat mikroskopere, eller er PCR den nye diagnostik for fæecesparasitter? PCR er en god analyse til at diagnosticere protozoer, men er ikke god til ormeæg, pga problemet med at oprense DNA og de mange forskellige orm, der findes. Det er ikke cost effektivt og man får ingen øget sensitivitet ved at lave PCR for orme. TvG argumenterede herefter for at der fortsat er behov for rutine diagnostik af helminther. Helminthinfestationer er stadig meget hyppigt forekommende udenfor de vestlige lande. I Holland rejser ca. 3 millioner mennesker udenfor Europa hvert år, og det kan ofte være svært at få en ordentlig rejseanamnese. Ridley koncentration er fortsat en god diagnostisk metode til protozoer og orm, men ikke lige sensitiv for alle. For Strongyloides, Schistosoma mansoni, S. haematobium og Fasciola hepatica er serologi mest sensitivt. De finder ca 1-2 pt/md, der er positiv for Strongyloides. TgV s lab sender et sæt på 3 rør (TFT) beregnet til fæcesprøver ud til pt. To rør er tilsat fixativ til Ridley koncentration (SAF) og et rør uden tilsætning. Der laves mikroskopi på alle 3 rør. Røret uden tilsætning bruges tillige til PCR. De laver en multiplex PCR, der detekterer Giardia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidier og Dientamoeba fragilis, men har også undersøgt for Blastocystis hominis med PCR Efter at 3-rør metoden blev indført øgedes sensitiviteten for Giardia/E. histolytica med 30% B. hominis med 98% (25 5 af alle pt. er positive) D. fragilis med 100 % (10% af alle pt.) DNA for protozoer kan være positiv op til 3 uger efter endt behandling, og kan ikke bruges som behandlingskontrol. Ag-tests for protozoer er generelt gode, men er de fleste steder erstattet af PCR. Man kunne evt. forestille sig en basal screening for faecesparasitter på det lille lab, ved hjælp af multiplex PCR for Giardia, E. histolytica, Cryptosporidium og D. fragilis, og en udvidet diagnostik på de større lab, med mikroskopi og PCR. En meget væsentlig ting, er at gøre klinikerne opmærksomme på, hvilke parasitter, der er undersøgt for, og at der kan være behov for yderligere diagnostik. Hos TgV laves rutinemæssigt : TFT (triple faeces diagnostik med rør tilsat SAF, ridley conc og PCR rutine for Giardia.

4 PÅ laboratoriet har man sammenlignet PCR og mikroskopi. (TFT) Parasit TFT PCR E. histolytica = = E. dispar = = D. fragilis =? = (90%) Giardia Cryptosporidiumr = = Blastocystis sp. =? = Cyclospora?? Isospora?? Cyclospora blev ikke kun fundet hos immunkompromitterede pt. De pt. der var mikroskopi negative for Giardia, men PCR positive, var ofte behandlet inden fæcesprøven blev taget eller udskilte kun få cyster, og PCR havde typisk en høj CT værdi på 35-37. Til slut understregede TvG vigtigheden af at følge et kvalitetssikringsprogram, hvor han klart anbefalede UK Neqas. Rune Stensvold Kom ind på de forskellige aspekter af parasitologien, som alle har betydning, såsom, morfologi, transmission, udskillelse, patogenese, public health aspekter, epidemiologi og behandling. Den gamle state of the art er mikroskopi også på fikserede præparater og dyrkning Han diskuterede hvilke krav man må stille til en moderne parasitologisk diagnostik og til indsamling af prøvemateriale. I Danmark har vi ingen opgørelse over forekomst af parasitter, bortset fra malaria, hvorimod man i Sverige reporterer forekomst af 6 forskellige parasitter. I Sverige har man set udbrud af ccryptosporida, cyclospora og Microsporida. RS præsenterede en vision for human parasitologi i DK med standardiserede diagnostiske test og algoritmer for prøvebehandling, med nationalt samarbejde og overvågning og med øgning af parasitologisk forskning og udvikling. Han præsenterede en liste over hvilke PCR på faecesparasitdiagnostik der udbydes på SSI: Cryptosporidier, Giardia, Entamoeba sp, D. fraglis, Trichuris, Ascaris, Strongyloides, Taenia sp., microsporidier, cryptosporidier, Isospora belli, cyclospora. PCR er primært rettet mod 18s delen af det parasitære ribosom (kun protozoer?) RS præsenterede en sammenhæng mellem PCR og mikroskopi og dyrkning fundet på SSI blandt 889 prøver

5 PCR mik dyrkning Giardia 24 9 Cryptosporidium (ct>30) 16 0 Entamoeba hist. 4 1 Entamoeba dispar 2 1 Dientamoeba fragilis 167 NA Blastocystis hominis 19 64?? other 28 Dette udløste en diskussion omkring sensitivitet af mikroskopi. Der var kun 1 sample/pt. Samtidig er det vigtigt at kende parasitæmigraden og evt forudgående behandling før man med sikkerhed kan bruge tallene til en sammenligning af de to metoder. For fremtidige opgørelser af lignende slags ville en estimering af antal parasitter pr ul/faeces eller lign være nyttig. Og CT værdier giver en langt bedre mål for følsomheden af PCR. Kliniske oplysninger om pt. med hensyn til eksposition/ vedvarende diarré, ville også give en bedre mulighed for at vurdere brugbarheden af de forskellige metoder. Dette udløste en diskussion omkring indikationer og praevalenser. Blandt 30.500 rejse ass, prøver fandtes helminther blandt 0,2%, svarende til 60 patienter, og Giardia hos 4 %. Fordelen ved PCR iflg RS: Bedre sensitivitet. Mindre hands on time. Direkte differentiering af E. histolytica og E. dispar. PCR finder ikke de apatogene parasitter, (betyder det noget?) Så udfordringer ved PCR er primært prøvemateriale, oprensning af DNA, beslutning om primerprober. Herefter almindelig diskussion om der er stemning for at nedsætte en landsdækkende arbejdsgruppe indenfor parasitologi, og hvad dens opgaver primært skal være. Forslag var etablering eller diskussion af algoritmer til brug ved parasitologisk diagnostik, og om hvilke indikatorer skal udløse hvad. (Visse steder i landet (Hillerød-Herlev) er man allerede i gang med at udvikle en total faeces algoritme). Desuden at etablere et overvågningssystem, samt samarbejde omkring forskningsprojekter og parasitologiske områder relevante for danske forhold. RS omtalte, at SSI gerne ville indgå i et samarbejde og bl.a. støtte opsætningen af rutinemetoder på de lokale KMAer, men at dette omvendt krævede, at SSI fik en eller anden form for håndgribelig opbakning og en klart defineret rolle. Maria Vang Johansen One Health MV fortalte om one health approach indenfor tropical neglected diseases og emerging zoonotic diseases, hvor den samme mikroorganismer forårsager sygdom både blandt dyr og mennesker og ofte store produktionstab i landbruget. WHO har iværksat one health projektet, der bygger på samarbejde mellem veterinærer og læger.

6 Der er 5 hovedinterventionsområder 1. Forebyggende kemoterapi 2. Intensiveret case management 3. Vektorkontrol 4. Vand, hygiejne og sanitet 5. Veterinær public health Mange steder er indsatsen forfejlet. Som eksempel brugte MV forekomst af Clonorchis sinensis, der er stigende generelt på grund af øget sushi spisning. Der findes måske 40 forskellige lever- og tarmikter og mennesket kan inficeres eller være bærere af flere af dem, men det er kun leverikter der giver symptomer. De to typer kan ikke adskilles ved mikroskopi, hvilke har ført til at man i Nordvietnam i 2009 har konstateret en forekomst ved mikroskopi af C. sinensis på 26 %. 2 år før fandt man med en bedre diagnostik kun 0.9% i samme område, så de 26 % omfatter formentlig mange andre species, men undersøgelsen har alligevel ført til at befolkningen i store områder i Nordvietnam er blevet behandlet med praziquanel. Et udtryk for, at man handler og spilder midler før man har forstået sygdommen til bunds. MV brugte cysticercosis som et eksempel på et stigende problem i Afrika, hvor man grundet befolkningstilvæksten der er 8 doblet siden 1950 mange steder har erstattet kvæghold med svinehold, Sygdommen er ukendt af befolkningen, på trods af kalkulationer, der siger at 56 millioner er døde alene ud fra symptomerne. Hertil kommer følgesygdomme, som ulykker, epilepsi, hovedpine og misdiagnoser. Prevalensen er ukendt, og cystiscercosis er ikke erkendt som human sygdom, men 30 % af epilepsitilfælkde i Afrika er muligvis forårsaget af cystiscercose. Sygdommen er ikke anmeldelsespligtigt. Der er dårlige diagnostiske muligheder i de afrikanske lande, hvor sygdommen er hyppig. De diagnostiske muligheder er til svinebrug: ELISA, copro-pcr og copro-elisa. Til humant brug: billeddiagnostik, AB-ELISA og Ag-ELISA. I Afrika bliver mange mennesker exponeret for praziquantel og imidazole, på grund af store behandlingskampagner for andre sygdomme. Dosis her er som regel ikke høj nok, til totalt at behandle cystiscercosis, og ofte er det et stort problem, da asymptomatiske patienter med cysticercosis ofte får symptomer ofte i form af epilepsi efter behandling- De største problemer i Afrika, der skal løses for at holde sygdommen under kontrol er: 1. M+angel på viden 2. Fødevaresikkerhed 3. Fødevaresikkerhed og kødkontrol har svære vilkår i Afrika, hvor kødet ofte sælges på åbne landsbymarkeder ved kødtræet eller lign. 4. Handels og butikssystemer er dårlige, ofte ikke eksisterende, hvilket vanskeliggør kontrol.

7 Sidste eksempel: Echinococcus multilocularis i Danmark, endnu et eksempel på manglende viden. Der er ingen systematisk indsamlet viden om E. multilocularis i Danmark. I 1994 fandtes antistoffer mod E. multilocularis hos 10 % (af danske ræve) og 3-4 /400 ræve fundet på Sjælland. Senere studie (hvornår? Og hvor?) fandt ingen tegn på E. multilocularis i 450 ræve. Derefter ingen studier indtil E. multilocularis findes hos 2 katte i 2011. Den er aldrig fundet hos hunde. I 2011 undersøgte man 300 ræve og 80 mårhunde og fandt E. multilocularis hos 1 ræv. Der er nu fundet tilfælde i Sverige, hvorefter man har startet en intensiv overvågning. Endnu ingen tiltag til systematisk overvågning I Danmark på trods af at fundet hos katte er højst bekymrende, idet dette markant øger risikoen for spredning, da katte samt deres afføring findes overalt. Som konklusion på præsentationen virker det rationelt at sikre et samarbejde mellem human og veterinær parasitologi i Danmark, måske med inspiration at hente Danmap samarbejdet på det bakteriologiske område. Eskild Petersen talte om behovet for fælles forskning indenfor parasitologien i Danmark. Først præsenterede han 4 cases med patienter med vanskeligt behandlelige tilfælde af Giardiasis. Han beskrev behandlingssvigt med metronidazol, albendazol, nitazoxanide, men med endeligt behandlingsrespon på tinidazol. Der kom forskellige forslag til forskningsprojekter: 1. Undersøgelser af antal udbrud af Giardia i børnehaver 2. Genotypning af cutan leischmaniasis 3. Børneorm resistens 4. Toxoplasmose, genotypning via sera, sammenholdt med alvorligheden af klinisk sygdom. Interessant, da folk i Vestafrika har langt hyppigere toxoplasmose øjensygdom end hvad tilfældet er herhjemme. SSI har sendt nogle genotyper til Frankrig, hvor nogle blev fundet til at være atypiske.. Herefter var der en lang diskussion om sensitivitet af fæecesdiagnostik, samt den klinisk betydning af low count forekomst. TgV argumenterede for, at det er vigtigt at rapportere cut off level ved PCR evt. med en semikvantitativ bemærkning, mens andre mente at det var tvivlsomt, om dette var brugbart for klinikerne, specielt da der ofte er tale om intermitterende udskillelse. Til slut en diskussion om den bedste metode til at finde Blastocystis, hvor TgV henviste til flere publikationer der omtaler gode resultater med Ridley koncentrationsmetoden. Jørgen Kurtzhals holdt derefter et indlæg om hæmoparasitter. Til rutinediagnostik er det tit et problem at tykdråbe præp og at udstrygning ikke har en tilstrækkelig høj kvalitet. Vi har ikke på nuværende tidspunkt en god metode til kvantificering af

8 inficerede erythrocytter. Tælling af parasitæmi følger en Poisson fordeling og kan svinge med 1,5 % parasitæmigrad ved tælling af 400 erythrocytter, selv hvis det er den samme person der tæller. Nøjagtigheden bliver ikke væsentligt forbedret selv om tæller 2000 erythrocytter. Dette giver aktuelt et problem, da WHO har ændret sine anbefalinger, således at det nu anbefales at give IVbehandling allerede ved en parasitæmigrad > 2 %. Flowcytometri og kvantitaiv ELISA af HRP2 fra P. falciparum er langt bedre til at give et kvantitativt mål, men er ikke en del af almindelig rutinediagnostik.. Ag analyse er ikke kvantitativ, specielt ikke HRP2 båndet. Iflg. TgV vil det generelle bånd (aldolase eller LDH båndet dog altid være positivt ved >1% parasitæmigrad for P.falciparum, og tykkelsen af båndet giver umiddelbart et bedre kvantitativt udtryk. Ag-test udføres mest pålideligt i lab, da forsøg på de kliniske afdelinger gav alt for mange tests uden kontrolbånd. JK sammenlignede herefter de forskellige metoder til malaria-diagnostik: Blandingsinfektioner med flere malariaparasitter risikere at blive overset, hvis man kører multiplex-pcr. Nogle Ag-tests kan være positive helt op til 4 uger efter vellykket behandling og kan således ikke benyttes til kontrol af behandlingsrespons. Det samme gælder PCR: Anbefalinger vedr. rutine diagnostik af malaria Klinisk afdeling: Tykdråbepræp og udstrygningpræp udført på den kliniske afdeling samt 3 ml EDTA blod til Ag test. Der skal tages 2 gange stryg, hvis patient fortsat har feber 3 gange. Iflg TgV er en gang nok hvis pt. har været syg 3 dage. Antikoaguleret blod er uegnet til tykdråbepræparater og udstryg. Der er ingen væsentlig forskel på, om der bruges venøst blod eller kapillærblod til udstryg. Det mikrobiologiske laboratorium: Antigentest og mikroskopi af udstrygningspræparat udføres i vagten. Næste dag udføres mikroskopi af dråbe og udstryg af en erfaren person. Der laves PCR på EDTA blod, hvis prøven er mikroskopi positiv. Hvis der skal skelnes mellem P. malariae og P. knowlesii laves individuel PCR og ikke multiplex. Diagnostik af leishmanias Der findes flere gode kommercielle metoder til påvisning af antistoffer mod Leishmania: (DiaMed_IT dipstick ab to RK 39) Mikroskopi Dyrkning PCR og sekventering 69% sens 84% sens 98% sens Henrik Vedel Nielsen HVN startede med et forslag til hvordan forholdet mellem de forskellige metoder til parasitologisk diagnostik vil ændre sig i fremtiden, hvor mængden af serologiske us vil være uændret, men en del Ag-test, mikroskopi og dyrkninger (??)vil være helt eller delvist overtaget af PCR, især vil mængden af dyrkninger nedsættes drastisk.

9 Derefter fremlagde han en oversigt over den serologi der udføres på SSI, og vanskeligheder ved tolkning af svarene. Der ses ofte krydsreaktion mellem forskellige helmiths. Det er uklart hvad en lav titer betyder. For mange af de serologiske analyser er sensitiviteten ikke tilstrækkeligt undersøgt. Han beskrev at man i Holland har fundet krydsreaktion mellem Filaria og Strongyloides. En del af de serologiske undersøgelser sendes ud af landet, typisk til Hamburg eller London, og man har derfor ikke altid baggrundsviden om opsætningen og validering af disse analyser. Det blev diskuteret hvor hurtigt, man har brug for et serologisk svar. (Uden konklusion) Specielt gjorde HVN grundigt rede for toxoplasmosediagnostikken. På SSI laver man IgG og IgM, ISAGA-IgM samt aviditetstest. Dyetesten er nedlagt, men hvis IgG titeteren er høj laver man i stedet udtitrering af serum, med henblik på et mere nøjagtigt titersvar. Desuden laves PCR på amnionvæske, spinalvæske og biopsier, dyrkning for toxoplasmose er nedlagt. Slutevaluering Man endte med en diskussion af hvorvidt det vil være en god idé at nedsætte en dansk parasitologisk gruppe, der skulle bestå af klinisk mikrobiologer, infektionsmedicinere, parasitologer og evt. andre interesserede. Som Arbejdsopgaver for en sådan gruppe blev foreslået: Oprettelse af et indrapporteringssystem af parasitinfektioner i Danmark, evt. med individuelle anmeldelser fra de enkelte laboratorier til SSI en gang årligt. Mulighed for udtræk fra MIBA. Udarbejdelse af et antal koder, der vil være evt. udtræk i MIBA lettere. Retningslinjer for parasitologisk diagnostik Hvordan skal vi håndtere diagnose af Malaria? Rune Stensvold foreslog, at SSI kunne være overordnet reference, der forsynede de øvrige laboratorier med probe- primer sæt og PCR programmer, samt overvågede forekomst af mutationer af betydning for analysen, samt fremkomst af nye parasitter eller varianter af de allerede kendte. Der var generel stemning for at nedsætte sådan er gruppe, og som medlemmer blev foreslået en fra hver afdeling. Lene Nielsen Overlæge, KMA Herlev