Markørfrie GMO ved hjælp af rekombination

Markørfrie GMO ved hjælp af rekombination Under fremstilling af genetisk modificerede planter indsættes som regel gener, som gør planteceller modstandsdygtige overfor et antibiotikum eller et ukrudtsmiddel. Det gør det muligt at udvælge de transgene celler, men senere i forløbet er disse gener ofte uønskede. Ved hjælp af et enzym fra en bakterie kan man fjerne specifikke DNA-fragmenter ved en kontrolleret rekombination. Af Jesper T. Grønlund, University of Warwick, UK, Klaus Grasser, Aalborg Universitet og Inga C. Bach, Planteforskning.dk. Når der fremstilles genetisk modificerede planter (GMplanter) indsættes oftest mindst to gener, et eller flere interessegener og et markørgen. Interessegener koder for egenskaber, som man ønsker at tilføre planten, f.eks. dyrkningsmæssige egenskaber som tørke- eller salttolerance eller forbedrede kvalitetsegenskaber. Funktionen af et interessegen kan også være at slukke for et af plantens egne gener. Markørgener bruges til at udvælge (selektere) de transgene planteceller eller til at gøre det muligt at skelne de transgene planteceller fra de andre celler. For at kunne selektere nogle få transgene planter blandt mange utransformerede indsættes ofte en særlig type markørgener, som også kaldes selektionsgener eller selektionsmarkører. De giver planten øget tolerance eller resistens overfor enten et antibiotikum, et herbicid (ukrudtsmiddel) eller et andet stof, der normalt forhindrer planterne i at vokse (Figur 1, Figur 2, Boks 1). En anden type markørgener, som også kaldes reportergener, bruges bl.a. til molekylærbiologiske undersøgelser af plantegeners funktion. Et reportergen, som kaldes GUS, bevirker, at plantecellerne bliver blå, når de tilføres et kemisk stof ved navn X-gluc (Boks 2). Et andet reportergen ved navn GFP får plantecellerne til at lyse grønt i lys med bestemte bølgelængder. Reportergener indsættes som regel ikke i planter til kommerciel dyrkning. De mest anvendte markørgener stammer fra bakterier og er blevet tilpasset, så de kan virke i planter. Bl.a. er genets styreelement (promoter) blevet udskiftet med en promoter fra en plante (Figur 3). Det skyldes, at det maskineri, der styrer udtrykket af gener i planter og bakterier, er forskelligt. Gener med en promoter fra en bakterie bliver ikke udtrykt i planter, da plantens maskineri ikke kan genkende DNA et som gener. Plante uden selektionsgen Behandling med selektionsmiddel Plante med selektionsgen Figur 1. Ved hjælp af et selektionsgen og et selektionsmiddel kan transgene planter udvælges. Når frøene spirer i tilstedeværelse af selektionsmidlet, dør de kimplanter, der ikke indeholder selektionsgenet hurtigt. 1

Boks 1. Selektionsmarkører Metoderne til transformation af planteceller er generelt ineffektive, og indsættelse af et stykke DNA i genomet lykkes kun en for en ganske lille del af de celler, som kan regenereres til planter. Effektive selektionsmetoder er derfor nødvendige for at kunne udvælge de planter, der faktisk er blevet transgene. Uden selektion ville det blive en uoverskuelig opgave at finde frem til de få transgene planter blandt de mange, som ikke har fået indsat det ønskede DNA. Derfor indsættes der næsten altid en selektionsmarkør under fremstilling af transgene planter, og der benyttes et selektionsmiddel for at kunne identificere de transgene planter. Der findes mange forskellige selektionssystemer, som kan bruges til at udvælge transgene planteceller, men kun få af dem bruges i større stil. Det skyldes dels, at langt fra alle selektionssystemer virker effektivt for alle plantearter, dels at et selektionssystem skal tilpasses til hver enkelt planteart. De mest anvendte selektionsgener gør plantecellerne resistente overfor et antibiotikum eller et herbicid. Med det tilsvarende antibiotikum eller herbicid som selektionsmiddel i dyrkningsmediet, kan de transgene celler, skud eller planter vokse, mens de ikke-transformerede dør (Figur 1 og 2). Andre selektionsgener giver plantecellerne evnen til at udnytte specifikke sukkerarter, f.eks. mannose eller xylose, som kulstofkilde. Ikke-transformerede celler sulter ihjel, medmindre de har adgang til en anden kulstofkilde, som de kan udnytte. Antibiotikaresistens Det hyppigst anvendte antibiotikaresistensgen til selektion er nptii, som stammer fra bakterien Escherichia coli. NptIIgenet er blevet modificeret, så det kan udtrykkes i planteceller. Bl.a. er det styrende element (promoteren) blevet skiftet ud for at gøre genet aktivt i planteceller. NptII giver resistens overfor kanamycin og neomycin. Adskillige sorter af bomuld, majs og soja med nptii-genet er godkendt til dyrkning og til anvendelse som foder og/eller fødevarer i bl.a. USA, Argentina og Canada, hvor disse afgrøder har været dyrket afgrøder på millioner af hektar. Enkelte af dem er godkendt til anvendelse i EU, men ikke til dyrkning (Se www.gmo-compass.org). Resistens overfor antibiotika har ingen agronomisk værdi. Når nogle GMafgrøder indeholder nptii-genet, skyldes det dels besværet med at fjerne genet igen efter transformation, dels at godkendelsesmyndighederne i bl.a. USA, Argentina og Canada ikke betragter det som et problem, at GM-planter indeholder nptii. Heller ikke European Food Safety Authority (EFSA) vurderer, at brugen af nptii-genet i planter er problematisk. I en rapport fra marts 2007 (EFSA 2007) konkluderes, at brugen af nptii-genet som selektionsmarkør i GM-planter til foder og fødevarer ikke udgør en risiko for menneskers eller dyrs sundhed eller for miljøet. Konklusionen begrundes bl.a. med, at sandsynligheden for, at et intakt nptii-gen overføres fra planter til bakterier er ekstremt lille og derfor ikke vil øge den allerede udbredte forekomst af antibiotikaresistens i bakterier i miljøet. Blandt politikere og interesseorganisationer er der imidlertid frygt for, at gener for antibiokaresistens, herunder nptii, kan overføres fra planter til sygdomsfremkaldende bakterier og dermed forringe mulighederne for at behandle alvorlige sygdomme. Ofte henvises til en fælles rapport fra FAO (Food and Agriculture Organisation, FN) og WHO (World Health Organisation) (FAO/WHO, 2000). Rapporten afsluttes med en række anbefalinger, herunder at brugen af antibiotikaresistensgener i genetisk modificerede fødevarer bør undgås, hvis der findes sikre alternativer. I selve rapporten nævnes, at den naturlige forekomst af den pågældende resistens samt den terapeutiske betydning af det pågældende antibiotikum bør inddrages i risikovurderingen. Det nævnes også, at der ikke er evidens for, at de selektiongener, som blev brugt, da rapporten blev skrevet (dvs. bl.a. nptii), udgør en risiko for mennesker eller dyr. Kanamycin anvendes kun i ringe udstrækning som lægemiddel, men i takt med, at der er øget forekomst af sygdomsfremkaldende bakterier med resistens mod almindeligt brugte antibiotika, vurderer European Medicines Agency (EMEA), at det er blevet vigtigere at bevare det terapeutiske potentiale ved kanamycin. Også WHO anser kanamycin for at være et vigtigt antibiotikum, jf. en rapport fra et arbejdsgruppemøde i februar 2005 (WHO 2005). Ændret klassificeringen af kanamycin har medført en fornyet debat om brugen af nptii-genet i transgene planter. Det er aldrig blevet påvist, at markørgener fra planter kan overføres til bakterier i naturen eller i mave-tarmsystemet på dyr, men det er lykkedes forskere, at overføre gener fra planter til jordbakterier ved at dyrke dem sammen under meget kunstige betingelser (Kay et al. 2002). For at få genoverførslen til at lykkes skulle planterne indeholde mange kopier (~10000) af transgenet i hver enkelt celle. Til sammenligning er der normalt kun få kopier af det indsatte i hver celle i transgene planter. Derudover var det også nødvendigt at tilføre bakterierne DNA materiale, identisk med det plante DNA, som transgenet var blevet indsat i. Hvis kun den ene af disse betingelser var opfyldt, var det umuligt at detektere genoverførsel fra de transgene planter til bakterierne. Overførsel af et resistensgen fra en plante til en bakterie er ikke nok i sig selv til at gøre bakterien resistent overfor det pågældende antibiotikum. Styreelementet (promoteren) skal også efterfølgende udskiftes i bakterien, for at genet kan blive aktivt. Om end det kræver meget specielle forhold at få det til at lykkes i laboratoriet, kan det ikke udelukkes fuldstændigt, at der kan ske overførsel af DNA fra planter til bakterier under meget specielle forhold i naturlige økosystemer. Herbicidtolerance Der er ofte sammenfald mellem selektionsgen og interessegen, når der indsættes gener for herbicidtolerance i transgene planter. Herbicidtolerante GMafgrøder dyrkes på mange millioner hektar især på det amerikanske kontinent. Disse afgrøder gør det muligt at praktisere reduceret jordbehandling (pløjefri dyrkning), og det er en af de vigtigste årsager til, at de har vundet så stor udbredelse. I Canada og det nordlige USA dyrkes især raps, som kan tåle sprøjtning med glyphosat, det aktive stof i bl.a. Round- Up. Andre GM-afgrøder tåler glufosinate, som er det aktive stof i bl.a. Basta. I varmere temperaturzoner dyrkes primært glyphosat-tolerant soja, majs og bomuld. Planter med tolerance overfor et herbicid kan også udvikles med konventionelle forædlingsmetoder, herunder mutationsforædling. Et eksempel er majs, som har en mutation, som gør planterne tolerante overfor herbicider med det aktive stof imidazolinone (Se www.agbios. com). En ofte fremført risiko ved dyrkning af herbicidtolerante afgrøder er udvikling af superukrudt, som ikke kan bekæmpes. Dels kan de indsatte gener overføres til ukrudtsarter, som er nært beslægtet med afgrøden, dels kan der udvikles resistens hos ubeslægtede ukrudtsarter som følge af gentagne sprøjtninger med det samme herbicid. Når et herbicidresistensgen udelukkende sættes ind, for at få integreret et andet interessegen i plantens genom, ønsker man ofte at slippe af med herbicidresistensen igen. Læs mere om selektionsgener i Miki & McHugh (2004). 2

Figur 2. Selektion af transgene Arabidopsis thaliana (gåsemad). Til transformation af Arabidopsis benyttes som regel en metode, hvor blomsterstanden dyppes i en suspension af Agrobacterium. Ved denne metode undgår man tidskrævende dyrkning af planteceller i vævskultur, men kun ganske få af de høstede frø er transgene. Spiring af frøene på et dyrkningsmedium med selektionsmiddel gør det muligt at finde de transgene planter. Foto: Jesper T. Grønlund. Markørgener i transgene planter, som skal dyrkes kommercielt, er en kilde til kritik fra offentlighedens side. Det gælder især de selektionsgener, som koder for antibiotikaresistens. Der er frygt for øget forekomst af sygdomsfremkaldende bakterier med antibiotikaresistens, hvis selektionsgener fra planter overføres til bakterier i naturen eller i mave-/tarmsystemet hos mennesker eller dyr. Også dyrkning af afgrøder med herbicidresistens giver anledning til kritik. Det frygtes, at der kan opstå superukrudt, hvis generne spredes til andre planter. Uanset om selektionsgener udgør en risiko eller ej, så er der et politisk ønske i Europa om at undgå brugen af gener Kromosom Promoter Kodende del Terminator Figur 3. Et gen består af tre dele med hver sin funktion. Promoteren bestemmer hvor, hvornår og hvor meget et gen er udtrykt. Den kodende sekvens bestemmer aminosyresekvensen af det protein, som genet koder for og dermed genets funktion. Terminatoren er nødvendig for at cellens maskineri ved, at genet er slut. Ved at kombinere promoter og kodende sekvens fra forskellige gener kan man udtrykke gener i andre celler eller på andre tidspunkter, end de ellers ville blive udtrykt. for antibiotikaresistens i GM-afgrøder. Herbicidtolerante GM-afgrøder dyrkes i stor udstrækning især på det amerikanske kontinent, men hvis man ønsker at indsætte et andet interessegen, f.eks. sygdomsresistens eller tolerance overfor tørke ønsker man ikke nødvendigvis også at få en afgrøde, som kan tåle sprøjtning med et ukrudtsmiddel. For virksomheder, som investerer i udvikling af GMafgrøder, er det afgørende, at selektionsgener i planterne ikke medfører forsinkelser i godkendelsesproceduren eller afvisning. Også forbrugeraccept har meget stor betydning. Det antages, at forbrugerne lettere vil kunne acceptere GMplanter, hvis de indeholder så lidt artsfremmed DNA som muligt. Der er derfor stor interesse for at fremstille GMplanter, som ikke indeholder selektionsgener. Langt de fleste genetisk modificerede planter fremstilles udelukkene til forskningmæssige formål. Man har derfor ikke de samme risikovurderinger af selektionsgenerne. Alligevel er selektionsgener ofte uønskede, når man har identificeret og selekteret de transgene planter. Det skyldes, at man ofte ønsker at indsætte flere forskellige gener ind i den samme transgene linie. Hvis selektionsgenet forbliver i planten, kan det ikke genbruges til at indføre nye transgener. Selvom der findes flere forskellige selektionsgener, er det kun ganske få, der virker godt i praksis. Det begrænser muligheden for at lave multi-transgene planter. I denne artikel beskrives hvordan man kan fremstille genetisk modificerede planter, som ikke indeholder markørgener. Der fokuseres især på en ny metode, som er udviklet på Aalborg Universitet. Med denne metode kan man fjerne markørgener ved hjælp af kontrolleret rekombination af DNA i en levende plantecelle. GM-planter uden selektionsgener Hvis man vil være fri for markørgener i transgene planter, virker det umiddelbart mest logisk at lade være med at sætte dem ind. Der er da også udviklet transformationsmetoder, hvor man slet ikke bruger selektionsgener, men oftest er transformationsfrekvensen meget lav. Det har krævet årtiers forskning at udvikle de transformationsmetoder, som kendes i dag, og det vil være ekstremt ressourcekrævende at udvikle alternative transformationsmetoder uden brug af selektionsmarkører til de enkelte plantearter. En metode til transformation af befrugtede ægceller i byg ser lovende ud (Holme et al. 2008). En anden strategi til fremstilling af GM-planter uden selektionsgener er at fjerne dem, når der ikke længere er brug for dem. Markørgenerne kan fjernes på flere måder, efter at de er blevet brugt til at identificere de transgene planter, men generelt er succesraten lav. Spontan rekombination Overkrydsningen mellem to DNA-strenge (rekombination) sker som regel i forbindelse med celledelinger, men der kan også forekomme overkrydsning mellem to dele af den samme DNA-streng (intrakromosomal rekombination). 3

Planteforskning.dk April 2009 Boks 2. Reportergener Reportergener er vigtige redskaber til at opklare, hvor og hvornår plantens egne gener er aktive. I praksis kombinerer man promoteren fra det gen, som man vil undersøge, med den kodende sekvens fra reportergenet. Den nye udgave af reportergenet sættes ind i planten, hvor det aktiveres i de samme væv og på samme udviklingstrin, som det gen, som promoteren stammer fra. De proteiner, som reportergenerne koder for, er nemme at detektere, og ses f.eks. som en farvereaktion. Farven afslører, hvor og hvornår det gen, som promoteren kommer fra, er aktivt. Et ofte anvendt reportergen, som stammer fra E. coli, koder for enzymet β-glucuronidase, i daglig tale GUS. GUS-genet bruges meget ofte som reportergen i transgene planter. Enzymet, som udtrykkes, når GUS-genet er aktivt, kan spalte stoffet Xgluc i to. Derved dannes de to stoffer glucoronsyre og 5-bromo-4-chloro-2-hydroxy-indol. 5-bromo-4-chloro-2-hydroxy-indol bliver spontant oxideret og dimeriserer, så man får dannet stoffet indigo. Indigo fælder ud som blå krystaller i de planteceller, hvor genet er aktivt. Et andet reportergener, som bruges meget er GFP-genet, som koder for et grønt fluorescerende protein. Dette gen stammer fra en vandmand. Reaktion 1 i et GUS-assay kræver β-glucuronidase. Reaktion 2 sker spontant. Eksempler på GUS-farvning af transgene Arabidopsis thaliana, som har fået indsat genkonstruktioner med forskellige promotere. De gener, som promoterne stammer fra er aktive i rødder (A), kimblade (B), blade (C) og blomster (D og E). Farvereaktionen i et GUS-assay ødelægger plantecellerne, så de ikke kan vokse videre. A B C D E Eksempler på GFP fluorescens i bladhår (trichomer, F), overfladeceller (epidermis) på et blad (G) og læbeceller ved stomata (H og I). Plantevæv med GFP kan studeres i et fluorescensmikroskop i en kortere periode uden at vævet tager skade. F G H I 4

Herved kan et stykke af kromosomet flyttes til et andet sted på kromosomet eller blive klippet ud. I sjældne tilfælde kan en spontan rekombination medføre, at markørgenet flyttes væk fra interessegenet. For at finde sådan en plante, dyrker man et meget stort antal frø fra de transgene planter og undersøger alle sammen for at se, om der er nogle, hvor planterne selv har flyttet markørgenet væk fra interessegenet. Det er en yderst ineffektiv proces, der kræver analyse af tusindvis af planter. Samtidig resulterer denne metode ofte i, at store stykker af plantens eget DNA tabes. Det kan have meget skadelige konsekvenser for planten. Co-transformation En mere effektiv metode til at fjerne et markørgen er co-transformation. Her indsætter man markørgenet og interessegenet som to uafhængige stykker transgent DNA på samme tid. Mens en celle er ved at blive transformeret med et transgen er den mere modtagelig over for andre transgener, så sandsynligheden for at få flere transgener ind i en celle stiger. Man selekterer så med markørgenet, og efterfølgende undersøges de planter, der indeholder markørgenet, for tilstedeværelse af interessegenet. Hvis de to DNA-fragmenter er indsat på forskellige kromosomer eller med stor afstand på samme kromosom, nedarves de uafhængigt af hinanden. Nogle af afkomsplanterne vil derfor kun have interessegenet (se Figur 4). De to DNAfragmenter bliver dog jævnligt indsat det samme sted i plantens DNA og kan så kun skilles ad ved intrakromosomal rekombination. Det er væsentligt mere effektivt at fjerne et selektionsgen efter co-transformation, end ved at lede efter afkomsplanter, hvor der er sket en spontan intrakromosomal rekombination, men succesraten varierer meget og afhænger bl.a. af plantearten. Transposons Transposons er naturligt forekommende DNA-elementer, som kan flytte rundt i plantens genom. Der kan være mange tusinde transposons i en plantes genom. I ris, som har et stort genom i forhold til Arabidopsis thaliana, men et lille genom i forhold til majs og hvede, er der omkring 4000 transposons. Hvis et selektionsgen indsættes på den rigtige måde, kan det flyttes ved hjælp af et transposon og derefter fjernes ved udspaltning. Selektionsgenet placeres i en kopi af et transposon, og DNA-fragmentet med selektionsgen og transposon sættes ind i plantens genom sammen med interessegenet. Efter at planten er blevet transformeret, bliver det indsatte transposon med selektionsgenet flyttet væk fra interessegenet til en anden position i genomet. Selektionsgen og interessegen kan så adskilles ved udspaltning i den næste generation. I nogle tilfælde klippes et transposon ud, uden at det bliver integreret et andet sted i genomet. I teorien kan denne metode således bruges til at fjerne selektionsgener fra planter, som normalt ikke Figur 4. Udspaltning af to uafhængigt nedarvede gener. Ved selvbestøvnig af en transgen plante, hvor to gener et indsat på forskellige kromosomer, vil de to gener spalte ud i næste generation. Afkom af en primær transformant, dvs. en plante, som blev regeneret fra en enkelt celle efter transformation, vil spalte ud med hensyn til transgenet. For at undgå udspaltning i efterfølgende opformeringer af en transgen linie, udvælges en homozygotisk afkomsplante til opformering. frøformeres, f.eks. kartofler. Site-specifik rekombination En af de mest lovende metoder til at fjerne selektionsgener fra transgene planter er såkaldt site-specific rekombination. Denne metode benytter sig af en særlig slags enzymer (rekombinaser) fra gærstammer, bakterier eller virus, som angriber bakterier (bakteriophager). En rekombinase genkender specifikt en bestemt DNA sekvens, et site. Hvis to af disse genkendelses-sites sidder tilstrækkeligt tæt på hinanden, kan det DNA, der sidder imellem dem, blive skåret ud (Figur 5). Man kan derfor placere sådan et genkendelses-site på hver side af markørgenet, inden det sættes ind i planten, og efter man har brugt markørgenet til at udvælge de transgene planter, kan man skære det ud igen. Hidtil er tre rekombinaser blevet brugt i planter. De stammer fra gær eller fra bakteriofager, og de tilhører en familie af enzymer, som betegnes tyrosin-rekombinaser. Den bedst undersøgte af disse rekombinaser er CRE (CAUSES RECOMBINATION). CRE genkender en specifik DNA-sekvens, som kaldes lox (locus of cross-over). Ved at indsætte lox-sites på begge sider af et markørgen og udtrykke CRE i planten, kan DNA-fragmentet mellem de to 5

Rekombinaserne binder til genkendelsessekvenserne og fører dem sammen. Der sker overkrydsning mellem de to ens DNA-sekvenser fragmentet mellem dem skæres ud. Figur 5. Fjernelse af DNA-sekvens ved hjælp af rekombinase. Rekombinaser genkender specifikke DNA-sekvenser og bindes til dem. DNA-strengen bøjes, så de to genkendelses-sekvenser og de tilknyttede rekombinaser kommer til at ligge helt tæt sammen. Det fører til, at det DNA-fragment, som er placeret mellem de to genkendelses-sekvenser bliver skåret ud sammen med den ene genkendelses-sekvens, mens de to flankerende DNA-sekvenser bliver ført sammen, kun adskilt af en enkelt genkendelses-sekvens Et cirkulært DNA-molekyle og rekombinaserne frigøres. lox-sites fjernes (Figur 5). Der er flere eksempler på, at det er lykkedes at fjerne markørgener fra transgene planter ved hjælp af CRE/ lox, men der er visse problemer. Det har vist sig, at blot tilstedeværelsen af enzymet CRE er nok til, at planter kan komme til at se syge ud. Det samme gælder for celler fra insekter, mus og mennesker, hvor enzymet også er blevet undersøgt. Man mener at årsagen er, at genkendelses-sitet for CRE enzymet er så kort, kun 34 bp, så der tilfældigvis findes sites i de højere organismers DNA, som minder om lox. Undersøgelser i modelplanten Arabidopsis thaliana (gåsemad) viser, at der er adskillige mulige lox-sites i plantens eget DNA, og at mange af dem kan genkendes af CRE. Det kan lede til, at der sker uønskede overkrydsninger i plantecellernes eget DNA, og i værste fald kan det føre til, at cellerne dør. Forskning i β-rekombinase på Aalborg Universitet For at undgå de skader på planterne, som CRE/loxsystemet forårsager og for at udvide arsenalet af brugbare rekombinasesystemer i planter, er en rekombinase ved navn β, blevet undersøgt på Aalborg Universitet. β-rekombinase stammer ligesom CRE fra en bakterie (Bacillus subtilis), men tilhører en anden enzym-familie, som kaldes serinrekombinaser. Rekombinaser fra denne familie har ikke tidligere været afprøvet i planter. Blandt forudsætningerne for, at β-rekombinase kan anvendes til at fjerne markørgener fra transgene planter er, at enzymet er funktionelt, uden at det skader planten. β-rekombinase har et relativt langt genkendelses-site, der kaldes six (site of crossing over). Six er 90 bp langt, og derfor er der ringe sandsynligheden for, at der findes tilsvarende genkendelses-sites i plantens eget DNA med utilsigtede overkrydsninger i plantens DNA til følge. β-rekombinasens evne til at skære et stykke DNA ud afhænger af, at et andet protein bringer to genkendelsessites i kontakt med hinanden. I den bakterie, som β- rekombinasen stammer fra, udføres denne funktion af proteinet HBsu (Histone like protein from Bacillus subtilis). DNA er normalt relativt stift, og kan sammenlignes med en stålwire, der kan bøjes, men ikke bukkes uden at bruge en tang. HBsu virker som en tang for β-rekombinasen og bukker DNA-molekylet kraftigt imellem de to genkendelsessites, så de kan komme i kontakt med hinanden. Planter indeholder ikke proteiner, der direkte minder om HBsu. Til gengæld indeholder de en række andre proteiner, der har samme funktion, altså proteiner der kan bukke DNA kraftigt. Når man prøver at etablere et nyt system, er man nødt til at vise, at alle trin i processen virker. Første trin i analysen af muligheden for at anvende β-rekombinase i planter var, at undersøge, om plantens DNA-bukkende proteiner funktionelt kan erstatte HBsu. Derefter blev det undersøgt, om β-rekombinase kan udtrykkes i en plante, og om enzymet er i stand til at fjerne et specifikt stykke transgent DNA, som er integreret plantens arvemasse. Test af DNA bukkende proteiner En gruppe af de DNA-bukkende proteiner i planter er de såkaldte HMGB (High mobility group box) proteiner. Hypotesen om, at HMGB funktionelt kan erstatte bakteriens HBsu i relation til β-rekombinasen, kan testes på følgende måde. Man laver et plasmid, som indeholder et stykke DNA, der er flankeret af to six-sites (Figur 6). Man blander så plasmidet sammen med β-rekombinasen og tilsætter et HMGB protein. Hvis systemet virker, vil plasmidet blivet delt i to nye cirkulære DNA-molekyler. Som kontrol laver man et lignende forsøg, hvor man ikke tilsætter HMGB protein. I kontrolforsøget skulle plasmidet ikke blive delt på grund af manglende HMGB protein. Efterfølgende kan man så klippe DNA et og adskille DNA stykkerne efter størrelse ved hjælp af gelelektroforese. Man får så forskellige størrelser, alt efter om plasmidet stadig er helt, eller om det er blevet delt i to (Figur 6). Test af β-rekombinasen med og uden tilsat protein viste, at HMGB proteinerne er i stand til funktionelt at erstatte Hbsu i relation til β-rekombinasen. Næste skridt var at undersøge, om det var muligt at bruge β-rekombinasesystemet i planter. 6

Uden plante HMGB protein Uden DNA bukkende proteiner kan β-rekombinasen ikke rekombinere DNA et. Med plante HMGB protein Når DNA-bukkende proteiner er til stede kan β-rekombinasen rekombinere DNA et. β-rekombinase-konstruktion HMGB β-rekombinase Test-konstruktion før rekombinering Kontrol-konstruktion Promoter Kodende del af genet for β-rekombinase Six-site Spacer DNA Kodende del af GUS-gen Terminator Når DNA et efter-følgende klippes i stykker får man derfor de to viste DNA stykker. Når DNA et efter-følgende klippes i stykker får man derfor nogle andre DNA stykker. Figur 6. Forsøg, hvor det testes om HMGB-proteiner fra planter kan erstatte Hbsu-proteinet fra Bacillus subtilis. Figur 7. Gen-konstruktioner, der blev brugt til at undersøge, om enzymet β-rekombinase virker i planter. Hvis β-rekombinase virker, kan det skære spacer DNA et ud af test-konstruktionen, som dermed kommer til at svare til kontrol-konstruktionen. Genkonstrukter til test af β-rekombinase i planter For at teste β-rekombinase i planter, fremstillede vi tre genkonstruktioner (Figur 7): A: en β-rekombinase konstruktion, hvor udtrykket af β-rekombinasen styres af en promoter, der virker i planter. B: en test-konstruktion, som indeholder GUS adskilt fra sin promoter af et langt stykke DNA (spacer DNA) flankeret af to six-sites. Formålet med det indsatte spacer DNA er at forhindre udtrykket af GUS enzymet fra den kodende del. C: en kontrol-konstruktion, hvor promoteren og den kodende del af GUS-genet kun er adskilt af et six-site. Hvis β-rekombinasen kan fjerne spacer DNA et mellem de to sixsite i test-konstruktionen, vil den blive identisk med kontrolkonstruktionen. I første omgang blev de tre gen-konstruktioner transformeret ind i planter hver for sig. Formålet var at få svar på tre spørgsmål: 1: Er udtrykket af β-rekombinasen i planter et problem, ligesom det er blevet vist for CRE? 2: Er spacer-dna et i test-konstruktionen langt nok til at forhindre udtryk af GUS-enzymet? 3: Vil det six-site, der vil være tilbage mellem promoteren og den kodende del, efter at β-rekombinasen har klippet spacer DNA et ud af test-konstruktionen, forhindre udtrykket af GUS enzymet? Ad 1: Planterne, som var transformeret med β-rekombinase konstruktionen, så ud som almindelige planter og groede helt normalt. Det tyder altså ikke på, at β-rekombinase skader planten. Ad 2. Ingen af de planter, der var transformeret med test-konstruktionen, blev blå af at få tilført X-gluc. Disse planter havde altså ikke GUS-aktivitet, hvilket viser, at det indsatte spacer-dna var tilstrækkelig langt til at forhindre udtryk af GUS-enzymet (Figur 8). Ad 3. Alle planterne, der var transformeret med kontrolkonstruktionen og fik tilført X-gluc, blev blå. Det viser, at det 90 basepar lange six-site er kort nok til at tillade udtryk af GUS-enzymet fra den kodende del af gen-konstruktionen. Efter at have vist, at β-rekombinase kan udtrykkes i planter uden at skade dem, og at test-konstruktion og kontrol-konstruktion virker efter hensigten, kunne systemet testes som helhed. Test af β-rekombinase i planter For at teste om β-rekombinase virker i planter, skulle der fremstilles planter, som indeholder både genkonstruktionen med β-rekombinase og test-konstruktionen. Det gjorde vi ved at transformere planter, der indeholdt β-rekombinase konstruktionen, med test-konstruktionen. Hvis β-rekombinase-systemet virker i planter, skulle β-rekombinasen være i stand til at skære spacer DNA et ud af test-konstruktionen. Dermed ville promoteren og den del af gen-konstruktionen, som koder for GUS-enzymet, blive bragt tæt sammen ligesom i kontrol-konstruktionen. Det ville tillade udtryk af GUS-enzymet, som så kan 7

Planter med β-konstruktionen indeholder ikke GUSgenet og kan derfor ikke farves blå. Planter med test-konstruktionen har spacer DNA mellem promoteren og den kodende del, så GUS-genet ikke bliver udtrykt, og de kan ikke farves blå. I planter med både β-konstruktionen og test-konstruktionen bliver spacer DNA et skåret ud, og planterne kan derfor farves blå. Figur 8. Dette forsøg viser, at β-rekombinase fra Bacillus subtilis virker i planter uden tilsætning af Hbsu proteinet. Planter, der kun indeholder gen-konstruktionen med β-rekombinase, og planter, der kun indeholder test-konstruktionen, farves ikke blå, når man tilfører X-gluc. Hvis begge konstruktioner er til stede i den samme plante kan β-rekombinasen, evt. i samarbejde med HMGB-proteiner fra planten, skære spacer DNA et ud af test-konstruktionen. Promoteren kan dermed udtrykke den kodende del af GUS-genet, og planterne bliver blå, når de tilføres X-gluc. omsætte X-gluc til indigo. Hvis plantens egne DNAbukkende proteiner kan assistere β-rekombinase, så det kan fjerne et DNA-fragment, som er flankeret af six-sites fra plantens genom, skulle planter som har fået indsat både β-konstruktion og test-konstruktion blive blå. Omsider blev spændingen udløst. Alle planterne som indeholdt begge gen-konstruktioner viste blåfarvning. Det er dermed påvist, at β-rekombinase/six systemet fra bakterien Bacillus subtilis er funktionelt i modelplanten Arabidopsis thaliana. Fortsat behov for forskning Der er stadig mange ubesvarede spørgsmål, og arbejdet med β-rekombinase/six systemet i planter er langt fra færdigt. Nye udfordringer vil blive at undersøge, om det rent faktisk er HMGB proteinerne, der hjælper β-rekombinasen i planterne, eller om der er andre af plantens proteiner, der også kan udføre den DNA-bukkende funktion. Identifikation og karakterisering af planteproteiner, som kan bukke DNA kan lede til opdagelsen af nye proteiner eller til opdagelsen af nye funktioner for allerede kendte proteiner. Modelplanter er velegnede til grundvidenskabelige studier, men hvis β-rekombinase/six systemet skal anvendes til at fremstille genetisk modificerede afgrødeplanter uden markørgener, er det afgørende, at metoden kan implementeres i vigtige kulturplanter. Det er sandsynligt, at β-rekombinase/six systemet vil virke i tokimbladede arter som raps og kål, som er nært beslægtede med Arabidopsis thaliana, men det skulle også gerne virke i enkimbladede arter som ris, hvede og majs, som udgør størstedelen af verdens samlede fødevareproduktion. Behov for anvendt plantebioteknologi Vores kulturplanter er blevet tilpasset til menneskets behov igennem årtusinders udvælgelse og avl på af de individer, som var bedst egnede til produktion af fødevarer, foder og tekstiler mv. Målrettet forædling har bragt store fremskridt 8

indenfor det seneste århundrede, især i form af øget produktivitet. Dyrkede planter vil fortsat danne grundstammen i verdens fødevareproduktion. Med befolkningstilvækst og stigende velstand i flere udviklingslande er det en stor udfordring at sikre tilstrækkelig fødevareforsyningen. Samtidig er der stærkt stigende behov for at bruge planteprodukter som råvare til fremstilling af energi og en lang række produkter som i dag fremstilles af olie. Tilpasning af kulturplanter til nye formål kan i nogle tilfælde klares med konventionelle forædlingsmetoder, men der vil i høj grad blive brug for at supplere med bioteknologiske forædlingsmetoder, hvis der skal findes løsninger på de store udfordringer, som verden står overfor. Med arbejdet, som er beskrevet i denne artikel, er der blevet åbnet op for nye muligheder for at udvikle genetisk modificerede planter, som ikke indeholder markørgener og andre artsfremmede DNA-fragmenter, som der ikke er behov for i fremtidens skræddersyede kulturplanter. Referencer og videre læsning EFSA (2007). Statement of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the safe use of the nptii antibiotic resistance marker gene in genetically modified plants. http:// www.efsa.europa.eu/efsa/statement/gmo_statement_nptii_,0. pdf FAO/WHO (2000), Safety aspects of genetically modified foods of plant origin. Report of a joint FAO/WHO expert consultation on foods derived from biotechnology, http://www.who.int/foodsafety/ publications/biotech/ec_june2000/en/index.html Grønlund, J., Stemmer, C., Lichota, J., Merkle, T., Grasser, KD (2007). Functionality of the beta/six site-specific recombination system in tobacco and Arabidopsis: A novel tool for genetic engineering of plant genomes. http://www.springerlink.com/ content/j00457032h4255w1/ Haldrup, A. (1999). Planter og gensplejsning. Aktuel Naturvidenskab 3:14-17 Holme, IB, Brinch-Pedersen H, Lange M, Holm PB, Bach IC (2008). Gensplejsning af byg uden brug af selektionsgener. Planteforskning.dk. Kay, E., Vogel, TM., Bertolla, F., Nalian, R. and Simonet, P (2002). In Situ Transfer of Antibiotic Resistance Genes from Transgenic (Transplastomic) Tobacco Plants to Bacteria. Applied Environmental Microbiology 68:3345-3351 Miki, B., McHugh, S. (2004). Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety. Journal of Biotecnology 107:193-232 WHO (2005) Critically Important Antibacterial Agents for Human Medicine for Risk Management Strategies of Non-Human Use. Report of a WHO working group consultation, 15-18 February 2005, Canberra, Australia., World Health Organization. http://www.who.int/foodborne_disease/resistance/fbd_ CanberraAntibacterial_FEB2005.pdf Ordforklaring Agrobacterium - Bakterieslægt, som under naturlige forhold kan inficere planteceller og indsætte et DNA-fragment (T-DNA) i plantecellens arvemasse. Antibiotikaresistens - Modstandsdygtighed overfor et antibiotikum, f.eks. kanamycin. CRE/lox - Specifikt rekombinase-system, der stammer fra bakteriophagen P1. Systemet består af rekombinaseenzymet CRE (CAUSES RECOMBINATION) og DNA genkendelsessitet lox (locus of cross-over). Dyrkningssubstrat - Flydende eller fast næringssubstrat, som bruges til dyrkning af planteceller i vævskultur. Det indeholder makro og mikronæringsstoffer, kulhydrater og evt. plantehormoner. Eukaryoter - Organismer med cellekerne. Genkanon - Apparat til beskydning med metalpartikler, som bærer DNA. Gensplejsning - Begrebet bruges både om splejsning af DNA-molekyler udenfor en levende organisme og om overførsel og integration af DNA-fragmenter i en levende organismes genom. Se også transformation. GFP-gen - Et almindelig brugt reportergen, som koder for et fluorescerende protein (Green fluorescent protein; GFP). GFPgenet stammer fra en vandmand. GUS-gen - Et almindelig brugt reportergen, som koder for enzymet beta-glucuronidase (GUS). GUS-genet stammer fra E. coli. Herbicidtolerance - Mange afgrøder er naturligt tolerante overfor visse herbicider, men der bliver også indsat mikrobielle gener i planter, som giver tolerance overfor f.eks. glyphosat. Kallus - Udifferentierede planteceller, som dannes, når planten heler et sår eller når planteceller dyrkes i vævskultur. Kanamycin - Antibiotikum, som hæmmer både bakteriers plantecellers vækst. Markørgener - Se reportergen og selektionsgen. nptii - Gen, som koder for enzymet neomycin-phosphotransferase II. Dette protein inaktivierer kanamycin. Genet stammer fra E. coli. Plasmid - Cirkulært DNA-molekyle. Vildtyper af Agrobacterium bærer et såkaldt Ti-plasmid (Tumor Inducing plasmid). Tiplasmidet indeholder et T-DNA med gener, som inducerer dannelse af en tumor på det sted, som planten er blevet inficeret. Reportergen - Et gen, hvis udtryk er let at følge, enten visuelt eller ved en simpet test. Se også GFP-gen og GUS-gen. Selektere - Udvælge. Selektionsgen - Et gen, som gør det muligt at selektere transformerede celler eller væv på et dyrkningssubstrat, som indeholder et selektionsmiddel. Ofte anvendes et antibiotika-resistensgen, f.eks. nptii eller et gen, som giver tolerance overfor et herbicid. T-DNA - Den del af et plasmid, som overføres til en anden organismes genom ved Agrobacterium-transformation. Transformation - Overførsel og integration af DNA-fragmenter i en levende organismes genom. Se også gensplejsning. 9