Den rette vaccine til den rette infektion Gregers Jungersen, dyrlæge, ph.d, Professor i Veterinær immunologi og vaccinologi
Dagens tekst Immunologi ved forskellige infektioner Immunologiske korrelater for beskyttelse Den rette vaccine til den rette infektion PRRS Lawsonia 2
Forløbet af en infektion 3
4 Respons på VACCINATION
Immunsystemet beskytter imod 4 klassiske typer patogener - hver type bekæmpes forskelligt Type af patogen Eksempel Sygdom Relevant immunsvar Extracellulære bakterier, svampe og parasitter E. coli Clostridium tetani Trypanosoma brucei Actinobaccilus pleuropneumoniae Bl.a. fravænningsdiarré Stivkrampe Sovesyge Ondartet lungesyge ANTISTOFFER mod toksiner eller overfladeproteiner på agens Intracellulære bakterier og parasitter Lawsonia intracellularis Mycobacterium paratuberculosis Plasmodium falciparum Toxoplasma gondii Proliferativ enteropati Paratuberkulose Malaria Toxoplasmose ANTISTOFFER mod ekstracellulære stadier HJÆLPER T CELLE aktivering af makrofager DRÆBER T CELLER mod inficerede celler Virus (intracellulære) Influenza virus PRRSV Varicella zoster-virus Influenza PRRS Skoldkopper ANTISTOFFER mod ekstracellulære stadier DRÆBER T CELLER mod inficerede celler Parasitære orme (extracellulære) Ascaris Schistosoma spp. Spolorm Bilharziose Eosinofile granulocytter Antistof afhængig celle-medieret cytotoksicitet (ADCC) 5
Reguleringen af immunsystemet er komplekst 1. Kontakt 2. Optagelse i celler 3. Interaktion med immun celler Kitano & Oda 2006 6 Virus Intracellulære bakterier Extracellulære bakterier
Hvad fejler grisen? Det er ejeren der er syg! 7
Infektion med virus Smitte Virus bruger kroppens celler som fabrik for nye virus 8
Infektion med virus Virus bruger kroppens celler som fabrik for nye virus Antistoffer kan neutralisere spredning til nye celler, men ikke forhindre virus replikation 9
Peptider fra produktionen loades i MHC klasse I molekyler Brudstykker af egne og virus proteiner pakkes i MHC klasse I molekyler og præsenteres på cellens overflade Cytotoksiske T celler overvåger om cellen producerer egne proteiner eller virus 10
Peptider fra produktionen loades i MHC klasse I molekyler Ven eller fjende? Brudstykker af egne og virus proteiner pakkes i MHC klasse I molekyler og præsenteres på cellens overflade Cytotoksiske T celler overvåger om cellen producerer egne proteiner eller virus 11
Virusinficeret celle dræbes af cytotoksiske T celler Hvordan måler vi om der er dannet efter infektion eller vaccination? 12
Intracellulære bakterier Immunitet afhængig af T hjælper (T H 1) celler og interferon-gamma (IFN-γ) T H 1 13
Intracellulære bakterier Immunitet afhængig af T hjælper (T H 1) celler og interferon-gamma (IFN-γ) IFN-γ IFN-γ T H 1 14
Kvaliteten af et immunrespons efter vaccination afhænger af hvilken infektion der skal bekæmpes Antistoffer Toksin Extracellulær bakterie Virus Neutraliserende? Cellemedieret immunsvar Hjælper (T H 1) T-celler Intracellulære bakterier Cytotoksiske T-celler Virus (Lawsonia?) Ofte bedre X-beskyttelse mellem serotyper 15
16 Antistoffers effektormekanismer
Standard måling af antistof svar Antistof niveau Evt en bestemt antistof isotype Slimhinde siga respons (svært) Neutraliserende titer F.eks. inhibering af infektion i celle kultur ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay 17
3 Effektor T-celler Hjælper T-celle (T H ) Cytotoksisk T-celle (CTL) Natural Killer Cell www.the-scientist.com 18
Aktivering af T-celler Gutcher & Becher J Clin Invest. 2007 19
Cytokiner styrer differentiering af T H celler Naïve CD4 + T cell IL-12, IL-18, (IL-1) IL-4 TGF-β + IL-21/IL-6 IL-23 TGF-β, IL-2 T H 1 Cellemedieret Immunitet IFN-γ TNF-α IL-2 T H 2 Humoral Immunitet IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 T H 17 Proinflammatorisk IL-17 IL-21 IL-22 Treg Immun regulering TGF-β IL-10 20
Måling af cellemedieret immunitet (T H 1) Intradermal kutantest Antigen optages af Langerhans celler i kutis og præsenteres for circulerende lymfocytter. CD4+ T H 1 celler der genkender Ag vil producere cytokiner celleinfiltration og ødem = hudfortykkelse In vivo assay DTH delayed type hypersensitivity reaction 21
Måling af cellemedieret immunitet (T H 1) DTH delayed type hypersensitivity reaction Intradermal kutantest In vivo assay Interferon-gamma (IFN-γ) assay Isolerede lymfocytter eller heparin stabiliseret blod inkuberes i 20-22 timer med antigen. T H 1 celler der genkender Ag vil producere IFN-γ (ELISA) In vitro assay APC IL-12 IL-18 Ag CD4+/T H 1 IFN-γ IFN-γ produktion i supernatant måles i ELISA 22
Måling af cytotoksiske T celler (CTL) T cell TcR Peptid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MHC I Inficeret celle 23
Farvning af cytotoksiske (CD8+) T-celler med Tetramerer Rekombinant producerede MHC klasse I molekyler samlet I komplex med virus peptid Kobles i tetra- eller multimer strukturer Direkte farvning af Ag-specifikke lymfocytter T-celle membran APC Simulerer koblingen: 24 Tetramer production figure modified from: Generation of peptide MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange Boris Rodenko, Mireille Toebes, Sine Reker Hadrup, Wim J E van Esch, Annemieke M Molenaar, Ton N M Schumacher & Huib Ovaa Nature Protocols 1, 1120-1132 (2006) Published online: 31 August 2006 Corrected online: 19 October 2006 doi:10.1038/nprot.2006.121
Flowcytometri (FACS) måling af mærkede celler Fluorescens negativ celle population Fluorescens positiv celle population 25
Eksempel 1: PRRS 26
PRRS Antistoffer: Den gode, den onde og den grusomme Den gode: Neutraliserende antistoffer mod GP5 protein Den onde: Irrelevante antistoffer mod nsp2, N og M protein Den grusomme: Antistoffer (N og GP5) der øger optagelse af infektive virus makrofager (ADE) ADE: Antibody Dependent Enhancement
Udvikling af immunologiske hændelser efter PRRSV infektion Lopez OJ, Osorio FA. Role of neutralizing antibodies in PRRSV protective immunity. Vet Immunol Immunopathol. 2004 Dec 8;102(3):155-63. 28
En ny og bedre vaccine mod PRRS skal: Danne Neutraliserende Antistoffer Undgå ADE antistoffer Fremme et CD4+ og CD8+ cellemedieret immunsvar Aktivere makrofager via CD4+ Standse virus replikation ved CD8+ cytotoksicitet 29
Eksempel 2: Lawsonia intracellularis Ca 1400 proteiner i genomet Lokaliseret på begge sider af basalmembranen Obligat intracellulær Beskyttende immunitet er ikke klarlagt 30
Lawsonia inokulation med tarmhomogenat To re-infektion forsøg i 2006 og 2008 (totalt 44 grise) Primær infektion ved 5 uger Antibiotic clearance of the infection Challenge ved 12 uger Day: 0 21 31 49 Kill day 70-84 Group Primary infection Antibiotic Resolving/healing Challenge infection treatment Re-infection (Re-I) Treatment control (TC) Challenge control (CC) Primær infektion ved 5 uger Challenge ved 12 uger 31
Lawsonia udskillelse i fæces % positive pigs 100 75 50 25 Pass of bacteria Re-infection (RE) Treatment control (TC) Challenge control (CC) 0-7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Days 32
Lawsonia udskillelse i fæces % positive pigs 100 75 50 25 Pass of bacteria Re-infection (RE) Treatment control (TC) Challenge control (CC) Vaccine (V) 0-7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 Days 33
Patologisk score i tarm Experiment I Ileum Score (mean and range) 3 2 1 0 RE CC Challenge infection (3 weeks p.i.) score (mean and range) Experiment II Ileum Ileum 3 3 2 2 1 1 0 0 Primary Primary infection infection (3 weeks (3 weeks p.i.) p.i.) score (mean and range) RE RE CC Vac Challenge Challenge infection infection (5 weeks (5 weeks p.i.) p.i.) 34
Serum akut fase protein Haptoglobin µg/ml (mean +/- SEM) 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Re-infection Treatment control Challenge control 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 Day 35
Serum akut fase protein Haptoglobin µg/ml (mean +/- SEM) 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Re-infection Treatment control Challenge control Vaccine 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 Day 36
37 Hvilket immunrespons skal styrkes hvis en ny vaccine skal være bedre end Enterisol?
L. intracellularisspecifikt IgG og IgA i serum RE RE Maternel IgG beskytter ikke TC TC Grise uden antistofsvar er også beskyttede Ældre smågrise udvikler mere robust antistofsvar CC CC 38
Sekretorisk IgA i fæces RE siga respons på challenge kommer sent efter inokulation siga respons på challenge er ens i immune og naïve grise CC Ældre smågrise udvikler mere robust siga respons 39
Cellemedieret immunrespons CMI responses to L. intracellularis are not easily measured Guedes & Gebhart 2010 L. Intracellularis er obligat intracellular (cytosol) IFN-γ knock-out mus er mere modtagelige for Lawsonia infektion Tidligere DTH og IFN-γ assay målinger er lave og kun tilstede i få grise 40
Potensering med ril-18 afslører IFN-γ respons IFN-γ assay på L. intracellularis inokulerede grise dag 48 p.i. (N=12) og ikke-inokulerede kontrol grise (N=10) (Experiment I). Riber et al. Vet. Imm. Immunopathol. 2011. 41
ril-18 potentiated (50 ng/ml) IFN-γ assay IFN-γ respons efter primær infektion stiger i uger efter inokulation Umiddelbart IFN-γ boost efter challenge Ældre pigs udvikler et more robust IFN-γ respons IFN-γ (pg/ml) IFN-γ (pg/ml) IFN-γ (pg/ml) 10000 1000 100 10 1 10000 1000 100 10 1 10000 1000 RE 26 37 38 39 52 53 55 57 61 64 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 TC 27 29 43 62 68 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 CC Inoculation Inoculation 36 44 51 58 59 66 70 Inoculation 42 100 10 1 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 Day Inoculation
Gated Lymphocytes 43 Detaljering af IFN-γ producerende celler IFN-γ 95.5% IFN-γ + 4.5 % L. intracellularis-specific CD4+CD8+ er high IFN-γ producers IFN-γ - IFN-γ + 82.3 % 12.2 % L. intracellularis-specific CD4-CD8+ er low IFN-γ producers I CD8 + CD4 - cells II CD8 + CD4 + cells High productive cells Relativ IFN-γ produktion per celle 43
Detaljering af IFN-γ producerende celler 44 CD4+CD8+ IFN-γ high memory T H cells CD8+ IFN-γ low effector cytotoxic T cells? CD4+ T H cells CD4-CD8- NK cells? 44
L. intracellularis inficeret lamina propria har forøget antal CD4+ og CD8+ T-celler i forhold til immune grise. % cells (within gated lymphocytes) 100 75 50 25 0 * * * ns 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 Ratio CD4 + : CD8 high CD3 + CD8 high CD4 + Ratio CD4 + : CD8 high CC group RE group TC group 45
Lawsonia konklusioner Cellemedieret immunrespons Significant højere IFN-γ respons i immune grise Produceres af både CD4+CD8+ og CD8+ lymfocyter Serum IgG Maternelle antistoffer beskytter ikke (nok) Immunitet var ikke afhængigt af antistof respons Serum IgA Ingen booster effekt af challenge inokulation Lokal Intestinal siga Ingen forskel i respons på challenge inokulation mellem immune og modtagelige grise Kan først måles 2 uger inokulation 46 Cordes et al. Vet. Research 2012.
Hvilket immunrespons skal styrkes hvis en ny vaccine skal være bedre end Enterisol? Vores bud: Et cytotoksisk (CD8+) T-celle respons 47
Tak til: DTU Veterinærinstituttet Ulla Riber Henriette Cordes Hvass Lasse Eggers Pedersen Jeanne Toft Jakobsen Lien Thi Minh Ngyuen Peter Heegaard Lars Erik Larsen Københavns Universitet Søren Buus Plum Island Animal Disease Center, USDA William T. Golde 48
Dagens tekst Immunologi ved forskellige infektioner Immunologiske korrelater for beskyttelse Den rette vaccine til den rette infektion PRRS Lawsonia 49
Den store ligning: Spørgsmål? 50