Individuelt studieforløb Kandidatuddannelsen i Folkesundhedsvidenskab Københavns Universitet Forårssemesteret 2003 Tumorbiologi Antal anslag med mellemrum (eksklusiv tabeller, figurer, noter, indholdsfortegnelse, forside og referencer): 48.902 = 20,38 sider Vejleder: Lektor Bente Stallknecht Eksamensnummer 21 Afleveret den 4. juni 2003
Indholdsfortegnelse 1. Indledning... 3 2. Den normale celle... 4 3. Nomenklatur... 9 4. Molekylærbiologi... 11 1. egenskab: Selvtilstrækkelighed af vækstsignaler... 12 2. egenskab: Ufølsomhed for væksthæmmende signaler... 15 3. egenskab: Undgå programmeret celledød (apoptose)... 17 4. egenskab: Ubegrænset celledeling... 20 5. egenskab: Tiltrække blodårer (angiogenese)... 21 6. egenskab: Vævsinvasion og metastasering... 23 5. En samlet model?... 26 6. Et case-studium - mammacancer... 29 1. egenskab... 30 2. egenskab... 31 3. egenskab... 31 4. egenskab... 32 5. egenskab... 32 6. egenskab... 33 En samlet model... 33 7. Konklusion... 35 Referencer... 36 2
1. Indledning Cancer er en udbredt og i mange tilfælde fatal sygdom. I 1999 fik 31.348 danskere stillet diagnosen 1 og 15.446 døde af en cancersygdom 2. Dette betyder at cancer samlet set er den hyppigste dødsårsag i Danmark 2. Formålet med denne opgave er at få et indblik i de biologiske forandringer, der sker under onkogenesen *. Men lad det være sagt med det samme: En grundig gennemgang vil ikke være mulig! Netop dette forskningsfelt har udviklet sig eksplosivt de sidste årtier 3 og i denne opgave vil jeg kun kunne ridse i overfladen. Det skal også nævnes at selve produktet (denne opgave) ikke har været det væsentligste i kursusforløbet. Det har derimod været at læse biologiske artikler om cancer for at få en forståelse af onkogenese. I opgaven vil pladshensynet derfor komme til at spille en central rolle. Det har bl.a. medført at flere grundlæggende ting ikke præsenteres, men blot antaget kendt. Dette vil gælde elementer, der er blevet præsenteret på det obligatoriske kursus på Folkesundhedsvidenskab. Opgaven vil være opbygget med hovedvægt på cancerens molekylærbiologi (afsnit 4), men inden dette vil jeg præsentere fire emner, der er nødvendige at berøre inden molekylærbiologien (afsnit 2) og opstille en cancer-nomenklatur (afsnit 3). Disse to afsnit vil altså være springbræt for afsnit 4. I afsnit 5 vil jeg sammenholde fundene i en samlet model. Dette afsnit skulle således samle trådene og give afsæt til en præsentation af en enkelt cancerform: Mammacancer (afsnit 6). I dette afsnit vil begrebsapparatet blive benyttet på den hyppigst forekommende cancer hos kvinder i Danmark. Grunden til at det netop er denne cancerform, der vil være i fokus er at den vil spille en central rolle i mit kommende speciale. Opgaven afrundes i afsnit 7 med en konklusion. * Onkos betyder masse eller tumor og genesis begyndelse. 3
2. Den normale celle I dette første afsnit vil jeg præsentere fire emner, der er nødvendige at berøre inden den videre beskrivelse af cancerens molekylærbiologi: Gener, cellecyklus og cellecyklus-proteiner, epitelvæv og mutationer. Kroppen består af milliarder af celler, og der bliver hele tiden dannet nye, som erstatter dem, der ødelægges eller slides op. På den måde kan blod, hud og slimhinder gendannes og sår heles, så organismen vedligeholdes og vokser. Hele processen styres nøje af cellernes arveanlæg. DNAs funktion er at initiere og kontrollere proteinsyntesen. Dette er centralt for forståelsen af cancerceller, der er a disease of our genes 4. Cancer opstår på grund af mutation i generne, så visse proteiner ikke dannes, de forkerte proteiner dannes eller for mange proteiner dannes. Disse mutationer kan påvirke homeostasen. Cancer beskrives som en cellecyklussygdom med ukontrolleret eller upassende celledeling (proliferation) 5. Cancerceller deler sig hyppigere end organismens behov. Proliferation deles i fire faser: G 1 : Vækst og forberedelse af kromosomerne til replikation S: DNA-syntese G 2 : Forberedelse til mitosen M: Mitose Forskellige celletyper deler sig med vidt forskellige hastigheder og forskellene ses ved forskellige længder af G 1, da længden af S, G 2 og M stort set er ens for alle celletyper 5. Der findes en yderligere fase, G 0, hvor cellen ikke er under deling. I en cellecyklus foregår altså vækst og replikation, men også kontrol af at det er foregået korrekt. I cellecyklus-modellen bliver kontrollen begrebsliggjort ved fire kontrolpunkter; et i hver fase. Man forestiller Arveanlæg henviser i denne opgave til de proteinkodende gener, dvs. de nuklinsyresekvenser, der er nødvendig for syntesen af visse proteiner. Dermed er generne lokaliseret i DNA-molekylerne (desoxyribonukleo-acidum), dvs. at en specifik DNA-sekvens koder for et specifikt protein 98. Kromosomer er i denne sammenhæng tæt snoede DNA-molekyler. 4
sig at der i alle fire faser findes et kontrolpunkt inden cellen begiver sig videre ind i næste fase 6. Regulatorerne af om cellecyklus skal fortsætte forbi et kontrolpunkt har tiltrukket interesse inden for cancerforskning. De primære regulatorer er tre proteinfamilier: Cykliner, cyklin-afhængige kinaser (CDK) og CDK-hæmmere (CKI). Cyklinerne er karakteriseret ved en cyklisk adfærd (deraf navnet), således at syntesen af de forskellige cykliner er konstant og at der derved sker en løbende ophobning gennem cellecyklus. På visse tidspunkter i cellecyklus (forskellige tidspunkter for de enkelte cykliner) sker der en destruktion, hvorefter koncentrationen opbygges igen. CDK derimod har en konstant koncentration gennem cellecyklus. Kinaserne er dog ikke effektive før de bindes med specifikke cykliner. De enkelte cykliner bindes med specifikke CDK og derved kommer de enkelte CDK til at spille forskellige roller gennem cellecyklus. Det er altså cyklin-cdk-komplekserne, der medvirker til reguleringen af cellecyklus. Man kan skelne mellem cyklin-cdk-komplekser, der er forbundet med overgangen mellem G 1 og S og komplekser, der er forbundet med mitosen 5. I den første gruppe findes cyklin D og E, der bindes til CDK2, 4 og 6. I den anden gruppe er cyklin A og B, der bindes til CDK1. Denne opdeling er ikke helt korrekt, hvilket også fremgår af figur 2.1, da cyklin A indgår to steder alt afhængig af hvilken CDK den bindes til. Figur 2.1. Cyklin-kompleksers indvirkning under cellecyklus (fra Musunuru 5, side 41). 5
Det skal bemærkes at der findes flere cykliner og CDK end de netop nævnte, men at deres rolle i cellecyklus ikke er endeligt bestemt 5. Det skal også bemærkes at flere af cyklinerne består af flere undertyper. Forskellene mellem disse vil i opgaven blive fremhævet, hvor det er nødvendigt. Den sidste familie er CKI, der hæmmer virkningen af cyklin-cdkkomplekserne 7, hvor der skelnes mellem to grupper: CIP/KIP-familien, der består af p21, p27 og p57 (navnene refererer til proteinernes molekylære vægt). Denne familie hæmmer cyklin-cdk-komplekser med cyklin A, D og E. INK4-familien, der består af p15, p16, p18 og p19. Denne familie har fået navn efter deres inhiberende effekt på CDK4, men påvirker også CDK6. Disse tre protein-familier spiller en central rolle i cancer-udvikling, men som det vil fremgå af afsnit 4 er det nødvendigt at anskue dem i sammenhæng med andre molekylærbiologiske elementer. Man ved at cancer potentielt kan opstå i alle celletyper, men langt hovedparten af tumorer opstår i epitelvæv. Epitelvæv består af cellelag, der giver beskyttelse til kroppens ydre og indre overflader. De spiller en vigtig regulerende rolle, fordi alt hvad der skal ind i kroppen skal gennem dem. Epitelvævet kan bestå af et lag af celler (simpelt epitel) eller flere lag af celler (stratificeret epitel). Det inderste lag er typisk forbundet med basalmembranen. Epitelvæv klassificeres i tre typer efter cellernes form: Plade- (squamous), kubisk- (cuboidal) og cylinderepitel (columnar). Visse specialiserede epitelceller kan være samlet i kirtler, der f.eks. kan udskille enzymer. Dette gælder dog kun for tumorer blandt voksne (over 80% af tumorer blandt voksne har oprindelse i epitelvæv), da pædiatriske tumorer i højere grad har oprindelse i blod, lymfe eller nervevæv. Kun ca. 9% af børnetumorer har oprindelse i epitelvæv 9. 6
Figur 2.2 viser stratificeret epitelvæv: Yderst (venstre) ses pladeepitelvæv og under disse findes flere lag af celler, der vil blive skubbet ud når de yderste celler går til grunde. Inderst mod basalmembranen findes det basale cellelag, der ved deling giver ophav til de yderste celler. I epitelvævet er ingen blodårer eller lymfekar. Herunder er basalmembranen, der adskiller epitelvævet fra det underliggende bindevæv, der er rigt forsynet med blodårer og lymfekar. Figur 2.2. Epitelvæv i spiserøret. Som beskrevet koder DNA for proteiner, dvs. rækkefølgen af aminosyrer i proteinet. Sker der ændring i genets kode vil rækkefølgen ændres. En ændring i et gen, der videreføres til næste cellegeneration, kaldes genmutation. Langt hovedparten af mutationer videreføres dog ikke, da cellen under celledeling kontrollerer og reparerer skader på DNA. Mutationer kan ske ved påvirkning af miljømæssige stoffer (f.eks. ultraviolet stråling eller genotoksiske kemikalier), af biprodukter ved normal cellulær metabolisme eller ved at kemiske bindinger i DNA opløses under fysiologiske betingelser 4. Når der sker mutationer uheldige steder får det konsekvenser for genproduktet, proteinet, ved at det får en ny aminosyresekvens, så det enten mister sin funktion, får en ny funktion eller bliver hyperaktivt. Det er kun mutationer i særlige gener, der kan være onkogene (cancergener). 7
Da der hele tiden sker celledelinger er der også en betydelig risiko for at udvikle blivende genmutationer. På trods af det optræder der kun få DNA-skader, der bliver vedvarende mutationer. Årsagen er dels et effektivt reparationssystem i cellen og dels et selvmordsprogram, der aktiveres når skaden ikke kan repareres (apoptose). Mindst fire, delvist overlappende, reparations-pathways findes (se Hoeijmakers 4 ). Ved en mutation kan der altså ske en af tre ting: 1) DNA-skaden rettes og cellen fungerer normalt, 2) DNA-skaden rettes ikke og cellen dør eller 3) DNA-skaden forårsager en mutation, der videreføres til næste cellegeneration. Den tredje mulighed sker ved onkogenese, men også ved aldring eller visse medfødte sygdomme. Mangler i et eller flere reparationssystemer øger hyppigheden af mutationer i DNA. Dette er også fundet associeret med visse cancerformer, f.eks. mutationer i generne MLH1 og MSH2, der disponerer for udvikling af coloncancer. Efter at have præsenteret disse emner vil cancernomenklaturen blive præsenteret. 8
3. Nomenklatur Cancer betyder krabbe på latin, da man i antikken så at cancervæv strakte sig ind i normalt væv ligesom en krabbeklo. Tumor, der ofte benyttes om cancer, betyder masse. Begrebet gælder uanset om massen har inflammatorisk, patologisk eller fysiologisk oprindelse. Et tredje begreb er neoplasme, der betegner væv, der vokser abnormt og ikke opfylder brugbare eller nødvendige funktioner for værtsorganismen. Både tumor og neoplasme dækker således bredt. Normalt skelnes mellem benigne (godartede) og maligne (ondartede) tumorer/neoplasmer. Benigne opstår når normale celler deler sig for meget, hvilket kaldes hyperplasi **. Benigne tumorer/neoplasmer spreder sig ikke til andre organer og må ikke forveksles med cancer. De kan forsvinde af sig selv eller blive siddende. Her kan de give irriterende gener (f.eks. forstoppelse i tarmen) eller være livstruende, hvis de presser på sårbart væv (f.eks. i hjernen). I en malign tumor er cellerne derimod ikke normale. Cellerne deler sig for meget og de får en unormal form og indbyrdes placering. Dette kaldes dysplasi. Hvis denne udvikling fortsætter vil dysplasi efterfølges af karcinoma in situ, som er en malign tumor, der ikke er vokset gennem basalmembranen. Hvor normale celler begår selvmord, hvis de er syge, fortsætter cancerceller med at dele sig. Bliver de ikke behandlet kan de vokse ind i de nærtliggende organer. Når tumoren bryder igennem det omkringliggende væv (f.eks. basalmembranen), er der tale om invasiv cancer. Hvis cancercellerne når blod- eller lymfebanen kan de blive ført videre rundt i kroppen og vokse i andre organer. Dette kaldes metastase. Neo betyder ny og plasi dannelse. ** Betyder for meget dannelse. Dårlig dannelse. Betyder en malign tumor med oprindelse i epitelvæv på sin rette plads. Betyder omflytning. 9
Cancer kan i princippet opstå i alle kroppens celler. Ved navngivelsen af en tumor er hovedreglen at det sker med henvisning både til organet, hvor canceren er opstået samt om tumoren er benign eller malign. Endelsen -oma betyder tumor af og når endelsen kun er dette henviser det til benigne tumorer. Tre endelser beskriver en malign tumor: Karcinoma, sarkoma og blastoma. Karcinoma henviser til en malign tumor med oprindelse i epitelvæv, sarkoma til en malign tumor fra bindevæv, mens en gruppe af maligne børnetumorer har endelsen blastoma 8. Det er karcinomer, der er den langt hyppigste cancertype 9. Det skal bemærkes at denne nomenklatur har visse undtagelser, f.eks. melanoma, der er en malign tumor med oprindelse i pigmenteret hud. 10
4. Molekylærbiologi Gennem de sidste årtier har cancerforskning givet en stadig større og mere kompleks viden. Cancer beskrives som en sygdom, der involverer mange molekylærbiologiske forandringer. Disse ændringer fra normal til malign celle vil være omdrejningspunktet i dette afsnit. Kompleksiteten kan enten beskrives med en stor detaljerigdom og mange nuancer, der skaber et indtryk af kompleksiteten. Eller den kan beskrives ud fra nogle få og (relativt) enkle principper, der så eventuelt kan suppleres med flere detaljer. Formålet med nærværende opgave vil ikke være at beskrive al viden om de enkelte onkogener, cykliner, integriner, etc. (det vil kræve flere bøger), men vil derimod være at skabe et overblik, der så kan bruges som en begrebsramme de enkelte proteiner kan indplaceres i. Begrebsrammen vil indeholde seks dimensioner, som går igen ved mange cancertyper 3;10-12. Den bagvedliggende idé til denne skematisering er ældre. Foulds beskrev i 1954 cancer som en sygdom, der udvikles progressivt fra normale celler via en serie af præmaligne tilstande til invasiv cancer 13. Denne opfattelse er blevet underbygget af studier, der viser at maligne celler har flere mutationer 10. Det diskuteres stadig om disse egenskaber er nødvendige og/eller tilstrækkelige og om de genfindes ved alle cancer-former. Dette vil jeg ikke berøre i nærværende opgave, men blot understrege at modellen ikke har status som sikker viden. De seks egenskaber kan ses i tekstboks 4.1. Tekstboks 4.1. Cancercellers seks egenskaber 1. Selvtilstrækkelighed af vækstsignaler 2. Ufølsomhed overfor væksthæmmende signaler 3. Undgå programmeret celledød (apoptose) 4. Ubegrænset celledeling 5. Tiltrække blodårer (angiogenese) 6. Vævsinvasion og metastase 11
Hver af disse ændringer i maligne celler repræsenterer en succesfuld overlevelsesevne, som en normal celle ikke evner. De seks egenskaber vil blive gennemgået i det følgende. 1. egenskab: Selvtilstrækkelighed af vækstsignaler Normale celler er afhængige af vækstsignaler for at kunne begive sig fra hvilefase (G 0 ) til en aktiv proliferativ fase. Cancerceller adskiller sig fra denne afhængighed, da de udviser en markant reduceret afhængighed af eksogen vækststimulation. Dette skyldes både at cancerceller genererer en betydelig andel af vækstsignaler selv samt at de begynder celledeling ved en lavere påvirkning af vækstfaktorer. Denne uafhængighed bryder med en væsentlig homeostatisk mekanisme, der normalt medfører en passende opførsel af celler i et væv. Onkogener modulerer netop denne egenskab ved cancerceller. Et onkogen er et muteret proto-onkogen. Proto-onkogeners funktion er regulering af normale cellers vækst og differentiering og indgår i signaleringen fra det ekstracellulære rum til cellekernen. Gennem en kaskade af begivenheder bliver et eksternt signal ført gennem cellemembranen og ind til kernen og skaber derved en respons oftest gennem specifikke ændringer af transkriptionen. De enkelte protoonkogener indgår specifikke steder i denne kaskade. Se tabel 4.1. (Proto)onkogens funktion Vækstfaktor Vækstfaktorreceptor Intracellulært signalprotein Genreguleringsprotein Eksempel PDGF TGFα Beskrivelse Cancerceller kan selv skabe og udskille vækstfaktorer, der påvirker egne receptorer (autokrin signalering) Cancerceller kan have receptorer, der erbb-1 Integriner signalerer uden vækstfaktor ras I cancerceller kan et signalprotein afsende vækststimulerende signaler uden aktivering af en receptor Myc Et genreguleringsprotein kan aktivere et specifikt vækst- og delingsgen uden stimulering fra et signalprotein Andre proteiner Bcl-1 Bcl-1 koder cyklin D1 MDM2 (cellecyklusprotein) og MDM2 er antagonist til p53 Tabel 4.1. Proto-onkogener og onkogener klassifikation i forhold til deres funktionelle rolle. Omskrevet fra McKinnell 8, side 140 12
Tabel 4.1 er en forsimpling, men giver dog et indtryk af hvor onkogener kan påvirke signalvejen fra det ekstracellulære miljø til proteinsyntese eller celledeling. Den første gruppe onkogener fremtvinger afvigende produktion og udskillelse af vækstfaktorer. Mens de fleste vækstfaktorer, der fremmer celledeling og vækst, udskilles af en celle for at fremme celledeling hos en anden celle (parakrin eller endokrin signalering) formår cancerceller ofte at udskille vækstfaktorer de selv responderer på (autokrin signalering). Et eksempel er TGFα ***, der udskilles fra karcinomer. Denne fremmer deling og kan binde sig til samme cancercelle, der udskilte dem. En anden type onkogener kan ændre membranbundne receptorer, så de får en unormal funktion. En afvigende proteinstruktur kan afsende vedvarende signaler til cellekernen uden at der bindes et signalstof til receptoren. Et eksempel er erbb-1 receptoren for EGF, der fremmer deling af flere typer epitelvæv. En anden gruppe membranbundne proteiner er integriner, der er receptorer som bindes til den ekstracellulære matrix (ECM) 14. Ved binding til specifikke dele af ECM fikseres cellen, men fremmer desuden at signaler sendes ind i cytoplasma, der påvirker celleadfærd f.eks. aktivering af celledeling 15;15. Den tredje gruppe koder for proteiner, der indgår i signalvejen fra cellemembranen til kernen. Et eksempel er ras-familien, der er lokaliseret på indersiden af cellemembranen, hvor den ved aktivering videresender receptor-medierede stimuli 16. Et muteret ras-gen kan medføre, at der konstant afsendes signal til kernen uafhængigt af signal fra receptoren. Det er vist at ras signaleringen påvirker cellecyklus gener (f.eks. cyklin D1 og E) 17. Den fjerde gruppe proto-onkogener koder for proteiner, der indgår i genreguleringen i kernen. Heriblandt findes myc-familien. Normalt fremstilles myc kun når cellen stimuleres med en vækstfaktor, men ved flere cancerformer er koncentrationen af myc vedvarende forhøjet 18. myc påvirker celledeling på flere måder 18 : Ved at aktivere *** Transforming Growth Factor α. Epidermal growth factor. 13
cyklin/cdk-komplekser 19 (f.eks. medfører c-myc en hurtig stigning i transkription af CDK4 20 og aktivering af kinaser associeret med cyklin D1 og E), ved at aktivere E2F-afhængig transkription 21 (se næste afsnit) og ved at regulere proteinsyntese i celler positivt. Den femte gruppe indvirker ikke et specifikt sted i signalvejen. Bcl-1 spiller en rolle i sammenhæng med cyklin D1 22 og MDM2 er tæt forbundet med tumorsuppressorgenet p53 (se næste afsnit). Ud over disse onkogener er også cellecyklusproteinerne centrale. Cyklin A vil umiddelbart være speciel interessant, da den er involveret i både overgangen fra G 1 til S-fasen samt under mitosen, men der findes kun få studier der viser en sammenhæng mellem cyklin A og cancer 5. Cyklin A/CDK2 spiller en væsentlig rolle ved initieringen af DNA-replikation samt ved kontrol af at kun en DNAreplikation gennemføres per celledeling. Under mitosen er cyklin As rolle stadig uklar, men proteinet spiller måske en rolle i stabilisering af cyklin B 23. Cyklin Bs rolle under mitosen er stadig uklar 5 24 og der er ikke fundet en sammenhæng mellem cyklin B og cancer 5. D-type cykliner (D1, D2 og D3) spiller en afgørende rolle ved kontrolpunktet i G 25 1. Det er vist at cyklin D1 og D2 er forbundet med flere cancerformer 5;22, men visse studier viser at effekten af D1 og D2 ikke er ens 26 og at effekten af D2 ikke er ens for forskellige cancertyper 27. Som beskrevet ovenfor regulerer c-myc cyklin D 19. E- type cykliner er fundet associeret med flere cancerformer, men sammenhængen med onkogener er stadig uklar 5. Sammenhæng mellem CDK og cancer stemmer i større eller mindre grad overens med de resultater, der netop er fremstillet for cyklinerne. D-type cykliner kombineret med CDK4 og 6 er aktive i starten og slutningen af G 1 -fasen, mens cyklin E/CDK2 aktiveres i slutningen af G 1 og ved inaktivering af prb (se næste afsnit) 28. Desuden er cyklin D/CDK4 og 6 ofte overaktivt ved onkogenese, mens cyklin E/CDK2 sjældent spiller en aktiv rolle i onkogenesen. Et andet studie 25 fremhæver at cyklin D og E spiller forskellige roller i overgangen, således at cyklin D/CDK4 og 6 spiller en central rolle, men at cyklin E/CDK2 støtter ved inaktivering af prb. De foregående sammenhænge kompliceres dog yderligere af at et cyklin påvirker andre cykliner. Et eksempel er cyklin D-afhængige 14
kinaser (CDK4 og 6), der via flere medierende faktorer, påvirker cyklin A og E 25. Den sidste gruppe er CKI. Ændringer i CIP/KIP hæmmerne er sjældne i cancer, men det er vist at de inaktiverer cyklin E/CDK2 komplekser 28. Selvom der findes flere studier, der viser at p27 har en betydning for udvikling af f.eks. leukæmi og lymfomer, viser hovedparten af studier ikke ændringer af p27 5. INK4-familien binder specifikt til CDK4/6 og hæmmer dermed aktivering af cyklin D. p16 er den regulator, der oftest er ændret ved cancer 5. p16 bindes til CDK4/6 og driver derved cellen ud i G 0 eller stopper cellen i G 1 28. Vi ved altså nu at cancerceller kan påvirke sig selv til vækst uafhængigt af eksterne stimuli. At cancercellen er fuldstændig uafhængig af omgivelserne er dog ikke korrekt. Man skal derimod anse cancercellen som en celle, der bruger omgivelserne til sit eget bedste. En succesfuld cancercelle er en celle, der kan påvirke naboceller (også ikke-maligne) til at udskille vækstfremmende faktorer 29. Disse celler udvikles sammen med cancercellerne for at støtte med vækstsignaler 30 og studier viser at betændelsesceller tiltrukket til områder med cancervæv kan fremme cancerceller 31. 2. egenskab: Ufølsomhed for væksthæmmende signaler Tumorsuppressorgener (herefter TSG) koder for proteiner, der bremser normale cellers vækst og deling. Mutation af disse gener kan medføre at de enten ikke koder for de korrekte proteiner eller at proteinerne inaktiveres. Dermed ophører en central kontrolmekanisme. En gruppe TSG blokerer signalvejen fra membranbundne receptorer til kernen. To eksempler er DCC, der er relateret til cellulære adhæsions receptorer og NF-1, der bindes til ras, så det ikke kan stimulere til vækst. Celler der mangler NF-1 mangler derfor en hæmmer af ras, der derved vedbliver med at sende signaler til kernen. Forkortelse for Deleted in Colorectal Carcinoma. Receptorer, der binder celler til naboceller. 15
En anden gruppe af TSG blokerer kerneproteiner. To centrale er p53 og prb. Inaktive former af disse findes i mange cancerformer og det er foreslået at alle cancere enten mangler den ene eller begge 32. Effekterne af de to TSG vil i det følgende blive præsenteret. **** Retinoblastoma-proteinet (prb) blev først fundet ved en sjælden arvelig børnecancer, hvor børn i en tidlig alder fik bindevævscancer i begge øjne. Forekomsten af Rb-mutationer i hovedparten af menneskelige tumorer er lav. Hvad der derimod gør prb interessant er at proteinet regulerer E2F i tidlig G 1 28. E2F spiller en væsentlig rolle i at bringe cellen gennem cellecyklus. Tidligt i G 1 er prb og E2F bundet, men gennem G 1 inaktiveres prb af cyklin/cdkkomplekser, hvilket medfører at prb s affinitet for E2F falder. E2F påvirker derefter gener, der muliggør at cellen fortsætter fra G 1 til S- fasen. Herved fremstår prb som en medierende faktor fra cyklin/cdk-komplekset og til aktiveringen af E2F 33. Men cyklin/cdk-komplekset hæmmes af CKIs. Specielt INK4-familien påvirker cyklin D, der er aktiv i starten af G 1. Se figur 4.1 32. Figur 4.1. CKI hæmmer cyklin-komplekser, der hæmmer prb. p53 er ofte muteret i cancer og det er at de fleste cancere enten har en defekt i p53 eller i signalvejen til aktivering af p53 ved onkogen stimulation 34. p53 aktiveres ved cellulært stress (f.eks. DNA-skade, aktivering af onkogener eller hypoksi 35 ) og skal ses i sammenhæng med proto-onkogenet MDM2. I ikke-stressede celler er p53 effektivt undertrykt, hvilket hovedsageligt skyldes MDM2. MDM2 virker på den ene side som en effektfuld antagonist til p53 ved fysisk at binde sig eller ved at skabe protease-medieret svækkelse af p53 34. På den anden side er MDM2 et mål for p53s aktivitet. Netop denne samtidige hæmning af hinanden kaldes for det basale p53-mdm2 **** Jeg må dog fremhæve at det af pladshensyn har været nødvendigt at tegne et stærkt forenklet billede. En familie af transskriptionsfaktorer. Prote(in)aser er en fællesbetegnelse for enzymer, der spalter specifikke proteiner. 16
loop 36. Dette loop vil vægte til fordel for MDM2 hos en ikke-stresset celle, dvs. p53 er inaktivt i den ikke-stressede celle. Når cellen stresses sker der en forskydning i det basale p53-mdm2 loop. Det sker på flere måder, hvoraf kun en skal præsenteres her. Den bedst forståede mekanisme inkluderer ARF TSG. ARF binder sig til MDM2 og hæmmer dets aktivitet, hvilket igen frisætter p53 fra denne hæmning. Flere onkogener er blevet fundet at aktivere p53 via ARF, deriblandt myc, ras og E2F(1) (f.eks. fremmer ras ARF, der hæmmer MDM2, der derefter mindsker hæmningen af p53, som derfor aktiveres) 36. p53 kan medføre flere ting: Cellecyklus kan stoppes, apoptose kan gennemføres eller p53 kan medvirke til reparation af DNA-skader. Hvad der vælges afhænger bl.a. af koncentrationen af p53. Høj koncentration medfører apoptose 34 (se næste afsnit). Men prb og p53 er også koblet på flere måder. Den første er E2F, da et inaktivt prb fremmer E2F-transkriptionsfaktorens aktivitet. Samtidig har studier vist at E2F også fremmer ARF, som igen hæmmer MDM2, hvilket i sidste ende aktiverer p53 37. En yderligere kombination sker også over E2F og ARF, da høj ras-aktivitet både fremmer E2F og ARF aktivitet, der igen hæmmer MDM2 og p53 bliver derfor aktiveret. Det samme gælder for myc, der påvirker E2F 37. Pga. disse mekanismer vil muterede TSG medføre at celler vil fortsætte proliferation i situationer, hvor værtsorganismen ikke har behov for det. 3. egenskab: Undgå programmeret celledød (apoptose) Flercelleorganismer er afhængige af forskellige celletypers funktion. Når organismen er færdigudviklet behøver kroppen at bevare og forny disse celletyper, hvilket sker ved en konstant celledeling og død 38. Som beskrevet i de to foregående afsnit er proliferation en stærk reguleret proces. Reguleringen af celledød er en ligeså kompleks proces. Der findes grundlæggende to former for celledød: Nekrose og apoptose. Nekrose er en passiv proces, der f.eks. kan ske ved mekanisk skade eller forgiftning. Cellen svulmer op, 17
plasmamembranen går i stykker og organellerne i cytosolen løber ud i det ekstracellulære rum, hvilket resulterer i inflammation. Apoptose derimod er en aktiv proces, der foregår ved at cellen skrumper ind, cellemembranen omdannes til blærer, cellekernen fragmenterer og DNA opsplittes. Herefter omdannes cellen til små vesikler (apoptotic bodies), der optages af fagocytter. Herved undgås inflammation 39. Generelt skelner man mellem to pathways ved apoptose 40 : 1. Den ydre pathway 2. Den indre pathway Ved den ydre pathway aktiveres apoptose via membranbundne death receptors, der påvirkes af ekstracellulære signalstoffer, f.eks. TNF ***** og FasL 41. Disse bindes til specifikke receptorer, der sender signal ind i cellen, der fremmer visse caspaser. Disse udløser andre caspases, der eksekverer apoptosen gennem selektiv destruktion af cellulære organeller og DNA 10. Det skal bemærkes at kaskaden kan hæmmes flere steder, hvilket ikke vil blive beskrevet her (se eventuelt French 42 ). Et eksempel kan ses i figur 4.2. Figur 4.2. En ydre pathway, der medfører apoptose. Ved både den ydre og den indre pathway spiller mitokondria ofte en central rolle 43;44. Ved påvirkning eksternt kan den aktiverede caspase 8 udover at aktivere caspase 3, 6 og 7 også påvirke mitokondrier til at udskille cytokrom c, der igen aktiverer caspase 9, som aktiverer apoptose 40. Udskillelsen af cytokrom C sker ved at mitokondriernes yderste membran bliver permeabel for proteiner, der findes i intermembranøse rum (heriblandt cytokrom C) samtidig med at den inderste membrans transmembrane potentiale formindskes. I dette tilfælde er den indre pathway relevant, der aktiveres ved f.eks. DNA- Den indre pathway kan desuden skilles mellem pathways, der involverer caspases og pathways, der ikke involverer disse 45. Det vil fremgå i den videre beskrivelse. ***** Tumor necrosis factor, som den overraskende hedder! En familie af intracellulære proteaser. 18
skader. Som beskrevet i det foregående afsnit vil p53 blive aktiveret ved DNA-skader, der herefter vil aktivere bax (et pro-apoptotisk medlem af bcl-2 familien; se nedenfor), der igen påvirker mitokondrier til at udskille cytokrom C 34. En anden indre pathway inddrager ikke caspaser, men virker direkte på cellekernen 45. Eksempler i denne gruppe er AIF og endonuclease G, der også udskilles fra mitokondrias intermembranøse rum. En anden gruppe af proteiner er bcl-2 familien, der både er proapoptotiske (f.eks. bax og bak), anti-apoptotiske (bcl-2 og bcl-x) og nogle der gør cellen mere følsom for apoptose-stimuli (BH3 proteinerne). Bcl-2 familien optræder som kontrolproteiner af apoptose-signaler. Skematisk er pathways og proteiner opstillet i figur 4.3. Figur 4.3. Oversigt over forskellige pathways til apoptose. Apoptosis-inducing factor. 19
4. egenskab: Ubegrænset celledeling Selv med de tre ovenstående egenskaber vil en cancercelle møde endnu en barriere: At celler kun kan dele sig et endeligt antal gange. Denne begrænsning sker sandsynligvis uafhængigt af celle-til-celle signaler 10. Når en celle har delt sig et antal gange (ca. 50-100 gange for humane celletyper 3 ) stopper delingen, en fase kaldet senescence. Dette stop kan dog overkommes ved at TSG prb og p53 hæmmes, hvorved cellen kan fortsætte deling indtil den når ind i en fase kaldet krise 46. I denne fase kan cellen ikke længere dele sig og vil derfor senere hen undergå apoptose. Denne proces forklares ved at der ved hver celledeling mistes et stykke af den yderste del af kromosomet kaldet telomer. Efter et vist antal celledelinger har cellen ikke længere mulighed for deling, fordi telomer er blevet for kort (senescense). Telomer kan altså forstås som et slags replikometer 47, der styrer antallet af gange en celle kan dele sig. I denne fase stopper cellen i G 1 -fasen. Inaktivering af p53 og prb medfører at cellen kan komme fra G 1 til S, hvilket medfører at cellen stadig kan dele sig i senescence. Celler mister dog stadig telomer ved hver deling, hvilket efter endnu nogle delinger medfører at cellen går ind i krisefasen 46. I denne fase vil cellen ikke længere kunne dele sig og vil derfor gennemføre apoptose efter et stykke tid. Se figur 4.4 for at vise sammenhængen mellem længden af telomer og antallet af celledelinger. Figur 4.4. Sammenhæng mellem antal celledelinger og længden af telomer (fra Bryan 48 ). Normale celler vil således kun kunne dele sig et endeligt antal gange. For at overkomme forkortelsen af telomer kan menneskelige celler danne enzymet telomerase, der bevirker at telomer forlænges. Ved at danne dette enzym kan cancercellen overkomme barrieren og opnå 20
evnen til ubegrænset deling 3. Disse celler kaldes udødelige celler 10. Det er fundet at telomerase er hæmmet i normalt menneskeligt væv, men aktiveret i cancer, hvor det foreslås at udødelige celler er en nødvendighed for tumorvækst 49. Forekomsten af aktivt telomerase er blevet fundet i langt hovedparten af cancere 50 og samtidig er det vist at aktiviteten af telomerase er korreleret med cancer-sygdommens aggressivitet 3. Mekanismen bag og selve kontrollen af telomerase er ikke endeligt forstået, men flere onkogener og TSG er fundet at indgå i denne kontrol (f.eks. m-myc, p53, prb, Bcl-2) 51. Se f.eks. Greider 52 for en diskussion af sammenhængen mellem myc, HPV og telomerase. 5. egenskab: Tiltrække blodårer (angiogenese) Oxygen og næringsstoffer er nødvendig for alle celler i kroppen og spredes gennem et tæt net af blodårer. Ved tumorvækst er det nødvendigt at nye blodårer tiltrækkes, så alle celler i tumoren ernæres tilstrækkeligt 10. Angiogenese er en proces, hvor nye blodårer knopskyder ud fra allerede eksisterende blodårer 53, der er reguleret af pro- og anti-angiogene faktorer. Angiogenesens centrale rolle ved udvikling og vækst af tumorer har været kendt i flere år uden at mekanismerne var endeligt forstået. Hvis en tumor skal vokse over 2-3 mm 3 er det nødvendigt at udvikle et tæt netværk af blodårer i tumoren til forsyning af cancercellerne samt til afgivelse af affaldsstoffer. I hurtigtvoksende tumorer vil blodårer ofte ikke dannes hurtigt nok til at tumorens inderste celler når at få energi og ilt nok. Derfor vil en tumor ofte fremstå med levende celler yderst og døde celler inderst. Nyere resultater viser dog, at hypoksi har flere konsekvenser, f.eks. en mere aggressiv tumortype, udskillelse af flere vækstfaktorer og større tendens til metatastasering 54. Hypoksi-initieret angiogenese starter med at tumoren udskiller proangiogene faktorer, der diffunderer gennem det nærtliggende væv og binder sig til receptorer på endotelceller i nærtliggende blodårer. Human papilommavirus. 21
Dette aktiverer endotelcellerne til at producere enzymer, der opløser basalmembranen, der omslutter blodåren. Endotelcellerne deler sig og udvikler blodåren gennem hullerne i basalmembranen i retning mod tumoren. Adhæsionsmolekyler (f.eks. integriner) fastholder de nye endotelceller samtidig med at andre enzymer opløser væv foran blodåren i bevægelsen fremad. Samtidig med dette remodelleres vævet omkring blodåren. Endelig dannes glat muskulatur omkring blodåren, så det er muligt at regulere blodårens dilationsgrad. 10;53;55 I processen indgår flere faktorer. En gruppe af pro-angiogene vækstfaktorer er VEGF ******. VEGF A-E binder til membranbundne receptorer (VEGFR 1-3) på endotelcellerne og udløser forskellige effekter: Initiering af angiogenese, lavere permeabilitet af blodårerne og kontrol af væksthastigheden 56. VEGF suppleres af angiopoietin 1, der stabiliserer årerne ved at gøre dem mindre følsomme overfor VEGF 56. Desuden indgår andre pro-angiogene faktorer (f.eks. PDGF og EGF) 57. En anden gruppe er anti-angiogene faktorer. Et eksempel er angiostatin, der hæmmer endotelcellers proliferation. Herunder hæmmes også matrix modelleringen, der er nødvendig for at blodåren kan bevæge sig gennem vævet. Det skal bemærkes at gruppen af anti-angiogene faktorer består af op mod 30 faktorer 53, heriblandt p53 55. Udover disse faktorer er der også en betydelig celle-celle interaktion, da blodårene skal bane sig vej mellem andre celler. Matrixmetalloprotease er vigtig i nedbrydningen af ECM 58. Integriner, der præsenteres i næste afsnit, er ligeledes centrale 59. Initieringen af angiogenese er ikke en glidende overgang, men beskrives som et angiogent switch 55. Dette betyder at når der ikke er nok pro-angiogene faktorer dannes ingen nye blodårer, hvorimod angiogenesen gennemføres fuldt, hvis der er faktorer nok. Som det vil fremgå af næste afsnit spiller angiogenese også en central rolle ved metastasering, da nærheden af blodårer medfører større risiko for at cancerceller kommer ud i blodbanen. I denne ****** Vascular endothelial growth factor. Platelet-derived growth factor. 22
proces spiller lymfekarrene også en central rolle, og det har vist sig at faktorer, der fremmer angiogenese (specielt VEGF-C og D og receptoren VEGFR-3) også fremmer dannelsen af nye lymfekar (lymphangiogenesis) 60. 6. egenskab: Vævsinvasion og metastasering Metastasering er spredning af den primære tumor til andre steder i kroppen 58. Langt hovedparten af cancerforløb med fatal udgang skyldes metastaser og ikke den primære tumor. Dette har sat fokus på at opdage cancer i et så tidligt stadium som muligt 61. Det har længe været kendt at tumorer med oprindelse i forskellige væv har en tilbøjelighed til at metastasere til specifikke organer. Mekanismen bag denne vævsspecificitet er forsøgt forklaret med Seed and soil-hypotesen, der udsiger at metastaser ikke er en tilfældig proces, men derimod at cancercellerne (sæden) har en specifik affinitet for visse organer (jorden). 62 Figur 4.5. Den metastatiske kaskade. Metastaser opstår gennem en række begivenheder, der kaldes den metastatiske kaskade 61. Se figur 4.5. Kaskaden foregår ved en frigørelse af celler fra den primære tumor med lokal invasion i det omgivende væv, indgang af celler i lymfe- eller blodbanen (intravasation), transport og overlevelse i cirkulationen, ophold ved fjerntliggende organer, udgang fra lymfe- eller blodbanen (ekstravasation) og endelig cellevækst til dannelse af en sekundær tumor i det nye organ (metastatisk kolonisering) 58. Ved 23
koloniseringen er det nødvendigt for tumoren igen at overvinde de barrierer, der allerede er beskrevet ovenfor (f.eks. at tiltrække blodårer 10 ). Forbedrede teknikker har vist at den metastatiske kaskade ofte opstår tidligt i onkogenesen, men har også vist at dele af kaskaden er ineffektiv. Specielt overlevelse i cirkulationen, ophold ved andre organer og ekstravasation sker ofte hurtigt og effektivt, mens kolonisering derimod er langsom, ineffektiv og med store celletab 61. Dette indikerer at der er betydelige hæmmere i dele af kaskaden, hvilket har affødt forskning i såkaldte metastase suppressorgener, der hæmmer metastaser uden at påvirke den primære tumor. I normale celler bindes den enkelte celle til nabocellerne og forbliver på den måde fastlåst på det korrekte sted. Dette sker ved hjælp af membranbundne proteiner, der bindes til naboceller og til ECM 14. Der findes bl.a. cadherin-familien, der skaber binding mellem naboceller, og integrinerne, der binder cellen til ECM 10. Den mest udbredte mutation i celle-til-celle proteiner i cancer involverer E- cadherin, der er udbredt i størstedelen af karcinomer 63. Det er desuden vist at E-cadherin indgår som effektiv stopklods for progressionen fra adenomer til karcinomer 64. Integriner indgår i bindingen mellem cellen og ECM, og der sker ofte ændringer i disse, således at invasion muliggøres. Der findes flere integriner, der binder cellen til forskellige ECM-typer. Dette medfører at en cancercelle, der ikke bindes til det korrekte sted kan have evnen til at binde sig til ECM andetsteds. Dette fremmer adhæsion et forkert sted. Proteaser fremmer nedbrydningen af ECM og basalmembranen og derved fremmes invasion fra den primære tumor 58. Men gruppen indvirker også i nedbrydningen af vægge i lymfe- og blodkar, samt ved ekstravasationen og koloniseringen. Medlemmer af denne gruppe indvirker også ved angiogenese og vækstsignalering 10. En yderligere kompleksitet til interaktionen mellem cancercellen og omgivelserne er de mange forskellige celletyper omgivelserne består af. I flere karcinomer produceres proteaserne ikke af epitel-vævet selv, men udskilles derimod af stroma og inflammatoriske celler 10 og det er vist at mange cancere bliver suppleret i onkogenesen af 24
inflammatoriske celler, der fremmer celledeling, overlevelse og invasion 65. De seks egenskaber er nu blevet præsenteret. Alle seks er brud på den normale homeostatiske kontrol, der medfører at cancerceller kan undgå kontrol af celledeling, celledød, aldring og selv skaffe ilt og energi samt metastasere 3. 25
5. En samlet model? I dette afsnit vil egenskaberne blive forsøgt samlet i en model for overgangen fra normal til malign celle. Cancer anses som en sygdom, der udvikler sig progressivt via en serie af præmaligne tilstande 13. Udviklingen begrebsliggøres f.eks. ved hjælp af begreberne initiering, promovering og progression 8. Initiering er fasen, hvor carcinogene stoffer interagerer med DNA, hvorved der skabes irreversible mutationer i cellens DNA. Initierede celler udvikler sig ikke til cancer uden passende omgivelser, hvilket sker under promoveringen. Hvis disse signaler forsvinder vil onkogenesen stoppe. Progression er karakteriseret ved vækst og deling af en kræftcelle til en egentlig klinisk tumor. Denne model for onkogenese udsiger, at hovedparten af tumorer udspringer fra én enkelt celle. Denne antagelse kaldes klonal evolution 66. Se figur 5.1. Figur 5.1. Klonal evolution. Den ene celle deler sig flere gange, hvorunder den muterer ved delinger. I denne udvikling overlever nogle af de muterede celler, mens andre uddør. Denne udvikling beskrives som en darvinistisk overlevelseskamp, hvor kun den stærkeste celle kan overkomme alle barrierer og blive en levedygtig cancercelle (den røde celle i figur 5.1) 67;68. Fearon og Vogelstein har opstillet en model for en specifik genetisk pathway for colorectal cancer (også kaldt adenoma-karcinoma - sekvensen eller Vogelstein-modellen) 68;69. I denne model opstilles overgangen fra normalt epitelvæv til et invasivt metasterende karcinom ved flere mellemliggende stadier 70. Se figur 5.2. 26
Figur 5.2. Vogelstein-modellen (kilde Kinzler 69 ). I overgangen mellem stadierne indvirker mutationer i protoonkogener og TSG, hvoraf nogle er specifikke for colorectal cancer (f.eks. APC og DCC) og andre er generelle (f.eks. k-ras og p53). Modellens grundliggende struktur er siden hen blevet suppleret med andre pathways 68;71;72, der dog ikke angriber strukturen med en trinvis udvikling af tumoren. Når tumorer opstår fra en enkelt celle (klonal evolution) ved multiple mutationer, betyder det også at tumorvæv består af forskelligartede celler. Antallet af mutationer varierer fra celle til celle i den samme tumor. Dette betegnes cellulær heterogenitet og er en medvirkende årsag til at terapeutika sjældent har effekt på alle tumorceller. Selvom modellen ovenfor fremstiller onkogenesen som en fast rækkefølge af mutationer, hvor visse mutationer sker tidligt (f.eks. inaktivering af TSG og aktivering af cykliner), mens andre sker senere (f.eks. aktivering af onkogener), er rækkefølgen i princippet ikke afgørende. Det er derimod akkumuleringen af mutationer, der er det afgørende for hvilket trin tumoren befinder sig i 26;70. En yderligere komplikation ved modellen er at man ikke har fundet en mutation, der går igen i alle cancere, eller blot går igen i samme cancertype! Denne store heterogenitet mellem cancere medfører også at det ikke er rimeligt at tale om en cancertypes egenskaber. Der kan være stor forskel mellem to coloncancere. Da man således ved at cancerceller skal have et vist antal mutationer har det været diskuteret om tumorer skal være genetisk instabile 67;73;74. Der er enighed om, at de fleste cancere er genetisk Adenopolyposis coli. 27
instabile, men at instabiliteten findes i to former. Langt de fleste tumorer er instabile på kromosom-niveau, hvilket vil sige at større dele af DNA tilføjes eller slettes, mens en mindre andel af tumorer er instabil på nukleotid-niveau (en del af DNA) 73. Denne skelnen vil ikke blive yderligere udfoldet (jeg henviser til Lengauer 73 ). Diskussionen er interessant, fordi argumentet har været at en potentiel cancercelle først skulle opnå instabilitet før de andre mutationer ville ske. 28
6. Et case-studium - mammacancer I dette afsnit vil begreber fra de foregående afsnit blive benyttet på en konkret cancerform. Afsnittet vil gennemgå de molekylærbiologiske egenskaber, der til sidst samles i en model for udvikling af brystcancer. Men først vil anatomien og nomenklaturen kort blive præsenteret. Brystet er afgrænset cranialt af det andet ribben, medialt af sternum og caudalt af det sjette ribben 75. Anatomisk består brystet hovedsageligt af fedt- og fibrøst bindevæv og deles i 15-20 lobi. Hver lobus er opdelt i lobuli, der hver indeholder mælkeproducerende kirtler (se figur 6.1). Mælken føres af udførselsgange og samles i et hulrum bag brystvorten. Brystet indeholder også et ekstensivt dræningssystem af mange lymfekar. Figur 6.1. Brystets anatomi (kilde www.cancer.dk). Langt hovedparten af brystcancere opstår i epitelvæv i kirtlerne eller i udførselsgangene 76. Blandt disse karcinomer opdeles de i ikkeinvasive og invasive. De ikke-invasive deles i duktalt karcinoma in situ (DCIS også kaldet intraduktalt karcinoma) og lobulært karcinoma in situ (LCIS). Begge er karakteriseret ved ikke at have invaderet det omkringliggende stroma. De invasive opdeles i flere typer, hvoraf de to hyppigste er det invasive duktale karcinom (70-80% af alle invasive brystcancere) og det invasive lobulære 29
karcinom (10-15%). Begge er karakteriseret ved at have gennembrudt basalmembranen. 77 5-10% af brystcancere menes at være arveligt betinget 78. Mutationer i to brystcancer følsomme gener, BRCA1 og BRCA2, medfører en stærkt forøget risiko for udvikling af brystcancer i en tidlig alder 78. Det er således estimeret at kvinder med mutation i en af disse to gener har en 60-80% livsrisiko for at udvikle brystcancer 79. 1. egenskab Brystcancer er en hormon-sensitiv cancer, hvilket betyder at østrogen og progesteron eksponering er tumorfremmende. Her skal kun østrogen præsenteres, der til en vis grad er medieret af østrogenreceptorerne (ER), α og β. Man skelner mellem ER-positive (ER+) og negative (ER-) tumorer, hvilket både har prognostiske og terapeutiske konsekvenser. 70-80% af brystcancere menes at være østrogenfølsomme. 79 Flere onkogener er fundet associeret med brystcancer. ras er sjældent aktivt i normalt væv, benigne tumorer og ved DCIS, hvorimod det ofte er aktivt ved invasive brystcancere. Det er også fundet at der er sammenhæng mellem ras og metastaser til lymfekirtler i armhulen. På denne baggrund mener man at ras først er aktiv i den senere progression af canceren 26. Et aktivt c-myc gen er ligesom ras udtrykt ved invasive cancere og ikke ved DCIS. Dette indikerer at også dette onkogen spiller en rolle ved progression. Forøget niveau af cykliner er også fundet associeret med brystcancer. Omkring halvdelen af brystcancere har således overaktivt cyklin D1 sammenlignet med normalt epitelvæv 22. Samtidig er det fundet at cyklin D1 er aktivt også i præmaligne tilstande (f.eks. DCIS og hyperplasi) 80. Dette mønster gør sig også gældende for cyklin E 81. Dette gør sig specielt gældende for ERnegative celler 26. Det er også vist at cyklin E kan lede til inaktivering af prb og derved cellecyklus progression. Cyklin E er forbundet med dårlig prognose 26. 30
Cyklin D2 derimod fremstår som en regulator, der er inaktiv ved brystcancer. Dette kan betyde at cyklin D2 hæmmer celledeling ved i normale mammaceller 27. Det foreslås at cyklin D2 inaktiveres tidligt i onkogenesen 26. 2. egenskab Et af de bedst undersøgte TSG ved brystcancer er p53. I studier af benigne brysttumorer er det fundet at en betydelig del har muterede p53-gener, hvilket indikerer at denne mutation kan spille en rolle tidligt i onkogenesen. I forhold til andre cancere er der dog færre brystcancere, der har mutation i p53, mens arvelige brystcancere (mutation i BRCA1 og BRCA2) oftere har mutationer 82. Mutation i Rb-genet er også relativt udbredt i brystcancere 76. Studier sandsynliggør at tabet er en tidlig begivenhed i onkogenesen 26. 3. egenskab Regulering af proliferation og apoptose i det normale brystvæv er afgørende for at tilpasse de ændrede stimuli under pubertet, menstruation, graviditet, laktation og menopause. Denne balance kan påvirkes ved mutationer i onkogener, TSG og gener forbundet med apoptose (f.eks. p53 og bcl-2 familien). Umiddelbart ville man forvente at en tumor under udvikling ville have høj proliferation og lav apoptose, men studier viser at duktal hyperplasi og DCIS har forhøjet apoptose, mens graden af apoptose først falder ved invasive duktale karcinomer 83. Det anti-apoptotiske bcl-2 er udtrykt i ca. 80% af brysttumorer og er korreleret med antallet af østrogenreceptorer 83. Mutationer i p53 eller i proteiner forbundet med p53 (f.eks. MDM2) spiller en afgørende rolle i onkogenesen 84. Studier af hvornår en mutation i p53 sker i onkogenesen indikerer at det sker tidligt 84. 31
4. egenskab Telomerase er ofte udtrykt i invasive brystkarcinomer, men aldrig eller sjældent i normalt brystvæv 26. Et studie har vist at også DCIS havde en høj grad af telomerase-aktivitet, hvilket indikerer at telomerase spiller en rolle tidligt i onkogenesen 85. I et andet studie havde 70% af DCIS et aktivt telomerase enzym 86. Disse fund indikerer at aktivt telomerase kan være nødvendigt for udvikling af invasiv brystcancer. Dette understøttes også af at brystcancer udvikler sig over flere årtier og gennem mange generationer af celler. Samtidig viser det også muligheden for at hæmme telomerase som et terapeutisk mål 87. 5. egenskab Brystvævet ændrer sig fysiologisk markant gennem livet, hvilket også påvirker vævets behov for oxygen. Der sker således angiogenese under puberteten, graviditet og laktation. Efter laktation trækker det vaskulære netværk sig sammen igen. Disse mekanismer er styret af f.eks. VEGF, angiopoietin og PDGF, hvoraf VEGF-A fremstår som en meget central regulator af angiogenesen. Det er vist at VEGF-A er reguleret af østrogen 88. De samme mekanismer gør sig gældende for den voksende tumor, når den når en vis størrelse (diameter på ca. 2 mm), hvor de inderste celler i tumorern ikke længere får ilt og næringsstoffer nok. Som bekendt kaldes denne proces angiogenic switch 55. Det er generelt accepteret at de normale blodårer, der ligger omkring den voksende tumor bliver påvirket af tumoren selv til at undergå en hurtig vækst ind i tumoren 88. Stigningen i VEGF findes ved invasive karcinomer, men også ved DCIS. Dette sandsynliggør at tumorer, i stedet for at invadere normalt stromavæv, invaderer det vaskulære stroma og at DCIS derved kan blive invasive 26. 32