HercepTest for Automated Link Platforms

HercepTest for Automated Link Platforms Kode SK001 20. udgave (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.1/39

Indhold Tilsigtet anvendelse...3 Resumé og forklaring Bryst...4 Procedureprincip Bryst...4 Medfølgende materiale Bryst...5 HercepTest kontrolobjektglas...5 Nødvendigt, ikke medfølgende materiale Bryst...6 Forholdsregler Bryst...7 Opbevaring Bryst...7 Klargøring af prøver Bryst...8 Klargøring af prøver Bryst...8 Farvningsprocedure Bryst...9 Kvalitetskontrol Bryst...10 Fortolkning af farvning Bryst...11 Generelle begrænsninger Bryst...14 Produktspecifikke begrænsninger Bryst...14 Præstationskarak- teristika Bryst...14 Fejlfinding Bryst...17 Resumé og forklaring Gastrisk...19 Procedureprincip Gastrisk...19 Medfølgende materialer Gastrisk...20 HercepTest kontrolobjektglas...20 Nødvendige materialer, der ikke medfølger Gastrisk...21 Forholdsregler Gastrisk...21 Opbevaring Gastrisk...22 Klargøring af prøver Gastrisk...22 Klargøring af prøver Gastrisk...23 Farvningsprocedure Gastrisk...23 Kvalitetskontrol Gastrisk...25 Generelle begrænsninger Gastrisk...29 Produktspecifikke begrænsninger Gastrisk...29 Præstationskarak-teristika Gastrisk...30 Fejlfinding Gastrisk...35 Referencer...37 Symbolforklaring...39 Side (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.2/39

Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik HercepTest er en semikvantitativ, immuncytokemisk analyse til påvisning af HER2 protein overekspression i væv fra brystkræft, der behandles rutinemæssigt med henblik på en histologisk vurdering og formalinfikseret, paraffinindstøbt cancervæv fra patienter med gastrisk adenocarcinom, herunder gastroøsofageal overgang. HercepTest er beregnet som en hjælp til at udvælge de patienter, hvor behandling med Herceptin (trastuzumab) kan overvejes (se indlægssedlen for Herceptin ). NOTE alene for brystcancer: Alle patienterne i det kliniske forsøg med Herceptin blev udvalgt ved hjælp af en foreløbig immuncytokemisk klinisk undersøgelsesanalyse (clinical trial assay CTA). af patienterne i de kliniske forsøg blev udvalgt med brug af HercepTest. HercepTest blev sammenlignet med CTA analysen på uafhængige prøver, og det viste sig, at testen gav acceptabelt overensstemmende resultater. Den aktuelle korrelation mellem HercepTest og det kliniske resultat af behandlingen med Herceptin er ikke påvist. NOTE alene for gastrisk cancer: Alle patienterne i fase III-forsøget BO18255 (ToGA) sponsoreret af Hoffmann-La Roche blev udvalgt ved hjælp af Dako HercepTest (IHC) og Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Forsøget påviste den kliniske anvendelighed af begge tests til vurdering af HER2-status hos patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk, gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang. I dette sæt, kode SK001, er reagensernes volumen tilpasset automatiske Dako Link systemer. Gastrisk adenokarcinom, herunder gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom, kaldes også gastrisk cancer i dette dokument. HercepTest og Herceptin er varemærker der tilhører Genentech, Inc., og de er udviklet under licenser fra Dako Denmark A/S og F. Hoffmann La Roche Ltd. Der henvises til side 4 18 for anvendelse til brystcancer. Der henvises til side 19 36 for anvendelse til gastrisk cancer. Vigtigt: Bemærk forskellene på væv fra brystcancer og gastrisk cancer, især i afsnittene Fortolkning af farvning. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.3/39

Brystcancer Resumé og forklaring Bryst Baggrund Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) koder for et protein, der ofte omtales som HER2 protein eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 8). HER2 proteinet er en normal cellekomponent, der dannes i forskellige former for epitelceller.* Hos en del patienter med brystkræft findes en overekspression af HER2 proteinet som et led i den maligne transformationsproces og tumorudvikling (9). Overekspression af HER2 protein på overfladen af brystkræftceller antyder, at der kan anvendes en antistofbehandling. Herceptin (trastuzumab) er et rekombinant humant monoklonalt antistof (10) der med høj affinitet binder sig til HER2 proteinet. Det er påvist, at det hæmmer proliferationen af humane tumorceller med overekspression af HER2 protein in vitro og in vivo (11 13). Egenskaber HercepTest er udviklet som et alternativ til den foreløbige analyse, der er anvendt i de kliniske forsøg med Herceptin. HercepTest evne til at påvise HER2 proteinets overekspression blev bestemt i en uafhængig undersøgelse ved at sammenligne resultaterne af HercepTest med CTA analysen for 548 brystkræftpræparater, hvoraf ingen var fra patienter, der deltog i de kliniske forsøg med Herceptin. Resultaterne viste 79% konkordans mellem resultaterne af de to analyser af de pågældende vævspræparater. Konkordansdata viste også, at det er sandsynligt, at 3+ aflæsningen med HercepTest svarer til en positiv aflæsning med CTA analysen, der skulle opfylde adgangskriteriet for forsøget (2+ eller 3+). Fundet af 2+ med HercepTest stemte ikke så godt overens med resultaterne af CTA analysen. Ca. 42% (53/126) af HercepTest 2+ resultaterne var negative i CTA analysen (0-1+), og ville ikke have haft adgang til deltagelse i de kliniske forsøg med Herceptin. HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ farveintensitet), svagt positiv (2+ farveintensitet) og stærkt positiv (3+ farveintensitet). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. Procedureprincip Bryst HercepTest indeholder de reagenser, der er nødvendige for at udføre en to trins immuncytokemisk farvning af rutinebehandlede, paraffinindstøbte præparater. Efter inkubation med det primære monoklonale kaninantistof mod humant HER2 protein, anvender dette sæt et brugsklart Visualization Reagent baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære gede anti kanin immunglobulinmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbase, hvorfor der ikke er behov for sekventiel påføring af link antistof og peroxidase konjugat antistof. Visualization Reagent krydsreaktion med humane immunglobuliner og føtalt kalveserum er fjernet ved hjælp af fastfaseabsorption. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Til vurdering af farvningerne leveres der kontrolobjektglas med tre formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farveintensiteter på 0, 1+ og 3+. Farveintensiteten af disse cellelinjer svarer til antallet af receptorer pr. celle. HercepTest for Automated Link Platforms, kode SK001, kan anvendes til automatisk farvning med automatiske Dako Link systemer. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.4/39

Brystcancer Medfølgende materiale Bryst Kode SK001 De anførte materialer rækker til 50 analyser (50 objektglas inkuberet med primært antistof mod HER2 protein og 50 objektglas inkuberet med den tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 200 µl pr. vævssnit (22 mm x 22 mm) for hvert reagens bortset fra opløsningen til Epitope Retrieval Solution. Sættet indeholder materialer til maks. 10 individuelle farvninger. Mængde Beskrivelse 1 x 22 ml HercepTest peroxidaseblokerende reagens 3% hydrogenperoxid, der indeholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3). 1 x 12 ml HercepTest kanin antihumant HER2 protein Affinitetsisoleret antistof klar til brug. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C terminal fragment (intracytoplasmatisk del) af HER2 proteinet koblet til hæmocyanin fra albueskæl. Specificitet: HER2 protein. Rensningsmetode: Antistoffet er affinitetsisoleret ved hjælp af et immobiliseret HER2 proteinpeptid. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranpolymer konjugeret med peberrodsperoxidase og affinitetsisoleret gede antikanin immunglobuliner. Leveres i Tris/HCl buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. 1 x 10 ml HercepTest negativ kontrolreagens Immunglobulin fraktion af normalt kaninserum ved en ækvivalent proteinkoncentration som antistoffet til HER2 protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. 2 x 22 ml HercepTest DAB substratbuffer Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende < 0,1% hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. 1 x 1 ml HercepTest DAB kromogen 5% 3,3' diaminobenzidintetrahydrochlorid kromogenopløsning. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citratbuffer med et vaskemiddel. 2 x 5 objektglas HercepTest kontrolobjektglas Hvert objektglas indeholder snit fra tre formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer fra brystkarcinomer, med forskellige niveauer af HER2 protein ekspressioner: MDA 231 (0), MDA 175 (1+) og SK BR 3 (3+). Kontrolobjektglassene er varmebehandlede, så snittene sidder bedre fast på objektglassene. Yderligere opvarmning af kontrolobjektglassene med henblik på at forbedre snittenes fastklæbning kan kompromittere resultatet af farvningen. 10 x flasker User Fillable Reagent Bottle, 12 ml Capacity Hver flaske kan indeholde op til 12 ml reagens. Flaskerne skal bruges til at blande og opbevare substratkromogenopløsning (se også afsnittet Forberedelse af reagenser). Leveres i separat pose. BEMÆRK: Alle reagenser er formuleret specifikt til anvendelse sammen med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke udskiftes med andre. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.5/39

Brystcancer Nødvendigt, ikke medfølgende materiale Bryst Dako Wash Buffer, kode S3006 Kontrastfarve: Hæmatoxylin, såsom Hematoxylin for Automated Link Platforms (kode SK308) Dækglas Destilleret eller deioniseret vand Tørreovn der kan holde en temperatur på 60 C eller mindre Ethanol, absolut og 95% Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium såsom Dako Faramount (kode S3025) eller Dako Glycergel (kode C0563) Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, SuperFrost Plus, poly L lysin belagte eller Dako Silanized Slides (kode S3003) Xylen, toluen eller xylen erstatninger SK001 er beregnet til anvendelse med automatiske Dako Link systemer. Der henvises til brugsanvisningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.6/39

Brystcancer Forholdsregler Bryst 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemisk stof der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (21). 4. Herceptest peroxidaseblokerende middel, indeholder 3% brintoverilte. Sikkerhedsdatablade kan rekvireres af uddannet personale. 5. HercepTest kanin antihumant HER2 Protein, HercepTest visualiseringsreagens og HercepTest negative kontrolreagenser indeholder materialer af animalsk oprindelse. 6. Som ved alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 7. Alle kontrolglas og alle præparater både før og efter fiksering samt alt materiale, der har været i forbindelse med dem, skal håndteres som om de kunne overføre smitte, og de skal bortskaffes under overholdelse af passende forholdsregler (22). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 8. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser, da der i modsat fald kan forekomme en øget uspecifik farvning. 9. Andre inkubationstider, temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. Overdreven tørring ved 60 C i mere end én time kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). 10. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvningen. 11. Alle reagenser er formuleret specifikt til anvendelse sammen med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andre. 12. HercepTest visualiseringsreagens og HercepTest DAB kromogen kan blive negativt påvirket, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 13. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 14. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokale, nationale og EU bestemmelser. 15. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. 16. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan resultere i tab af synlig HER2- immunreaktivitet. Vævssnit, der er større end 22 mm x 22 mm kræver, at der påføres 2-3 x 200 µl reagens på 2-3 automatiske påføringsområder. 17. HercepTest DAB Chromogen indeholder 1 5% 3,3 diaminobenzidintetrahydrochlorid (biphenyl 3,3,4,4 tetrayltetraammonium tetrachlorid) og er mærket: Fare H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P280 Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P504 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 18. Paraffinrester kan føre til falsk negative resultater. Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger (efter EU s direktiv 94/33/EF). Se venligst sikkerhedsdatabladet (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. USA: 3,3 diaminobenzidin (DAB) kan være skadeligt ved indånding, ved kontakt med huden og ved indtagelse. Materialet irriterer øjne og hud. Hvis materialet kommer i kontakt med huden, renses det berørte område med vand og sæbe. BEMÆRK: Selvom diaminobenzidin strukturelt ligner benzidin, findes der ingen beviser for, at diaminobenzidin er karcinogent. Konsulter lokale og nationale bestemmelser for bortskaffelse. Opbevaring Bryst Opbevares ved 2 8 C, når det ikke er i brug på Dak o automatiske Link platforme. HercepTest Peroxidase Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer og HercepTest DAB Chromogen skal opbevares mørkt ved 2 8 C. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt uden på pakningen. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end de, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først evalueres af brugeren (14a, 14b). Bemærk, at kontrolobjektglassene også skal opbevares ved 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Der bør derfor udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HercepTest. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.7/39

Brystcancer Klargøring af prøver Bryst Biopsipræparater skal behandles, så vævet bevares til immuncytokemisk farvning. Der skal anvendes standardmetoder for vævsbehandling til alle præparaterne (15). Paraffinindstøbte snit Væv, der er opbevaret i neutralt bufferet formalin eller Bouins væske til rutinemæssig behandling og paraffinindstøbning, er egnet til denne analyse. Biopsipræparater skal for eksempel skæres i blokke af 3 4 mm og fikseres i 18 24 timer i neutralt bufferet formalin. Vævene skal derefter dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af imprægnering med smeltet paraffin ved temperaturer ikke over 60 C. Korrekt fi kserede og indstøbte vævsblokke, der udtrykker HER2 protein kan holde uendeligt inden skæring og montering, hvis de opbevares køligt (15 25 C).(15,16). I USA kræver C linical Laboratory Improvement Act of 1988 (lov for kliniske laboratorieforbedringer af 1988) i 42 CFR 493.1259(b) at Laboratoriet skal opbevare farvede præparatglas i mindst ti år fra undersøgelsesdato og vævsblokke i mindst to år fra undersøgelsesdato (16). Vævsprøverne skal skæres i snit på 4 5 µm, monteres på objektglas og lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller indtil de er tørre) ved 37 C natte n over eller ved 60 C i én time. FORSIGTIG: Overdreven opvarmning i mere end én time ved 60 C kan give anledning til et væsentligt fald i e ller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter de er skåret, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (18). Objektglas, der er påkrævet til HE R2 proteinevaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Det tilrådes, at anvende mindst 5 objektglas: 1 objektglas til verificering af tilstedeværelse af tumorer, 2 objektglas til evaluering af HER2 protein (1 objektglas til inkubation med kanin antihuman HER2 protein og 1 objektglas til negativt kontrolreagens) og 2 objektglas som reserve. For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter skæringen, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (1 8). Anvendelse af HercepTest på afkalkede væv er ikke godkendt og frarådes. Se Dako s Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) samt reference 15 og 16 for yderligere oplysninger om klargøring af præparater. Behandling af vævsprøver før farvning Der skal anvendes en specifik epitope retrieval i 0,01 mol/l citratbuffer for at opnå de bedste resultater. Opløsningen til epitope retrieval leveres med HercepTest sættet. Denne metode indebærer en opvarmning af vævspræparaterne, der er monteret på objektglas og nedsænket i en 0,01 mol/l citratbuffer (20) i et kalibreret vandbad eller Dako PT Link ved den krævede temperatur (95 99 C). Laboratorier, der er plac eret i højderne, bør finde den bedste metode til at vedligeholde den krævede temperatur. Andre metoder til epitope retrieval er blevet afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. Afvigelser fra den beskrevne procedure kan påvirke resultaterne. Klargøring af prøver Bryst Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: Epitope Retrieval Solution Fortynd en passende mængde HercepTest Epitope Retrieval Solution i forholdet 1:10 med destilleret eller deioniseret vand til den planlagte farvningsprocedure. Ubrugte, fortyndede opløsninger kan anvendes i en uge, hvis de opbevares ved stuetemperatur, og i en måned, hvis de opbevares ved 2 8 C. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde Dako Wash Buffer (kode S3006) i forholdet 1:10 med destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt, fortyndet buffer kan anvendes i en uge, hvis den opbevares ved stuetemperatur, og i en måned, hvis den opbevares ved 2 8 C. Kassér buf feren, hvis den er uklar. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. Substratkromogenopløsning (DAB) Klargør substratkromogenopløsningen i de brugerfyldbare flasker ved at tilsætte 25 µl DAB Chromogen per 1 ml DAB Substrate Buffer, og bland. Klargjort substratkromogenopløsning (DAB) er stabil i ca. 5 dage, når det opbevares ved 2 8 C. Opløsningen skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. De brugerfyldbare flasker med substratkromogenopløsningen skal defineres i det automatiske Dako Link system inden brug. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. BEMÆRK: Farven af DAB Chromogen kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til vejledningen på denne indlægsseddel. Hvis der tilsættes for meget DAB Chromogen til DAB bufferet substrat, vil det medføre en forringelse af det positive signal. Kontrastfarvning Det farvede slutprodukt fra DAB farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Hematoxylin til automatiske Link systemer (kode SK308) kan anvendes som kontrastfarve. De påkrævede trin og reagensinkubationstider er forprogrammeret i Dako Link softwaren. Det er ikke nødvendigt at forberede reagenserne. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.8/39

Brystcancer Monteringsmedie Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedium. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Monteringsmedier såsom Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready to Use (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) anbefales til vandbaseret montering. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. Farvningsprocedure Bryst Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se afsnittet Forholdsregler). Vævssnittene må ikke tørre ud på noget tidspunkt under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non specifik farvning. Alle de nødvendige trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Dako Link softwaren. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for mere detaljerede anvisninger til programmering og indføring af objektglas og reagenser. Hvis farvningsproceduren af brydes, kan objektglassene opbevares i bufferbadet efter inkubationen med det primære antistof i op til en time ved stuetemperatur (20 25 C) uden at det påvirker farvningens effek tivitet. Afparaffinering og rehydrering Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Anbring objektglassene i et xylenbad, og inkubér i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i ren ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i destilleret eller deioniseret vand i mindst 30 sekunder. Påbegynd farvningen som beskrevet i afsnittet om farvningsprotokol, under epitop retrieval. Xylen og alkoholopløsninger skal udskiftes efter 40 objektglas. Toluen eller xylenerstatninger, såsom Histoclear, kan anvendes. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige til brug ved udvælgelse af patienter til behandling med Herceptin. Farvningsprotokol Alle de nødvendige trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i softwaren til de automatiske Dako Link systemer. Efter afparaffinering, rehydrering og epitop retrieval vil instrumentet behandle præparatglassene, som beskrevet herunder. Trin 1: Epitope retrieval Fyld Dako PT Module karrene eller farvningskarret, f. eks et Coplin kar, med Epitope Retrieval Solution (se forberedelse af reagenser). For Dako PT Link: Forvarm den fortyndede Epitope Retrieval Solution i Dako PT Link karret til 85 C. V ed opvarmning bliver Epitope Retrieval Solution uklar. Anbring de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i Autostainer stativer, og dyp objektglassene i den forvarmede Epitope Retrieval Solution. Lad Dako PT Link opvarmes til 97 C, og inkubér i 40 ( ±1) minutter ved 97 C. Lad snittene afkøle i Dako P T Link, indtil temperaturen når 85 C. Fjern PT Link karrene med s nittene fra Dako PT Link. Lad karrene stå på bordet uden låg i 10 minutter for yderligere afkøling. Skyl snittene med Wash Buffer. Se brugervejledningen til Dako PT Link for yderligere oplysninger. Coplin skåle: Anbring farvningskarrene, der indeholder fortyndet Epitope Retrieval Solution, i vandbad. Opvarm vandbadet og Epitope Retrieval Solution til 95 99 C. Ved opvarmning bliver Epitope Retrieval S olution uklar. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Dyb de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i den forvarmede Epitope Retrieval Solution i farvningskarrene. Opvarm igen vandbadet og Epitope Retrieval Solution til 95 99 C. Inkubér i 40 (±1) minutter ved 95 99 C. Tag hele karret med objek tglassene op ad vandbadet. Lad objektglassene køle af i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved stuetemperatur. Dekantér Epitope Retrieval Solution og skyl snittene i Wash Buffer. Det bedste resultat opnås, hvis snittene anbringes i Wash buffer i 5 20 minutter efter epitope retrieval og inden farvning. BEMÆRK: Epitope Retrieval Solution er udelukkende beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Trin 2: Farvningsprocedure Efter epitope retrieval anbringes objektglassene i instrumentstativerne på de automatiske Dako Link systemer. Instrumentet vil udføre farvningsproceduren ved at påføre det korrekte reagens, overvåge inkubationstiden og skylle objektglassene mellem de forskellige reagenser. Reagensinkubationstider er forprogrammeret i Dako Link softwaren. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.9/39

Brystcancer Trin 3: Kontrastfarvning Objektglassene kan kontrastfarves med Hematoxylin til automatiske Dako Link systemer (kode SK308). Dako softwaren giver mulighed for to farvningsprotokoller. Den ene omfatter kontrastfarvning med hæmatoxylin, hvilket den anden ikke gør. Inkubationstiden i hæmatoxylin er forprogrammeret i den protokol, der omfatter kontrastfarvning. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger om programmeringsprotokoller. Trin 4: Montering Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Snittene kan monteres, og der kan sættes dækglas på med et vandbaseret monteringsmedie som Dako Faramount (kode S3025) eller Dako Glycergel (kode C0563). BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene forsynes med dækglas med et vandbaseret monteringsmedium og udsættes for kraftigt lys i over en uge. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). Kvalitetskontrol Bryst Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA henvises til retningslinjerne for kvalitetskontrol i College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23) og punkt 24 i litteraturlisten for yderligere oplysninger. Tabel 1: Formålet med daglig kvalitetskontrol Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv, da dette er mest følsomt for antistof eller antigennedbrydning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Specifikt antistof & detektionssystem Kontrollerer alle trin i analysen. Evaluerer reagenser og procedurer anvendt ved HER2 farvning. Påvisning af utilsigtet antistof krydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. uspecifikt antistof* eller buffer plus samme detektionssystem som anvendt med det specifikke antistof Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Patientvæv Påvisning af specifik farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Kontrolobjektglas leveret af Dako. Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. * Serum fra samme art som det specifikke antistof men ikke rettet mod samme målantigen. Til påvisning af uspecifik antistofbinding, f.eks. vævets binding til Fc delen af antistoffet. Kontrolobjektglas (medfølger) Hvert af de leverede kontrolobjektglas indeholder tre runde, formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farvningsintensiteter på 0, 1+ og 3+. For hver farvningskørsel skal der farves et kontrolobjektglas. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. Positivt kontrolvæv Kontrollerne skal være friske autopsi /biopsi /kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven ( prøverne). Positivt kontrolvæv er tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. For hvert sæt testforhold skal der medtages ét positivt kontrolvæv i hver farvningskørsel. Det positive kontrolvæv skal give en svag positiv farvning, så der kan påvises små forandringer i det primære antistofs følsomhed. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette sæt, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven ( prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og kontrollerer ikke vævspræpareringen. Som ideelt positivt kontrolvæv anvendes invasivt (infiltrerende) humant brystcarcinomvæv, der tidligere er bestemt for 2+ overekspression af HER2 protein. BEMÆRK: Kendt positivt kontrolvæv må kun anvendes til kontrol af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis det positive kontrolvæv ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.10/39

Brystcancer Negativt kontrolvæv Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for HER2 protein), der er fikseret, behandlet og indstøbt på en måde, som svarer til patientprøven ( prøverne), i hver farvningskørsel for at kontrollere specificiteten af det primære antistof og få en angivelse af den specifikke baggrundsfarvning. Colon, lever og thyroidea er velegnet som negativt kontrolvæv. De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Normale ducti lactiferi kan bruges som interne negative kontroller. Hvis der forekommer specifik farvning i de negative kontroller eller i de interne negative kontrolområder, skal resultatet af patientpræparaterne erklæres ugyldigt, og analysen skal køres igen. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger om programmering af kontrolobjektglas. Uspecifik negativ kontrolreagens Brug den medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Kontrol af analysen Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række interne væv med kendte IHC effektivitetskarakteristika, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne vedr. kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene til kvalitetskontrol i CAP Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Brystcarcinomer med en kendt HER2 protein farvningsintensitet mellem 0 og 3+ og negativt væv, som for eksempel fra colon, lever og thyroidea, er egnede ved kontrol af analysen. Fortolkning af farvning Bryst Til en bestemmelse af HER2 protein overekspression skal kun membranens farvningsintensitet og mønster sammenlignes med den skala, der ses i tabel 2. Præparaterne skal vurderes med lysmikroskop af en patalog. Et objektiv med en forstørrelse på 10x er velegnet til evaluering af den immuncytokemiske farvning og scoring. Brugen af en 20 40x forstørrelse er nyttig til at bekræfte farvningsgraden. Cytoplasmatisk farvning skal altid betragtes som non specifik farvning og skal ikke inkluderes i bestemmelsen af membranens farvningsintensitet (8). Som en hjælp til at differentiere mellem 0, 1+, 2+ og 3+ farvning henvises der til Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Vejledning til fortolkning af HercepTest Brystcancer), hvor der findes billeder af farvningsintensiteterne. Kun præparater fra patienter med invasivt brystkarcinom bør bedømmes. I tilfælde hvor der findes carcinoma in situ og invasivt carcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Tabel 2: Kriterier for cellemembraners farvningsintensitet. Farvningsgrad Rapporteres til den behandlende læge Vurdering af HER2 protein overekspression (Rapporteres til den behandlende læge) Farvningsmønster Der ses ingen farvning eller membranfarvning ses i mindre end 10% 0 Negative af tumorcellerne. Der ses svag/næsten ingen membranfarvning i mere end 10% af tumorcellerne. Cellerne er kun farvet i 1+ Negative dele af membranen. Svag til moderat farvning af hele membranen ses i mere end 10% af 2+ Svagt positiv tumorcellerne. Stærk farvning af hele membranen ses i mere end 10% af tumorcellerne 3+ Stærkt positiv HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ farveintensitet), svagt positiv (2+ farveintensitet) og stærkt positiv (3+ farveintensitet). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en semikvantitativ vurdering af præparaternes farvningsintensitet for hver farvningskørsel, skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 3. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.11/39

Brystcancer Tabel 3: Rækkefølge for vurdering af objektglassene Objektglassenes aflæsningsrækkefølge 1. Kontrolobjektglas med tre cellelinjer Begrundelse Tilstedeværelsen af 3+ brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. 2. Objektglas med positivt kontrolvæv. 3. Objektglas med negativt kontrolvæv. 4. Objektglas med patientvæv der er farvet med negativ kontrolreagens. 5. Objektglas med patientpræparat der er farvet ved hjælp af det primære antistof. Stiplet eller afbrudt membranfarvning ses i et lille til moderat antal celler i den svagt positive 1+ kontrolcellelinje MDA 175. I denne cellelinje kan der også ses prikket immunfarvning af cytoplasmaets Golgiapparat. Tilstedeværelsen af brun farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 (negativ for HER2 proteinfarvning) angiver at der er non specifik farvning i analysen. Analyseresultaterne kan være ugyldige på grund af overfarvning. Der skal ses brunfarvning af membranen. Farvning af cytoplasma og negativt væv må ikke være mere end for 1+. MANGEL på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis objektglasset med det negative kontrolvæv udviser specifik membranfarvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Manglende specifik membranfarvning bekræfter det primære antistofs specifikke binding til målantigenet. Hvis der ses en anden nuance eller en brunfarvning af cytoplasmaet i præparatet, der er behandlet med negativt kontrolreagens, for eksempel i bindevæv, leukocytter, erytrocytter eller i nekrotisk væv skal dette betragtes som uspecifik baggrundsfarvning og skal rapporteres under bemærkninger på dataregnearket. Hvis der ses HER2 protein overekspression i præparatet, vil dette ses som en brun rand, der er lokaliseret til cellemembranen på tumorceller, som er behandlet med det primære antistof. 1. Kontrolobjektglas (medfølger): Det positive kontrolobjektglas med Hercep Test skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Tilstedeværelsen af brunt (3,3 diaminobenzidine, DAB) reaktionsprodukt svarende til cellemembranerne angiver, at der er positiv reaktivitet. Tilstedeværelsen af en perifer, brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. Hvis nogle af kontrolcellelinjerne falder udenfor disse kriterier skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. 2. Positivt kontrolvæv Det positive kontrolvæv skal undersøges derefter. Dette objektglas bekræfter at fikserings og epitope retrieval processen er effektiv. Brug intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves non specifikt (25). Der skal ses brunfarvning af cellemembranen. Brunfarvning af cytoplasma og negativt væv inde i præparatet m ikke være mere end svarende til farveintensitetsgrad 1+. 3. Negativt kontrolvæv: Objektglasset med det negative kontrolvæv skal undersøges efter det positive kontrolvæv for at kontrollere specificiteten af det primære antistofs mærkning af målantigenet. Mangel på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Bemærk, at en svag reaktion (0-1+ farvningsintensitet) kan ses i de fleste former for normalt epitelvæv. Muligt negativt kontrolvæv inkluderer: Colon, lever og thyroidea. En eventuel non specifik farvning vil have et diffust udseende. Sporadisk farvning af bindevæv kan også ses i snit fra for kraftigt formalinfikseret væv. 4 + 5. Patientvæv: Undersøg patientpræparater der er farvet med HercepTest til sidst. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel non specifik baggrundsfarvning med den negative kontrolreagens. Som det er tilfældet med enhver immuncytokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Præstationskarakteristika for specifikke oplysninger om HercepTest immunreaktivitet. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.12/39

Brystcancer Yderligere forslag til fortolkning af farvning med HercepTest De fleste metastatiske brystkarcinomer der testes for HER2 protein overekspression bedømmes til at være grad 0 eller 3+. Mens de fleste af disse tilfælde er lige til, er en lille procentdel af de resterende 1+ og 2+ præparater vanskeligere at fortolke. Følg nedenstående retningslinjer for fortolkning af farvning med HercepTest i laboratoriet. 1. Evaluer kontrolcellelinjerne for at kontrollere analysens effektivitet. 2. Evaluer de positive og negative kontrolobjektglas. 3. Det anbefales at farve vævsprøverne med en hæmatoxylin eosin (H&E) farvning til første evaluering. (tumoren ses måske ikke tydeligt i præparater, der er farvet med HercepTest. Patologen har behov for et H&E farvet præparat for at kunne bekræfte tilstedeværelsen af tumorvæv). HercepTest skal udføres på et parret snit (skåret efter hinanden) fra samme paraffinblok af vævsprøven. 4. Evaluer først snittene, der er farvet for HER2 protein overekspression, med en lille forstørrelse. De fleste positive tilfælde vil være tydelige med en lille forstørrelse. 5. Der skal anvendes velbevarede og korrekt farvede områder af præparaterne til bestemmelse af procentdelen af positive tumorceller. 6. Generelt vil præparaternes farvningsgrad være tydelig ved en lille forstørrelse. Hvis det er svært at bedømme grænsetilfælde mellem 1+ og 2+ vil farvningsgraden normalt være 1+. 7. Til kontrol af membranfarvningen anvendes en 20 40x forstørrelse. 8. Hvis de fleste tumorceller viser en fuldstændig membran farvning, er farvningsgraden enten 2+ eller 3+. Brug en forstørrelse på 20 40x for at bekræfte farvningsgraden. 9. I de fleste tilfælde af 3+ vil mindst 80% af tumorcellerne være farvede, og membranfarvningen vil være kraftig. 10. Hvis præparatet er tæt på grænsen for 10% positive tumorceller, anbefales det at tælle mindst 100 tumorceller for at bestemme procentdelen af farvede celler. 11. Hvis der er fuldstændig membranfarvning med svag til moderat intensitet i mere end 10% af tumorcellerne, er præparatets farvningsgrad 2+. Denne tilstand ledsages normalt af en ufuldstændig membranfarvning i de fleste af de resterende tumorceller. 12. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne har fuldstændig, perifer membranfarvning er graden 1+ selvom andre tumorceller viser en ufuldstændig membranfarvning. 13. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne har en fuldstændig eller ufuldstændig perifer membranfarvning er graden 0. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.13/39

Brystcancer Generelle begrænsninger Bryst Produktspecifikke begrænsninger Bryst Præstationskarakteristika Bryst 1. Immuncytokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immuncytokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof trapping eller falsk negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5. Vævsprøver fra personer, som er inficeret med hepatitis B virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non specifik farvning med peberrodsperoxidase (26). 6. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv (27). Kontakt Dakos tekniske serviceafdeling med dokumenterede uventede reaktioner. 7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (27). 8. Farvningen udføres ved en forprogrammeret temperatur på (20 25 C). 1. Antigenet i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 nedbrydes med tiden. Bedøm resultatet for kontrolobjektglasset i henhold til dets udløbsdato. Negativ farvning af MDA 175 celler er muligvis kun et tegn på, at kontrolobjektglasset er for gammelt. Kontrolobjektglas skal opbevares ved 2 8 C. 2. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden 4 6 uger efter monteringen af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (28). 3. Udskift ikke sættets reagenser med reagenser med andre partinumre eller med reagenser fra andre producenter. 4. Der kan forekomme falsk positive resultater ved evaluering af den cytoplasmatiske farvning. Når resultaterne fortolkes, skal kun cellemembranens farvningsintensitet tages i betragtning. 5. Farvede kontrolobjektglas skal kun anvendes til kontrol af farvningskørslen og bør ikke anvendes til at bedømme farvningsreaktionen i vævssnittene. 6. Der kan undertiden ses stærkt fokaliseret farvning (3+) som for eksempel varme områder. Dette kan skyldes en ujævn fiksering og/eller behandling af vævet. Det anbefales at immunfarve en anden vævsblok fra samme vævsprøve. 7. Brugen af HercepTest på præparater, der er fikseret i andre fikseringsvæsker end neutral bufferet formalin eller Bouins væske, er ikke godkendt. 8. Normalt epitel i brystvæv bør farves mellem 0 og 1+. Hvis der ses en farvningsgrad højere end 1+ i det normale epitelvæv, skal analysen gentages. Bemærk at normalt epitelvæv fra tonsiller og øsofagus kan farves med en intensitet op til grad 2+. Baggrund Den foreløbige kliniske undersøgelsesanalyse (clinical trial assay CTA), der blev anvendt til at udvælge patienter til kliniske forsøg med Herceptin, var kun til forskningsbrug og er ikke længere tilgængelig. HercepTest blev udviklet som et sammenligneligt alternativ til CTA analysen. Sikkerheden og effektiviteten af Herceptin blev bedømt i et randomiseret, kontrolleret, klinisk forsøg og i et stort åbent forsøg (se indlægssedlen for Herceptin ). Alle patienter, der blev udvalgt til de kliniske forsøg med Herceptin, viste overekspression af HER2 protein ved immuncytokemisk test udført med CTA analysen på et centrallaboratorium. Patienter blev udvalgt til behandling med Herceptin, hvis deres tumor viste grad 2+ eller 3+ af HER2 protein overekspression (baseret på en skala fra 0 til 3+, hvor 3+ er det højeste niveau). Subgruppeanalyser af resultaterne fra disse forsøg antyder, at patienter, hvis væv er stærkt positivt (3+) for HER2 protein overekspression, har mere gavn af Herceptin end patienter, hvis væv er svagt positivt (2+). Graden af HER2 protein overekspression er potentielt en vigtig indikation for resultatet af behandling med Herceptin. Da ingen af patienterne i forsøgene med Herceptin blev udvalgt ved hjælp af HercepTest, er forholdet mellem graden af positivitet og sandsynligheden for klinisk udbytte af behandling med Herceptin ikke kendt. Sammenlignende forsøg Der blev udført to undersøgelser for at karakterisere HercepTest 1) Sammenligning med CTA analysen. 2) Nøjagtighed når den blev sammenlignet med fem andre analyser. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.14/39

Brystcancer Sammenligning med CTA analysen HercepTest blev sammenlignet med CTA analysen, der var brugt til at udvælge patienter egnet til behandling med Herceptin, med brug af 274 HER2 protein positive (2+ eller 3+) og et tilsvarende antal HER2 protein negative brystkræftpræparater. Tabel 4 viser resultaterne i et 2 x 2 skema, hvor 0 og 1+ betragtes som negative og 2+ og 3+ som positive. Tabel 4: En 2 x 2 overensstemmelse mellem HercepTest og CTA analysen (antal præparater). CTA analyse Positiv Negative I alt HercepTest Positiv 216 59 275 Negative 58 215 273 I alt 274 274 548 Overensstemmelse: 79% (76 82%) 95% konfidensinterval. Den samlede binære konkordans for HercepTest med CTA analysen var 79% (431/548), med et 2 sidet 95% konfidensinterval på 76 82%. I enogtyve procent (21%) af resultaterne var der diskordans mellem de to metoder. På en skala fra 0 3+ fortolkes resultaterne af HercepTest som negative for overekspression af HER2 protein (farvningsintensitet 0 og 1+), svagt positive (farvningsintensitet 2+) og stærkt positive (farvningsintensitet 3+). Tabel 5: En 3 x 3 konkordans mellem HercepTest og CTA analysen. CTA analyse 3+ 2+ 0 1+ I alt HercepTest 3+ 2+ 0 1+ 107 36 6 16 57 53 8 50 215 149 126 273 I alt 131 143 274 548 Denne 3 x 3 visning af konkordansundersøgelsen angiver, at en 3+ aflæsning med HercepTest med stor sandsynlighed svarer til et positivt resultat med CTA analysen og ville have mødt kriterierne for adgang til forsøget med Herceptin (2+ eller 3+). Fundet af 2+ med HercepTest stemte ikke så godt overens med resultaterne af CTA analysen. Ca. 42% (53/126) af HercepTest 2+ resultaterne var negative i CTA analysen (0-1+), og ville ikke have givet adgang til deltagelse i de kliniske forsøg med Herceptin. Nøjagtighed HercepTest blev også afprøvet på 2 objektglas til mikroskopi med paraffinindstøbte vævssnit fra168 brysttumorer. Disse tumorer var tidligere blevet karakteriseret med fem forskellige metoder til bestemmelse af HER2 genamplifikation og overekspression af HER2 protein, her i blandt intern Southern blot, fluorescens in situ hybridisering (FISH) til DNA amplifikation, Northern blot RNA analyse, Western blot og immuncytokemi (ICC) på frosne snit (28). Resultaterne vises i tabel 6. Tabel 6: Sammenligning af HercepTest med de samlede resultater (OE) fra undersøgelser af genamplifikation og HER2 protein overekspression. OE referenceklassificering + I alt HercepTest + 43 0 26 99 43 125 Positiv overensstemmelse: 43/69 =62% Negativ overensstemmelse: 99/99 = 100% I alt 69 99 168 Resultaterne angiver et 85% (142/168) overensstemmelsesniveau (95% konfidensinterval ud af 78 89%) mellem de positive (2+ og 3+) og de negative (0 and 1+) farvningsintensiteter med HercepTest. af de prøver, der blev fundet negative med de 5 forskellige metoder, blev fundet positive med HercepTest, hvorimod de samlede resultater af de 5 forskellige prøver viste et større antal positive tilfælde. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.15/39

Brystcancer Reproducerbarhed Reproducerbarhed inden for kørsler Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 5 præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier i maskeret, randomiseret form. Denne protokol blev anvendt med automatisk farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarhed mellem kørsler Reproducerbarheden mellem kørsler blev afprøvet randomiseret og maskeret på tre laboratorier over 4 dage med 5 præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader ved hjælp af en automatiseret metode. Der fandtes en fremragende reproducerbarhed for positive kontra negative resultater (0 og 1+ kontra 2+ og 3+) bortset fra to prøver i ét laboratorium, der varierede mellem 1+ og 2+. Der var 100% reproducerbarhed for 2+ og 3+ præparaterne. Reproducerbarhed mellem laboratorier Reproducerbarheden mellem laboratorier blev afprøvet på tre geografisk adskilte laboratorier med 40 identiske randomiserede og maskerede præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader. Friskt skårne præparater på objektglas blev sendt til hvert testlaboratorium til automatisk farvning og evaluering foretaget af en patolog. Overensstemmelser mellem laboratorierne lå mellem 83% og 90% for en dikotomisk positiv/negativ bestemmelse, hvor 0 og 1+ var negative og 2+ og 3+ var positive for HER2 protein overekspression. Sammenlignet med resultater fra referencelaboratoriet, der udførte CTA analysen, var der 12,5% (15/120) diskrepans mellem negative (0 eller 1+) og positive (2+ eller 3+) bestemmelser i de sammenlignede resultater. Der fandtes en yderligere diskrepans på 10% (12/120) mellem 2+ og 3+ farvningsgraderne. Immunreaktivitet Tabel 7 giver en oversigt over immunreaktiviteten for HercepTest med et anbefalet udvalg af normalt væv. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med HercepTest i henhold til vejledningen på indlægssedlen. Tabel 7. Sammenfatning af normal vævsreaktivitet for HercepTest. Vævstype (antal analyser) Adrenal (3) Knoglemarv (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesotelceller (3) Ovarie (3) Pancreas (3) Parathyreoid (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spytkirtel (3) Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testis (3) Thymus (3) Thyreoid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Positivt farvet vævsbestanddel og farvningsmønster Mælkekirtel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet) Tubuli i nyremarv (3 af 3 væv, 1-2+ i 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Prostatakirtel/-gange (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Svedkirtler (1 af 3 væv, 1+, 30 % af cellerne, cytoplasmatisk) Søjleepitel, overflade (1 af 3 væv, 2+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Epitel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Pladeepitel (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 80 % af cellerne) Medmindre andet er angivet, var den rapporterede farvning i alle væv membranfarvning. Medmindre andet er angivet, havde alle tre præparater for hver vævstype samme farvningsintensitet. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.16/39

Brystcancer Fejlfinding Bryst Se afsnittet om fejlfinding i den tidligere nævnte Dako håndbog (19) for afhjælpning, eller kontakt Dakos tekniske service for at rapportere om usædvanlig farvning. Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 1a. Programmeringsfejl. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1a. Kontroller logføringen for objektglassene for at kontrollere om det rigtige program var valgt. 1b. Natriumazid i vaskeopløsningen 1b. Brug kun Dako Wash Buffer, 2. Svag farvning af objektglas. 1c. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre tab af synlig HER2 immunreaktivitet. kode S3006. 1c. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2a. Utilstrækkelig epitop retrieval. 2a. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at epitope retrieval blev korrekt udført. 2b. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 2c. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2d. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre en signifikant reduktion af synlig HER2 immunreaktivitet. 2b. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 2c. Sørg for, at patientvævet ikke overfikseres, og at der anvendes en godkendt fikseringsvæske. 2d. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 2e. Utilstrækkelig reagensvolumen påført. 2e. Kontrollér størrelsen af vævssnittet (22 mm x 22 mm) og den påførte reagensvolumen. 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3a. Brug friske opløsninger til afparaffinering. 3b. Der har været anvendt stivelsesadditiver ved monteringen af vævet på objektglasset. 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3e. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 3f. uspecifik reagensbinding til vævet. 3b. Undlad at anvende stivelsesadditiver til at hæfte vævssnittene på objektglassene. Mange additiver er immunreaktive 3c. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at de blev skyllet tilstrækkeligt. 3d. Kontrollér, at der blev anvendt den rette mængde reagens til objektglassene. 3e. Sørg for, at der blev anvendt en godkendt fikseringsvæske. En alternativ fikseringsvæske kan give større baggrundsfarvning. 3f. Kontroller metoden vævet blev fikseret med, og kontroller for tilstedeværelse af nekrose. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 4a. Brug silaniserede objektglas, såsom Dako Silanized Slides, (kode S3003), SuperFrost Plus eller poly L lysin belagte objektglas. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.17/39

Brystcancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 5. For kraftig specifik 5a. Uegnet fikseringsmetode 5a. Sørg for, at der kun anvendes farvning. anvendt. godkendte fikseringsvæsker og 6. Svag farvning af 1+ cellelinjen på kontrolobjektglasset. 7. Epitope Retrieval Solution bliver uklar ved opvarmning 8. Epitope Retrieval Solution er uklar ved opbevaring (inden opvarmning) 5b. For lange reagensinkubationstider. 5c. Der er anvendt en uegnet vaskeopløsning. 6a. Der blev fulgt en forkert protokol for epitop retrieval 6b. Manglende reaktion med substrat/kromogen opløsningen (DAB) metoder. 5b. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 5c. Brug kun Dako Wash Buffer, kode S3006. 6a. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at epitope retrieval blev korrekt udført. 6b. Kontroller logføringen for kørslen for at bekræfte, at kromogenet blev fremstillet korrekt. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 6c. Nedbrydning af kontrolobjektglas. 6c. Kontrollér sættets udløbsdato og opbevaringsbetingelserne, der er trykt på pakningen. 7. Opløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Opløsningen er opbevaret forkert, eller udløbsdatoen for opløsningen er passeret 7. Dette er normalt og påvirker ikke farvningen 8. Kontrollér sættets udløbsdato og opbevaringsbetingelserne, der er trykt på pakningen. Kassér Epitope Retrieval Solution BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. Yderligere oplysninger om farvningsteknikker og vævspræparering findes i tidligere nævnte Dako håndbog (19) (kan bestilles hos Dako), Atlas of Immunohistology (29) og Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (30). (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.18/39

Gastrisk cancer Resumé og forklaring Gastrisk Baggrund Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) koder for et protein, der ofte omtales som HER2 protein eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 8). HER2 proteinet er en normal cellekomponent, der dannes i forskellige former for epitelceller.* Overekspression af HER2 proteinet og amplifikation af HER2 genet i gastrisk cancer er påvist i et stort antal undersøgelser (31). HER2 positivitet kan detekteres hos ca. 20% af patienterne ved enten IHC eller FISH (31). Prækliniske in vitro og in vivo undersøgelser har vist, at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i forskellige gastriske cancermodeller, hvilket således har ført til initiering af flere kliniske undersøgelser (31 35). I en fase III-undersøgelse BO18255, ToGA-forsøget, blev HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk, gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang randomiseret til at modtage 5-FU eller capecitabin og cisplatin enten alene eller i kombination med trastuzumab. Der blev konstateret en statistisk signifikant stigning i den generelle overlevelsesfaktor (OS) hos patienter, der modtog den kombinerede behandling med trastuzumab og kemoterapi (36, 37). Herceptin (trastuzumab) er et rekombinant humant monoklonalt antistof (10) der med høj affinitet binder sig til HER2 proteinet. Det er påvist, at det hæmmer proliferationen af humane tumorceller med overekspression af HER2 protein in vitro og in vivo (32-35). Egenskaber Data om HER2 status fra 3.807 patienter med gastrisk cancer er tilgængelige fra ToGA forsøgets screeningsfase. I denne undersøgelse blev både HER2 proteinoverekspression ved IHC (HercepTest, Dako) og HER2 genamplifikation ved FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) målt hos samtlige patienter. Resultaterne fra denne del af undersøgelsen viste, at 22,1% af patienterne med fremskreden gastrisk cancer var HER2 positive, hvilket blev detekteret enten ved IHC eller FISH (37). Med hensyn til anvendelsen af HercepTest i vurderingen af patienter, for hvilke trastuzumab behandling overvejes, henvises der til indlægssedlen for Herceptin for yderligere oplysninger. Procedureprincip Gastrisk HercepTest indeholder de reagenser, der er nødvendige for at udføre en to trins immuncytokemisk farvning af rutinebehandlede, paraffinindstøbte præparater. Efter inkubation med det primære monoklonale kaninantistof mod humant HER2 protein, anvender dette sæt et brugsklart Visualization Reagent baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære gede anti kanin immunglobulinmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbase, hvorfor der ikke er behov for sekventiel påføring af link antistof og peroxidase konjugat antistof. Visualization Reagent krydsreaktion med humane immunglobuliner og føtalt kalveserum er fjernet ved hjælp af fastfaseabsorption. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Til vurdering af farvningerne leveres der kontrolobjektglas med tre formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farveintensiteter på 0, 1+ og 3+. Farveintensiteten af disse cellelinjer svarer til antallet af receptorer pr. celle. HercepTest for Automated Link Platforms, kode SK001, kan anvendes til automatisk farvning med automatiske Dako Link systemer. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.19/39

Gastrisk cancer Medfølgende materialer Gastrisk Kode SK001 De anførte materialer rækker til 50 analyser (50 objektglas inkuberet med primært antistof mod HER2 protein og 50 objektglas inkuberet med den tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 200 µl pr. vævssnit (22 mm x 22 mm) for hvert reagens bortset fra opløsningen til Epitope Retrieval Solution. Sættet indeholder materialer til maks. 10 individuelle farvninger. Mængde Beskrivelse 1 x 22 ml HercepTest peroxidaseblokerende reagens 3% hydrogenperoxid, der indeholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3). 1 x 12 ml HercepTest kanin antihumant HER2 protein Affinitetsisoleret antistof klar til brug. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C terminal fragment (intracytoplasmatisk del) af HER2 proteinet koblet til hæmocyanin fra albueskæl. Specificitet: HER2 protein. Rensningsmetode: Antistoffet er affinitetsisoleret ved hjælp af et immobiliseret HER2 proteinpeptid. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Dextranpolymer konjugeret med peberrodsperoxidase og affinitetsisoleret gede antikanin immunglobuliner. Leveres i Tris/HCl buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. 1 x 10 ml HercepTest negativ kontrolreagens Immunglobulin fraktion af normalt kaninserum ved en ækvivalent proteinkoncentration som antistoffet til HER2 protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. 2 x 22 ml HercepTest DAB substratbuffer Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende < 0,1% hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. 1 x 1 ml HercepTest DAB kromogen 5% 3,3' diaminobenzidintetrahydrochlorid kromogenopløsning. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) 0,1 mol/l citratbuffer med et vaskemiddel. 2 x 5 objektglas HercepTest kontrolobjektglas Hvert objektglas indeholder snit fra tre formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer fra brystkarcinomer, med forskellige niveauer af HER2 protein ekspressioner: MDA 231 (0), MDA 175 (1+) og SK BR 3 (3+). Kontrolobjektglassene er varmebehandlede, så snittene sidder bedre fast på objektglassene. Yderligere opvarmning af kontrolobjektglassene med henblik på at forbedre snittenes fastklæbning kan kompromittere resultatet af farvningen. 10 x flasker User Fillable Reagent Bottle, 12 ml Capacity Hver flaske kan indeholde op til 12 ml reagens. Flaskerne skal bruges til at blande og opbevare substratkromogenopløsning (se også afsnittet Forberedelse af reagenser). Leveres i separat pose. BEMÆRK: Alle reagenser er formuleret specifikt til anvendelse sammen med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke udskiftes med andre. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.20/39

Gastrisk cancer Nødvendige materialer, der ikke medfølger Gastrisk Forholdsregler Gastrisk Dako Wash Buffer, kode S3006 Kontrastfarve: Hæmatoxylin, såsom Hematoxylin for Automated Link Platforms (kode SK308) Dækglas Destilleret eller deioniseret vand Tørreovn der kan holde en temperatur på 60 C eller mindre Ethanol, absolut og 95% Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium såsom Dako Faramount (kode S3025) eller Dako Glycergel (kode C0563) Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, SuperFrost Plus, poly L lysin belagte eller Dako Silanized Slides (kode S3003) Xylen, toluen eller xylen erstatninger SK001 er beregnet til anvendelse med automatiske Dako Link systemer. Der henvises til brugsanvisningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemisk stof der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (21). 4. Herceptest peroxidaseblokerende middel, indeholder 3% brintoverilte. Sikkerhedsdatablade kan rekvireres af uddannet personale. 5. HercepTest kanin antihumant HER2 Protein, HercepTest visualiseringsreagens og HercepTest negative kontrolreagenser indeholder materialer af animalsk oprindelse. 6. Som ved alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 7. Alle kontrolglas og alle præparater både før og efter fiksering samt alt materiale, der har været i forbindelse med dem, skal håndteres som om de kunne overføre smitte, og de skal bortskaffes under overholdelse af passende forholdsregler (22). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 8. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser, da der i modsat fald kan forekomme en øget uspecifik farvning. 9. Andre inkubationstider, temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. Overdreven tørring ved 60 C i mere end én time kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). 10. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvningen. 11. Alle reagenser er formuleret specifikt til anvendelse sammen med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andre. 12. HercepTest visualiseringsreagens og HercepTest DAB kromogen kan blive negativt påvirket, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 13. For at opnå nøjagtig fortolkning af HercepTest -resultaterne i farvede biopsipræparater fra gastrisk eller gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom anbefales det at anvende en klynge med mindst 5 farvede tumorceller. En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. 14. Da biopsipræparater af gastrisk cancer er heterogene, er det vigtigt at udføre IHC-testen for HER2 på flere (7-8) biopsistykker fra forskellige regioner af tumoren for at opnå et pålideligt resultat. 15. Det anbefales at teste mere end én vævsblokresektion af ventrikelcancer, når prøven udviser en høj grad af heterogenitet (41). 16. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 17. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokale, nationale og EU bestemmelser. 18. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. 19. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan resultere i tab af synlig HER2- immunreaktivitet. Vævssnit, der er større end 22 mm x 22 mm kræver, at der påføres 2-3 x 200 µl reagens på 2-3 automatiske påføringsområder.. 20. HercepTest DAB Chromogen indeholder 1 5% 3,3 diaminobenzidintetrahydrochlorid (biphenyl 3,3,4,4 tetrayltetraammonium tetrachlorid) og er mærket: Fare H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P280 Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 21. Paraffinrester kan føre til falsk negative resultater. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.21/39

Gastrisk cancer Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger (efter EU s direktiv 94/33/EF). Se venligst sikkerhedsdatabladet (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. USA: 3,3 diaminobenzidin (DAB) kan være skadeligt ved indånding, ved kontakt med huden og ved indtagelse. Materialet irriterer øjne og hud. Hvis materialet kommer i kontakt med huden, renses det berørte område med vand og sæbe. BEMÆRK: Selvom diaminobenzidin strukturelt ligner benzidin, findes der ingen beviser for, at diaminobenzidin er karcinogent. Konsulter lokale og nationale bestemmelser for bortskaffelse. Opbevaring Gastrisk Opbevares ved 2 8 C, når det ikke er i brug på Dak o automatiske Link platforme. HercepTest Peroxidase Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer og HercepTest DAB Chromogen skal opbevares mørkt ved 2 8 C. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt uden på pakningen. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end de, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først evalueres af brugeren (14a, 14b). Bemærk, at kontrolobjektglassene også skal opbevares ved 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Der bør derfor udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HercepTest. Klargøring af prøver Gastrisk Præparater af gastrisk adenokarcinom, herunder gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom fra biopsier, excisioner eller resektioner, skal håndteres korrekt, så vævet bevares til immuncytokemisk farvning. Der skal anvendes standardmetoder for vævsbehandling til alle præparaterne (15). Ved test af små biopsipræparater fastslås intakt tumormorfologi og tilstedeværelsen af tilstrækkelige tumorceller for IHC evaluering. Hvis HercepTest analysen udføres på et biopsipræparat, skal flere (7 8) biopsier fra forskellige områder af tumoren analyseres for at sikre, at HER2-status bestemmes korrekt. Paraffinindstøbte snit Væv, der er paraffinindstøbte og konserveret i neutral bufferet formalin, egner sig. Præparaterne skal f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i 18 24 timer i neutral bufferet formalin. Biopsipræparaterne blev fikseret i 6-8 timer under ToGA-forsøget (forsøgsreferencen findes under (36)). Vævene skal derefter dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af imprægnering med smeltet paraffin ved temperaturer ikke over 60 C. Korrekt fikserede og indstøbte vævsblokke, der udtrykker HER2 protein kan holde uendeligt inden skæring og montering, hvis de opbevares køligt (15 25 C).(15,1 6). I USA kræver Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (lov for kliniske laboratorieforbedringer af 1988) i 42 CFR 493.1259(b) at Laboratoriet skal opbevare farvede præparatglas i mindst ti år fra undersøgelsesdato og vævsblokke i mindst to år fra undersøgelsesdato (16). Vævsprøverne skal skæres i snit på 4 5 µm, monteres på objektglas og lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller indtil de er tørre) ved 37 C natte n over eller ved 60 C i én time. FORSIGTIG: Overdreven opvarmning i mere end én time ved 60 C kan give anledning til et væsentligt fald i e ller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter de er skåret, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (18). Objektglas, der er påkrævet til HE R2 proteinevaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Det tilrådes, at anvende mindst 5 objektglas: 1 objektglas til verificering af tilstedeværelse af tumorer, 2 objektglas til evaluering af HER2 protein (1 objektglas til inkubation med kanin antihuman HER2 protein og 1 objektglas til negativt kontrolreagens) og 2 objektglas som reserve. For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter skæringen, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (18). Anvendelse af HercepTest på afkalkede væv er ikke godkendt og frarådes. Se Dako s Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) samt reference 15 og 16 for yderligere oplysninger om klargøring af præparater. Behandling af vævsprøver før farvning Der skal anvendes en specifik epitope retrieval i 0,01 mol/l citratbuffer for at opnå de bedste resultater. Opløsningen til epitope retrieval leveres med HercepTest sættet. Denne metode indebærer en opvarmning af vævspræparaterne, der er monteret på objektglas og nedsænket i en 0,01 mol/l citratbuffer (20) i et kalibreret vandbad eller Dako PT Link ved den krævede temperatur (95 99 C). Laboratorier, der er plac eret i højderne, bør finde den bedste metode til at vedligeholde den krævede temperatur. Andre metoder til epitope retrieval er blevet afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. Afvigelser fra den beskrevne procedure kan påvirke resultaterne. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.22/39

Gastrisk cancer Klargøring af prøver Gastrisk Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: Epitope Retrieval Solution Fortynd en passende mængde HercepTest Epitope Retrieval Solution i forholdet 1:10 med destilleret eller deioniseret vand til den planlagte farvningsprocedure. Ubrugte, fortyndede opløsninger kan anvendes i en uge, hvis de opbevares ved stuetemperatur, og i en måned, hvis de opbevares ved 2 8 C. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde Dako Wash Buffer (kode S3006) i forholdet 1:10 med destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt, fortyndet buffer kan anvendes i en uge, hvis den opbevares ved stuetemperatur, og i en måned, hvis den opbevares ved 2 8 C. Kassér buf feren, hvis den er uklar. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. Substratkromogenopløsning (DAB) Klargør substratkromogenopløsningen i de brugerfyldbare flasker ved at tilsætte 25 µl DAB Chromogen per 1 ml DAB Substrate Buffer, og bland. Klargjort substratkromogenopløsning (DAB) er stabil i ca. 5 dage, når det opbevares ved 2 8 C. Opløsningen skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. De brugerfyldbare flasker med substratkromogenopløsningen skal defineres i det automatiske Dako Link system inden brug. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger. BEMÆRK: Farven af DAB Chromogen kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til vejledningen på denne indlægsseddel. Hvis der tilsættes for meget DAB Chromogen til DAB bufferet substrat, vil det medføre en forringelse af det positive signal. Kontrastfarvning Det farvede slutprodukt fra DAB farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Hematoxylin til automatiske Link systemer (kode SK308) kan anvendes som kontrastfarve. De påkrævede trin og reagensinkubationstider er forprogrammeret i Dako Link softwaren. Det er ikke nødvendigt at forberede reagenserne. Monteringsmedie Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedium. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Monteringsmedier såsom Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready to Use (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) anbefales til vandbaseret montering. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. Farvningsprocedure Gastrisk Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se afsnittet Forholdsregler). Vævssnittene må ikke tørre ud på noget tidspunkt under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non specifik farvning. Alle de nødvendige trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Dako Link softwaren. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for mere detaljerede anvisninger til programmering og indføring af objektglas og reagenser. Hvis farvningsproceduren af brydes, kan objektglassene opbevares i bufferbadet efter inkubationen med det primære antistof i op til en time ved stuetemperatur (20 25 C) uden at det påvirker farvningens effek tivitet. Afparaffinering og rehydrering Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Anbring objektglassene i et xylenbad, og inkubér i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i ren ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i destilleret eller deioniseret vand i mindst 30 sekunder. Påbegynd farvningen som beskrevet i afsnittet om farvningsprotokol, under epitop retrieval. Xylen og alkoholopløsninger skal udskiftes efter 40 objektglas. Toluen eller xylenerstatninger, såsom Histoclear, kan anvendes. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige til brug ved udvælgelse af patienter til behandling med Herceptin. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.23/39

Gastrisk cancer Farvningsprotokol Alle de nødvendige trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i softwaren til de automatiske Dako Link systemer. Efter afparaffinering, rehydrering og epitop retrieval vil instrumentet behandle præparatglassene, som beskrevet herunder. Trin 1: Epitope retrieval Fyld Dako PT Module karrene eller farvningskarret, f. eks et Coplin kar, med Epitope Retrieval Solution (se forberedelse af reagenser). For Dako PT Link: Forvarm den fortyndede Epitope Retrieval Solution i Dako PT Link karret til 85 C. V ed opvarmning bliver Epitope Retrieval Solution uklar.anbring de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i Autostainer stativer, og dyp objektglassene i den forvarmede Epitope Retrieval Solution. Lad Dako PT Link opvarmes til 97 C, og inkubér i 40 ( ±1) minutter ved 97 C. Lad snittene afkøle i Dako P T Link, indtil temperaturen når 85 C. Fjern PT Link karrene med s nittene fra Dako PT Link. Lad karrene stå på bordet uden låg i 10 minutter for yderligere afkøling. Skyl snittene med Wash Buffer. Se brugervejledningen til Dako PT Link for yderligere oplysninger. Coplin skåle: Anbring farvningskarrene, der indeholder fortyndet Epitope Retrieval Solution, i vandbad. Opvarm vandbadet og Epitope Retrieval Solution til 95 99 C. Ved opvarmning bliver Epitope Retrieval Solution uklar. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Dyb de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i den forvarmede Epitope Retrieval Solution i farvningskarrene. Opvarm igen vandbadet og Epitope Retrieval Solution til 95 99 C. Inkubér i 40 (±1) minutter ved 95 99 C. Tag hele karret med objek tglassene op ad vandbadet. Lad objektglassene køle af i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved stuetemperatur. Dekantér Epitope Retrieval Solution og skyl snittene i Wash Buffer. Det bedste resultat opnås, hvis snittene anbringes i Wash buffer i 5 20 minutter efter epitope retrieval og inden farvning. BEMÆRK: Epitope Retrieval Solution er udelukkende beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Trin 2: Farvningsprocedure Efter epitope retrieval anbringes objektglassene i instrumentstativerne på de automatiske Dako Link systemer. Instrumentet vil udføre farvningsproceduren ved at påføre det korrekte reagens, overvåge inkubationstiden og skylle objektglassene mellem de forskellige reagenser. Reagensinkubationstider er forprogrammeret i Dako Link softwaren. Trin 3: Kontrastfarvning Objektglassene kan kontrastfarves med Hematoxylin til automatiske Dako Link systemer (kode SK308). Dako softwaren giver mulighed for to farvningsprotokoller. Den ene omfatter kontrastfarvning med hæmatoxylin, hvilket den anden ikke gør. Inkubationstiden i hæmatoxylin er forprogrammeret i den protokol, der omfatter kontrastfarvning. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger om programmeringsprotokoller. Trin 4: Montering Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Snittene kan monteres, og der kan sættes dækglas på med et vandbaseret monteringsmedie som Dako Faramount (kode S3025) eller Dako Glycergel (kode C0563). BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene forsynes med dækglas med et vandbaseret monteringsmedium og udsættes for kraftigt lys i over en uge. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.24/39

Gastrisk cancer Kvalitetskontrol Gastrisk Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA henvises til retningslinjerne for kvalitetskontrol i College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline(23) og punkt 24 i litteraturlisten for yderligere oplysninger. Tabel 8: Formålet med daglig kvalitetskontrol Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv, da dette er mest følsomt for antistof eller antigennedbrydning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Specifikt antistof & detektionssystem Kontrollerer alle trin i analysen. Evaluerer reagenser og procedurer anvendt ved HER2 farvning. Påvisning af utilsigtet antistof krydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. uspecifikt antistof* eller buffer plus samme detektionssystem som anvendt med det specifikke antistof Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Patientvæv Påvisning af specifik farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Kontrolobjektglas leveret af Dako. Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. * Serum fra samme art som det specifikke antistof men ikke rettet mod samme målantigen. Til påvisning af uspecifik antistofbinding, f.eks. vævets binding til Fc delen af antistoffet. Kontrolobjektglas (medfølger) Hvert af de leverede kontrolobjektglas indeholder tre runde, formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farvningsintensiteter på 0, 1+ og 3+. For hver farvningskørsel skal der farves et kontrolobjektglas. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. Positivt kontrolvæv Kontrollerne skal være friske autopsi /biopsi /kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven ( prøverne). Positivt kontrolvæv er tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. For hvert sæt testforhold skal der medtages ét positivt kontrolvæv i hver farvningskørsel. Det positive kontrolvæv skal give en svag positiv farvning, så der kan påvises små forandringer i det primære antistofs følsomhed. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette sæt, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven ( prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og kontrollerer ikke vævspræpareringen. Som ideelt positivt kontrolvæv anvendes væv fra gastrisk adenokarcinom, herunder gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom, der tidligere er bestemt for 2+ overekspression af HER2-protein. BEMÆRK: Kendt positivt kontrolvæv må kun anvendes til kontrol af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis det positive kontrolvæv ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Negativt kontrolvæv Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for HER2 protein), der er fikseret, behandlet og indstøbt på en måde, som svarer til patientprøven ( prøverne), i hver farvningskørsel for at kontrollere specificiteten af det primære antistof og få en angivelse af den specifikke baggrundsfarvning. Colon, lever og thyroidea er velegnet som negativt kontrolvæv. De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige, og analysen skal køres igen. Se brugervejledningen til det automatiske Dako Link system for yderligere oplysninger om programmering af kontrolobjektglas. Uspecifik negativ kontrolreagens Brug den medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.25/39

Gastrisk cancer Kontrol af analysen Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række interne væv med kendte IHC effektivitetskarakteristika, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne vedr. kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene til kvalitetskontrol i CAP Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (23). Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Gastriske adenokarcinomer, herunder gastroøsofageale overgangsadenokarcinomer, med en kendt HER2-protein-farvningsintensitet mellem 0 og 3+ og negativt væv, for eksempel fra colon, lever og thyroidea, er egnede ved kontrol af analysen. Fortolkning af farvning Gastrisk Til en bestemmelse af HER2 proteinekspression skal kun membranens farvningsintensitet og mønster sammenlignes med den skala, der ses i tabel 9. Præparaterne skal vurderes med lysmikroskop af en patalog. Et objektiv med en forstørrelse på 10x er velegnet til evaluering af den immunhistokemiske farvning og scoring. Brugen af et 5 40x forstørrelsesobjektiv er nyttig til bekræftelse af resultatet. Cytoplasmatisk farvning skal altid betragtes som uspecifik farvning og skal ikke inkluderes i bestemmelsen af membranens farvningsintensitet (8). Som en hjælp til at differentiere mellem 0, 1+, 2+ og 3+ farvning henvises der til Dakos HercepTest Interpretation Manuel Gastric Cancer (Vejledning til fortolkning af Herceptest Gastrisk cancer), hvor der findes billeder af farvningsintensiteter og mønstre. Kun prøver fra patienter med gastrisk adenokarcinom, herunder gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom, bør evalueres. I tilfælde med intestinal metaplasi og gastrisk adenocarcinom i samme præparat skal kun den gastriske adenocarcinomkomponent bedømmes. Til fortolkning af HercepTest -farvede biopsier anbefales der en klynge med mindst 5 farvede tumorceller. En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. Tabel 9. Fortolkning og evaluering af HER2 immunhistokemisk farvning Farvning sgrad Kirurgisk præparat Farvningsmønster Biopsipræparat Farvningsmønster Evaluering af HER2 overekspression 0 reaktivitet eller ingen membranøs reaktivitet i < 10% af tumorcellerne reaktivitet eller ingen membranøs reaktivitet i nogen (eller < 5 i klyngen) tumorcelle Negativ 1+ Svag/næsten ingen synlig membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne; cellerne er kun reaktive i en del af deres membran Tumorcelleklynge (eller < 5 i klyngen) med en svag/næsten ingen synlig membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Negativ 2+ Svag til moderat, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne Tumorcelleklynge (eller < 5 i klyngen) med en svag til moderat, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Tvetydig 3+ Kraftig, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne Tumorcelleklynge (eller < 5 i klyngen) med en kraftig komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Positiv Retningslinjerne er baseret på Hofmann et al. (39). HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ score), tvetydig (2+ score) og positiv (3+ score). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en semikvantitativ vurdering af præparaternes farvningsintensitet for hver farvningskørsel, skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 10. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.26/39

Gastrisk cancer Tabel 10: Rækkefølge for vurdering af objektglassene Objektglassenes aflæsningsrækkefølge 1. Kontrolobjektglas med tre cellelinjer Begrundelse Tilstedeværelsen af 3+ brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. Stiplet eller afbrudt membranfarvning ses i et lille til moderat antal celler i den svagt positive 1+ kontrolcellelinje MDA 175. I denne cellelinje kan der også ses prikket immunfarvning af cytoplasmaets Golgiapparat. 2. Objektglas med positivt kontrolvæv. 3. Objektglas med negativt kontrolvæv. 4. Objektglas med patientvæv der er farvet med negativ kontrolreagens. 5. Objektglas med patientpræparat der er farvet ved hjælp af det primære antistof. Tilstedeværelsen af brun farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 (negativ for HER2 proteinfarvning) angiver at der er non specifik farvning i analysen. Analyseresultaterne kan være ugyldige på grund af overfarvning. Der skal ses brunfarvning af membranen. Farvning af cytoplasma og negativt væv må ikke være mere end for 1+. MANGEL på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis objektglasset med det negative kontrolvæv udviser specifik membranfarvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Manglende specifik membranfarvning bekræfter det primære antistofs specifikke binding til målantigenet. Hvis der ses en anden nuance eller en brunfarvning af cytoplasmaet i præparatet, der er behandlet med negativt kontrolreagens, for eksempel i bindevæv, leukocytter, erytrocytter eller i nekrotisk væv skal dette betragtes som uspecifik baggrundsfarvning og skal rapporteres under bemærkninger på dataregnearket. Hvis der ses HER2 protein overekspression i præparatet, vil dette ses som en brun rand, der er lokaliseret til cellemembranen på tumorceller, som er behandlet med det primære antistof. 1. Kontrolobjektglas (medfølger): Det positive kontrolobjektglas med Hercep Test skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Tilstedeværelsen af brunt (3,3 diaminobenzidine, DAB) reaktionsprodukt svarende til cellemembranerne angiver, at der er positiv reaktivitet. Tilstedeværelsen af en perifer, brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. Hvis nogle af kontrolcellelinjerne falder udenfor disse kriterier skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. 2. Positivt kontrolvæv Det positive kontrolvæv skal undersøges derefter. Dette objektglas bekræfter at fikserings og epitope retrieval processen er effektiv. Brug intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves non specifikt (25). Der skal ses brunfarvning af cellemembranen. Brunfarvning af cytoplasma og negativt væv inde i præparatet m ikke være mere end svarende til farveintensitetsgrad 1+. 3. Negativt kontrolvæv: Objektglasset med det negative kontrolvæv skal undersøges efter det positive kontrolvæv for at kontrollere specificiteten af det primære antistofs mærkning af målantigenet. Mangel på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Bemærk, at en svag reaktion (0-1+ farvningsintensitet) kan ses i de fleste former for normalt epitelvæv. Muligt negativt kontrolvæv inkluderer: Colon, lever og thyroidea. En eventuel non specifik farvning vil have et diffust udseende. Sporadisk farvning af bindevæv kan også ses i snit fra for kraftigt formalinfikseret væv. 4 + 5. Patientvæv: Undersøg patientpræparater der er farvet med HercepTest til sidst. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel non specifik baggrundsfarvning med den negative kontrolreagens. Som det er tilfældet med enhver immuncytokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Præstationskarakteristika for specifikke oplysninger om HercepTest immunreaktivitet. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.27/39

Gastrisk cancer Yderligere forslag til fortolkning af farvning med HercepTest Gastrisk adenokarcinom, herunder gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom, der er testet for HER2-proteinoverekspression, evalueres fra 0 til 3+. Mens tilfældene med 0 og 3+ er lige til, er en lille procentdel af de resterende 1+ og 2+ præparater vanskeligere at fortolke. Følg nedenstående retningslinjer for fortolkning af farvning med HercepTest i laboratoriet. 1. Evaluer kontrolcellelinjerne for at kontrollere analysens effektivitet. 2. Evaluer de positive og negative kontrolobjektglas. 3. Det anbefales at farve vævsprøverne med en hæmatoxylin eosin (H&E) farvning til første evaluering. (tumoren ses måske ikke tydeligt i præparater, der er farvet med HercepTest. Patologen har behov for et H&E farvet præparat for at kunne bekræfte tilstedeværelsen af tumorvæv). HercepTest skal udføres på et parret snit (skåret efter hinanden) fra samme paraffinblok af vævsprøven. 4. Evaluer først snittene, der er farvet for HER2 protein overekspression, med en lille forstørrelse. De fleste positive tilfælde vil være tydelige med en lille forstørrelse. 5. Til 1+ tilfælde anvendes en 40x objektivforstørrelse til verifikation af membranfarvning. 6. Til 2+ tilfælde anvendes en 10 20x objektivforstørrelse til verifikation af membranfarvning. Kirurgisk prøve 1. Der skal anvendes velbevarede og korrekt farvede områder af præparaterne til bestemmelse af procentdelen af positive tumorceller. 2. Hvis de fleste tumorceller viser en fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er farvningsgraden enten 2+ eller 3+. 3. Hvis der er fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning med en kraftig intensitet, der er lig med eller større end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver, er prøvens score 3+. 4. Hvis der er fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning med en svag til moderat intensitet, der er lig med eller større end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver, er prøvens score 2+. 5. Hvis 10% eller flere af tumorcellerne i kirurgiske prøver, der kun er farvede i en del af deres membran, har en svagt/næsten ikke synlig intensitet, er prøvens score 1+. 6. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver har en farvning, uanset farvningsmønsteret (f.eks. fuldstændig, basolateral eller lateral eller i en del af deres membran), er scoren 0. 7. Hvis der ikke observeres farvning, er resultatet for det kirurgiske præparat 0. Biopsiprøve 1. En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. 2. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge på mindst 5 farvede tumorceller med en kraftig, fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er biopsiprøvens score 3+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. 3. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge på mindst 5 farvede tumorceller med en svag til moderat, fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er biopsiprøvens score 2+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. 4. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge med mindst 5 farvede tumorceller med en svag/næsten ikke synlig membranfarvning, og cellerne kun er farvede i en del af deres membran, er biopsiprøvens score 1+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. 5. Hvis der ikke observeres farvning, er resultatet for biopsipræparatet 0. 6. Hvis der observeres membranfarvning (uanset farvningsintensitet) i mindre end 5 tumorceller i klyngen, er resultatet for biopsipræparatet 0. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.28/39

Gastrisk cancer Generelle begrænsninger Gastrisk Produktspecifikke begrænsninger Gastrisk 1. Immuncytokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immuncytokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof trapping eller falsk negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5. Vævsprøver fra personer, som er inficeret med hepatitis B virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non specifik farvning med peberrodsperoxidase (26). 6. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv (27). Kontakt Dakos tekniske serviceafdeling med dokumenterede uventede reaktioner. 7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (27). 8. Farvningen udføres ved en forprogrammeret temperatur på (20 25 C). 1. Antigenet i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 nedbrydes med tiden. Bedøm resultatet for kontrolobjektglasset i henhold til dets udløbsdato. Negativ farvning af MDA 175 celler er muligvis kun et tegn på, at kontrolobjektglasset er for gammelt. Kontrolobjektglas skal opbevares ved 2 8 C. 2. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden 4 6 uger efter monteringen af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (28). 3. Udskift ikke sættets reagenser med reagenser med andre partinumre eller med reagenser fra andre producenter. 4. Der kan forekomme falsk positive resultater ved evaluering af den cytoplasmatiske farvning. Når resultaterne fortolkes, skal kun cellemembranens farvningsintensitet tages i betragtning. 5. Farvede kontrolobjektglas skal kun anvendes til kontrol af farvningskørslen og bør ikke anvendes til at bedømme farvningsreaktionen i vævssnittene. 6. Der kan undertiden ses stærkt fokaliseret farvning (3+) som for eksempel varme områder. Dette kan skyldes en ujævn fiksering og/eller behandling af vævet. Det anbefales at immunfarve en anden vævsblok fra samme vævsprøve. 7. Brugen af HercepTest på præparater, der er fikseret i andre fikseringsvæsker end neutral bufferet formalin, er ikke godkendt. 8. Bemærk at normalt epitelvæv fra tonsiller og øsofagus kan farves med en intensitet op til grad 2+. 9. Anvendelse af knuste prøver af gastrisk cancer og fortolkning af artefaktisk farvning omkring en biopsikant bør undgås. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.29/39

Gastrisk cancer Præstationskarakteristika Gastrisk Baggrund Sikkerheden og effektiviteten ved trastuzumab (Herceptin ) er blevet påvist i en klinisk undersøgelse (ToGA forsøget) (37, 38). Undersøgelsen blev udformet som en open-label, randomiseret, multicenter fase IIIundersøgelse af HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang. I ToGA forsøget var HER2 positivitet defineret som enten værende IHC positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv ved HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0 (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Patienterne blev efter inklusion i undersøgelsen randomiseret til at modtage kemoterapi (5 FU eller capecitabin og cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det primære endepunkt i undersøgelsen var generel overlevelse (OS). Der blev i alt randomiseret 594 patienter i undersøgelsen, og 584 patienter modtog medicinsk behandling og blev inkluderet i hele analysesættet (FAS). For det primære endepunkt viste kombinationen af kemoterapi plus trastuzumab sig at være statistisk bedre end kemoterapi alene. Den mediane OS steg fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en hazard ratio på 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Kaplan Meier kurverne for OS vises i Figur 1. Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 1. Kaplan Meier kurve for OS (n=584). Præspecificerede, eksploratoriske undergruppeanalyser af HER2-status blev udført, når dataene var til rådighed. Der blev defineret to nye HER2-undergrupper post hoc baseret på IHC-scoring: (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.30/39

Gastrisk cancer Gruppe 1 ( gruppe med lav HER2 ekspression ): Gruppe 2 ( gruppe med høj HER2 ekspression ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ and IHC 3+ (FISH+ eller FISH- eller FISH intet resultat (n=446) Når den primære analyse af OS blev gentaget post hoc for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446), var fordelene for den kombinerede behandling endnu større. Den mediane OS for gruppen af patienter, der havde modtaget kemoterapi plus trastuzumab, steg til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for patienterne på kemoterapi alene. Hazard ratio for denne analyse faldt til 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Kaplan Meier kurverne for OS for gruppen med høj HER2 ekspression vises i Figur 2. Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan Meier kurve for OS for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446). ToGA forsøget har vist, at kombinationen af IHC og FISH test er forudsigelig for virkningen af den kombinerede behandling med kemoterapi og trastuzumab. De eksploratoriske analyser post hoc-analyser synes imidlertid at indikere, at patienter med højere niveauer af HER2-proteinekspression (IHC2+/FISH+ og IHC3+) opnår større fordel. Dette kan forklares ved, at proteinet er target for trastuzumab. For yderligere oplysninger om ToGA forsøget henvises til indlægssedlen for Herceptin. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.31/39

Gastrisk cancer Reproducerbarhed Reproducerbarhed inden for kørsler Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 3 præparater med forskellige ICH farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier. Denne protokol blev anvendt med automatisk farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 11 præparater med forskellige ICH farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier. Denne protokol blev anvendt med manuel farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarhed mellem kørsler og laboratorier: Der blev udført HercepTest -analyse af 60 forskellige cancerprøver taget fra gastriske eller gastroøsofageale overgangsområder ved kirurgisk resektion og biopsi over fem dage på tre forsøgssteder. De 60 præparater i forsøget var ligeligt fordelt over de tre HER2-statuskategorier. Seks patologer udførte i alt 2.040 HER2- evalueringer. Dag til dag-overensstemmelsen (negativ, tvetydig, positiv) varierede mellem 83,1 % til 98,3 %. I 47 af de 60 mulige sammenligninger var overensstemmelsen 90,0 % eller derover. Tabel 11 viser specifikke eksempler på dag til dag-sammenligninger med gennemsnitlige overensstemmelser på 91,2 %, 92,5 % og 92,5 % for de tre steder. Sted til sted-overensstemmelsen var henholdsvis 82,7 %, 75,0 % og 88,0 % for parvis sammenligning mellem steder (se Tabel 12). Ifølge Fishers eksakte test var der ingen forskel på resultaterne fra de forskellige steder. Observatør til observatør-overensstemmelsen mellem patologerne på de forskellige steder var henholdsvis 88,0 %, 83,6 % og 81,0 % for de tre forsøgssteder (tabel 13). HercepTest -analysen af gastriske cancerprøver på de tre forsøgssteder demonstrerede således god overensstemmelse mellem forskellige dage, steder og observatører. Tabel 11. Overordnet dag til dag-overensstemmelse i procent delmængde på 12 ud af 60 sammenligninger Sted 1 Sted 2 Sted 3 Observatør 1 Observatør 2 Gennemsnitlig Overensstemmelsstemmelse CI95 LL 1 Overens- CI95 LL 1 Overensstemmelse Dag 1 ift. dag 2 85,0 74,4 93,3 84,9 Dag 3 ift. dag 4 93,3 84,9 93.3 84,9 Dag 1 ift. dag 2 95,0 87,3 83,1 72,0 Dag 3 ift. dag 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Dag 1 ift. dag 2 90,0 80,5 91,7 82,7 Dag 3 ift. dag 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95 % nedre grænse for konfidensinterval. 91,2 92,5 92,5 Tabel 12. Overordnet sted til sted-overensstemmelse i procent Overensstemmelse CI95 LL 1 Gennemsnitlig overensstemmelse Sted 1 ift. sted 2 Dag 1 ift. dag 1 83,3 72,4 Dag 2 ift. dag 2 85,0 74,4 Dag 3 ift. dag 3 85,0 74,4 Dag 4 ift. dag 4 81,7 70,5 Dag 5 ift. dag 5 78,3 66,7 Sted 1 ift. sted 3 Dag 1 ift. dag 1 80,0 68,6 Dag 2 ift. dag 2 73,3 61,2 Dag 3 ift. dag 3 78,3 66,7 Dag 4 ift. dag 4 68,3 55,9 Dag 5 ift. dag 5 75,0 63,0 Sted 2 ift. sted 3 Dag 1 ift. dag 1 88,3 78,5 Dag 2 ift. dag 2 86,7 76,4 Dag 3 ift. dag 3 90,0 80,5 Dag 4 ift. dag 4 86,7 76,4 Dag 5 ift. dag 5 88,3 78,5 1 CI95 LL: 95 % nedre grænse for konfidensinterval. 82,7 75,0 88,0 (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.32/39

Gastrisk cancer Tabel 13. Observatør til observatør-overensstemmelse i procent Overensstemmelse CI 95 LL 1 Gennemsnitlig overensstemmelse Sted 1 Dag 1 91,7 82,7 Dag 2 91,7 82,7 Dag 3 93,3 84,9 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 80,0 68,6 Sted 2 Dag 1 86,4 76,0 Dag 2 83,3 72,4 Dag 3 83,3 72,4 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 81,7 70,5 Sted 3 Dag 1 80,0 68,6 Dag 2 78,3 66,7 Dag 3 80,0 68,6 Dag 4 78,3 66,7 Dag 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95 % nedre grænse for konfidensinterval. 88,0 83,6 81,0 (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.33/39

Gastrisk cancer Immunreaktivitet Tabel 14 giver en oversigt over immunreaktiviteten for HercepTest med et anbefalet udvalg af normalt væv. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med HercepTest i henhold til vejledningen på indlægssedlen. Tabel 14. Sammenfatning af normal vævsreaktivitet for HercepTest. Vævstype (antal analyser) Adrenal (3) Knoglemarv (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesotelceller (3) Ovarie (3) Pancreas (3) Parathyreoid (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spytkirtel (3) Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testis (3) Thymus (3) Thyreoid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Positivt farvet vævsbestanddel og farvningsmønster Mælkekirtel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet) Tubuli i nyremarv (3 af 3 væv, 1-2+ i 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Prostatakirtel/-gange (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Svedkirtler (1 af 3 væv, 1+, 30 % af cellerne, cytoplasmatisk) Søjleepitel, overflade (1 af 3 væv, 2+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Epitel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Pladeepitel (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 80 % af cellerne) Medmindre andet er angivet, var den rapporterede farvning i alle væv membranfarvning. Medmindre andet er angivet, havde alle tre præparater for hver vævstype samme farvningsintensitet. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.34/39

Gastrisk cancer Fejlfinding Gastrisk Se afsnittet om fejlfinding i den tidligere nævnte Dako håndbog (19) for afhjælpning, eller kontakt Dakos tekniske service for at rapportere om usædvanlig farvning. Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 1a. Programmeringsfejl. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1a. Kontroller logføringen for objektglassene for at kontrollere om det rigtige program var valgt. 1b. Natriumazid i vaskeopløsningen 1b. Brug kun Dako Wash Buffer, 2. Svag farvning af objektglas. 1c. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre tab af synlig HER2 immunreaktivitet. kode S3006. 1c. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2a. Utilstrækkelig epitop retrieval. 2a. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at epitope retrieval blev korrekt udført. 2b. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 2c. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2d. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre en signifikant reduktion af synlig HER2 immunreaktivitet. 2b. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 2c. Sørg for, at patientvævet ikke overfikseres, og at der anvendes en godkendt fikseringsvæske. 2d. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 2e. Utilstrækkelig reagensvolumen påført. 2e. Kontrollér størrelsen af vævssnittet (22 mm x 22 mm) og den påførte reagensvolumen. 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3a. Brug friske opløsninger til afparaffinering. 3b. Der har været anvendt stivelsesadditiver ved monteringen af vævet på objektglasset. 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3e. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 3f. uspecifik reagensbinding til vævet. 3b. Undlad at anvende stivelsesadditiver til at hæfte vævssnittene på objektglassene. Mange additiver er immunreaktive 3c. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at de blev skyllet tilstrækkeligt. 3d. Kontrollér, at der blev anvendt den rette mængde reagens til objektglassene. 3e. Sørg for, at der blev anvendt en godkendt fikseringsvæske. En alternativ fikseringsvæske kan give større baggrundsfarvning. 3f. Kontroller metoden vævet blev fikseret med, og kontroller for tilstedeværelse af nekrose. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 4a. Brug silaniserede objektglas, såsom Dako Silanized Slides, (kode S3003), SuperFrost Plus eller poly L lysin belagte objektglas. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.35/39

Gastrisk cancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 5. For kraftig specifik 5a. Uegnet fikseringsmetode 5a. Sørg for, at der kun anvendes farvning. anvendt. godkendte fikseringsvæsker og 6. Svag farvning af 1+ cellelinjen på kontrolobjektglasset. 7. Epitope Retrieval Solution bliver uklar ved opvarmning 8. Epitope Retrieval Solution er uklar ved opbevaring (inden opvarmning) 5b. For lange reagensinkubationstider. 5c. Der er anvendt en uegnet vaskeopløsning. 6a. Der blev fulgt en forkert protokol for epitop retrieval 6b. Manglende reaktion med substrat/kromogen opløsningen (DAB) metoder. 5b. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 5c. Brug kun Dako Wash Buffer, kode S3006. 6a. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at epitope retrieval blev korrekt udført. 6b. Kontroller logføringen for kørslen for at bekræfte, at kromogenet blev fremstillet korrekt. Kontroller logføringen for objektglassene for at bekræfte, at inkubationstiderne er korrekte. 6c. Nedbrydning af kontrolobjektglas. 6c. Kontrollér sættets udløbsdato og opbevaringsbetingelserne, der er trykt på pakningen. 7. Opløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Opløsningen er opbevaret forkert, eller udløbsdatoen for opløsningen er passeret 7. Dette er normalt og påvirker ikke farvningen 8. Kontrollér sættets udløbsdato og opbevaringsbetingelserne, der er trykt på pakningen. Kassér Epitope Retrieval Solution BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. Yderligere oplysninger om farvningsteknikker og vævspræparering findes i tidligere nævnte Dako håndbog (19) (kan bestilles hos Dako), Atlas of Immunohistology (29) og Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (30). (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.36/39

Referencer 1. Coussens L, Yang Feng TL, Liao Y C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230:1132 2. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v erbb related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985; 229:974 3. Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v erbb related protooncogene, c erbb 2, is distinct from the c erbb 1/epidermal growth factor receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82:6497 4. Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c erb B 2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319:230 5. Schechter AL, Hung M C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229:976 6. Bargmann CI, Hung M C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor related protein. Nature 1986; 319:226 7. Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990; 45:457 8. Press MF, Cordon Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER 2/neu proto oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990; 5:953 9. Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb 2 product is an atypical receptor like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990; 2:992 10. Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:4285 11. Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989; 9:1165 12. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993; 37:255 13. Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti HER2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998; 58:2825 14. a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003 b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, 1992 15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; 1980 16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press 1981 17. Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6,119 22. 18. Dako California Inc., Data on file 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fourth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2006 20. Leong AS Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996; 4:201 21. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78 127, Current 13. August 16, 1976 22. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29 A3 [ISBN 1 56238 567 4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 1898 USA, 2005 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4 A (1 56238 396 5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 1898 USA; 1999 24. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989; 92:836 25. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14:767 26. Omata M, Liew C T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626 27. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 28. Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER 2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 29. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: 16 30. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986 (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.37/39

31. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 32. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER 2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: 273 278. 33. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti HER2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: 681 685. 34. Fujimoto Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 795 805. 35. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: 89 95. 36. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastroesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet 2010. 37. Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 38. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 39. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52:797-805. 40. Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: 2070-2079. (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.38/39

Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Skrøbelig: Skal håndteres forsigtigt Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Opbevares mørkt Anvendes senest GHS-piktogram (se afsnittet forholdsregler) Se brugsanvisningen Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Producent Manufactered by: Distribueret i USA af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK 2600 Glostrup Danmark Tlf. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Dako North America, Inc. 6392 Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tlf. 805/566 6655, gratisnummer: 800/235 5743 Bestillingsoplysninger: Tlf. 800/235 5763 Fax 805/566 6688 Teknisk afdeling: Tlf. 800/424 0021 (125218-001) P04083DK_01_SK00121-2/2015.04 s.39/39