Humane embryonale stamcellers hæmopoietiske potentiale

Elise Hoffmann Munk Nielsen STAMCELLER 1017 Humane embryonale stamcellers hæmopoietiske potentiale Samt teratom-problematikken Dette er den fjerde af 5 artikler, der gør status over de senere års resultater inden for human embryonal stamcelleforskning. Artiklerne beskriver først forskning inden for en specifik vævstype, dernæst gives et generelt perspektiv på det, såsom terapeutisk kloning, teratomdannelse, transplantats afstødning og etiske problemstillinger. Her ses på, om humane embryonale stamceller kan videreudvikles til hæmopoietiske celler, og på et fundamentalt problem med dannelse af godartede tumorer, såkaldte teratomer. biografi: Forfatteren er turnuslæge. Hun har som lægestuderende i samarbejde med endokrinologisk afdeling på Odense Universitetshospital lavet et literaturstudie om de seneste års udvikling inden for stamcelleforskning. forfatters adresse: Nørrebrogade 164A, 5. sal, 2200 København N. E-mail: eniel99@student.sdu.dk Blodets voksne stamceller er de eneste stamceller, som på nuværende tidspunkt anvendes i praksis, bl.a. til behandling af blod-, immun- og cancersygdomme. Forskere håber at kunne få denne voksne stamcelle til at udvise pluripotens, dvs. evnen til at udvikle sig til celler fra alle væv. En sådan udvikling kræver, at cellen ikke blot kan bringes til at differentiere, men også proliferere in vitro. Blod, der anvendes i klinikken i dag, stammer fra marvaspirater eller fra perifert blod tappet fra patienter, der forinden er blevet behandlet med cytokiner, der medfører migration af stamceller fra knoglemarv ud i det perifere blod. Herudover arbejder man også med at transplantere navlestrengsblod typisk til børn. Forskning i stamceller Forskning i at dirigere humane embryonale stamceller (hes) til at udvikle hæmopoietiske celler, rummer flere fordele frem for anvendelsen af voksne stamceller. hes er langtidsproliferative, de er mere plastiske i deres potentielle differentiering, deres overflademarkører er mindre genkendelige for immunsystemet, og endeligt er de nemmere at arbejde med i forbindelse med genetisk manipulation (4). Dette muliggør nye anvendelser af hæmopoietiske celler. Potentielt kan hæmopoietiske stamceller genetisk manipuleres således, at de kan anvendes som angrebsceller mod specifikke sygdomme og tumorer. I forbindelse med

1018 Embryonale stamceller (ES) Sædcellens befrugtning af oocytten medfører dannelse af en zygote, som deler sig en gang i døgnet på vej til livmoderen. Denne cellemasse kaldes morula, og heri opstår efterhånden et væskefyldt hulrum. På femtedagen er dannet en blastocyt bestående af en ydre cellemasse (trofoblasten), som bliver til moderkage, navlestreng og fosterhinde, samt den indre cellemasse (embryoblasten), som er ophav til selve fosteret. Embryonet er på blastocytstadiet endnu omgivet af zona pellucida, en hinde af glykoprotein, som nedbrydes umiddelbart inden implantationen på 6. 7. befrugtningsdag (1). De humane embryonale stamceller isoleres fra denne indre cellemasse, inden en evt. implantation ville kunne have fundet sted. Embryonale stamceller er sammenlignet med voksne stamceller forholdsvis nemme at identificere, isolere og dyrke i et kemisk veldefineret medie. I forsøg, hvor embryonale stamceller sprøjtes ind i immuninsufficiente mus, danner disse teratomer indeholdende væv fra alle tre kimlag (2). Embryonale kønsceller (EG) Stammer fra primordiale kønsceller fra et 5 10 uger gammelt foster. Stamceller fra dette væv, der potentielt udvikles til testikler eller ovarier, er en form for progenitor-celler. Disse celler er som de embryonale stamceller pluripotente, men har altså forskellig afstamning og forskellige karakteristika. Voksne stamceller Udifferentierede celler fra kroppens specialiserede væv med evne til proliferation og differentiering. In vitro er det svært at få cellerne til at proliferere i længere tid, uden at de begynder at differentiere. I modsætning til ES-celler mangler voksne stamceller evnen til at danne teratomer efter implantation i mus, dvs. at de ikke kan differentieres til celler fra alle tre kimlag. In vivo udvikles voksne stamceller ofte til progenitor-celler eller precursor-celler, der senere kan dele sig til modne celler. Der forskes i øjeblikket i voksne stamcellers plasticitet, men ofte løber forskerne ind i problemer, fordi denne celletype er relativ sjælden, svær at identificere og problematisk at isolere (3). Det skal her nævnes, at de stamceller, som udvindes fra navlestrengsblod, er voksne stamceller. Boks 1. Begrebet stamceller dækker over flere typer af celler. transplantation af stamceller opstår problemet teratomdannelse, som vil blive belyst sidst i artiklen. Man har i nogen tid vidst, hvordan hes-cellers differentiering til hæmopoietisk væv kan dirigeres over flere trin. Et forsøg fra 2001 illustrerer, at differentieringen kan foregå ad flere veje. En del af cellerne dyrkes i kulturer sammen med museknoglemarvs stromaceller, mens en anden portion af hes cellerne dyrkes i et andet medie sammen med museendoteliale celler fra den føtale blommesæk. Begge behandlinger medfører dannelse af hæmopoietiske precursor-celler, der udtrykker overfladeantigenet CD34, som er karakteristisk herfor. De celler, der udtrykker CD34, selekteres og dyrkes herefter videre i medier, der promoverer differentiering i kraft af tilsatte hæmopoietiske vækstfaktorer. De herved fremkomne myocytter udtrykker overfladeproteinet CD15, erytrocytter udtrykker glykoprotein A, mens megakaryocytter udtrykker CD41. Alle overflademarkører er påvist ved flowcytometri. Via RT-PCR undersøger man endvidere erytrocytternes udtryk af proteiner til hæmoglobinsyntese. Det påvises, at de fremdyrkede hæmopoietiske celler er i stand til at danne hæmoglobin svarende til det, som findes hos voksne, men ikke hæmoglobin,

1019 som det findes i embryonal eller føtalstadiet i udviklingen. Cellerne har samme karakteristiske morfologi som de hæmopoietiske celler, der isoleres fra humant knoglemarv (5). Den videre forskning er rettet mod at gøre de udviklede celler anvendelige i klinikken. De precursor-celler, man har frembragt som ovenfor beskrevet, kan ikke bruges som transplantat. Kun i enkelte tilfælde er det beskrevet, at cellerne har dannet nye blodceller, og i disse tilfælde kun erytrocytter, aldrig lymfoide eller myeloide celler. Muligvis skyldes dette, at celler dyrket fra embryoner og i det dertilhørende mikromiljø forbliver umodne og dermed uegnede til at fungere i den voksne krop. De hæmopoietiske celler, som dannes i embryonet, er forskellige fra dem, der udvikles i blommesækken. In vivo-udviklede celler undergår yderligere forandringer ved cirkulation i den føtale krop og endnu en gang i forbindelsen med fødslen. Forskere arbejder derfor med nye protokoller for uddifferentieringen af dyre-esceller til hæmopoietiske celler. I Science blev der i 2003 publiceret en artikel over et studie af genmanipulerede embryonale stamceller. Man inkorporerede via retrovirus onkogenet BCR/ABL, som er associeret med kronisk myeloid leukæmi (CML) i museembryonale stamceller. Forventningen er, at dette vil stimulere proliferation uden at interagere med differentieringen. De fremdyrkede embryoide bodies (EB) blev dyrket på OP9-stroma i mindre end 2 uger. OP9-mediet er tilsat flere cytokiner, og stromaet er tidligere vist at kunne inducere dannelsen af hæmopoi etiske precursor-celler. De fremdyrkede celler udtrykte markører for primitive hæmopoietiske progenitors samt antigener karakteristiske for myeloide progenitors og lymfoide progenitors. Efter injektion i mus uden funktionel knoglemarv opstod et nyt blodbillede bestående af alle blodets normale celletyper. Desuden udviklede musene leukæmi, hvorfor der opstilledes en ny og forbedret forsøgsprotokol. Dels forsøgte forskerne nu kun at aktivere en del af den pathway, som BCR/ ABL-genet tidligere aktiverede. Man ønsker at bibeholde ekspressionen af proteinet STAT5, men uden transformationen af hele onkogenet. Man mener således at bevare den øgede proliferation, men samtidig at forstyrre cellefysiologien mindre. Endvidere inkorporeres genet HoxB4 i cellerne; dette er tidligere vist at forbedre hæmatopoietiske cellers transplantationsevne uden at inducere leukæmi. Ekspression af begge disse gener ønskes kontrolleret, hvorfor man inkorporerer en tetracyklin-afhængig promoter upstream for disse gener. De genmodificerede museembryonale stamceller får lov at udvikle sig til EB. Herfra isoleres celler, der dyrkes i kulturer sammen med OP9-stroma-celler. De hæmopoietiske celler isoleres via deres udtryk af proteiner og injiceres i mus, der dels er im-

1020 Humane embryonale stamceller dyrkes på muse-feeder layer tilsat vækstfaktor bevirker udtryk af alkalisk fosfatase samt SSEA-4 samt markører for hæmopoietisk væv. Colony-forming unit-assay viser ingen funktionel hæmopoietisk progenitor-funktion. Embryoid body (EB) udviklet fra hes-cellerne dyrkes på 4 forskellige måder (BMP-4 og eller cytokiner). Via sammenligning mellem de 4 grupper vurderes at det hovedsageligt er cytokiner, der medfører dannelse af hæmopoietisk væv. De fremdyrkede CD45- og CD34-positive celler svarer til celler fra embryonets aorta. Lysmikroskopi: karakteristisk morfologi. Det er usikkert, hvorvidt cytokinerne stimulerer differentiering af hes til hæmopoietisk væv. Måske stimuleres overlevelse og udvikling af ukendte precursor-celler, og blodcellerne er således ikke et produkt af stamcelledifferentiering. hes på MEF Tilsat bfgf EB tilsat hæmopoietiske cytokiner EB tilsat hæmopoietiske cytokiner og BMP-4 Alkalisk fosfatase samt SSEA-4? hes Udtryk af CD34, CD45, c-kit og AC133? hæmopoietisk væv Colony-forming test som er negativ EB tilsat BMP-4 EB i spontan differentiering Hæmopoietisk cytokiner => hæmopoietisk væv. BMP-4 øger cellernes replikationspotentiale Fig. 1. Kontrolleret uddiferentiering til Hæmopoietisk væv. munsupprimerede og desuden har fået udslettet deres knoglemarv. Cellernes evne til at bosætte sig og danne nye celler undersøges ved flowcytometri, antistofmærkning mod overfladeproteiner og morfologisk mikroskopisk undersøgelse. Mod forventning viser det sig, at kun celler der udtrykker HoxB4, forbliver funktionelle i dyrene. Celler isoleret fra disse dyr kan endog transplanteres videre til nye dyr, hvilket bekræfter evnen til langtids selvfornyelse. Forsøget viser altså, at aktivering af HoxB4-genet i embryonale hæmopoietiske precursor-celler er afgørende for disse cellers evne til at fungere som transplantat. Yderligere anvises en ny protokol for, hvordan museembryonale stamceller kan udvikles til hæmopoietiske precursor-celler, der også efter transplantation er ophav til alle blodets celletyper (6). Hvorvidt lignende forhold er gældende for humane embryonale stamceller, må afklares ved den videre forskning. Et senere studie arbejder med to hescellelinjers differentiering til hæmopoietiske celler (Fig. 1). De 2 hes-cellelinjer navngivet H1 og H9 dyrkes indledningsvis på muse-feeder layer (MEF) tilsat basisk fibroblastvækstfaktor (bfgf), som fremmer en udifferentieret vækst. Cellerne tester positiv for alkalisk fosfatase-aktivitet, samt udtryk af SSEA-4, hvilket verificerer, at de er hesceller. Endvidere registreres en lille ekspression af CD34, CD45, c-kit og AC133 fire markører for hæmopoietisk væv. Dette indikerer tilstedeværelse af hæmopoietiske celler, hvilket kan sløre det endelige forskningsresultat. Hvis der i disse kulturer findes en tidlig hæmopoietisk progenitorcelle, kan en endelig kulturs eventuelle evne til at producere blodceller måske skyldes faciliteret vækst af denne progenitor-

1021 Fig. 2. Perifere blodcellers uddifferentiering fra knoglemarven. celle. For at udelukke en sådan fejlkilde måler man cellernes evne til koloniserende vækst, dvs. cellernes funktionelle progenitor-funktion, hvilken vurderes ikke at være eksisterende. Cellerne overføres nu til skåle hvor de skal udvikles til EB. Der etableres 4 forskellige medier til EB s vækst: EB I et medie tilsat hæmopoietiske cytokiner EB i et medie tilsat bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) EB i et medie tilsat hæmopoietiske cytokiner og BMP-4 EB der får lov spontant at differentiere uden påvirkningsstoffer Cellerne dyrkes i 15 dage, hvorefter de sammenlignes mht. deres hæmopoietiske potentiale. Eftersom cellerne allerede inden denne behandling havde et lille udtryk af CD45, CD34, c-kit og AC133, markører for forskelligt hæmopoietisk væv, måler man stigningen i denne ekspression for at sammenligne de fire behandlingsformer. Der registreres en stigning i ekspression af CD45 og CD34. Dette kan skyldes, at behandlingen primært faciliterer differentiering af celler med en CD45+CD34+-fænotype, svarende til phenotypen af de tidligst udviklede hæmopoietiske celler, som udgår fra embryonets aorta. Via sammenligninger mellem de 4 behandlingsformer vurderer man, at det hovedsageligt er de hæmopoietiske cytokiner, der i et specifikt tidsrum medierer differentiering af hes til hæmopoietiske progenitores. At cytokinerne virker i et speci fikt tidsrum, er velkendt fra dyreforsøg. BMP-4 virker hovedsaligt ved at øge disse progenitor-cellers evne til at replicere sig selv, hvilket testes ved subkultivering af cellerne enkeltvis.

1022 Disse progenitor-cellers videre hæmopoietiske modning undersøges morfologisk via lysmikroskopi. Cellerne viser karakteristisk morfologi for makrofager, granulocytter, eutrocytter, makrocytter og megakariocytter. Den udviklede progenitor-celle kan altså danne multiple hæmopoietiske cellelinjer. Via forskellige undersøgelser forsøger forskerne at forstå cytokinernes virkningsmekanisme. En tilbundsgående forståelse opnår man ikke, men det vurderes, at cytokinerne virker på 1 af de 2 følgende måder: Cytokinerne inducerer differentiering af hes-celler til hæmopoietiske precursorceller Cytokinerne inducerer hæmopoietisk udvikling af endnu ukendte precursors, som udvikles meget tidligt i EB (7). Sandsynligheden for denne tolkningsmulighed søgtes nedbragt ved ovenfor nævnte efterprøvning af de oprindelige kulturers evne til koloniserende vækst. Det seneste forsøg dokumenterer cytokiner og BMP-4 s afgørende indvirkning på hesdifferentiering til hæmopoietiske celler. Fremtidig forskning sigter mod at afklare cytokinernes virkningsmekanisme samt endeligt at afgøre, om det er hes eller precursors, der er ophav til de dannede hæmopoietiske celler. Endvidere skal hæmopoietiske celler fra mennesker funktionelt testes samt afprøves i dyreforsøg. Embryonale hæmopoietiske stamcellers potentielle anvendelser et talrige. Disse celler kan genetisk manipuleres, transplanteres og dermed anvendes som angrebsceller mod sygdomme og tumorer. Hos organtransplanterede patienter kan hes-celler medføre øget tolerance for det nye væv. I forbindelse med transplantation af væv deriveret fra pluripotente stamceller er det overordentlig vigtigt at sikre sig mod formation af godartede tumorer, såkaldte teratomer. Disse kan potentielt opstå fra celler i transplantatet, som ikke er fuldt differentieret, eller fra celler som reverserer til et mindre differentieret men mere pluripotent stadie (8). I dag fungerer evnen til teratomdannelse efter injektion i mus som en markør for multipotente stamceller. Dette forhold siger noget om, hvor centralt et problem vi her arbejder med. En løsning på dette problem er en forudsætning for udviklingen af en praktisk anvendelig behandling. Teratomdannelse I 2003 publicerede en forskergruppe et arbejde omhandlende teratomproblematikken samt stamcellers evne til transplantation. Via allogen transplantation af genmodificerede embryonale stamceller til en abes foster udforskedes stamcellernes evne til at interagere og tendens til at danne teratomer efter transplantation. Allogen transplantation vil sige, at de transplanterede

1023 cellers genom adskiller sig fra recipientens gener, men cellerne stammer fra en abe af samme race som recipienten. Forskerne påpeger selv, at andre tidligere har undersøgt humane cellers evne til at interagere efter transplantation i fostre på forskellige dyrearter. Dette studie udmærker sig ved at være det første, hvor man transplanterer primate embryonale celler til en anden primat, og herefter registrerer tumordannelse. Embryonale stamceller fra aben genmanipuleredes til at udtrykke GFP-genet, et grønt flusorescens-protein. Denne manipulation udøves enten via en vektor indeholdende GFP-genet eller via et GFP-udtrykkende plasmid. Cellerne blev herefter kultiveret i minimum en måned på et museembryonalt feeder layer, inden man via flowcytometri testede deres udtryk af GFP. Via ultralydsvejledning transplanteredes cellerne til lever eller abdominal kavitet i abefoster. De 4 drægtige aber, der anvendes til forsøget, var i slutningen af deres første trimester. Fordelen ved at transplantere cellerne til et foster er flere. Fostrene har endnu ikke et immunforsvar, der kan angribe de transplanterede celler, hvilket muliggør transplantationen uden brug af immunsuppression. Endvidere vokser fostre hurtigt, hvorved der skaffes plads til transplantatets vækst. Efter 1 måned forløstes 3 af fostrene ved kejsersnit, hvorimod det fjerde foster først forløstes efter 3 måneder. Fostrenes væv blev findelt, DNA fra cellerne blev ekstraheret og undersøgtes via PCR for tilstedeværelsen af GFP. Celler udviklet fra de transplanterede stamceller kunne registreres i varierende koncentration i mange af fostrenes forskellige væv. Fordelingen af cellerne varierede mellem de enkelte dyr. Cellerne fandtes enkeltvis og uadskillelige fra det omkringliggende værts væv. Dette forhold er udtryk for, at cellerne evner at interagere og udvikle sig i samspil med det omkringliggende væv. I den abeunge, som blev forløst efter 3 måneder, fandt man en teratomrelateret tumor. Den cystiske formation, man fandt i thoraxhulen, kan ikke egentlig betegnes et teratom, fordi den hovedsageligt bestod af epiteliale celler. Tumoren er dog med sikkerhed udviklet fra de transplanterede celler, da celler herfra koder for GFP-proteinet. Forskerne mener, at tumoren muligvis kan være opstået i thoraxkaviteten som følge af en sivning af celler ind i dette hulrum. Celler, der ikke kan modtage de rigtige signaler fra det omkringliggende væv, kan udvikle sig ukontrolleret og muligvis danne sådanne tumorer. Endvidere påpeges den mulighed, at de andre 3 fostre også potentielt kunne udvikle teratomer men ikke nåede det i løbet

1024 af den første måned. Hos mus har man således registreret teratomer udviklet efter 9 til 12 uger (9). Man har længe vidst, at stamceller transplanteret til mus kan danne teratomer og dermed celler fra alle tre kimlag. Dette arbejde er dog det første, der dokumenterer dannelse at tumorvæv efter allogen transplantation til en primat. Således bestyrker det forventningen til, at også humane embryonale stamceller efter transplantation i fremtiden vil kunne interagere og udvikle sig under påvirkning fra modtagervæv. Endelig understreger dette arbejde endnu en gang, hvor fundamentalt et problem teratomformationen er i forbindelse med transplantation af stamceller. Endnu evner vi ikke fuldt ud at kontrollere cellernes udvikling, ej heller at forstå de påvirkninger, der in vivo spiller ind på deres udvikling til tumorceller. Forsøget understreger, hvor uforudsigelige konsekvenserne af små påvirkninger er. Teratomdannelse er en blandt mange udfordringer, vi må overvinde, før vi når en sikker stamcellebaseret transplantationsterapi. Interessekonflikter: ingen angivet. litteratur 1. Larsen JF, Skajaa K, Westergaard JG. Obstetrik, 2. udgave 2002: 22 3. 2. Pfendler KC, Kawase E. The potential of stem cells. Obstet Gynecol Surv 2003; 58: 197 208. 3. Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001. Kapitel 4. 4. Kirschstein R, Skirboll LR, Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001. Kapitel 5. 5. Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, Auerbach R, Thomson JA. Haematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. PNAS 2001; 98: 10716 21. 6. Daley GQ. From embryos to embryoid bodies generating blood from embryonic stem cells. Annals of the York Academy of Sciences 2003; 30: 122 31. 7. Chadwick K, Wang L, Li L, Menendez P, Murdoch B, Rouleau A et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. The American Society of Hematology 2003; 102: 906 15. 8. Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001. Kapitel 10. 9. Asano T, Ageyama N, Takeuchi K, Momoeda M, Kitano Y, Sasaki K et al. Engraftment and tumor formation after allogeneic in utero transplantation of primate embryonic stem cells. Transplantation 2003; 76: 1061 7.