EULISA Cardiolipin IgM

Brugsanvisning EULISA Cardiolipin IgM Anvendelse Enzym-immunoassay til bestemmelse af IgM- autoantistoffer rettet mod Cardiolipin Micro titration 96 wells Store kit at +2-8 C For in vitro diagnostic use only Document No. E-23-0210-01 DK January, 2013 EULISA Cardiolipin IgM DANSK 212896 96

Indhold 1. Introduktion og baggrund 2. Advarsler og forholdsregler 3. Testens principper 4. Kittets indhold 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger 6. Opbevaring af kittet 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 9. Evaluering og kvalitetskontrol 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger 11. Produkt karakteristik 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenitet af bindingskapacitet 11.5. Linearitet 11.6. Præcision 11.7. Frekvensfordeling af CL/ß2-GP-1-Ab (IgM)11.8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 12. Garanti 13. Symboler 14. Henvisninger 15. Resumé-flowdiagram 15. Summary flow chart Produktet, der er beskrevet heri, er blevet fremstillet i overensstemmelse med Direktiv om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik 98/79/EF. 1

1. Introduction and background Anti-phospholipid syndrom (APS) er en autoimmun sygdom, som kan omfatte kliniske tilstande såsom venøs og arteriel trombose, trombocytopeni, myokardieinfarkt, rekurrerende spontan abort og neurologiske komplikationer (1, 2, 3). Cardiolipin (CL) er det mest almindelige, negativt ladede, sure phospholipid. Autoantistoffer korreleret med APS er ikke kun rettet mod CL og lignende phospholipider, men også mod phospholipid/protein-komplekser. ß2- glycoprotein 1 (ß2-GP-1; = apolipoprotein H) er blevet identificeret som et sådant naturligt og essentielt co-antigen for CL-autoantistoffer (4, 5). Forekomsten af CL/ß2-GP-1 autoantistoffer er associeret med en tendens til tromboser (3). Udover denne diagnostiske signifikans anses disse antistoffer for at være direkte involveret i patogenesen af APS (6, 7). Den nuværende enzym-koblede immunosorbent analyse (ELISA) er beregnet til kvantitativ eller kvalitativ bestemmelse af IgM antistoffer i human serum rettet mod CL/ß2-GP-1. Det immobiliserede antigen er en højrenset præparation af CL isolated från bovine og native ß2-GP-1. Testen er hurtig (inkubationstid 30 / 30 / 30 minutter) og fleksibel (delelig fast fase, reagenser, der er parat til brug). Seks kalibratorer standardiserer de kvantitative målinger; en negativ og en positiv kontrol sikrer analysens gyldighed. 2. Advarsler og forholdsregler Testkittet er kun beregnet til in vitro diagnostisk brug og ikke til indvortes eller udvortes brug til mennesker eller dyr. Reagenserne må ikke anvendes efter deres udløbsdato. Det anbefales stærkt, at denne protokol følges. Prøvebuffer, kalibratorer og kontroller indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Vaskebufferen indeholder bromonitrodioxan og konjugatet methylisothiazolon / bromonitrodioxan som konserveringsmiddel. Substratet indeholder 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid (H2O2). Stop-opløsningen, 0,5 M svovlsyre (H2SO4), er sur og ætsende. De ovennævnte reagenser kan være toksiske, hvis de indtages. Følg rutinemæssige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. Undgå al kontakt med kroppen, brug handsker og øjenbeskyttelse. Hvis en reagens 2

kommer i kontakt med hud eller slimhinder, skal der skylles grundigt med vand. Der må aldrig pipetteres med munden. Skal bortskaffes på en måde, der er i overensstemmelse med nationale/lokale forordninger. Natriumazid kan reagere med bly- og kobbervandrør og danne eksplosive metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre ophobning af azid. Kalibratorerne og kontrollerne indeholder materialer af human oprindelse. They have produced negative results when tested for Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, hepatitis B overflade (HBs)-antigen, HIV 1/2-Ab og hepatitis C Virus (HCV)-Ab, i FDA godkendte eller Europæisk direktiv 98/79/EFoverensstemmende tests. Ingen kendte tests kan imidlertid garantere, at produkter, der er afledt fra humant blod, ikke vil være infektiøse. De skal derfor håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agenser og bortskaffes på behørig måde. Der henvises til CDC (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andre lokale/nationale retningslinjer for laboratoriesikkerhed og dekontamineringsprocedurer. 3. Testens principper Den faste fases brønde er belagt med CL and ß2-GP-1. På denne overflade vil de følgende immunologiske reaktioner finde sted: 1. reaktion: CL/ß2-GP-1-specifikke antistoffer i prøven vil binde sig til det immobiliserede antigen og danne antigen-antistof komplekset. Herefter vaskes de ikke-bundne prøvekomponenter væk fra den faste fase. 2. reaktion: Et andet antistof, der er rettet mod humane IgM-antistoffer og konjugeret med horseradish- (peberrod) peroxidase (HRP), tilsættes. Dette konjugat binder sig til komplekset. Herefter vaskes overskydende konjugat væk fra den faste fase. 3. reaktion: Det enzymmærkede kompleks omdanner et farveløst substrat til et blåt produkt. Graden af farveudvikling afspejler koncentrationen af CL/ß2-GP-1 -antistoffer (IgM) i prøven 3

4. Kittets indhold a. 1 mikrobrøndsplade belagt med CL/ß2-GP-1 og hermetisk indpakket i en folielaminatpose sammen med en pose med tørremiddel. Pladen består af 12 strimler, der hver kan afrives til 8 individuelle brønde. b. Prøvebuffer, 100 ml, parat til brug, orange farve. Indeholder tris-bufferet saltvand (TBS), bovin serumalbumin (BSA), Tween og natriumazid. c. Vaskebuffer, 100 ml, 10x-koncentrat, blå farve. Indeholder TBS, Tween og bromonitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml hver0-3,0-8,0-18 - 45 and 100 MPL-U CL/ß2-GP-1 antibodies (IgM) / ml, parat til brug, gradvist blåfarvet. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. e. Negativ og positiv kontrol, 2,0 ml hver, parat til brug, henholdsvis grøn og rød. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. f. Anti-humant IgM HRP-konjugat, 14 ml, parat til brug, rød farve. Bufferet opløsning, der indeholder stabiliserende protein, methylisothiazolon og bromonitrodioxan. g. Substratopløsning, 14 ml, parat til brug, farveløs. Indeholder en bufferet opløsning af TMB og H2O2. Indeholdt i et hætteglas, som lys ikke kan trænge igennem. 4

h. Stop-opløsning (0,5 M H2SO4), 14 ml, farveløs, parat til brug. Forsigtig: svovlsyre er ætsende. i Brugsanvisning j. Batch-specifikt analysecertifikat 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger a. Demineraliseret eller destilleret vand b. Måleglas, 1000 ml c. Rør til prøvefortynding (overførselsrør i mikrobrøndspladeformat anbefales) d. Pipetter til 10, 100 og 1000 µl (1- og 8-kanals pipetter anbefales) e. Mikrobrøndsplade-vaskeapparat (valgfri) f. Mikrobrøndsplade-fotometer udstyret med et 450 nm filter g. ELISA evalueringsprogram (anbefalet) 6. Opbevaring af kittet Kittet skal opbevares ved 2-8 C. Det er stabilt op til den udløbsdato, der er anført på boksens mærkat. Kittet må ikke anvendes efter dets udløbsdato. 7. Reagens- og prøvepræparation / prøvekrav Man må ikke ombytte eller sammensætte tilsvarende komponenter fra forskellige kits på grund af mulige forskelle på forsendelses- eller opbevaringsbetingelser. 5

a. Før posen med den faste fase åbnes, skal den først nå op på stuetemperatur. Tag alle mikrobrøndene ud af rammen og put dem øjeblikkeligt tilbage i posen, sammen med posen med tørremiddel. Genforsegl posen hermetisk og opbevar den i køleskab til fremtidig brug. b. Fortynd vaskebuffer 10x-koncentratet (100 ml, blå) med 900 ml demineraliseret vand. Bland grundigt. Den fortyndede buffer er stabil i adskillige uger, hvis den opbevares i køleskab (2-8 C). c. Klargøring af prøver: Patientprøver skal håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agens. Klargør sera i henhold til normale laboratorieteknikker og fortynd dem 1/100, fx 10 µl serum + 990 µl prøvebuffer. Bland grundigt. For at opnå hurtig dispensering under analyseproceduren anbefales det, at kalibratorer, kontroller og prøver i mikrobrønd-overførselsrør klargøres. Dette gør det muligt, at anvende en 8-kanals pipette under analyseproceduren. Hvis prøver ikke analyseres med det samme, skal de opbevares ved 2-8 C og analyseres indenfor 3 dage. For længere opbevaring anbefales -20 C eller derunder. Gentagen nedfrysning og optøning af sera skal undgås. Optøede prøver skal blandes inden de fortyndes. Prøvekrav: Stærkt lipæmiske, hæmolyserede eller mikrobielt kontaminerede sera kan forårsage fejlagtige resultater og skal undgås. 8. Analyseprocedure 8.1. Manuel udførelse Før analysen startes skal alle kittets komponenter være nået op stuetemperatur (23 ± 3 C). For at opnå de bedste resultater, dvs. det maksimale forhold mellem specifikt og baggrundssignal, er omhyggelig vask afgørende (trin a, c og e). Det er yderst vigtigt, at vaskeopløsningen fjernes fuldstændigt. Det gøres ved at tappe pladen resolut på adskillige lag absorberende servietter. Automatiserede vaskeapparater skal verificeres i henhold til resultater, der opnås med manuel vask. a. Umiddelbart før brug skal den faste fase vaskes én gang: fyld brøndene med 350 µl vaskebuffer hver, lad brøndene gennembløde i 10 sekunder og fjern vaskebufferen. 6

b. Dispensér kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå), kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver hurtigt i mikrobrøndene; 100 µl pr. brønd. Dobbeltbestemmelser anbefales. Inkubér pladen i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). c. Vask brøndene 4 gange som i trin a. d. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) konjugatet (14 ml, parat til brug, rød); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. e. Gentag vasketrin c. f. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) substratopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs, sort hætteglas); 100 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. Da substratet er lysfølsomt skal intens lyseksponering (fx direkte sollys) undgås under inkubation. g. Dispensér hurtigt (helst med en 8-kanals pipette) stopopløsningen (14 ml, parat til brug, farveløs. Forsigtig: ætsende!); 100 µl pr. brønd. Brug den samme sekvens som for substratet. Farven skifter fra blå til gul. Ryst pladen, helst på en orbitalryster, i ca. 10 sekunder. h. Aflæs øjeblikkeligt absorbansen i mikrobrøndsplade-fotometeret ved 450 nm. Opbevar de resterende reagenser i køleskab (2-8 C), hvis de skal bruges igen. 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Dette produkt er blevet valideret til brug med Dynex DS2 automatiseret ELISA system. En behørig programfil til analyseudførelse og -evaluering kan fås ved anmodning. Dette programs parametre er kun et forslag, og det kan være nødvendigt, at operatøren tilpasser dem til den faktiske analyses krav. Vi har generelt forsøgt, at holde os så tæt som muligt på protokollen for den manuelle udførelse, som beskrevet ovenfor. På grund af den nødvendigvis forhøjede temperatur inden i DS2 har det været nødvendigt at forkorte substratinkubationsperioden. Punkt 11.8. viser en sammenligning af analyseresultater opnået ved manuel udførelse og ved brug af DS2 ELISA systemet. 7

9. Evaluation and quality control Kvantitativ evaluering: De fremkomne data evalueres kvantitativt med standardkurven, som vist nedenfor. Den viste kurve tjener imidlertid kun som illustration. Den kan ikke erstatte målingen af kalibratorerne sammen med kontrollerne og de faktiske prøver. Kurven er blevet konstrueret med et konventionelt ELISA evalueringsprogram, der anvender en 4- parameterfunktion. Spline-approksimationen er ligeledes passende 2500 2000 Dynex DS2 --x----x-- manual op. --o----o-- mod 450nm 1500 1000 500 0 1 10 100 MPL-U / ml 0511FE00.FED/StdKurveV1310J Hvis computer-understøttet evaluering ikke er mulig, kan standardkurven tegnes i hånden. Det muliggør transformation af en prøves absorbansværdi til dens koncentration, dvs. til MPL-U CL/ß2-GP-1-antistoffer (IgM) pr. ml serum. Kvalitativ evaluering: Testen kan også evalueres på en kvalitativ måde. Dette kræver kun måling af den positive kontrol. Det anbefales ikke desto mindre at måle og undersøge den negative kontrol (se nedenfor: kvalitetskontrol). I kvalitativ testevaluering sammenlignes prøvernes absorbans med grænseabsorbansen (= cut-off). Den bestemmes ved brug af den følgende formular: absorbans gränse = absorbans positiv kontrol x faktor Faktoren varierer for forskellige kit batches og er anført på det batchspecifikke analysecertifikat, der er inkluderet med hvert enkelt test-kit. Eksempel 8

absorbans positiv kontrol = 1250 mod faktor = 0,35 absorbans grænse = 1250 mod x 0,35 = 438 mod For at få indtryk af, hvor positiv en bestemt prøve er for CL/ß2-GP-1-Ab (IgM)), kan man beregne forholdet ved hjælp af formlen: forhold = absorbans prøve / absorbans grænse Eksempel: Absorbans grænse = 438 mod absorbans prøve = 1480 mod forhold = 1480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontrol: Den positive og negative kontrol kontrollerer analysens gyldighed. Deres autoriserede værdier og acceptable områder er anført på det batch-specifikke analysecertifikat. Kontrollernes værdier skal falde indenfor de angivne områder, hvis de ikke gør, er analysens resultater ugyldige. 10. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger Baseret på målinger af en gruppe af sera fra bloddonorer og en gruppe af positive sera (se nedenfor), foreslår vi for vurderingen af patient-sera: kvantitativ evaluering kvalitativ evaluering MPL-U CL/ß2-GP-1 Ab ratio (IgM) pr. ml serum normalt (negativt) område < 5,0 < 0, 0,87 cut-off 6,0 1,00 tvetydigt område 5,0-7,2 0,87-1,16 positivt område > 7,2 > 1,16 Disse specifikationer gives kun som en indikation; for at kontrollere enhver analyses nøjagtighed bør der altid inkluderes parallelprøver af normal sera. Et negativt testresultat indikerer, at patienten ikke har et forhøjet niveau af IgMantistoffer mod CL/ß2-GP-1. Hvis kliniske tegn på APS ikke desto mindre observeres, kan yderligere anti-nukleære antistoffer måske blive bestemt 9

Et positive testresultat indikerar APS. Prøver, der udviser resultater mellem de ovenfor anførte grænser, skal betragtes som dobbelttydige og rapporteres som sådan. Det anbefales, at endnu en prøve indsamles to uger senere og køres parallelt med den første prøve for at dokumentere en mulig ændring i antistof-titer. Som med alle serologiske tests skal resultaterne fortolkes i lyset af patientens symptomer og andre diagnostiske kriterier. 11. Produkt karakteristik 11.1. Standardisation Testen er standardiseret med en renset serum-præparation, der indeholder IgG-antistoffer, der specifikt er rettet mod CL/ß2-GP-1. Denne præparation er blevet kalibreret overfor for ("Harris sera"; Louisville APL Diagnostics Inc., Louisville, KY, USA). Graden af prøvereaktivitet måles i internationale enheder MPL units (MPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgM)/mL serum). 1 MPL-U/mL motsvarar till antistoff bindning kapacitet av 1 µg/ml solution av IgM antistoff-purified från standard serum. Graden af prøvereaktivitet måles i internationale enheder (GPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgG)/ml serum). 11.2. Analytisk specificitet Testen muliggør specifik bestemmelse af humane IgM-antistoffer rettet mod CL/ß2-GP-1 11.3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) Detektionsgrænsen er defineret som den koncentration, der svarer til middelabsorbansen af prøvebuffer plus 3-fold standardafvigelse (s). Den blev bestemt som < 0,5 MPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgM) per ml serum (n = 24). Anbefalet måleområde: 2-100 MPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgM) pr ml serum. 11.4. Den faste fases homogenitet Måling af den faste fases homogenitet er en regelmæssig kvalitetskontrol- (QC) del af hver enkelt produktionsbatch. Denne bestemmes ved en 288-fold måling af en IgG-positiv, men ikke-mættende prøve på 3 udvalgte plader. Acceptkriterie: mod-variationskoefficient (cv) over pladerne < 8%. Figuren nedenfor viser et repræsentativt uddrag (fast fase batchnr. 0809C) af sådan en analyse. 10

mod 450nm plate early (n/10) late (9n/10) row 7 8 9 10 11 12 7 8 9 10 11 12 mean cv% line a 1220 1225 1206 1208 1199 1186 1191 1128 1133 1147 1177 1195 1185 2,7 line b 1184 1215 1187 1214 1177 1204 1172 1103 1146 1149 1165 1169 1174 2,7 line c 1203 1209 1184 1194 1181 1177 1166 1134 1138 1145 1200 1175 1176 2,2 line d 1234 1217 1172 1198 1204 1201 1211 1133 1174 1117 1185 1191 1186 2,8 line e 1201 1235 1219 1201 1215 1207 1183 1152 1191 1134 1208 1186 1194 2,4 line f 1188 1219 1208 1202 1203 1200 1169 1135 1184 1191 1227 1189 1193 2,0 line g 1190 1213 1215 1227 1202 1175 1165 1107 1183 1164 1219 1197 1188 2,8 line h 1197 1227 1212 1228 1231 1209 1174 1078 1164 1157 1223 1208 1192 3,7 mean 1202 1220 1200 1209 1202 1195 1179 1121 1164 1151 1201 1189 1186 cv% 1,4 0,7 1,4 1,1 1,4 1,1 1,3 2,1 1,9 1,9 1,9 1,0 2,7 line a line b line c line d line e line f line g line h 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 mod 450nm 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 7 8 9 10 11 12 7 8 9 10 11 12 early / late plate, row no. 0511FE00.FED/FphHomV1310J 11

MPL-U / ml 11.5. Linearitet For at vurdere testens dosis-respons forhold blev positive sera målt i seriel 2- fold fortynding. Acceptkriterie: lineær regression af 4 på hinanden følgende fortyndinger skal give en korrelationsfaktor > 0,98. Et typisk resultat er vist nedenfor. 60 45 30 serum 1 serum 2 serum 3 lin.regr.1 lin.regr.2 lin.regr.3 15 0 0 200 400 600 800 1000 nl serum / well 0511FE00.FED/LinearV1310J 11.6. Præcision For vurdering af testens præcision blev variabiliteten af resultater under de følgende forhold bestemt: a. indenfor 1 analyse og mellem 3 analyser, b. mellem 3 operatører og c. mellem 2 kit-batches.. a. Intra- og inter-analysevariabilitet (n = henholdsvis 24 og 72) prøve middelværdi variability (cv, %) MPL-U/mL intra-assay inter-assay 1 8,8 2,6 3,1 2 18 5,6 6,1 3 47 3,0 3,6 12

b. Operatør til operatør-variabilitet (n = 12) prøve middelværdi variability MPL-U/mL (cv, %) 1 10 2,9 2 19 5,9 3 51 5,9 c. Variabilitet mellem 2 kit-batches (n = 6) prøve middelværdi variability MPL-U/mL (cv, %) 1 8,3 6,8 2 19 6,1 3 45 7,8 11.7. Frekvens-distribution af CL/ß2-GP-1-Ab (IgM) Denne blev analyseret for en gruppe af sera fra bloddonorer, der var ligeligt fordelt mht. køn og alder, og for en gruppe af sera, der var fundet positive for Sm-autoantistoffer i henhold til en CE-kompliant reference-elisa. Den følgende distribution af analyten blev observeret: blood donor sera positive sera n: 160 n: 32 middelværdi: 2,3 MPL-U/mL mean: 55 MPL-U/mL middelværdi: + s: 5,2 MPL-U/mL mean - s: 20 MPL-U/mL middelværdi:+ 2s: 8,2MPL-U/mL mean - 2s: < 0 MPL-U/mL median: 1,7 MPL-U/mL median: 46 MPL-U/mL 95 th percentile: 4,5 MPL-U/mL 5 th percentile: 21 MPL-U/mL ROC-analyse af disse data blev brugt til at bestemme cut-off som 6,0 MPL- U/mL (7). De her præsenterede data indikerer en diagnostisk specificitet og sensitivitet for ELISA'en på henholdsvis ca. 98 % og næsten 100 %. Disse værdier gælder kun for de målte sera; andre grupper kan give andre resultater 13

<1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 relative frequency (% <1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 relative frequency (% blood donor sera 20 15 cut-off 10 5 0 MPL-U/mL positive sera 20 15 10 cut-off 5 0 MPL-U/mL 0511FE00.FED/HäufgPlotV1310J 14

Dynex DS2 (MPL-U/mL) 11.8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Variabilitet: Ved brug af prøve fra den samme kit-batch blev variabiliteten af analysens resultater sammenlignet mellem manuel udførelse og Dynex DS2 automatiseret ELISA system: manuel udførelse Dynex DS2 intra-analyse variabilitet mean cv = 1,6 % mean cv = 3,0 % (n = 16) inter-analyse variabilitet mean cv = 1,9 % mean cv = 4,2 % (n = 48) Standardkurve: vist i punkt 9 Korrelation: 40 30 y = 0,933 x r = 0,996 20 10 0 0 10 20 30 40 manual operation (MPL-U/mL) 0511FE00.FED/KorrDynexDS2-V1310J 15

12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterer, at det leverede produkt er blevet testet grundigt for at sikre, at dets egenskaber, som specificeret heri, er opfyldt. Der ydes ingen yderligere garantier. De data, der er præsenteret her, blev indhentet ved brug af den anførte procedure. Enhver procedure-modifikation kan påvirke resultaterne og Euro Diagnostica AB vil i så tilfælde fraskrive sig alle garantier, hvad end de er udtrykkelige, underforståede eller lovbefalede. Euro Diagnostica AB vil ydermere ikke acceptere noget ansvar for skader, hvad end de er direkte, inddirekte eller efterfølgende opståede som følge af ubehørig brug eller opbevaring af produktet. 13. Symboler Bestillingsnummer Batchkode Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests In vitro diagnostisk medicinsk anordning CE-overenstemmelsesmærkning Må ikke udsættes for sollys 16

Temperaturgrænse Skal anvendes inden Forsigtig Biologiske risici Producent 14. Henvisninger 1. Gromnica-Ihle, E., and Schössler, W.: Antiphospholipid Syndrome. Int Arch Allergy Immunol 123 (2000), 67-76 2. Harris, E. N., et al.: Anticardiolipin antibodies: Detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet Nov 26 (1983), 1211-1214 3. Petri, M.: Epidemiology of the Antiphospholipid Antibody Syndrome. J Autoimm 15 (2000), 145-151 4. Galli, M., et al.: Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma cofactor. Lancet 335 (1990), 1544-1547 5. Matsuura, E., et al.: Anticardiolipin antibodies recognise ß2-Glycoprotein 1 structure altered by interacting with an oxygen modified solid phase surface. J Exp Med 179 (1994), 457-462 17

6. Shoenfeld, Y., et al.: Induction and treatment of the antiphospholipid syndrome - lessons from animal models. Eur J Clin Invest 31 (2001), 736-740 7. Pierangeli, S. S., et al.: Complement activation: a novel pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome. Ann NY Acad Sci 1051 (2005), 413-420 8. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 18

15. Summary flow chart a. Dilute the sera 1/100 in sample buffer (100 ml, ready-to-use, orange) and mix. b. Dilute the wash buffer 10x-concentrate (100 ml, blue) with water and mix. c. Wash the wells once with 350 µl wash buffer each. Dispense 100 µl of the calibrators (2,0 ml each, ready-to-use, gradually blue) and controls (2,0 ml each, ready-to-use, green and red) and of the diluted samples into the wells of the solid phase. Duplicate measurements are recommended. Incubate for 30 minutes at room temperature (23 ± 3 C). d. Wash the wells 4 times with 350 µl wash buffer each. e. Dispense 100 µl of the conjugate (14 ml, ready-to-use, green) into the wells. Incubate as in step c. f. Repeat washing step d. g. Dispense 100 µl of the substrate solution (14 ml, ready-to-use, black vial) per well. Incubate as in step c. Then, add 100 µl stop solution (14 ml, ready-to-use, colourless) per well and agitate the plate briefly. h. Immediately measure the absorbance at 450 nm. i. Quantitative evaluation: Determine the standard curve and, using this curve, transform the absorbance of the samples into their respective antibody concentration (MPL-U CL/ß2-GP-1-Ab (IgM)/mL serum). j. Qualitative evaluation: Determine the borderline absorbance by multiplying the absorbance of the positive control with the factor shown in the certificate of analysis. Then, calculate the ratio of the samples by dividing their absorbance by the borderline absorbance. 19

Gebrauchsanweisung EULISA Cardiolipin IgM Verwendungszweck Enzym-Immunoassay zum Nachweis von IgM-Autoantikörpern gegen Cardiolipin Mikrotitration 96 Kavitäten Kit bei +2-8 C lagern Nur für in vitro-diagnostische Anwendung Dokument No. E-23-0210-01 Januar 2013 EULISA Cardiolipin IgM English: page... 1 Deutsch: Seite... 20 212896 96 20

Inhalt 1. Einführung und Hintergrund 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen 3. Testprinzip 4. Inhalt des Testkits 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien 6. Aufbewahrung des Testkits 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben 8. Durchführung des Tests 8.3. Manuelle Durchführung 8.4. Dynex DS2 automatisches ELISA System 9. Auswertung und Qualitätskontrolle 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode 11. Testcharakteristika 11.1. Standardisierung 11.2. Analytische Spezifität 11.3. Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) 11.4. Homogenität der Festphase 11.5. Linearität 11.6. Präzision 11.7. Häufigkeitsverteilung von CL/ß2-GP-1-AK (IgM) 11.8. Manuelle Durchführung vs. Dynex DS2 automatisches ELISA System 12. Garantie und Haftung 13. Symbole 14. Literatur 15. Kurzanleitung Das hier beschriebene Produkt wurde in Übereinstimmung mit der IVD- Direktive 98/79/EG hergestellt. 21

1. Einführung und Hintergrund Das Antiphospholipid-Syndrom (APS) ist eine Autoimmun-Erkrankung, die sich klinisch auf unterschiedliche Weise manifestieren kann: in arteriellen und venösen Thrombosen, Thrombozytopenie, Herzinfarkt, habituellen Aborten oder neurologischen Komplikationen (1, 2, 3). Cardiolipin (CL) ist das verbreitetste negativ geladene, saure Phospholipid. Die mit APS assoziierten Autoantikörper sind nicht nur gegen CL und ähnliche Phospholipide gerichtet, sondern auch gegen deren Proteinkomplexe. ß2- Glycoprotein 1 (ß2-GP-1; = Apolipoprotein H) ist ein derartiges natürliches und essentielles Co-Antigen für CL-Autoantikörper (4, 5). Das Auftreten von CL/ß2- GP-1 Autoantikörpern geht einher mit einer Tendenz zu Thrombosen (3). Abgesehen von ihrer diagnostischen Bedeutung sind diese Antikörper offenbar auch direkt an der Pathogenese des APS beteiligt (6, 7). Der vorliegende Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) ist dazu bestimmt, Antikörper (IgM) gegen CL/ß2-GP-1 in menschlichem Serum quantitativ oder qualitativ zu bestimmen. Das immobilisierte Antigen ist ein Kombinations- Präparat aus Rinderherz-CL und hochgereinigtem natürlichem ß2-GP-1. Der Test ist schnell (Inkubationszeit 30-30-30 Minuten) und flexibel (teilbare Festphase, gebrauchsfertige Reagenzien). 6 Standards erlauben quantitative Messungen; eine negative und eine positive Kontrolle prüfen die Funktion des Testansatzes. 2. Sicherheitshinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der Test ist ausschließlich für die in vitro-diagnostik bestimmt; nicht für die interne oder externe Anwendung an Menschen oder Tieren. Die Reagenzien nicht über ihr Verfallsdatum hinaus verwenden. Es wird nachdrücklich empfohlen, das Protokoll genau einzuhalten. Probenpuffer, Standards und Kontrollen enthalten Na-Azid als Präservativ. Der Waschpuffer enthält Bromonitrodioxan als Präservativ, das Konjugat Methylisothiazolon / Bromonitrodioxan. Das Substrat enthält 3, 3', 5, 5'- Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die Stoplösung, 0,5 M Schwefelsäure (H2SO4), ist sauer und ätzend. Diese Reagenzien sind giftig, wenn sie aufgenommen werden. Daher müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung gefährlicher Chemikalien getroffen werden. Jeden Körperkontakt vermeiden, Handschuhe und Schutzbrille tragen. Sollte dennoch Haut (oder Schleimhaut) von einem Reagenz benetzt werden, die betroffene Stelle sofort mit viel Wasser abspülen. 22

Nicht mit dem Mund pipettieren. Die Reagenzien gemäß lokalen / nationalen Vorschriften entsorgen. Na-Azid kann mit Kupfer- und Bleirohren reagieren und explosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen mit Wasser nachspülen, um eine Akkumulation zu verhindern. Die Standards und Kontrollen enthalten Komponenten menschlichen Ursprungs. Sie wurden daraufhin geprüft, ob Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Ag, Hepatitis B-Oberflächen (HBs)-Ag und Antikörper gegen HIV 1/2 und Hepatitis C-Virus (HCV) vorliegen und zeigten negative Resultate; entweder in einem FDA-zugelassenen oder einem CE-konformen Test, entsprechend der Europäischen Richtlinie 98/79/EC. Allerdings kann kein Test garantieren, dass Material humanen Ursprungs tatsächlich nicht infektiös ist. Die Präparate sollten daher als potenziell infektiös behandelt und entsprechend entsorgt werden, gemäß CDC (Center of Diseae Control, Atlanta, USA)- oder anderen lokalen / nationalen Richtlinien zu Laborsicherheit und Dekontaminierung. 3. Testprinzip Die Kavitäten der Festphase sind beschichtet mit CL und ß2-GP-1. An dieser Oberfläche laufen die folgenden immunologischen Reaktionen ab: 1. Reaktion: CL/ß2-GP-1-spezifische Antikörper aus der Probe binden an das immobilisierte Antigen; es bildet sich der Antigen-Antikörper-Komplex. Nichtgebundene Probenbestandteile werden anschließend von der Festphase gewaschen. 2. Reaktion: Ein zweiter, gegen human-igm gerichteter und mit Peroxidase (HRP) konjugierter Antikörper wird zugesetzt. Dieses Konjugat bindet seinerseits an den Antigen-Antikörper-Komplex. Überschüssiges Konjugat wird anschließend von der Festphase gewaschen. 3. Reaktion: Der Enzym-markierte Komplex setzt ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt um. Das Ausmaß der Farbentwicklung spiegelt die Menge an CL/ß2-GP-1-Antikörpern (IgM) in der Probe wider. 23

4. Inhalt des Testkits a. 1 Mikrowell-Platte, beschichtet mit CL/ß2-GP-1 und hermetisch in einem Beutel aus laminierter Metallfolie verpackt, zusammen mit Trockenmittel. Die Platte besteht aus 12 Streifen, die sich jeweils in 8 Einzelkavitäten teilen lassen. b. Probenpuffer, 100 ml, gebrauchsfertig, orange gefärbt. Enthält Trisgepufferte Saline (TBS), bovines Serumalbumin (BSA), Tween und Na-Azid. c. Waschpuffer, 100 ml, 10x-Konzentrat, blau gefärbt. Enthält TBS, Tween und Bromonitrodioxan. d. 6 Standards à 2,0 ml, 0-3,0-8,0-18 - 45 und 100 MPL-U CL/ß2-GP-1- Antikörper (IgM) / ml, gebrauchsfertig, abgestuft blau gefärbt. Enthalten TBS, BSA, Tween und Na-Azid. f. Negative und positive Kontrolle, je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün bzw. rot gefärbt. Enthalten TBS, BSA, Tween und Na-Azid. f. Anti-human IgM HRP-Konjugat, 14 ml, gebrauchsfertig, grün gefärbt. Gepufferte Lösung mit stabilisierendem Protein, Methylisothiazolon und Bromonitrodioxan. g. Substrat, 14 ml, gebrauchsfertig, farblos. Enthält eine gepufferte Lösung von TMB und H2O2, abgefüllt in einem Licht-undurchlässigen Gefäß. 24

h. Stoplösung (0,5 M H2SO4), 14 ml, farblos, gebrauchsfertig. Vorsicht: Schwefelsäure ist ätzend. i. Gebrauchsinformation k. Chargen-spezifisches Analysen-Zertifikat 5. Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien a. Deionisiertes oder destilliertes Wasser b. Messzylinder, 1000 ml c. Reagenzröhrchen für die Probenverdünnung (Transfer-Röhrchen im Mikrowell-Plattenformat empfohlen) d. Pipetten für 10, 100 und 1000 µl (1- und 8-Kanalpipetten empfohlen) e. Mikrowell-Plattenwascher (optional) f. Mikrowell-Plattenphotometer mit 450 nm-filter g. ELISA Auswertungsprogramm (empfohlen) 6. Aufbewahrung des Testkits Der Testkit muss bei 2-8 C gelagert werden. Er ist bis zum Verfallsdatum einsetzbar, das auf dem Etikett der Verpackung angegeben ist; danach nicht mehr verwenden. 7. Reagenzien- und Probenvorbereitung / Anforderungen an die Proben Wegen möglicherweise unterschiedlichen Lagerungs- und Transport- Bedingungen dürfen korrespondierende Komponenten aus verschiedenen Kits nicht vermischt oder gegeneinander ausgetauscht werden. 25

a. Den Beutel mit der Festphase akklimatisieren lassen, erst dann öffnen. Die für den aktuellen Test evtl. nicht benötigten Kavitäten sofort aus dem Gitterrahmen nehmen und zusammen mit dem Trockenmittel in den Folienbeutel zurücklegen. Diesen hermetisch verschließen und bis zur künftigen Verwendung weiter gekühlt lagern. b. Das Waschpuffer-10x-Konzentrat (100 ml, blau) wird mit 900 ml deionisiertem Wasser verdünnt und gut durchmischt. Gekühlt bei 2-8 C ist diese Lösung für mehrere Wochen stabil. c. Präparation der Proben: Patientenseren als potenziell infektiös betrachten und entsprechend vorsichtig handhaben. Sie werden mit dem Probenpuffer 1:100 in Reagenzröhrchen verdünnt; bspw. 10 µl Serum + 990 µl Probenpuffer. Die Verdünnungen gut durchmischen. Zum schnellen Dispensieren während des Testablaufs empfiehlt es sich, Standards, Kontrollen und Proben in Transferröhrchen (Microwell-Format) vorzulegen. Dann kann mit einer 8-Kanal-Pipette gearbeitet werden. Proben, die nicht sofort analysiert werden können, müssen bei 2-8 C gelagert und innerhalb von 3 Tagen gemessen werden. Ist eine längere Lagerung vorgesehen, so müssen sie eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Aufgetaute Proben vor dem Verdünnen durchmischen. Anforderungen an die Proben: Stark lipämische oder hämolysierte Proben sowie mikrobiell verunreinigte Seren können falsche Ergebnisse liefern und sollten daher vermieden werden. 8. Durchführung des Tests 8.1. Manuelle Durchführung Bevor der Test gestartet wird, müssen alle Kitkomponenten Raumtemperatur (23 ± 3 C) angenommen haben. Um das bestmögliche Ergebnis (d.h. ein maximales Verhältnis zwischen spezifischem und Hintergrund-Signal) zu erreichen, ist sorgfältiges Waschen ganz wesentlich (Schritte a, c und e). Insbesondere ist es wichtig, die Waschlösung vollständig aus den Kavitäten zu entfernen. Dazu klopft man die Festphase auf Saugpapier aus. Automatische Wascher müssen daraufhin geprüft werden, ob ihre Ergebnisse mit denen vergleichbar sind, die mit manuellem Waschen erzielt werden. 26

a. Unmittelbar vor Testbeginn die Kavitäten einmal mit je 350 µl Waschpuffer füllen, ca. 10 Sekunden einwirken lassen und wieder entleeren. b. Je 100 µl der Standards (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, abgestuft blau), der Kontrollen (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün und rot) und der verdünnten Proben zügig in die Kavitäten pipettieren. Doppelbestimmungen werden empfohlen. Die Kavitätenplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. c. Die Kavitäten 4x wie in Schritt a waschen. d. Je 100 µl Konjugat (14 ml, gebrauchsfertig, grün) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt b. e. Waschschritt c wiederholen. f. Je 100 µl Substrat (14 ml, gebrauchsfertig, farblos, im schwarzen Gefäß) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt b. Das Substrat ist lichtempfindlich; direkte Belichtung (bspw. Sonnenlicht) während der Inkubation vermeiden. g. Je 100 µl Stoplösung (14 ml, gebrauchsfertig, farblos. Vorsicht ätzend!) zügig (am besten mit einer 8-Kanal-Pipette) in die Kavitäten pipettieren; in derselben Reihenfolge wie beim Substrat: Farbumschlag von blau nach gelb. Die Festphase für ca. 10 Sekunden vorsichtig agitieren, am besten auf einem Schüttler. h. Die Platte sofort im Mikrowell-Plattenphotometer bei 450 nm messen. Überschüssige Reagenzien weiter bei 2-8 C lagern, wenn sie später noch einmal verwendet werden sollen. 8.2. Dynex DS2 automatisches ELISA System Der Test wurde validiert für die Verwendung mit dem Dynex DS2-Automaten. Eine entsprechende Programmdatei für die Assay-Durchführung und Auswertung kann zur Verfügung gestellt werden. Die Parameter dieses Programms sind nur als Vorschlag zu verstehen und müssen evtl. vom Anwender an die Erfordernisse des aktuellen Tests angepasst werden. Generell haben wir versucht, so eng wie möglich am manuellen Protokoll (s.o.) zu bleiben. Allerdings musste die Substrat-Inkubationsdauer verkürzt werden wegen der zwangsläufig erhöhten Temperatur innerhalb des Geräts. Abschnitt 11.8. vergleicht Ergebnisse der manuellen Durchführung und des DS2 ELISA Systems. 27

9. Auswertung und Qualitätskontrolle Quantitative Auswertung: Die Messdaten werden anhand einer Standardkurve quantitativ ausgewertet. Die unten dargestellte Kurve kann jedoch nicht die Messung der Standards bei der Testdurchführung ersetzen, zusammen mit den Kontrollen und den aktuellen Proben. Sie dient lediglich als Modell. Die Kurve wurde von einem üblichen ELISA Auswertungsprogramm mit einer 4- Parameter-Funktion errechnet; die Spline-Approximation ist ebenso geeignet. 2500 2000 Dynex DS2 --x----x-- manuell --o----o-- mod 450nm 1500 1000 500 0 1 10 100 MPL-U / ml 0511FE00.FED/StdKurveV1310J Steht keine Rechner-gestützte Auswertung zur Verfügung, so zeichnet man die Standardkurve per Hand und liest an ihr die Antikörper-Konzentration in den Proben ab (MPL-U CL/ß2-GP-1-AK (IgM) / ml Serum). Qualitative Auswertung: Der Test kann auch auf qualitative Art ausgewertet werden. Dazu muss nur die positive Kontrolle gemessen werden; allerdings empfiehlt es sich, auch die negative Kontrolle zu messen (s.u.: Qualitätskontrolle). Bei der qualitativen Testauswertung wird die Absorption der Proben mit der grenzwertigen Absorption (= cut-off) verglichen. Diese errechnet sich folgendermaßen: Absorptioncut-off = Absorptionpositive Kontrolle x Faktor 28

Der Faktor hängt von der Kit-Charge ab und ist im Chargen-spezifischen Analysen-Zertifikat angegeben; dies liegt jedem Kit bei. Beispiel: Absorptionpositive Kontrolle = 1250 mod Faktor = 0,35 Absorptioncut-off = 1250 mod x 0,35 = 438 mod Um einen Eindruck zu gewinnen, wie hoch positiv eine bestimmte Probe an CL/ß2-GP-1-AK (IgM) ist, kann man ihre Ratio berechnen, nach der Formel: Ratio = Absorption Probe / Absorption cut-off Beispiel: Absorption cut-off = 438 mod Absorption Probe = 1480 mod Ratio = 1480 mod / 438 mod = 3,4 Qualitätskontrolle: Die positive und die negative Kontrolle dienen der Überprüfung des Tests. Ihre jeweiligen Sollwerte und akzeptablen Bereiche sind im Chargen-spezifischen Analysen-Zertifikat angegeben. Die Messwerte der Kontrollen müssen innerhalb der Toleranzgrenzen liegen; ansonsten sind die Ergebnisse des Tests nicht gültig. 10. Interpretation der Ergebnisse / Grenzen der Methode Auf der Basis einer Serienmessung von Blutspender- und Positiv-Seren (s.u.) schlagen wir für die Beurteilung von Patientenseren vor: Auswertung quantitativ qualitativ MPL-U CL/ß2-GP-1-AK Ratio (IgM) / ml Serum normaler (negativer) Bereich < 5,0 < 0,87 cut-off 6,0 1,00 grenzwertiger Bereich 5,0-7,2 0,87-1,16 positiver Bereich > 7,2 > 1,16 Diese Spezifikationen sind nur als Anhaltspunkt zu verstehen. Zu ihrer Überprüfung sollten in jedem Test Normalseren mitgeführt werden. 29

Ein negatives Ergebnis zeigt an, dass der Patient keinen erhöhten Titer an IgM- Antikörpern gegen CL/ß2-GP-1 aufweist. Sind jedoch charakteristische klinische Anzeichen des APS erkennbar, sollten IgG/IgA-Antikörper gegen CL und/oder ß2-GP-1 bestimmt werden. Ein positives Ergebnis sollte als Hinweis auf das APS interpretiert werden, wie eingangs ausgeführt. Proben mit grenzwertigen Resultaten sollten als zweifelhaft betrachtet und als solche berichtet werden. Es empfiehlt sich, nach etwa 2 Wochen eine weitere Probe zu messen, parallel mit der zuerst entnommenen, um eine mögliche Änderung des Antikörper-Titers zu erfassen. Wie bei jedem serologischen Test sollten dessen Resultate nicht isoliert interpretiert werden, sondern im Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten und anderen diagnostischen Kriterien. 11. Testcharakteristika 11.1. Standardisierung Der Test wird mit einem gereinigten Serumpräparat standardisiert, das spezifisch gegen CL/ß2-GP-1 gerichtete IgM-Antikörper enthält. Es wird seinerseits kalibriert an einem Satz kommerziell verfügbarer, graduell-positiver Seren ( Harris-Seren ; Louisville APL Diagnostics Inc., Louisville, KY, USA). Der Reaktivitätsgrad einer Probe wird in MPL-Einheiten (MPL-U CL/ß2-GP-1- AK (IgM)/mL Serum) angegeben. 1 MPL-U/mL entspricht der Antigen- Bindungskapazität einer Lösung mit 1 µg/ml IgM-AK, welcher aus dem Standardserum Affinitäts-gereinigt wurde. 11.2. Analytische Spezifität Der Test weist spezifisch humane IgM-Antikörper nach, die gegen CL/ß2-GP-1 gerichtet sind. 11.3. Nachweisgrenze (analytische Sensitivität) Die Nachweisgrenze ist definiert als diejenige Konzentration des Analyten, die dem OD-Mittelwert des Probenpuffers entspricht, zu dem die 3-fache Standardabweichung (s) addiert wurde. Sie wurde zu < 0,5 MPL-U CL/ß2-GP- 1-AK (IgM)/mL Serum bestimmt (n = 24). Empfohlener Messbereich: 2-100 MPL-U CL/ß2-GP-1-AK (IgM)/mL Serum. 30

11.4. Festphasen-Homogenität Dieser Parameter ist regulärer Bestandteil der QC jeder Produktions-Charge. Die Homogenität wird bestimmt durch 288-fache Messung einer positiven, aber nicht sättigenden Probe auf 3 ausgewählten Platten. Akzeptanz-Kriterium: mod-variationskoeffizient (VK) über die Platten < 8%. Die folgende Abbildung zeigt einen repräsentativen Auszug einer solchen Analyse (Ch.-Bez. der Festphase: 2103F). Platte früh (n/10) spät (9n/10) Spalte 7 8 9 10 11 12 7 8 9 10 11 12 Zeile a 1220 1225 1206 1208 1199 1186 1191 1128 1133 1147 1177 1195 1185 2,7 Zeile b 1184 1215 1187 1214 1177 1204 1172 1103 1146 1149 1165 1169 1174 2,7 Zeile c 1203 1209 1184 1194 1181 1177 1166 1134 1138 1145 1200 1175 1176 2,2 Zeile d 1234 1217 1172 1198 1204 1201 1211 1133 1174 1117 1185 1191 1186 2,8 Zeile e 1201 1235 1219 1201 1215 1207 1183 1152 1191 1134 1208 1186 1194 2,4 Zeile f 1188 1219 1208 1202 1203 1200 1169 1135 1184 1191 1227 1189 1193 2,0 Zeile g 1190 1213 1215 1227 1202 1175 1165 1107 1183 1164 1219 1197 1188 2,8 Zeile h 1197 1227 1212 1228 1231 1209 1174 1078 1164 1157 1223 1208 1192 3,7 MW 1202 1220 1200 1209 1202 1195 1179 1121 1164 1151 1201 1189 1186 VK % 1,4 0,7 1,4 1,1 1,4 1,1 1,3 2,1 1,9 1,9 1,9 1,0 2,7 MW VK % Zeile a Zeile b Zeile c Zeile d Zeile e Zeile f Zeile g Zeile h 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 mod 450nm 31

MPL-U / ml mod 450nm 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 7 8 9 10 11 12 7 8 9 10 11 12 frühe / späte Platte, Spalte No. 0511FE00.FED/FphHomV1310J 11.5. Linearität Um die Dosis / Wirkungs-Beziehung des Tests zu bestimmen, wurden positive Seren in serieller Zweifachverdünnung gemessen. Akzeptanz-Kriterium: Die lineare Regression vierer sukzessiver Verdünnungen muss einen Korrelationsfaktor > 0,98 ergeben. Ein typisches Ergebnis ist hier abgebildet. 60 45 30 Serum 1 Serum 2 Serum 3 LinRegr1 LinRegr2 LinRegr3 15 0 0 200 400 600 800 1000 nl Serum / Kavität 0511FE00.FED/LinearV1310J 32

11.6. Präzision Um die Präzision des Tests zu ermitteln, wurde die Variabilität der Ergebnisse unter folgenden Bedingungen ermittelt: a. innerhalb eines Assays und zwischen 3 Assays, b. zwischen 3 Anwendern und c. zwischen 2 Kit-Chargen. a. Intra- und Inter-Assay Variabilität (n = 24 bzw. 72) Probe Mittelwert (MW) Variabilität (VK, %) MPL-U/mL intra-assay inter-assay 1 8,8 2,6 3,1 2 18 5,6 6,1 3 47 3,0 3,6 b. Operator-zu-Operator Variabilität (n = 12) Probe MW Variabilität MPL-U/mL (VK, %) 1 10 2,9 2 19 5,9 3 51 5,9 c. Variabilität zwischen 2 Kit-Chargen (n = 6) Probe MW Variabilität MPL-U/mL (VK, %) 1 8,3 6,8 2 19 6,1 3 45 7,8 11.7. Häufigkeitsverteilung von CL/ß2-GP-1-AK (IgM) Diese wurde bestimmt in einem Blutspender-Serenkollektiv, gleichmäßig nach Alter und Geschlecht verteilt, und einem Serenkollektiv, das in drei verschiedenen, CE-konformen Referenz-ELISAs positiv gefunden worden war. Folgende Verteilung des Analyten wurde beobachtet: 33

<1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 relative Häufigkeit (% <1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 11,8-13,9 16,4-19,3 22,8-26,8 31,6-37,3 43,9-51,8 61,1-72 84,8-100 relative Häufigkeit (% Blutspender-Seren 20 15 Cut-Off 10 5 0 MPL-U/mL Positiv-Seren 20 15 10 Cut-Off 5 0 MPL-U/mL 0511FE00.FED/HäufgPlotV1310J 34

Blutspender-Seren positive Seren n: 160 n: 32 MW: 2,3 MPL-U/mL MW: 55 MPL-U/mL MW + s: 5,2 MPL-U/mL MW - s: 20 MPL-U/mL MW + 2s: 8,2 MPL-U/mL MW - 2s: < 0 MPL-U/mL Median: 1,7 MPL-U/mL Median: 46 MPL-U/mL 95. Perzentile: 4,5 MPL-U/mL 5. Perzentile: 21 MPL-U/mL Mittels ROC-Analyse dieser Daten wurde der cut-off des ELISAs zu 6,0 MPL- U/mL bestimmt (8). Aus den hier gezeigten Daten ergibt sich eine diagnostische Spezifität und Sensitivität des Tests von 98 bzw. annähernd 100 %. Diese Werte gelten nur für die gemessenen Seren; andere Kollektive können abweichende Ergebnisse erzielen. 11.8. Manuelle Durchführung vs. Dynex DS2 automatisches ELISA System Variabilität: Mit Testkits aus einer einzigen Produktions-Charge wurde die Variabilität der Assayergebnisse verglichen zwischen manueller Durchführung und dem automatischen DS2 ELISA System: manuelle Durchführung Dynex DS2 intra-assay Variabilität mittl. VK = 1,6 % mittl. VK = 3,0 % (n = 16) inter-assay Variabilität mittl. VK = 1,9 % mittl. VK = 4,2 % (n = 48) Standardkurve: abgebildet in Abschnitt 9 35

Dynex DS2 (MPL-U/mL) Korrelation: 40 30 y = 0,933 x r = 0,996 20 10 0 0 10 20 30 40 manuelle Durchführung (MPL-U/mL) 0511FE00.FED/KorrDynexDS2-V1310J 12. Garantie und Haftung Euro Diagnostica AB garantiert, dass das ausgelieferte Produkt gründlich getestet wurde, um sicherzustellen, dass es seine Spezifikationen erfüllt und der hier gegebenen Beschreibung entspricht. Weitergehende Garantien werden nicht gegeben. Die hier genannten Testcharakteristika wurden mit der angegebenen Methode ermittelt. Jede Änderung der Methode kann die Ergebnisse beeinflussen. In einem solchen Fall verweigert Euro Diagnostica AB jede Haftung, ob ausgesprochen, impliziert oder gesetzlich. Darüber hinaus kann Euro Diagnostica AB keinerlei Haftung für Schäden übernehmen, die aufgrund einer unkorrekten Lagerung oder Anwendung des Produktes entstanden sind; direkt, indirekt oder als Konsequenz. 36

13. Symbole Artikelnummer Chargencode Ausreichend für <n> Prüfungen In-vitro-Diagnostikum Conformité Européenne Von Sonnenlicht fernhalten Temperaturbegrenzung Verwendbar bis Achtung Biologische Risiken 37

Hersteller 14. Literatur 1. Gromnica-Ihle, E., und Schössler, W.: Antiphospholipid Syndrome. Int Arch Allergy Immunol 123 (2000), 67-76 2. Harris, E. N., et al.: Anticardiolipin antibodies: Detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet Nov 26 (1983), 1211-1214 3. Petri, M.: Epidemiology of the Antiphospholipid Antibody Syndrome. J Autoimm 15 (2000), 145-151 4. Galli, M., et al.: Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma cofactor. Lancet 335 (1990), 1544-1547 5. Matsuura, E., et al.: Anticardiolipin antibodies recognise ß2-Glycoprotein 1 structure altered by interacting with an oxygen modified solid phase surface. J Exp Med 179 (1994), 457-462 6. Shoenfeld, Y., et al.: Induction and treatment of the antiphospholipid syndrome - lessons from animal models. Eur J Clin Invest 31 (2001), 736-740 7. Pierangeli, S. S., et al.: Complement activation: a novel pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome. Ann NY Acad Sci 1051 (2005), 413-420 8. Sommer, R., und Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 38

15. Kurzanleitung a. Die Seren 1/100 in Probenpuffer (100 ml, gebrauchsfertig, orange) verdünnen und durchmischen. b. Das 10x-Konzentrat des Waschpuffers (100 ml, blau) mit Wasser verdünnen und durchmischen. c. Die Kavitäten der Festphase einmal mit je 350 µl Waschpuffer waschen. Dann je 100 µl der Standards (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, abgestuft blau), der Kontrollen (je 2,0 ml, gebrauchsfertig, grün bzw. rot) und der verdünnten Proben in die Kavitäten pipettieren. Doppelbestimmungen sind zu empfehlen. 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ± 3 C) inkubieren. d. Die Kavitäten 4x mit je 350 µl Waschpuffer waschen. e. Je 100 µl des Konjugats (14 ml, gebrauchsfertig, grün) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt c. f. Waschschritt d wiederholen. g. Je 100 µl des Substrats (14 ml, gebrauchsfertig, in einem schwarzen Fläschchen) in die Kavitäten pipettieren. Inkubieren wie in Schritt c. Dann je 100 µl Stoplösung (14 ml, gebrauchsfertig, farblos) zusetzen und die Platte kurz schütteln. h. Sofort die Absorption bei 450 nm messen. i. Quantitative Auswertung: Die Standardkurve ermitteln und anhand dieser Kurve die Absorption der Proben in ihre jeweilige Antikörper-Konzentration (MPL-U CL/ß2-GP-1-AK (IgM)/mL Serum) umformen. j. Qualitative Auswertung: Die grenzwertige Absorption ermitteln, indem die Absorption der positiven Kontrolle mit dem Faktor multipliziert wird, der im Analysen-Zertifikat angegeben ist. Dann die Ratio-Werte der Proben berechnen, indem ihre Absorption durch die grenzwertige Absorption dividiert wird. Internal file id._ver.-no. / date of issue: 0511FE60_1301M.FWD.doc / January 13, 2013 39