SPEKTRUM FYSIK C. HIV det omvendte liv

SPEKTRUM FYSIK C Artiklen her er skrevet af Lise Fog Wichmann og Niels Henrik Würtz og den er sponsoreret af Aarhus Amt i forbindelse med et efteruddannelsesprojekt i det Naturvidenskabelige Grundforløb efteråret 2004 / foråret 2005. HIV det omvendte liv HIV og AIDS side 2 Cellen og arvematerialet side 4 Immunforsvar og T-celler side 6 HIV og nanoskala side 7 HIV s livscyklus side 9 HIV s kønnede formering side 12 Hvordan undgår HIV kroppens immunforsvar? side 14 HIV s overlevelse i kroppen side 15 Overlevelse på sigt side 17 Teknologier side 17 Perspektiver side 21 Opgaver side 21 Diskussioner side 23 Øvelser side 24 Artiklen her knytter sig til kapitel 2, Stof Illustrationer: Ebbe Sloth Andersen Forlaget har forsøgt/forsøger at finde frem til alle rettighedshavere i forbindelse med brug af billeder. Skulle enkelte mangle, vil de ved henvendelse til forlaget blive betalt, som om aftale var indgået. GYLDENDAL 2005 1

HIV - det omvendte liv På verdensplan er der i dag (2004) knapt 40 millioner HIVsmittede. To tredjedele af verdens smittede bor i Afrika syd for Sahara. Hvor epidemien er værst, er op imod 40 % af hele landets befolkning HIV-smittede. I Afrika er AIDS den primære dødsårsag og på verdensplan er den nummer fire. HIV står for Human Immuno deficiency Virus, og den er ansvarlig for sygdommen AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrome). AIDS blev beskrevet i 1981 da den brød ud blandt homoseksuelle mænd i USA. I 1983 blev det påvist at sygdommen skyldes HIV. HIV ligner genetisk set en abevirus. Man regner derfor med, at HIV er en mutation af denne. For mennesker er sygdommen dødelig efter ca. fire år, hvis den ikke behandles. Den tilsvarende sygdom hos aber er ikke dødelig. Der er to hovedtyper af HIV - type 1 og type 2. Type 1 er den mest udbredte og den værste. Type 2 kendes stort set kun i Vestafrika. Figur 1 Antallet af HIV-smittede. Værst ser det ud i Afrika syd for Sahara. Der findes ca. 2/3 af de smittede på verdensplan. 2

I det følgende gennemgås viruset HIV og sygdommen AIDS først overordnet. Derefter vil vi bevæge os ned på nano-niveau for at forklare de mekanismer, der gør HIV til en virus, der truer med at udslette store dele af Jordens befolkning. En nanometer er 1/1000.000.000 meter (en milliarddel meter). Det svarer til ca. 10 atomer. Nanoteknologien beskæftiger sig med ting i størrelsesordnen nanometer, hvilket typisk er store molekyler. Figur 2 Procentdelen af HIV smittede i afrikanske lande. Botswana er det land i Afrika, hvor flest er smittet med HIV. Knap 40 % (2001) af den samlede befolkning på 1,6 millioner er smittet. Det forventes, at den gennemsnitlige levealder i Botswana år 2010 vil være ca. 26 år. Det spiller en stor rolle for landets fremtid. Dels nedbrydes infrastrukturen, og dels tabes kulturen og den viden, som normalt bliver overført fra generation til generation. Da der ikke er råd til at holde den traditionelle begravelsesfest for familie og venner, efterlades de døde i vejgrøfter og i skove. En både socialt og sundhedsmæssigt uholdbar situation. HIV og AIDS HIV spredes med kropsvæsker fra et individ til et andet ved sex, amning, blodtransfusion og brug af inficerede kanyler. Da smitten oftest spredes ved sex, kaldes AIDS en kønssygdom. Man regner med, at risikoen for smitte ved hver seksuel kontakt er fra 0,5 % til 10 % med den største risiko ved analt samleje. Virus spredes ikke ved kys og almindelig kropskontakt. Sygdommen betegnes som langsom, da der går lang tid fra man smittes, til sygdommen giver sig til kende med AIDS til følge. En til seks uger efter smittetidspunktet mærker den smittede ofte virusangrebet som en kraftig influenza. I løbet af et par uger falder sygdommen til ro igen, og man mærker ikke væsentlige gener, før den egentlige AIDS kommer i udbrud. Der er dog hele tiden virus i blodet og i kropsvæskerne, så man kan smitte andre, og man er således det, der kaldes rask smittebærer. I denne periode ved man typisk ikke, at man har AIDS. Det kan gøre det vanskeligt at undgå spredning af sygdommen. AIDS rammer kroppens immunforsvar. Det betyder, at man mister det biologiske forsvar, som kroppen har mod almindelige, ellers harmløse, sygdomme. Antistofferne er immunforsvarets våben mod indtrængende vira. Det var indtil for nylig på baggrund af antistofferne, at man stillede diagnosen HIV-smittet. Nu er man blevet i stand til at måle direkte på HIV. I starten af infektionen reagerer kroppens immunforsvar ved at danne antistoffer mod HIV i blodet. Dette er med til at holde sygdommen nede. Diagnosen AIDS stilles på baggrund af følgesygdommene sammen med en positiv HIV-test. 3

Forebyggelse og behandling af HIV og AIDS Ved samleje beskytter man sig mod sygdommen ved at bruge kondom. Det er et alvorligt problem, at denne mulighed ikke udnyttes tilstrækkeligt i Afrika. Det skyldes dels økonomi, dels kulturen. Den katolske kirke med paven og biskopperne i spidsen tordner mod prævention. Dertil kommer, at analt samleje i Afrika er særligt almindeligt som en form for prævention, men der er smitterisikoen større end ved almindeligt samleje. Uvidenhed og overtro spiller også en afgørende rolle. Fx er det en udbredt myte, at en mand med AIDS kan helbredes ved at have sex med en jomfru. Den AIDS-medicin, man har på nuværende tidspunkt, virker på to forskellige måder. Dels forsøger man bl.a. ved hjælp af nanoteknologi at udvikle medicin til at blokere for kopieringen af HIV inde i kroppens celler. Dels søger man ved AIDS i udbrud at holde følgesygdommene nede. Det er dog karakteristisk, at medicinen har begrænset effekt. Den kan indtil videre kun beskytte mod udviklingen af sygdommen i kroppen, ikke fjerne HIV fra de celler, der allerede er inficeret. Desuden har HIV en særlig udtalt evne til at blive resistent overfor den medicin, man tager. Kroppens naturlige immunforsvar spiller fallit i forhold til sygdommen AIDS. Faktisk er det tabet af immunforsvaret, der er årsagen til, at AIDS er en dødelig sygdom. Men hvorfor er det, at HIV kan undgå en lang række af kroppens naturlige forsvarsmekanismer? Det vil vi se på ved at bevæge os ned på nanoskala og beskrive HIV s opbygning og livscyklus. For at forstå dette, er det vigtigt med et vist kendskab til de celler, HIV angriber. Derfor præsenteres i det følgende først en oversigt dels over de normale celler og dels immunforsvaret med vægt på T-celler. Cellen og arvematerialet Cellen er biologiens byggesten, på samme måde som atomet er kemiens. Der findes mange forskellige slags celler, men de er alle mere eller mindre opbygget på samme måde. Yderst findes cellemembranen, som afgrænser cellen mod dens omgivelser og regulerer, hvad der kommer ud af og ind i cellen. Cellen er fyldt med en væske, der kaldes cytoplasma. I cytoplasmaet findes de organceller (cellens organer), der er nødvendige for, at cellen kan overleve og formere sig, heriblandt cellekernen som indeholder arvematerialet. Kernen er omgivet af en dobbeltmembran kaldet kernemembranen. Cellemembran Cytoplasma Kernemembran Cellens arvemateriale (DNA) Figur 3. Illustration af cellen biologiens byggesten. 4

For at cellen kan formere sig, er den nødt til at have en opskrift på alle de ting, den har brug for i sin livscyklus. Denne opskrift er arveanlæggene, som i form af DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) findes i cellekernen. Opskriften skal bruges i cytoplasmaet, men DNA et opbevares i kernen (som en sikkerhedskopi), så der er behov for en budbringer, der kan bringe opskriften ud i cytoplasmaet. Denne budbringer er RNA (Ribose Nucleic Acid). Budbringer RNA'et kaldes messenger-rna eller mrna. I cytoplasmaet er cellen i stand til at oversætte RNA-opskrifterne til proteiner. Proteinerne er de værktøjer, cellen har brug for til sine livsprocesser. Når cellen formerer sig, kopierer den DNA et, så efterkommerne får de samme livsnødvendige opskrifter. Denne sammenhæng mellem DNA, RNA og protein kaldes biologiens centrale dogme. Figur 4. Biologiens centrale dogme. Når cellen skal deles, kopieres DNA et. Når cellen skal producere protein, skal DNA et først omskrives til RNA. Derefter skal RNA et oversættes til protein. Figur 5. DNA s opbygning. DNA er opbygget som en stige. Vangerne består af skiftevis sukker (S) og fosfat (F). Trinene består af baseparrene A-T og C-G. DNA er opbygget som et meget langt stigeformet molekyle. Vangerne i stigen består af skiftevis en sukkerenhed (deoxyribose) og en phosphatgruppe. På hver sukkerenhed sidder en base. I DNA findes 4 forskellige baser: Adenin (A) Thymin (T) Cytosin (C) Guanin (G) Figur 6. Mennesket er opbygget af celler. I celle-kernen findes arvematerialet (kromosomer). Kromosomerne er opbygget af lange DNA-strenge. Ud fra DNA et dannes alle de proteiner, cellen har brug for. 5

Trinene i stigen dannes, når de to vanger bindes sammen vha. svage bindinger mellem baserne. Adenin (A) sidder altid overfor thymin (T) og cytosin (C) altid overfor guanin (G). I RNA skiftes T ud med U (uracil), mens resten af baserne er de samme som i DNA. RNA består kun af en enkelt streng. Når DNA skal oversættes til RNA spaltes de svage bindinger i midten af DNA-stigen, og den ene DNA-streng kopieres til en RNA-streng. Eksempel: Oprindelig DNA-streng: RNA-kopi af DNA et: A T C G G G C T A T C G G T A T U A G C C C G A U A G C C A U A Når cellen skal oversætte RNA-koden til protein aflæser den tre baser ad gangen. Hver triplet koder for en bestemt aminosyre. Aminosyrerne bindes sammen til lange kæder kaldet proteiner. Immunforsvar og T-celler Kroppens immunforsvar har bl.a. til opgave at holde infektioner (indtrængende bakterier eller vira) nede. Dertil har evolutionen udviklet et komplekst forsvarssystem, hvor T-celler spiller en central rolle. En særlig type T-celle har de såkaldte CD4- receptorer på overfladen, og det er disse CD4-celler, der er HIV s foretrukne værtscelle - den celletype HIV formerer sig i. I det følgende refererer T-celler til de T-celler, der har CD4- receptorer. Figur 7. Elektronmikroskopi- billede af en T-celle med de karakteristiske CD4- receptorer på overfladen (udposningerne). Ud over CD4-receptorerne er der receptorer, der sørger for genkendelsen af fremmedlegemer. Billedet er kunstigt farvet. De grønne prikker er HIV, der er ved at blive afsnøret fra T- cellen. 6

T-celler og biologiske nøgler T-celler dannes i knoglemarven og har til opgave at opspore og destruere fremmedlegemer i kroppen. Derfor er de på overfladen forsynet med et særligt sæt af receptorer, som kan opfattes som en slags biologiske låse, som fremmedlegemernes biologiske låse passer til. Da der findes mange forskellige fremmedlegemer i vores omgivelser, findes der også mange forskellige typer T- celler. Hver med en bestemt type biologiske låse på overfladen, så de kan opspore et fremmedlegeme med et bestemt biologisk udseende. Ud over disse låse til at opspore fremmedlegemer har T-cellerne også CD4-receptorerne. Dem bruger T-cellerne, når de har opsporet et fremmedlegeme og skal sørge for, at kroppen begynder at danne antistof. Det sker ved, at T-cellerne med fremmedlegemet bundet til sine biologiske låse forbinder sig med B-celler. B-celler er en anden type immunforsvarsceller, der også findes i stort antal i blodet. T-cellerne bruger CD4, når der etableres forbindelse med B-cellerne. I løbet af ca. tre døgn omdannes en B-celle til en såkaldt plasmacelle, der blot er en antistoffabrik. Dens eneste funktion er at danne så mange antistoffer, der kan angribe fremmedlegemerne, som muligt. CD4 er altså en kommunikationskanal, hvormed T-cellerne giver de tilsvarende B-celler besked på at producere en særlig type antistof. HIV har udviklet et sæt falske nøgler, der passer til CD4. Det giver dem uretmæssigt adgang til T-cellerne. Nøglerne består af et glucoprotein, der kaldes GP120, hvor GP står for Gluco Protein og de 120 svarer til molekylets masse i kilodalton (dalton er en molekylevægt enhed, 1D = 1 u = 1 g/mol). GP120-molekylerne vejer altså ca. 120.000 u. Med GP120-nøglerne, finder HIV automatisk sammen med værtscellerne. HIV på nanoskala HIV er ca. 100 nm i diameter. Det er en retrovirus, hvilket betyder, at dens arvemateriale findes som RNA og ikke DNA, som ved de fleste andre vira. Der findes to kopier af RNA'et i HIV - et fænomen, der har stor betydning for dens evne til at omgå kroppens immunforsvar, som vi skal se i det følgende. GP120 RNA (arvemateriale) Figur 8. Skitse af HIV Membran Proteinkappe 7

Omkring HIV s arvemateriale er der en indre proteinkappe, der bruges, når HIV skal bevæge sig fra værtscellens cytoplasma ind i cellekernen. Yderst er der en membran ligesom den, celler normalt er omgivet af. Ud gennem HIV-membranen stikker de særlige GP120-nøgler (HIV s falske nøgler). De har afgørende betydning både for HIV's vej ind i og ud af værtscellerne og for at HIV kan snyde kroppens immunforsvar. I praksis bruger HIV mange forskellige varianter af GP120. Denne mangfoldighed er en af hemmelighederne bag HIV's evne til at ændre udseende og til at inficere nye celler. Figur 9. Elektronmikroskopisk billede af HIV, farvet, så strukturerne bedre kan ses. Den aflange røde struktur i midten er den indre proteinkappe. Inden i denne findes bl.a. arvemassen i form af en dobbelt RNA-streng. Proteinkappen bruges, når arvemassen skal ind i værtscellens kerne. Yderst ses den gule membran, hvor igennem de grønne GP120 glukoproteiner stikker ud som kemiske nøgler. De er helt afgørende for, at HIV finder ind i de rigtige værtsceller i immunforsvaret. Inde i HIV findes, foruden selve arvematerialet, en mængde hjælpeværktøjer (proteiner), som skal bruges i HIV s livscyklus. Man kan opfatte hele virusen som en værktøjskasse, der er pakket til rejsen ind i værtscellerne og videre ud igen. Dels skal værktøjet bruges på vej ind i cellen, hvor HIVarvematerialet indføjes i værtscellens normale arvemateriale. Dels skal arvematerialet sørge for, at der foruden en kopi af HIV-arvematerialet også produceres nyt værktøj. Endelig skal det nye værktøj produceres på en sådan måde, at det af sig selv samles til en ny HIV med det rette værktøj, som så forlader værtscellen igen. 8

HIV's livscyklus Vi vil nu se på HIV s livscyklus. For at forstå denne, skal vi huske på, at værtscellerne er T-celler med de karakteristiske CD4- låse. HIV er en immunsygdom, fordi den kan benytte sig af disse låse til at finde og inficere sin vært. HIV GP120-nøgle Figur 10. HIV og T-cellen vist skematisk inden de bindes sammen. Det svarer til punkt a) i livscyklen beskrevet nedenfor. T-celle CD4-låse Cellekerne Figur 11a. HIV lige inden den møder en T-celle, der afpatruljerer kroppen for fremmedlegemer. Figur 11b. Når T-cellen møder HIV, vil HIV s GP120-nøgler passe i T-cellens CD4-låse, og HIV sætter sig fast. 9

Figur 11c. HIV er ikke en celle, som T- cellen forventer, at det er, og GP120- nøglerne binder sig til CD4 på en sådan måde, at de to celle-membraner bringes til at røre hinanden. De smelter sammen som to sæbebobler, og HIV er fusioneret med T-cellen. Figur 11d. HIV s membran sidder nu som en del af T-cellens membran, og HIV er kommet ind i T-cellens plasma. Her træder et særligt protein i aktion. Dette protein kaldes revers-transkriptase og er en del af HIV s værktøjskasse. Det laver en DNA-kopi af HIV s dobbelt-rna-streng. Denne proces kendes fra andre retrovira, men HIV's revers-transkriptase laver specielt mange fejl og er dermed helt afgørende for, at HIV muterer med en større hastighed end andre vira. HIV ændrer sig typisk så hurtigt, at kroppens antistofproduktion ikke kan følge med, og så hurtigt, at når der er fundet en medicin, bliver HIV hurtigt resistent overfor denne. Herom senere. Figur 11d Figur 11e. HIV transporteres aktivt ind i T-cellens kerne gennem kernemembranen. Kernemembranen har store porer, som normalt sørger for kontrolleret transport ind og ud af kernen. På proteinkappen har HIV nøgler. De passer til de store porer og åbner for transport af HIV ind i kernen. Figur 11f. Vel inde i T-cellens kerne træder endnu et medbragt protein - kaldet integrase - i aktion og indsplejser HIV s DNA-streng et vilkårligt sted i T-cellens arvemateriale. 10

Figur 11g. Som et led i T-cellens egen livscyklus kopieres DNA-arvematerialet til RNA. Sammen med cellens eget RNA dannes også HIV's RNA. I starten dannes små stykker RNA, som i cellens plasma danner det værktøj (de proteiner), HIV har brug for. Processen sætter også gang i produktionen af de GP120-nøgler, der skal stikke ud af T-cellens membran. Når værktøjet er produceret, signaleres tilbage til kernens DNA, at der skal dannes hele kopier af HIV-koden. Derved dannes arvematerialet til de næste HIV-kopier. Figur 11h. Præcis to kopier af RNAstrengen går sammen og arrangerer sig med de værktøjer (revers transkriptase, integrase, styreproteiner mm.), der skal være i HIV. Den indre proteinkappe dannes og søger ud til T-cellens ydre membran, hvor GP120-nøglerne er med til at bukke cellemembranen rundt om den nye HIV. Figur 11i. HIV løsriver sig fra T-cellen. Resultatet er den første kopi af den oprindelige HIV. HIV s arvemateriale kan kopieres lige så længe, T-cellen lever, idet HIV-arvematerialet befinder sig i T-cellens DNA. Det er kendetegnende for vira, at de benytter værtscellens kopieringscyklus til deres egen formering, men HIV gør det særligt effektivt. 11

HIV's kønnede formering Den kønnede formering hos dyr sker ved, at forældrenes gener forenes, når sædcellen smelter sammen med ægget. Derfor kommer halvdelen af vore gener fra vores mor og halvdelen fra vores far. Indtil nu har vi antaget, at HIV bærer to identiske RNA-strenge. Men nu skal vi se, at arvematerialet kan blandes som ved kønnet formering. Det kan ske, hvis en enkelt T-celle bliver inficeret af to forskellige HIV, som vi kalder X og Y. DNA-koden for både X og Y bliver placeret i T-cellens arvemateriale. Nu vil T-cellen producere RNA-arvemateriale for både X og Y. Når HIV skal pakkes med to RNA-strenge, er det tilfældigt om strengene kommer fra den samme eller to forskellige forældre. Ved kopiering af RNA til DNA (figur 11d) springer revers transkriptase fra den ene RNA-streng til den anden. Det betyder, at den nye DNA-kopi bliver et mix af de to RNA-kopier, og at det DNA, der nu sættes ind i T-cellens DNA, er en ny blanding af X og Y s arvemateriale. Men hvordan kan de to RNA-strenge hos HIV gå sammen, når de to strenge er ens - eller næsten ens - og ikke komplementære som ved DNA? 12

HIV har løst dette ved at indføje selvparrende sekvenser i RNAstrengen: fx GCGCGC eller GAGCUC. Eksemplerne er hentet fra HIV type 1. Parres to sådanne sekvenser (med den ene skrevet baglæns) fås: GCGCGC CGCGCG GAGCUC CUCGAG De to RNA-strenge matcher hinanden som to DNA-strenge ville gøre. Det kaldes en kysse-interaktion. Det er årsagen til at RNAsekvenserne finder sammen to og to, når HIV forlader T-cellen. De to strenge ligger parallelt inde i HIV, og hele RNA-strengen er spundet op i større og mindre løkker, så matchende sekvenser sidder overfor hinanden. Kysse-interaktionerne sidder for enden af sådanne løkker. Hvis man læser sekvensen af en kysseinteraktion og skifter RNA-streng på midten, har vi et palindrom. Det vil sige en sekvens, der er ens læst forfra og bagfra. Palindromer kendes også fra litteraturen: "Regitse i Lima fnisede da Baronesse Nora badede sin families tiger". GAGCUC GCGCGC Figur 12 De første 370 af HIV's 9000 baser hentet fra HIV type 1. På figuren er løkkerne alle vendt opad. I virkeligheden er det et tredimensionelt makromolekyle, hvor løkkerne stikker ud i alle retninger. Pilene angiver kysse-interaktionernes palindromer. 13

På inano, Aarhus Universitet har man undersøgt kysseinteraktionerne med et AFM-mikroskop. En overflade belagt med HIV-sekvenser ses i AFM-mikroskopet på figur 13. RNAstrengene ses lyse på billedet. Forsøget er af tekniske grunde udført med de 370 første af HIV's 9000 baser. Det er der, kysseinteraktionerne sidder. Den nyeste forskning i udvikling af medicin mod HIV tager udgangspunkt i kysse-interaktionerne. Ved at føre medicin ind i cellens cytoplasma søger man at fjerne muligheden for dannelse af kysse-interaktionerne (antisense). Derved mister HIV sin evne til at pakke arvematerialet og danne nye HIV. Man kan læse mere om HIV's kønnede formering i artiklen af Ebbe Sloth Andersen i Aktuel Naturvidenskab, november 2004. Figur 13 AFM billede af RNAdobbeltstrengene i HIV. På figuren til venstre ses en række karakteristiske loops. Et sådant loop er vist skematisk til højre i billedet. Et loop består af den dobbelte RNA-streng, der holdes sammen af to kysse-interaktioner i hver sin ende. De er vist med rødt på skitsen til højre. Hvordan undgår HIV kroppens immunforsvar? HIV s evne til at undslippe kroppens immunforsvar er, som beskrevet ovenfor, helt særegen. Sammenfattende kan vi sige, at HIV opnår dette på tre måder: HIV angriber de T-celler i kroppen, der normalt skal bruges til at tilintetgøre virus. Derved undgår HIV T- cellernes angreb. 14

Alle retrovira, det vil sige vira, hvor arvematerialet findes som RNA, har et tilhørende protein, reverse transkriptase, der sørger for, at RNA-koden omdannes til DNA inde i cellen. HIV muterer meget hurtigt, da reverse transkriptase hos HIV har en fejlrate så høj som en fejl for hver ca. 10.000 baser. I HIV 's RNA er der ca. 9.000 basepar, og det betyder, at HIV i gennemsnit muterer en gang pr. livscyklus. Det vil bl.a. give en hurtig forandring af de GP120-nøgler, kroppen skal lære at kende for at kunne nedkæmpe HIV. Derfor kan antistofferne, som er ca. 3 dage undervejs i produktion, ikke nå at slå sygdommen ud, inden den har ændret sig. Kroppens antistoffer er lavet, så de passer helt præcist til et bestemt fremmedlegeme og er derfor meget følsomme for selv små forandringer hos de fremmedlegemer, de skal forsvare kroppen imod. HIV har kønnet formering ligesom højerestående arter. HIV har to identiske, eller næsten identiske, kopier af RNA-strengen med arvematerialet. Det betyder, at der som hos dyr med kønnet formering er mulighed for at blande de arvelige egenskaber, som fx resistens mod medicin, fra to forskellige HIV. HIV s overlevelse i kroppen HIV udvikler sig kun langsomt til AIDS. Vi vil nu kigge nærmere på denne udvikling. Figur 14 Antallet af HIV-kopier pr. ml blod er vist med rødt på skalaen til venstre. Læg mærke til skalaen springer med en faktor 10. Antallet af T- celler pr.µl er vist med sort på skalaen til venstre. Præfixetµ betyder milliontedel eller 1/1.000.000. En µl er derfor 10-6 L. Bemærk, at tidsaksen har to forskellige inddelinger. Den i venstre side er i uger og den i højre side er i år. 15

Som det fremgår af figur 14 er antallet af HIV-kopier nogenlunde konstant (vær opmærksom på, at aksen springer med en faktor 10) fra få måneder efter infektionen, til man får AIDS. Til gengæld falder antallet af T-celler støt fra den 3. måned, til patienten dør. På et tidspunkt er antallet af T-celler faldet til så lav en værdi, at ellers harmløse infektioner, der normalt slås ned af T- cellerne, vokser ukontrollabelt og forårsager døden. Mængden af HIV stiger under almindelige infektionssygdomme. Det skyldes, at immunforsvaret under en infektion stimuleres til at forøge sin produktion af immunforsvarsceller. Det stimulerer tilsvarende produktionen af HIV. Af grunde, man endnu ikke har forstået, falder antallet af T-celler under sygdommen. Der kan være følgende forklaringer: Når T-cellerne bliver inficeret med HIV, begynder T- cellerne at klumpe sammen, da inficerede T-celler indeholder både nøgler og låse. Se figur 15. Når HIV's DNA sættes ind i T-cellernes arvemateriale, sker det et vilkårligt sted, fx midt i opskriften på et bestemt protein, og det er sandsynligt, at T-cellen vil gå til grunde på grund af det manglende protein. Produktionen af T-celler med CD4 i knoglemarven standser. Måske fordi knoglemarven bliver overbelastet. Det ser ud til, at de proteiner, som HIV bruger til at regulere sin egen livscyklus, påvirker værtscellernes livscyklus. Så i stedet for at producere flere T-celler, hvilket er i HIV s interesse, forstyrrer tilstedeværelsen af HIV kroppens naturlige produktion af T-celler. Figur 15 Sammenklumpede T-celler. Inficerede T-celler bærer på overfladen både CD4-låse og HIV s GP120- nøgler. Derfor kan de bindes sammen. AIDS er resultatet af nedbrydningen af kroppens T-celler, og af at produktionen af HIV er styret af immunforsvarets aktivitet. Et lavt antal T-celler bevirker, at kroppen ikke kan modstå ellers uskadelige infektioner. Når AIDS-infektionssygdommene indfinder sig, øges HIV-produktionen eksplosivt. Til sidst dør patienten af AIDS. 16

Overlevelse på sigt Omkring en femtedel af verdens befolkning har en gen-fejl - en mutation - på det ene gen for CD4. Fejlen bevirker, at T-cellernes CD4 ikke fanger HIV. Disse mennesker har en lavere følsomhed overfor HIV. Ca. 4 % af verdens befolkning har denne mutation på begge gener, hvilket betyder, at de stort set ikke smittes med HIV. I denne sammenhæng er der altså tale om en positiv genfejl. Man regner med, at den omtalte mutation er en følge af fortidige retrovirusangreb, hvor det har været afgørende ikke at kunne blive smittet. Hvis dette er rigtigt, kunne man forvente, at hvis HIV ikke bliver behandlet, og der ikke udvikles en kur mod HIV, så er det efterkommere af disse 4 % af befolkningen, der kommer til at føre de humane gener videre. Og så er mennesket faktisk blevet immun overfor HIV. Til gengæld kan HIV måske nå at mutere, så det ikke længere er T-celler med CD4, der skal forestå det ufrivillige værtskab, men en anden celletype. Kun en lille del af menneskets arvemateriale benyttes, resten anvendes ikke. Faktisk er otte procent af vores arvemateriale rester af tidligere tiders retrovira. Der er grund til at antage, at de med mellemrum har slået store dele af jordens liv ihjel. Kun de individer, der var immune, har ført generne videre. Det er helt naturligt, at gener muterer, men normalt sker det meget langsomt. Ved at undersøge antallet af mutationer, kan man beregne, hvor lang tid det er siden, det pågældende område af vores arvemateriale har været aktivt, og dermed hvornår virus epidemien har floreret. Mutationer kan opstå som resultat af fejl i kopieringen under DNA-syntesen, når cellerne skal dele sig, eller ved påvirkning udefra med fx kemiske stoffer eller radioaktiv stråling. Det er afgørende, om fejlene optræder i kønscellerne eller ej. Fejl i kønscellerne føres videre til efterkommerne, mens fejl uden for kønscellerne højst kan påvirke det individ, hvori de sker. Teknologier PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) anvendes, når den mængde DNA, man har til rådighed, er for lille til den undersøgelse, man vil lave. Teknikken er altså en kunstig måde at opformere DNA på. Man laver en reaktionsblanding der indeholder det relevante DNA fx HIV-DNA primere ( startere ) - korte enkeltstrengede DNA-stykker, der er designet til opformeringen af det pågældende DNA nukleotider DNA-byggestenene: A, T, C og G en varmestabil DNA-polymerase - et enzym der binder nukleotider sammen til DNA. 17

Denne blanding placeres i en PCR-maskine. PCR-maskinens funktion er at ændre temperaturen i et bestemt mønster kaldet en temperaturcyklus. Ved 94 C adskilles de to komplementære DNA-strenge Ved ca. 50 C (afhængigt af primeren) bindes primerne til det enkelt strengede DNA Ved 72 C kan polymerasen hæfte nukleotiderne sammen. Polymerasen skal have noget at hæfte det første nukleotid fast på, det er derfor, der skal tilsættes en primer. Nukleotiderne sættes sammen, så der dannes DNA-strenge, der er komplementære til den oprindelige. DNA-mængden er efter en temperaturcyklus blevet fordoblet. PCR-maskinen kører typisk ca. 30 cykler, og mængden af DNA fordobles altså ca. 30 gange. Dvs. at hvis man starter med ét enkelt stykke DNA, har man efter nogle timer ca. en milliard identiske stykker! qpcr qpcr (quantitative PCR) tager udgangspunkt i PCR-teknikken, som er beskrevet ovenfor. Ofte er man interesseret i at undersøge om, DNA-materialet indeholder bestemte DNA-sekvenser, fx HIV-DNA. Til denne brug udvikler man kunstige testsekvenser, der er komplementære til den DNA-sekvens, man vil undersøge. Testsekvensen konstrueres med den optiske egenskab, at den reagerer på lys ved at udsende lys (flourcens), når testsekvensen har bundet sig til den rigtige DNAsekvens. Hvis ikke den DNA-sekvens, man leder efter, findes I DNA-materialet, bindes testsekvensen ikke, og der udsendes ikke lys. Figur 16. Grafen viser den registrerede lysmængde fra opløsningens testsekvenser som funktion af antallet af PCR-cykler. Grafen viser én testsekvens, og forsøget er kørt med forskellige startmængder af den udvalgte DNA-sekvens. Nederst ses de benyttede startmængder. Startblandingen i PCR-maskinen tilføjes de relevante testsekvenser. Ved at følge lysintensitetens forøgelse fra cyklus til cyklus fås et billede af, mængden af de pågældende DNAsekvenser i DNAmaterialet. Ud fra antallet af PCRcykler kan man beregne hvor mange DNA-sekvenser, der var ved start. 18

Det er muligt at undersøge for tilstedeværelsen af flere forskellige DNA-sekvenser på en gang. Det sker ved at konstruere de forskellige testsekvenser, så de lyser med forskellige farver. Alle testsekvenserne tilsættes opløsningen med det DNA, der skal undersøges. Ud fra farven af lyset, kan man identificere testsekvenserne, og ud fra tidsudviklingen kan man beregne det oprindelige indhold af de enkelte DNA-sekvenser. DNA-sensorer DNA-sensorer bruges til at undersøge, om et arvemateriale indeholder bestemte DNA-sekvenser. Fx kan man undersøge, om en persons DNA indeholder HIV. Med en fotografisk teknik kendt fra elektriske chips, har man udviklet små flade guld-fjedre, som belægges med sekvenser af enkeltstrenget DNA. De er i den ene ende kemisk forbundet til guldfjederens overflade, og de fanger de komplementære DNAenkeltstrenge. Når dette sker, bøjer fjederen på grund af bindingen, og denne ændring registreres af nogle små elektriske sensorer. En enkelt chip indeholder fire DNA-sensorer, og der kan derfor ledes efter fire forskellige DNA-sekvenser samtidigt. Sensorerne kan fremstilles, så de passer til præcis de DNA-sekvenser, man er interesseret i. Der er en fin animation på firmaet Cantions hjemmeside: www.cantion.com (på forsiden vælges Animation: Nanomechanical sensors in action). I stedet for en elektrisk registrering af forekomsten af DNAsekvenser, findes også typer af DNA-sensorer, DNA-chips, der består af enkeltstrenget DNA placeret i felter på en overflade. På det DNA, der skal undersøges, sættes kemiske markører, der udsender lys (flourscens). Derefter ledes DNA-materialet hen over chippens felter. Hvis DNA-materialet er komplementært til chippens DNA, vil man kunne registrere lysudsendelse fra det pågældende felt. Hvis ikke, vil der ikke bindes DNA og dermed kemiske markører til chippen, og der vil ikke ses lysudsendelse. AFM AFM er et mikroskop, der forstørrer så meget, at man kan registrere de enkelte atomer i makromolekyler. AFM (Atomic Force Microscope) blev opfundet i 1986 af Binnig, Quate og Gerber. Mikroskopet fungerer ved, at en meget tynd spids monteret på en fjeder føres hen over den overflade, man vil undersøge. Afbøjningen af spidsen registreres med en laser-stråle. Billedet af den overflade, der undersøges, dannes ved en elektronisk gengivelse af afbøjningen hen over overfladen. Resultatet minder om et landkort, hvor man afsætter højdekurver og farver områderne alt efter landskabshøjden (se figur 13). 19

Spidsen er kun et enkelt atom bredt. Den styres elektronisk med en teknik, hvor man kan skanne hen over overfladen med en nøjagtighed på 0,01 nm samtidig med, at spidsens højdevariation registreres. Af praktiske grunde styres forløbet ved feed-back. Det vil sige, at fjederens krumning fastholdes, og i stedet flytter man hele holderen med fjeder og spids op og ned undervejs i takt med overfladevariationerne. Umiddelbart kunne det lyde som en klodset måde at danne en højdekurve på, men der er afgørende fordele: Man kan måle på molekylerne uden at skade dem, fordi spidsens tryk kun udgør ca. 1/10 af kraften mellem atomerne. Variationerne kan måles med 0,01 nanometers nøjagtighed. Det svarer til ca. 1/10 atoms udstrækning. Apparatet virker i vand og andre naturlige omgivelser for biologisk materiale. Mikroskopet kan måle på neutrale emner. Det er derfor ikke nødvendigt først at gøre materialet elektrisk ledende, som ved scanning elektronmikroskopet. En proces, der kan ødelægge biologisk materiale. Figur 17 Den blå spids føres hen over den grønne overflade ved hjælp af den sorte holder. Derved bøjer den cyklamefarvede fjeder, og dette registreres elektronisk. Holderen hæves eller sænkes i stedet for at fjederen bøjes. Efterhånden som spidsen føres hen over overfladen, dannes et elektronisk billede af den grønne overflade. Figur 18 AFM mikroskopet. Til venstre spidsen, som skanner hen over overfladen. Spidsen belyses af en laserstråle, som spejles op i detektoren, der måler lyset. I midten ses mikroskopet og til højre ses det forstørrede billede på computerskærmen. 20

Perspektiver I de 25 år, man har kendt til AIDS, er omkring 1 % af verdens befolkning enten døde på grund af AIDS eller blevet smittet med HIV. Der er udviklet medicin, som kan forlænge livet for HIVsmittede, men der er pt. lange udsigter til at finde en kur mod HIV og AIDS. På verdensplan ofres enorme ressourcer for at forske i sygdommen, og det er grunden til, at vi ved så meget om sygdommen, som vi faktisk gør. Forskningen foregår bl.a. på nanoteknologiske centre, hvor fagene biologi, fysik og kemi er smeltet sammen. Her giver forskningen et detaljeret indblik i HIV's forunderlige verden og afslører samtidigt en flig af den rige variation, evolutionen fremviser. Opgaver 1 - Mutationsrate HIV har en mutationsrate på 1 pr.10.000 basepar. Det giver i gennemsnit knap en mutation for hver ny HIV-kopi. I mennesket, som i alle andre levende væsner, kopieres DNA, umiddelbart før cellerne deler sig. Her er fejlraten ca. en fejl pr. 10 6 kopier af hele cellens arvemateriale. Sammenlign de to fejlrater, når det menneskelige genom består 9 af 3,2 10 basepar. Hvilke fordele og ulemper har HIV af mutationerne? Kunne man forestille sig, at mennesket kunne have fordel af en mutationsrate så stor som hos HIV? 2 - Hvor meget membran? Hver ny HIV-kopi snupper en bid af værtscellens ydre membran og gør det til en del af sin egen. T-celler er ca. 10.000 nm i diameter. Hvor mange HIV-kopier dannes der ud af en T-celle, før T-cellens ydre membran er brugt op, når vi antager, at T-cellen ikke fornyer sin membran undervejs? HIV er 100 nm i diameter. 3 - Hvor mange HIV? På grafen over mængden af HIV i blodet som funktion af tiden (figur 14) kan man aflæse tætheden af HIV i kropsvæskerne (blod, lymfe mm.). Hvor mange HIV er der i en person med 5 L kropsvæske, a) i perioden inden sygdommen udvikles til AIDS, og b) lige før personen dør af AIDS? Hvor stor en brøkdel af personens volumen udgøres af HIV? 21

4 - Hvor mange unit? HIV's GP120-nøgler vejer hver 120.000 u. Atomerne er opbygget af neutroner, protoner og elektroner. I atomkernen er der neutroner og protoner, der hver vejer 1 u. Elektronerne findes i en sky rundt om atomet. Elektronerne er negative, og protonerne er positive, og der er i et neutralt atom altid lige mange elektroner og protoner. Elektronernes masse er lille, så den ser vi bort fra her. Hvor mange neutroner og protoner er der tilsammen i GP120? I biologisk materiale, der hovedsageligt består af lette atomer, kan man regne med, at der er lige mange neutroner og protoner. Hvor mange elektroner er der i GP120? 5 - RNA og piberensere Et palindrom er en sekvens, der er ens læst forfra og bagfra, fx CGCCCCGC. Et antipalindrom er en sekvens, hvor den ene halvdel er modsat, så C er byttet ud med G og så A er byttet ud med U (og omvendt). Sekvensen CGCCGGCG er et antipalindrom. Forestil dig piberenserne som HIV's to identiske RNA-strenge. Mal to piberensere med samme mønster, og der skal indgå et antal antipalindromer undervejs. Vælg en farve til hver af baserne C,G, U og A. For at de skal binde i en kysse-interaktion, skal C binde til G og U binde til A. Læg de identiske piberenserne parallelt og se, om de er komplementære nogen steder. Fold piberenserne ved hvert antipalindrom. Læg de to piberensere parallelt, og dan loops ved hjælp af kysse-interaktioner der, hvor de matcher. 6 - Livets opståen Geologerne anslår ud fra fossilfund, at det tidligste liv er opstået for ca. 3,8 mia. år siden. Det er ca. 4,6 mia. år siden Solen og Jorden blev dannet. Hvor stor en del af tiden, siden Jorden blev skabt, har der været liv på Jorden? I artiklen http://www.forskning.no/artikler/2002/august/1029229591.42 er der oplysninger om nye fund i Grønland. Hvor meget rykker de nye fund ved beregningen? Hvor stor en del af denne tid har cellen været den biologiske byggesten? 22

Diskussioner 1 - Er HIV liv? Levende organismer kan formere sig og de kan dø. Diskuter om HIV er liv. 2 - Kirken og AIDS Den katolske kirke argumenterer mod sex før ægteskabet og mod anvendelsen af prævention. Diskuter betydningen af dette for spredningen af HIV. Diskuter også, om den katolske kirke har et medansvar for AIDS-epidemien. 3 - Er HIV et biologisk våben? Nobels Fredspris 2004 gik til den kenyanske kvinde Wangari Maathai. Ved flere lejligheder har hun udtalt, at "HIV er et biologisk våben, som vesten har udviklet for at udrydde sorte". Diskuter påstanden. 4 - Human virus og computervirus Sammenlign HIV med computervirus. Hvad svarer HIV og T-cellerne til i computerverdenen? Skitser en computervirus, der har HIV's egenskaber. Hvad betyder antallet af computere for sandsynligheden for at blive smittet og hastigheden, hvormed virussen udbredes? Hvad er de biologiske paralleller? Er der biologiske paralleller til computerverdenens internet? Er en computervirus liv? 5 - Tidlige teorier En tidlig teori fra 1980'erne forklarer AIDS med, at HIV dannes inden i T-cellerne og efterhånden fylder mere og mere. Når der bliver for meget HIV i den enkelte T-celle, brister den. Dermed mister kroppen sit immunforsvar, og patienten rammes af følgesygdommene med AIDS i udbrud til følge. Hvor meget rigtigt og hvor meget forkert er der i denne teori set med nutidens briller? 6 - Har HIV gavn af at slå sin vært ihjel? HIV er som andre sygdomme helt afhængig af sin vært i form af mennesket. HIV's "formål" er at formere sig og sprede sig så meget som muligt. Er det hensigtsmæssigt, at HIV slår sin vært ihjel? Forklar. Den abevirus, som man regner med, at HIV er en mutation af, er ikke dødelig for aber. Giv dit bud på, om mennesket vil udvikle sig, så vi kan overleve AIDS. Vurder også, om det er sandsynligt, at HIV vil udvikle sig til en ikke dødelig virus. 23

7 - Fortidens epidemier Ud fra studiet af DNA hos både mennesker og dyr undervejs i hele den biologiske udvikling kan man konstatere, at der er spor efter tidligere tiders retrovira. Giv dit bud på, om det kunne være en virus, der udryddede dinosaurerne for ca. 65 millioner år siden. Øvelser 1 - Simuleret HIV-smitte Hver elev får et halvt glas kropsvæske. Eet glas indeholder salt opløst i ionbyttet vand. De andre blot ionbyttet vand. Saltvand skal markere, at man er "smittet", og alm. vand skal markere at man er smittefri. Lad eleverne smitte hinanden ved at blande "kropsvæske" to og to. Det sker ved at man hælder en slat på ca. 1/10 indhold fra det ene glas over i det andet og rører godt rundt. Derefter hældes en slat tilbage. Med 25 elever, er det passende med max 4 "seksuelle kontakter" pr. elev. Lad eleverne notere hvem de har haft "seksuel kontakt" med og i hvilken rækkefølge. HIV-testen består i at måle ledningsevne i glassene - brug evt. også smagssansen. Lad eleverne rekonstruere smittevejene ud fra HIV-testen. Bemærk, at saltkoncentrationerne kan blive så små, at man får en negativ HIV-test, selvom man er smittet. 2 - ELISA-test Når man laver en HIV-test, anvender man en teknik, der kaldes ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Tidligere testede man for antistoffer mod HIV i blodet, men testen kan også designes, så man tester for HIV selv. Princippet i teknikken er, at det man tester for, fx antistofferne, skal bindes til en fast overflade. Når de er det, tilsætter man et såkaldt konjugat. Konjugatet består af to dele: en del, der kan binde sig til antistoffet, og en enzym-del. Man vasker omhyggeligt alt det væk, der ikke er bundet. Til sidst tilsættes et stof (substrat), der skifter farve, når enzymet omdanner det. Hvis der er antistoffer i blodet, vil de bindes til overfladen. Konjugatet vil så binde til antistofferne, og man vil se et farveskift, når man tilsætter substratet. Hvis der ikke er antistoffer i blodet, vil konjugatet ikke kunne bindes, og der ses intet farveskift. Flere firmaer, bl.a. BioRad og Edvotek har til undervisningsbrug udviklet ELISA-kits, som kan bruges til at simulere en HIV-test. På nedenstående hjemmeside ligger en beskrivelse af, hvordan testen udføres. Her kan man også se en animation af testen. http://www.biorad.com (søg på ELISA Immuno Explorer Kit) 24

3 DNA-oprensning DNA kan oprenses fra friske celler. En gammel kending er Isolering af DNA fra løg fra Biofag særnummer, nr. 7, sep. 1994. I denne vejledning foreslås også oprensning af DNA fra torskerogn, lever mm. Vejledningen findes også på: http://www.dr.dk/tv/tv-fakta/videnom/43bakterie/bak3dna.htm http://www.tornbjerg-gym.dk/biologi/dna/dna.htm Man kan også oprense DNA fra celler fra indersiden af kinden. Cellerne kan skabes af med en tandstikker eller en lille børste, men der skal en del til, så man kan godt blive lidt øm i kinden. Se evt. vejledning på: http://www.biorad.com 25