Ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød

Transkript

1 Side1 Ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød Udarbejdet i et samarbejde mellem: Lisbeth Thestrup, Lone Als Egebo, Rebekka Neergaard, Maj Thorup Nielsen, Poul Gerhard Pedersen, Benthe Schou, Jakob Lund, Camilla Kær Mørkholt, Jørn M. Clausen og Lars Haastrup Pedersen.

2 Side2 1. Introduktion Myoglobins struktur og funktion Oprensning af proteiner er en basal og essentiel proces i den bioteknologiske forskning og industri. I dette eksperiment skal vi oprense proteinet myoglobin fra oksekød. Myoglobin er et iltbindende globulært protein på 153 aminosyrer med en molekylvægt på Dalton (units) eller 17,1 kda (Figur 1) Figur 1: Proteinstruktur af myoglobin: oxygen-transportør i muskelvæv, globulært protein, enkelt peptidkæde på 153 aminosyrer, bygget op af 8 α-helices, indeholder en hæm-gruppe (Fe(II)-bindende porphyrin) som prostetisk gruppe Især dyrs muskelvæv er rig på myoglobin, da arbejdende muskler har et højt energikrav og dermed et højt iltforbrug. Ilten føres rundt i blodet og ud til musklerne vha. hæmoglobin. Her overtager myoglobin ilten fra hæmoglobin og transporterer det til muskelcellernes mitochondrier, hvor respirationen og energidannelsen foregår. Mængden af myoglobin i den humane muskulatur varierer alt efter hvor meget musklerne bruges. Trænede muskler har eksempelvis en højere koncentration af myoglobin end utrænede. Hvis musklen er i hvile, fungerer myoglobin som et iltlager, dvs. jo mere myoglobin der findes i musklerne jo større iltlager. Musklernes rødlige farve skyldes, at myoglobin indeholder en jernholdig gruppe den såkaldte hæm-gruppe. Farveintensiteten afhænger derfor af myoglobin mængden. Eksempelvis er musklerne hos hvaler nærmest brune pga. den høje koncentration af myoglobin, og det gør dem i stand til at være neddykkede i op til en time. Oprensningen af myoglobin Forsøget foregår i tre trin: 1. Ekstraktion af proteiner fra oksekød. I denne øvelse tager vi udgangspunkt i oksekød, men andre typer kød kan sagtens anvendes.

3 Side3 2. Fraktionering af proteinekstraktet og oprensning af proteinerne ved hjælp af ionbytningskromatografi. 3. Analyse og proteinseparation ved hjælp af gel-elektroforese. Ekstraktionen af protein foregår ved at findele kødet og tilsætte acetat buffer med ph 5.5, hvormed proteinerne kommer i opløsning Proteinerne oprenses ved hjælp af FPLC (Fast Protein Liquid Chromatograhpy eller hurtig protein væskekromatografi). I FPLC processen adskiller man proteiner vha. en ionbytter søjle. Søjlen indeholder et bæremateriale med en negativt ladet overflade (produktnavn SP Sepharose) som kan binde positivt ladede proteiner, mens negativt ladede proteiner passere uhindret ved den anvendte ph 5,5 De positivt ladede proteiner vil bindes til kolonnen med forskellig styrke afhængig af deres opbygning (sammensætning af aminosyrer samt proteinets foldning). Derefter vaskes søjlen med en eluerings-væske, der indeholder natriumklorid og saltkoncentrationen øges gradvist. På denne måde vil natrium-ionerne konkurrerer med proteinerne om bindingen til kolonnen og den stigende saltkoncentration medfører at proteinerne mister bindingen til kolonnen og udvaskes således med elueringsvæsken. Elueringsvæsken opsamles i små fraktioner á 5 ml, som på grund af søjlens evne til at tilbageholde de forskellige proteiner i kortere eller længere tid, vil have et forskelligt proteinindhold. Der er således sket en fraktionering af proteinekstraktet og en delvis oprensning af proteinerne. Proteinernes eluering i fraktioner visualiseres i et kromatogram. På kromatogrammet indikerer absorbansen målt ved 280 nm (A280) indholdet af proteiner i de individuelle fraktioner. Fraktionerne er nummererede i kromatogrammet og på fraktionsopsamleren. En høj top i kromatogrammet indikerer en høj protein koncentration. De fraktionerede proteiner separeres ved SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). SDS-PAGE er en gel-elektroforese, som anvendes til at adskille proteiner efter deres størrelse. Separationen foregår i et elektrisk flet over en gel af polyacrylamid. Inden elektroforesen denatureres og udfoldes proteinerne ved at reducere eventuelle disulfidbroer og ved at tilsætte et sæbelignende stof, natriumdodecylsulfat(som forkortes SDS fordi natrium = sodium på engelsk). Ved at tilsætte disse stoffer og udsætte proteinerne for varme, vil de udfoldes, og det negativt ladede SDS bindes regelmæssigt langs med det udfoldede protein og giver derfor alle proteiner samme ladning pr masseenhed, samt medvirker til atholde det lineært. Den negative ladning af SDS vil overstige proteinets egen samlede ladning og dermed muliggøre at alle proteiner bliver adskilt efter størrelse og ikke deres oprindelige ladning. Oftest anvendes DTT (Dithiothreitol) som reduktionsmiddel og dermed forhindres dannelsen af disulfid bindinger mellem svovlholdige aminosyrer, cystein. Peptidkæderne kan derefter adskilles efter størrelse og sammenlignes med en størrelsesmarkør (se Figur 2)

4 Side4 Figur 2: Princippet bag SDS-PAGE 2. Formål Formålet med forsøget er at oprense proteinet myoglobin fra kød, at udføre laboratorieforsøg med anvendelse af to bioteknologiske metoder, nemlig FPLC og SDS-PAGE samt at stifte bekendtskab med proteiners egneskaber og biologiske funktion. 3. Proteinekstraktion fra oksekød Materialer Skært oksekød Skalpel/køkkenkniv Acetatbuffer ph 5.5 (buffer A) Målebæger 50 ml Greinerrør 20 ml sprøjte 2-3 0,4 µm engangsfilter Pipetter og pipettespidser Eppendorfrør

5 Side5 Fremgangsmåde a) Afvej 10 g oksekød og findel kødet med en skalpel/almindelig køkkenkniv. b) Overfør kødet til et rent 50 ml Greinerrør. c) Tilsæt 30 ml buffer A, sæt låg på røret og vend det forsigtigt nogle gange. N.B. Her skulle væsken gerne blive rød (i hvert fald hvis oksekød anvendes) den røde farve skyldes hovedsageligt jern (Fe 2+ ) bundet af proteinet myoglobin, der transporterer O 2 og CO 2 i muskelceller. d) Lad opløsningen stå i 5-15 minutter. Den kan evt. vendes / omrøres fra tid til anden. e) Sug ca. 20 ml af kød-buffer-opløsningen op i en 20 ml engangs-sprøjte. Undgå at suge for meget kød med op. f) Et gult 0,4 µml engangs-filter placeres på sprøjtens spids (skrues fast) og væsken presses igennem filteret og ned i et rent 50 ml Greiner rør. g) Udtag 20 µl af proteinekstraktet med pipetten (husk at der skal være sat en ren pipettespids fast for enden af pipetten, hver gang denne benyttes!) og overfør dette til et 1,5 ml centrifugerør. Dette rør markeres med teksten rå-ekstrakt og gemmes i køleskab til senere analyse. h) Protein ekstraktionen er nu fuldendt og ekstraktet er klar til at blive fraktioneret vha FPLC. Sprøjte, filter og 50 ml centrifugerør er engangsmaterialer og bortskaffes efter anvendelse. i) Om nødvendigt kan der gøres ophold her. I så tilfælde opbevares den udtagne prøve (punkt g) på frost ved -20 C, indtil proteinoprensningen har fundet sted (afsnit 4). Proteinekstraktionen (punkt f) kan opbevares på køl (4 C) eller på frost (-20 C). 4. Protein oprensning ved FPLC (TID: ca. 45 min) Materialer Computerstyret FPLC apparatur inkl. fraktionsopsamler og en SP Sepharose kationbytter-kolonne 10 ml sprøjte Papirservietter Fremgangsmåde a) 10 ml af det filtrerede kød-protein-ekstrakt suges op i ren 10 ml engangs-sprøjte. b) Sprøjten tømmes for luft (på bedste lægemanér) ved at vende spidsen opad og presse luften ud af sprøjten. Skyd en lille smule væske med ud og hav en serviet klar til at tørre sprøjten. c) Sprøjten med det filtrerede proteinekstrakt påsættes FPLCen i injektionsventilens port nummer 3, og størstedelen af ekstraktet skydes langsomt ind i prøve-loopet. Efterlad 1 ml tilbage i sprøjten (Derved undgås at injicereluft i prøve-loopet. Dette vil forstyrre proteinoprensningen) (se Figur 3). N.B. Da prøve-loopet har et volumen på 5 ml, og prøven er større end 5 ml, vil noget af proteinekstraktet løbe hele vejen igennem loopet og ud i affaldsflasken. Dette er helt i orden, så længe loppet er fyldt med prøve. d) Oprensningen påbegyndes ved at navigere med FPLCens pile-taster og OK-tasten: e) Vælg menuen Run stored method og tryk OK. f) Herefter vælges den rigtige metode ved at vælge From System og tryk OK. g) Vælg nummer: program 1 og tryk OK.

6 Side6 h) Tryk på OK endnu en gang for at starte oprensningen. i) Programmet stopper af sig selv. Vælg nej til at lave memory print-out. N.B. Det første minut løber væsken direkte i affaldsflasken. Herefter skal man holde øje med, at væsken rammer rørene i fraktionsopsamleren. Undervejes bliver kolonnen farvet rød (hvis oksekød eller andet rødt kød anvendes). Den røde farve forsvinder i takt med at salt-koncentrationen i kolonnen stiger (under elueringen hvor buffer A og B gradvist blandes). j) Imens oprensningen finder sted, angives navnet på resultat-filen øverst i PrimeView programmet. Noter navnet, da dette skal bruges til at evaluere resultatet senere! k) Myoglobin forventes at eluere imellem fraktion 16-18, I kan visuelt se på jeres kromatogram om det er tilfældet, samt kigge direkte ned i røret på fraktionsopsamleren og se om den er blevet farvet rød! Figur 3: Påsætning af proteinprøve 5. Udvælgelse af prøver vha. kromatogrammet Når proteinoprensningen er fuldendt kan kromatogrammet åbnes i software programmet PrimeView Evaluation (der findes en genvej på PCens skrivebord). Kromatogrammet åbnes således: a) Vælg file b) open (Filen ligger i mappen Results ). Kromatogrammerne er navngivet med år (Y), måned (M), dag (D) og nummer (X): YYYYMMMDDnoXXX (Eksempel: 2011jan27no001 kromatogram nummer 001 fra den 27. januar 2011). c) Ved at højre-klikke på kromatogrammet og vælge properties kan man vælge hvilke data, der skal vises i kromatogrammet under Curve fanebladet. d) Udvælg relevante fraktioner ud fra kromatogrammet (max 16 stk. i de medfølgende geler vil der typisk være plads til at påsætte prøver af 10 forskellige fraktioner pr gel). Vælg gerne fraktioner på begge sider af en top (A280-peak). Se også Figur 4. N.B. Det er ikke muligt direkte ud fra kromatogrammet at afgøre hvilken fraktion der indeholder myoglobin, men ved at kigge på fraktionerne kan en svag rød farve indikere at myoglobin er tilstede. e) Fra hver udvalgt fraktion udtages 20 µl med pipette (husk ren pipettespids på før hver enkelt pipettering), som overføres til hver sit rene 1,5 ml centrifugerør. N.B. Her kan forsøget stoppes, og alle prøver kan lægges på frost!

7 Side7 Figur 4: Kromatogram efter oprensning af proteiner ekstraheret fra oksekød vha. FPLC. Den blå linje repræsenterer absorbansen ved UV 280, den røde linje repræsenterer conductiviteten (indholdet af salt), den grønne repræsenterer gradienten (forholdet mellem buffer A og B). Resultatet af denne oprensning er en stor peak i starten af kromatogrammet, som er alle de ubundne proteiner, der løber igennem. Den næste peak ses idet gradienten (den grønne streg) begynder at stige, og indeholdet i denne peak skulle hovedsageligt være myoglobin (se om fraktionerne har en rød farve). Der kommer efterfølgende 2 små peaks, som selvfølgelig også skal testes for protein indhold ved SDS-PAGE. 6. Analyse af proteinoprensningen I har nu det maksimale antal prøver samt jeres rå-ekstrakt prøve (punkt 3g). Alle disse køres nu på en SDS-PAGE. Materialer TGX SDS geler Sample buffer Running Buffer Protein-vægt-markør (Fermentas #SM0431, figur 3) Gel elektroforesesystem: Bio-Rad Mini protean tetra kar med 2 holdere, låg, ledninger, plastikbufferdam og strømforsyning CBB stain Rystebord Pippetter og pipettespidser Varmeblok eller vandbad Is Farvebakke Mikrobølgeovn Grønt adskillelsesværktøj til gel Papirservietter Evt. plastiklomme og skanner

8 Side8 Fremgangsmåde a) Tilsæt 20 µl Sample buffer (SB) til hver af prøverne (inkl. rå-ekstrakt prøven ) (brug pipetten husk ren pipettespids til hver pipettering). b) Prik hul i hvert låg, således at lågene ikke popper under opvarmning c) Alle prøver samt protein-vægt-markør (Fermentas #SM0431, figur 3) opvarmes i 5-10 min ved C (i vandbad eller varmeblok). d) Herefter sættes prøverne på is i 5 minutter, hvorefter de centrifugeres kort i en bordcentrifuge på max speed (ex. 14,500 rpm i 20 sekunder). N.B. Imens prøverne varmes og nedkøles gøres SDS-PAGE klar e) Tag et par handsker på og pak TGX gelen ud (måske hedder gelen noget andet alt efter hvad der er på lager ved afsendelsestidspunktet fra universitetet). N.B.Det er vigtigt at fjerne det grønne stykke tape i bunden og den grønne plastikkam i toppen af gelen! f) Gelen isættes gelelektroforesekarret som vist på Figur 5, den korte side af gelen vender ind mod midten af indsatsen og sikre at gelerne sidder stramt mod bunden mens siderne klikkes op: N.B. Følg evt. linket hvor det demonstreres hvordan karret sættes rigtigt i (dette kar er muligvis ikke helt identisk med det, som I får udleveret). A B C D Figur 5: A indsæt gelerne ved at placere den korte side af gelen mod midten af beholderen. B Når gelerne er på plads skubbes de grønne klemmer på plads. C Gelbeholderen placeres i karret ved at beholderen med elektroderne står udenfor plastikforhøjningerne på karret. D Fermentas-markør der anvendes som værktøj til at vurdere ukendte proteiners størrelse.

9 Side9 g) Karret med gelerne fyldes først helt op med SDS-PAGE running-buffer. Tjek om der løber running buffer ud af beholderen før der fyldes SDS-PAGE running-buffer i resten af karet. Holder midten af karret ikke tæt, skal hele indsatsen skilles ad, sættes ordentlig sammen og karret tørres af inden man forsøger igen! h) 7 µl af protein-vægt-markøren (Fermentas #SM0431) loades (påsættes) i den første brønd med pipetten og 25 µl af hver af prøverne tilføres hver af de resterende brønde (husk ren pipettespids ved hver enkelt pipettering). N.B. Husk at notere rækkefølgen af de enkelte prøver. Anvend vedlagte skema (Tabel 1) til at holde styr på rækkefølgen Låget sættes på karret (dette kan kun vende på én måde) og strømstikkene isættes strømforsyningen (rødt stik til rød indgang sort stik til sort indgang). Tabel 1: Skema til notering af fraktioner loaded på gelen. Husk at skrive numre efter Fraktion. Eksempelvis: Fraktion 5 Gel 1 Brønd Prøve Mix Load 1 Markør Er blandet 7 µl 2 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 3 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 4 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 5 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 6 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 7 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 8 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 9 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 10 Rå ekstrakt 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl Gel 2 Brønd Prøve Mix Load 1 Markør Er blandet 7 µl 2 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 3 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 4 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 5 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 6 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 7 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 8 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 9 Fraktion 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl 10 Rå ekstrakt 20 µl prøve+20 µl SB 25 µl i) Strømforsyningen tændes (stik på højre side) hvorved der sættes en strøm over gelen med konstant spændingsforskel på 70 V i 5 minutter og herefter 200 V i ca. 22 minutter (indtil den blå linje har arbejdet sig ned til bunden af gelen - kør ikke farven helt ud af gelen!). (Strømforsyningen kan ses på Figur 6).

10 Side10 N.B. For at adskille proteinerne med en konstant spændingsforskel skal prikken lyse udfor V (Voltage) og ikke A eller T. Når strømmen er startet skal det gerne begynde at boble med ilt inde i karret (hvis dette ikke er tilfældet, sidder gelen enten ikke rigtigt, eller også er der for lidt buffer i karret). Figur 6: til venstre ses strømforsyningen til elektroforesekarret og til venstre ses displayet. j) Når den blå linje er i bunden af gelen (efter ca minutter) skilles elektroforesecellen ad og gelen udtages. Gelen sidder imellem to stykker plastik. Disse skilles ad som vist på Figur 7. Der er fire sorte pile på gelen hvor værktøjet indsættes og vrikkes til det siger klik. Pas på ikke at ødelægge gelen i denne proces. Figur 7: TGX gelen har 4 sorte pile, her på billedet ses 2. Værktøjet indsættes mellem de to plastikplader ved hver pil og vrikkes op og ned indtil det siger klik, sørg for den er ordentlig skilt ved alle fire punkter før gelen overføres til farvning. k) Gelen overføres til en bakke hvori der tilsættes blå SDS-PAGE farve (Coomassie Brilliant Blue (CBB) stain) til gelen er dækket. Låget sættes på bakken (må gerne stå lidt åbent i et hjørne). l) Blandingen varmes i mikrobølgeovn i sekunder og derefter køles gelen i 10 minutter ved stuetemperatur (gerne på et rystebord). m) Den blåt farvede væske hældes fra gelen (i vasken kan også hældes tilbage i flasken og genbruges), og destain-buffer tilsættes så det dækker gelen. n) Blandingen opvarmes igen i sekunder i mikrobølgeovnen. o) Et par foldede papirservietter lægges ned i bakken til gelen for at suge farven (der skal stadig være væske i beholderen).

11 Side11 p) Lad gelen affarve (destaine) i 10 min, hvorefter papirservietterne skiftes. Allerede her burde det være muligt at se nogle blåt farvede protein bånd på gelen (disse bånd ses lettere ved at løfte bakken op fra bordet). N.B. Kan man ikke se nogle bånd kan gelen evt. opvarmes en ekstra gang i mikrobølgeovn med vand. q) Lad gelen affarve fuldstændigt (skift papir ca. hver tiende minut og tilsæt evt. mere buffer) og derefter kan proteinoprensningen visualiseres. r) Gelen kan med fordel overføres til en plastiklomme og scannes med en almindelig scanner. 7. Evaluering af oprensningen Kromatogrammet åbnes i softwareprogrammet PrimeView Evaluation (der findes en genvej på PC ens skrivebord). a) Kromatogrammet åbnes ved at vælge file -> open. b) Kromatogrammerne er navngivet med år (Y), måned (M), dag (D) og nummer (X): YYYYMMMDDnoXXX (Eksempel: 2011jan27no001 kromatogram nummer 001 fra den 27. januar 2011). c) Ved at højre-klikke på kromatogrammet og vælge properties kan man vælge hvilke data, der skal vises i kromatogrammet under Curve fanebladet. d) Under fanebladet X-axis kan indstillingerne for x-aksen foretages: Skal kromatogrammet vises som funktion af antal minutter oprensningen har kørt, eller af antallet af ml der har passeret kolonnen. e) Under fanebladet Y-axis kan indstillingerne for y-aksen foretages: Hvordan skal de enkelte data (valgt under Curves ) vises. f) Kromatogrammet kan gemmes som billede-fil (.emf) ved at højreklikke på kromatogrammet og vælge Save as meta-file g) Data kan også eksporteres til en tekst-fil som kan overføres til fx Excel (Figur 8): a. Vælg file b. Vælg Export c. Vælg Curves (her kan også vælges Peak table ) d. Vælg de ønskede data e. Tryk på Select f. Tryk på Export g. Tryk på OK

12 Side12 Figur 8: Skærmbillede til hjælp af eksport af data h) De eksporterede data kan importeres i Excel: a. Vælg Data b. Vælg Fra tekst c. Vælg vis: Alle filer d. Vælg de eksporterede data e. Vælg Importer f. Vælg Udfør g. Tryk på OK i) PrimeView Evaluation kan integrere arealet under graferne (Figur 9): a. Vælg menuen Integrate b. Vælg Peak Integration c. Vælg den graf der skal integreres (UV280). Grafen hedder det samme som data filen + :10_UV. (Eksempel: 2011jan27no001:10_UV) d. Basislinjen (baseline) defineres. Vælg enten calculated baseline eller Zeroed baseline e. Man behøver ikke at tage stilling til Target peak list f. I undermenuen Peak window kan man vælge de dele af kromatogrammet som skal integreres. Ændres dette ikke integreres hele kromatogrammet. g. Toppene (peaks) noteres efter deres placering på x-aksen (i minutter eller i ml). h. Vælg OK Figur 9: Skærmbillede til hjælp af integrering af areal under grafer

13 Side13 1. Lærervejledning ÄKTAprime Plus er et FPLC apparatur til oprensning af proteiner. Systemet styres let ved brug af tasterne på apparatets forside. Figur 10: Billede af frontpanelet på FPLC'en Piletasterne anvendes til at navigere imellem de forskellige menuer. OK-knappen bruges til at gå ind i den valgte menu (enter), samt til at godkende valgte indstillinger. Esc-knappen bruges til at gå tilbage til den forrige undermenu. End-knappen bruges til at afslutte en kørsel (run). Hvad enten dette er en manuel eller automatisk metode. Pause/cont -knappen bruges til at introducere en pause i den valgte metode, samt til at genoptage kørslen. Feed-tube får fraktionsarmen til at skifte til det næste position, såfremt den er placeret over rør. Hold/cont funktionerne anvendes ikke her. N.B. Der opereres her med to vaskeprocedurer: Systemets automatiske som vasker pumperne og vaskeprogram 4 (en forprogrammeret metode), der vasker søjlen. Når et program startes, starter FPLC en nogle gange på pause. Det startes ved at trykke på pause/cont-knappen 2. Klargøring af ÄKTAprime FPLC (ca. 2 timer) Klargøring kan gøres dagen før. I så fald skal punkt 13 (automatisk vask) gentages lige inden brug. 1. Fraktionsopsamleren (på toppen af FPLCen) fyldes med ca. 45 rør, og fraktionsarmen placeres over rør 1 ved at løfte den op og bevæge den til den ønskede position. Mærket på indersiden af det hvide stykke plastik på armen skal stå udfor midten af rør nummer 1. Fraktionsopsamleren drejes ved at trække det lille tandhjul bagerst til højre ud (markeret med rød cirkel på figur 13), hvorefter fraktionsopsamleren frit kan drejes.

14 Side14 Figur 11: Indstilling af fraktionsopsamler 2. Forbind den bærbare PC med ÄKTAprime plus via USB stikket. Anvend kun den markerede USB port i PC en. 3. Tænd ÄKTAprime plus på kontakten på bagsiden. FPLCen foretager en automatisk opstartskontrol og kalibrering dette kan tage et par minutter. Når FPLCen er klar ses teksten Templates på displayet. 4. Tænd PC (User: AAU, Password: biotech). 5. Start PrimeView software på PC en (der findes en genvej på computerens skrivebord). 6. Placér affalds-slangerne (de tre tynde brune slanger i en tom beholder markeret affald ). 7. Buffer-slangerne markeret A1 og B overføres til flasken med vand. N.B. Husk at banke bufferslangerne forsigtigt hver gang de overføres til en ny buffer for at undgå luftbobler 8. Vask buffer-slanger og pumpe med FPLCs automatiske vaskeprogram således: (se punkt 22, hvis du på noget tidspunkt får en pressure limit alarm) a. Automatisk vaskeprogram findes ved at bruge FPLCens piletaster og OK-tast: b. Vælg menuen Templates og tryk OK. c. Vælg undermenuen Application Template og tryk OK. d. Vælg undermenuen System wash method og tryk OK. e. Brug piletasterne til at flytte markøren (den lille vandrette streg under teksten på displayet) hen under OK (sådan: OK) og tryk på OK-tasten. f. Tryk på OK-tasten for at starte det automatiske vaskeprogram. g. Vasken tager ca. 5 minutter og maskinen bipper, når den er færdig. Tryk NO til at gemme udskrift. 9. Herefter startes et langsomt flow af vand igennem bufferslange A1: a. Brug FPLCens piletaster til at finde menuen Manual Run og tryk på OK-tasten. b. Brug piletasterne og OK-tasten til at indstille system parametrene (se nedenstående tabel). Her anvendes OK-tasten til at ændre og acceptere de indstillede parametre. c. Når alle parametre er indstillet som angivet i ovenstående tabel (tjek evt. disse indstillinger endnu en gang), vælges Start Run og tryk på OK-tasten. d. Tryk på OK-tasten endnu en gang for at starte vasken.

15 Side15 Tabel 2: Skema til at indstille parametrene i en manual run Parameter Værdi Sådan skal displayet se ud: Set Method Base Ml Set Method Base (ml) Set Concentration %B 0 %B Set Concentration %B (0 %B) Set Gradient Off Set Gradient (Off) Set Flow Rate 1 ml/min Set Flow Rate (1 ml/min) Set fraction Base ml Set Fraction Base (ml) Set Fraction Size 0.0 ml Set Fraction Size (0.0 ml) Set Pressure Limit 0.4 MPa Set Pressure Limit (0.4 MPa) Set Buffer Valve Pos Pos 1 Set Buffer Valve Pos. (Pos 1) Set Injection Valve Pos Load Set Injection Valve Pos (Load) 10. Kolonnen skal nu påsættes systemet. Når kolonnen er koblet til med slangerne skal det se ud som vist på figur 16. a. Find kolonnen frem. Den er markeret SP Sepharose. Behandl denne forsigtigt. b. Påsætning af kolonne skal ske ved et konstant lavt flow af buffer (jf. punkt 9 og ovenstående tabel). c. Lukkepropperne på kolonnen er markeret med rød tape, den grønne og hvide slange der skal sættes sammen er markeret med gul tape og slangen i bunden af kolonnen er markeret med hvid, ligeså er adaptoren (der findes i den medfølgende kasse med adaptorer) og detektoren.

16 Side16 d. Fjern den sorte lukkeprop fra den hvide slange markeret med gul tape, og løsn den sorte lukke-prop i enden af den hvide slange fra bunden af kolonnen (begge markeret med rød tape). På den måde kan væsken løbe lidt igennem kolonnen. (propperne kan ses på Figur 12). e. Montér FPLCens grønne slange fra port 1 på injectionventilen (markeret med gul tape) til den anden ende af den hvide slange der går fra toppen af kolonnen (markeret med gul tape) (Figur 12). Nu er toppen af kolonnen forbundet til FPLCen, og man burde kunne se noget væske pible op forbi den løsnede lukkeprop for enden af den hvide slange i bunden af kolonnen. f. Fjern den sorte lukke-prop (markeret med rød tape) fra den nederste slange på kolonnen (markeret med hvid) hvorefter væsken løber frit ud (Figur 12). Monter denne ende i adaptoren markeret med hvid tape og forbind nu dette til indgangen af detektoren (markeret med hvid). N.B. Pas godt på disse sorte stopskruer (markeret med rød tape), da disse skal anvendes igen, når kolonnen afmonteres fra FPLCen efter endt eksperiment. g. Når man kan se væsken løbe igennem de brune slanger i affaldsflasken, stoppes det manuelle program ved at trykke på end-knappen på forsiden af FPLCen. Figur 12: Her ses FPLC en som i modtager den. Stoppropperne for enden af kolonnens hvide slanger er markeret med rød tape (se gule pile). Stopproppen til slangen i bunden af kolonnen er afrundet, hvor stopproppen for enden af slangen i toppen af kolonnen ligner et han stik. Der er en hvid slange fra toppen af kolonnen som skal forbindes med den grønne slange fra injektionsporten (begge markeret med gul tape). Den hvide slange fra bunden af kolonnen skal forbindes med den adaptor med hvid tape der ses på billedet (gul cirkel), dette forbindes nu med detektorens indgang markeret med hvid tape.

17 Side Jævnfør punkt 10 skulle kolonnen nu være tilsluttet FPLC-systemet og kan nu vaskes igennem med vand (ca. 10 min): a. Vælg menuen Run stored method og tryk OK. b. Der spørges nu efter, hvor metoden ligger gemt: Her vælges Systemet og tryk OK. c. Vælg nummer program 4 og tryk OK. d. Tryk på OK endnu en gang for at starte vasken. e. Programmet stopper af sig selv vælg nej til at lave memory print-out. N.B. Vasken i punkt 11 kan følges på computerens display. Når vaskeprogrammet er slut, bør absorptions- og konduktivitetsmålingerne (ca. 3 ms/cm) være stabiliseret er dette ikke tilfældet gentages punkt Buffer-slangerne markeret A1 og B overføres til henholdsvis buffer A og buffer B. N.B. Husk at banke bufferslangerne forsigtigt hver gang de overføres til en ny buffer for at undgå luftbobler a. Buffer A (vaskebuffer): 20 mm Eddikesyre, 20 mm NaCl, ph 5.5 b. Buffer B (elueringsbuffer): 20 mm Eddikesyre, 1000 mm NaCl, ph 5.5 c. De 20 mm eddikesyre er fordelt således: 3,52 mm eddikesyre (l) og 16,48 mm natrium acetat. Dette giver en ph tæt ved de ønskede 5.5. ph justeres med 2M NaOH til Vask buffer-slanger og pumpe med FPLCs automatiske vaskeprogram således: a. Automatisk vaskeprogram findes ved at bruge FPLCens piletaster og OK-tast: b. Vælg menuen Templates og tryk OK. c. Vælg undermenuen Application Template og tryk OK. d. Vælg undermenuen System wash method og tryk OK. e. Brug piletasterne til at flytte markøren (den lille vandrette streg under teksten på displayet) hen under OK (sådan: OK) og tryk på OK-tasten. f. Tryk på OK-tasten for at starte det automatiske vaskeprogram. g. Vasken tager ca. 5 minutter og maskinen bipper, når den er færdig. Tryk NO til at gemme udskrift. 14. Kolonnen skal nu vaskes igennem med buffer: a. Vælg menuen Run stored method og tryk OK. b. Der spørges nu efter, hvor metoden ligger gemt: Her vælges Systemet og tryk OK. c. Vælg nummer program 4 og tryk OK. d. Tryk på OK endnu en gang for at starte vasken. e. Programmet stopper af sig selv vælg nej til at lave memory print-out. N.B. Vasken i punkt 13 kan følges på computerens display. Når vaskeprogrammet er slut, bør absorptions- og konduktivitetsmålingerne (ca. 3 ms/cm) være stabiliseret er dette ikke tilfældet gentages punkt 13. f. Tryk på feed tube for skifte til et rent rør før oprensningen eller udskift røret som vist i punkt Når pumperne er vasket (punkt 13), kolonnen påsat (punkt 10) og vasket (punkt 14), er apparatet klar til anvendelse. Afsnit 3, 4 og 5 fra elev-vejledningen udføres som beskrevet.

18 Side18 3. Rengøring og adskillelse af FPLC system (ca. 2 timer) Dette bør gøres samme dag eller senest dagen efter proteinoprensningen har fundet sted. Det er yderst vigtigt at absorbansen bliver stabil/lineær, da det ellers betyder at kolonnen er kontamineret. 16. Rengøring med 100 % buffer B: a. Kolonnen vaskes igennem med at køre et manual run som angivet i Tabel 2, med den afvigelse at der under set concentration % B vælges 100% b. Lad den stå og køre indtil absorbansen bliver stabil (kan godt tage en times tid) 17. Rengøring med 2 M NaCl: a. Når absorbansen er stabil sættes systemet på pause på FPLCens frontpanel (se Figur 10) b. Herefter flyttes begge slanger over i den medfølgende 2 M NaCl, slangerne bankes lige for at undgå luft. c. Indstil koncentrationen af B ved at bruge piltasterne på frontpanelet indtil set concentration er nået, tryk da ok, og indstil til 50 % med piltasterne. Tryk da ok, og anvend piltasterne til at komme tilbage til start og tryk da run igen. d. Systemet må igen gerne stå en times tid eller indtil absorbansen er stabil. e. Når absorbansen er stabil, sættes systemet igen trykkes der på end. 18. Vask bufferslanger og pumpe med FPLCs automatiske vaskeprogram: (se punkt 22, hvis du får en pressure limit alarm) a. Overfør begge bufferslanger til den medfølgende flaske med MilliQ vand, bank slanger for at fjerne luft. b. Automatisk vaskeprogram findes ved at bruge FPLCens piletaster og OK-tast: c. Vælg menuen Templetes og tryk OK. d. Vælg undermenuen Application Template og tryk OK. e. Vælg undermenuen System wash method og tryk OK. f. Brug piletasterne til at flytte markøren (den lille vandrette streg under teksten på displayet) hen under OK (sådan: OK) og tryk på OK-tasten. g. Tryk på OK-tasten for at starte det automatiske vaskeprogram. h. Vasken tager ca. 5 minutter og maskinen bipper når den er færdig. Tryk NO til at gemme udskrift. 19. Herefter vaskes kolonnen med program 4: (se punkt 22, hvis du får en pressure limit alarm) a. Vælg menuen Run stored method og tryk OK. b. Der spørges nu efter hvor metoden ligger gemt: Her vælges Systemet og tryk OK. c. Vælg nummer program 4 og tryk OK. d. Tryk på OK endnu en gang for at starte vasken. e. Programmet stopper af sig selv vælg nej til at lave memory print-out 20. Begge bufferslanger (både A1 og B) placeres i den leverede flaske med 20 % ethanol og punkt 18 og 19 gentages indtil absorptionen er stabil (konduktiviteten skulle gerne her stabiliseres omkring 0, da dette ikke indeholder salt). Er dette ikke tilfældet gentages punkt 19. Er dette tilfældet fortsæt da med punkt Kolonnen er nu klar til at blive afmonteret fra FPLC-systemet:

19 Side19 a. Start en manuel kørsel (run) med et langsomt flow af buffer A igennem bufferslange A1 (se punkt 9). Denne gang indstilles flow til 0.5 ml/min, og kolonnen kan nu afmonteres fra systemet: b. Bunden af kolonnen, som er monteret til FPLCens absorptionsmåler (markeret med hvid tape), løsnes, adaptoren skues af og den ene sorte lukke-prop (markeret med rød tape) skrues løst på bunden af kolonnen. N.B. Skru kun proppen løst på, så væsken stadig kan komme ud. c. Toppen af kolonnens slange (markeret med gul), som er monteret til den grønne slange, løsnes og den anden sorte stop-prop (markeret med rød tape) skrues ind i hun-stikket (denne skrues helt på - kun ved håndkraft, anvend ikke værktøj). d. Herefter strammes bundproppen og kolonnen er nu afkoblet. e. Den grønne slange (markeret med gul tape) monteres på FPLCens absorptionsmåler. f. Når man kan se væsken løbe igennem slangerne i affaldsflasken, stoppes det manuelle program ved at trykke på end-knappen på forsiden af FPLCen. g. Sug ca ml vand ind i en ren engangssprøjte, og sprøjt dette ind i port nummer 3 i FPLCens injektionsventil (samme ventil som prøven i sin tid blev doseret (loaded) ind i). Gentag dette med 20 % ethanol. Herved vaskes injektionsventil og prøve-loopet igennem. h. FPLCens slukkes på bagsiden af apparatet i venstre side. i. Computeren afmonteres. 22. Hvis du får en alarm med at trykket er for højt trykker du på pause. Brug da piletasterne til at manøvrere igennem programmet med, indtil du når indstilling flow (ml/min), tryk da OK og indstil den til 1 ml mindre, tryk continue. Hvis problemet fortsætter indstil da til et mindre flow, indtil du får et acceptabelt tryk. Figur 13: Proteiners 3-dimensionelle struktur