HOT NEWS. Primære Cilier: Cellernes indre antenner. Søren Tvorup Christensen, Ph.D. Associate Professor

Transkript

1 HOT NEWS Primære Cilier: Cellernes indre antenner Søren Tvorup Christensen, Ph.D. Associate Professor > Institut for Molekylær Biology Københavns Universitet 1

2 VORES FORSKNING Alle celler i vores krop har en antenne, der som en GPS modtager signaler fra cellens omgivelser og koordinerer fosterudviklingen og vedligeholder kroppens væv og organer i det voksne individ. Uden disse antenner ville fosteret afstødes og den voksne ville dø. > 2

3 TO TYPER AF ANTENNER: De bevægelige cilier De primære cilier > 3

4 De bevægelige cilier > 4

5 De bevægelige cilier i luftvejene > 5

6 De bevægelige cilier i æggelederne Livmoderen Æggelederen Ampulla (befrugtningsstedet) Æggestokken livmoderhalsen Vagina > 6

7 Graviditet uden for livmoderen > 7

8 De bevægelige cilier i hjernen hydrocephali > 8

9 De primære cilier > 9

10 Primary cilia Cells entering growth arrest primary cilium 4 Review: Pedersen et al (2008) Assembly of primary cilia. Dev Dyn Apr 4. [Epub ahead of print] axoneme plasma membrane centriolar vesicle (CV) 1 secondary centriolar vesicle (SCV) mother centriole daughter centriole formation of centriolar vesicle (CV) at distal end of mother centriole centriolar migration and fusion of CV with secondary CVs docking and fusion with the plasma membrane > Golgi 4 Elongation of the primary cilium (IFT) 10

11 Det primære cilie dannes fra modercentriolen under vækststop bugspytkirtel Sted og dato (Indsæt -> æggestok nyre hjernen stamcelle 11

12 9+2 cilia/flagella 9+0 cilia (primary cilia) trachea oviduct brain sperm cells > 12

13 Antenner i vores hverdag > 13

14 Antenner i vores krop bugspytkirtel Antenne km lang 100 km bred August Krogh Bygningen atmosfæren: 600 km æggestok nyre hjernen stamcelle > 14

15 Signalering fra andre celler og væv: hormoner, vækstfaktorer, overlevelsefaktorer Autokrin signalering Fysiokemiske ændringer i cellens ydre miljø: ph, osmotisk tryk, temperatur, etc Mekaniske stimuli cilie Golgi cellekerne Cellulært respons: Celledeling Celledød Cellemigration Celledifferentiering Celle > 15

16 RECEPTOR PRIMÆRT CILIUM (ANTENNE) SIGNAL ANKOMMER TIL RECEPTOREN CELLEOVERFLADE SIGNAL SENDES TIL KERNEN CELLEVÆKST ÆNDRING AF GENEKSPRESSION CELLEMIGRATION CELLEDIFFERENTIERING > KERNE 16

17 Eksempler på signaltransduktion gennem det primære cilie RTK signaling PDGFRα m. fibroblasts (77) Tie1, -2 h. ovary surface epithelium, m. extraovarian duct and bursa (123) Tie1, -2 (9+2) m. oviduct (123) FGFR1, -2, -3 m. node cells (130) FGFR1 (9+2) rm. trachea (129) Mek1/2 m. fibroblasts (77) Hedgehog signaling Smoothened (Smo) m. primary fibroblasts, m. MDCK cells, m. IMCD-3 cells, m. node cells (55,97) Gli proteins (Gli1,2,3) m. embryonic limb bud cells (99) SuFu m. embryonic limb bud cells (99) Wnt signaling Inversin m. collecting duct epithelium, m. node, m. primary fibroblasts (107,108) Vangl2 m. IMCD-3 cells (103) Vangl2 (9+2) h. respiratory epithelium (103) Steroid signaling Progesterone receptor (PR) (9+2) h. and m. oviduct (124) Neurotransmission somatostatin R(Sst3) m/r. hippocampus, hypothalamus, amygdala and cerebellum neurones (133) serotonin R (5HT6) r. striatum, nucleus accumbens, olfactory tubercle and islands of Calleja (134) Integrin/ECM signaling Integrins α3, α5, β1 m. MDCK cells (120) Integrins α2 and α3, NG2 c. chondrocytes (85) > Christensen et al (2007) Traffic TRP ion channels/ polycystin and Ca 2+ signaling PC-2 h. and m. collecting duct epithel. (65,66,68), m. ovarian granulosa cells (123), PC-2 m. node (116), r. cholangiocyte (72) PC-2 (9+2) m. oviduct epithelium (123) TRPV4 (9+2) m. ampulla region of oviduct epithelium (123) Calmodulin m. collecting duct epithelium (135) Cystin1 m. collecting duct epithelium (51,66) Fibrocystin m. MDCK cells (136) Nephrocystin 4 m. collecting duct epithelium (137,138) Nephrocystin 5 m. MDCK cells (135) adenylate cyklase (AC6) r. cholangiocyte (72) PC1 m. collecting duct epithelium, MDCK cells. (66,68) PC1 m. ovarian granulosa cells (123), r. cholangiocyte (72) PC1 (9+2) m. oviduct epithelium (123) STAT6, P100 m. collecting duct epithelium (71) Osmolyte Transporters TauT m. fibroblasts (117) 17

18 efter fødslen fosterudvikling Primære cilier opretholder organfunktionerne og styrer regenerering af beskadiget væv Primære cilier styrer fosterudviklingen med den korrekte dannelse af væv og organer > 18

19 Fejl i primære ciliers antennefunktion under fosterudvikling forårsager bl.a.: tidlig embryonal død mental retardering fosterskader polydactyli hypoplasia skeletdeformationer exencephali etc fosterudvikling > 19

20 Fejl i primære ciliers antennefunktion under fosterudvikling forårsager bl.a.: tidlig embryonal død mental retardering fosterskader polydactyli hypoplasia skeletdeformationer exencephali hydrocephali etc > 20

21 Fejl i primære ciliers antennefunktion under fosterudvikling forårsager bl.a.: tidlig embryonal død mental retardering fosterskader polydactyli skeletdeformationer hypoplasia exencephali hydrocephali etc > 21

22 Fejl i primære ciliers antennefunktion under fosterudvikling forårsager bl.a.: tidlig embryonal død mental retardering fosterskader polydactyli skeletdeformationer hypoplasia exencephali hydrocephali etc > 22

23 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) efter fødslen > 23

24 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) Progressiv degenerering af nethinden med gradvis nedbrydning af stav- og tapceller. På nethinden ses knoglelignende pigmenteringer. Sygdommen begynder ofte med natteblindhed ved nedbrydning af stavceller. Udvikler sig senere til kiggertsyn og sidst til blindhed. > 24

25 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) > 25

26 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) Musen til venstre har fejl i dannelsen af cilier i hypothalamus. > 26

27 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) normal nyre cystenyre > 27

28 Cilie-associerede sygdomme skyldes: Mutationer i de proteiner, der signalerer fra det primære cilie Fejl i selve dannelse af de primære cilier Fejl i transporten af receptorer og andre signalkomponenter til det primære cilie > 28

29 IFT: Intraflagellar transport Cilie-associerede sygdomme skyldes: Mutationer i de proteiner, der signalerer fra det primære cilie Fejl i selve dannelse af de primære cilier Fejl i transporten af receptorer og andre signalkomponenter til det primære cilie Anterograd transport (fra basen til spidsen af ciliet) foretages af kinesin-2, hvortil der er koblet mindst 17 IFT-partikler (f.eks. IFT88) Retrograd transport (fra spidsen til basen af ciliet) foretages af cytoplasmatisk dynein-2 > 29

30 Eksempler på koordinering af signaltransduktion gennem det primære cilie: cystenyre > 30

31 Fejl i primære ciliers antennefunktion efter fødslen forårsager bl.a.: cysteformationer i nyre, lever og bugspytkirtel cancer fedme og diabetes tab af lugtesans (anosmia) synet (retinitis pigmentosa) Progressiv degenerering af nethinden med gradvis nedbrydning af stav- og tapceller. På nethinden ses knoglelignende pigmenteringer. Defect IFT! Sygdommen begynder ofte med natteblindhed ved nedbrydning af stavceller. Udvikler sig senere til kiggertsyn og sidst til blindhed. > 31

32 VORES FORSKNING Alle celler i vores krop har et primært cilie, der som en antenne eller GPS modtager signaler fra cellens omgivelser og koordinerer fosterudviklingen og vedligeholder kroppens væv og organer i det voksne individ. Uden disse antenner ville fosteret afstødes og den voksne ville dø. Det er vores mål: At forstå hvordan antennerne dannes At forstå signaleringen gennem antennerne, som opretholder organer og vævs normale funktion. At kunne udnytte denne viden i kulturer af stamceller til at fremstille nye celletyper, der kan regenerere ødelagt væv i det voksne individ > 32

33 Det primære cilie i fibroblaster styrer cellevækst wt MEFs PDGFRα PI3K AP Sos Ras Raf Mek1/2 PDGF-AA shifted overlay Tg737 orpk MEFs develop no or very short cilia tb DAPI PDGFRα Tg737 Erk1/2 Akt Mek1/2 wt membrane fusion VIGTIGT!!!! tb GFP:PDGFRα nucleus > proliferation Golgi glycosylation of receptors Schneider et al. (2005) Curr. Biol. & Christensen et al (2007) Traffic Tg737-genet koder for IFT88 Celler med mutation i Tg737/IFT88 kan ikke danne primære cilier 33

34 Koordinering af cellecykluskontrol PDGFRαα PDGF-AA PM Primary cilium tb Pctn DAPI fibroblast * Ct Ct centrosomal PDGFRα localization MT Primary cilium centrosome Golgi ER growth arrest: capture of centrosomal mother centriole, centrosomal translocation to PM and ciliary assembly by IFT PDGFRα localization along the cilium nucleus target genes PDGFRα MT + cell cycle entrance cell cycle entrance: ciliary resorption and duplication of centrosomes * * Mitotic spindle MT MT * MT * * MT * * tb Sted og dato (Indsæt Pctn -- > DAPI Christensen et al (2008) Curr. Top. Devl. Biol. * mitosis tb Pctn DAPI 34

35 Det primære cilie fungerer som en tumor-suppressor PDGFRαα Crk SHP2 Grb2 PI3K Ras Primary cilium MT Raf? MT Golgi Mek ER nucleus HDAC6 HEF1 HEF1 Human enhancer of filamentation Akt Erk AurA CHFR AurA HDAC6 Aurora A kinase Tubulin deacetylase Plotnikova et al (2008) cdk1 cdk2 centrosome p53 CHFR Checkpoint with FHA and RING finger domains (tumor suppressor) muteret i 50% af alle humane kræftformer target genes cell cycle entrance > Christensen et al (2008) Curr. Top. Devl. Biol. nucleus 35

36 SÅRHELING DET PRIMÆRE CILIE SOM EN GPS Glu-tub primary cilia leading edge centrosome nucleus > Schneider et al. (2008) Submitted Glu-tub Pctn DAPI Primary cilium 36

37 Micropipette assay [PDGF-AA] pipette tip Distance from pipette tip PDGF-AA > 37

38 wt (no ligand) wt (PDGF-AA) Tg737 (PDGF-AA) PDGFRa-medieret signaltransduktion via Akt er blokeret no PDGF-AA Glu-tub phospho-akt + PDGF-AA wt Tg737 orpk 50 µm Migration tracks PDGF-AA (min) * * Akt phospho-akt wt Tg737 orpk > 38

39 Micropipette assay wt Tg737 orpk /IFT88 all cells (100%) move towards the pipette tip with the same average speed - PDGF-AA + PDGF-AA > 39

40 In vivo vævsheling er hæmmet i Tg737/IFT88 mus Day 0 day 7 average wound closure rate (mm 2 /hour) wild type mouse C 0.06 * ORPK mouse (IFT88 Tg737Rpw ) Schneider et al. (2008) Submitted 0 wild type Tg737/IFT88 > 40

41 Koordinering af cellemigration leading edge fibroblast F-actin Gradient of PDGF-AA primary cilium Golgi nucleus PDGFRα-mediated changes of cytoskeleton trailing edge > Christensen et al (2008) Curr. Top. Devl. Biol. 41

42 Signaleringsprocesser under cellemigration - I NHE1 Primary cilium Glu-tub β1-integrin DAPI ECM integrins PDGFRαα FAK Nck Primary cilium PKD1/2 NHE1 [Ca 2+ ] i NIK Akt p90rsk Erk PLCγ cofilin cortactin Akt F-actin ERM PI3K FAK ILK Nck stress fibres centrosome cell cycle control leading edge FA Schneider et al (2008a) JCB submitted Schneider et al (2008b) JCB submitted Christensen et al (2008) Curr. Top. Devl. Biol. > 42

43 Voksne stamceller: er ansvarlige for reparation af beskadiget væv i det voksne individ stamceller? D Embryonale stamceller hesc: er forstadiet til fosteret og kan omdannes til alle celletyper i vores krop 0.5 um Regenerering af hjertemuskulatur efter fødslen fosterudvikling Differentiering af embryonale stamceller Primære cilier opretholder organfunktionerne og styrer regenerering af beskadiget væv > Signaleringsveje: Hedgehog Wnt PDGFRα FGFR Navn på enhed EGFR (Indsæt --> Primære cilier styrer fosterudviklingen med den korrekte dannelse af væv og organer 43

44 Voksne stamceller: er ansvarlige for reparation af beskadiget væv i det voksne individ stamceller Embryonale stamceller hesc: er forstadiet til fosteret og kan omdannes til alle celletyper i vores krop D 0.5 um Regenerering af hjertemuskulatur Signaleringsveje: Hedgehog Wnt PDGFRα FGFR EGFR Differentiering af embryonale stamceller > 44

45 Conclusions Primary cilia functions as chemosensory, osmosensory and mechanosensory organelles that coordinate a series of signal transduction pathways including PDGFRα, Hedgehog and Wnt signaling in cell growth, differentiation, migration, polarity to control: Stem cell maintenance, differentiation and proliferation Embryonic development, organogenesis homeostasis and regeneration of adult tissues Behavioral responses The primary cilium and the centrosome constitute a highly dynamic system that coordinates the trafficking of signal components in and out of the cilium as well as coordinating signaling downstream of the centrosome. > 45

46 Christensen Lab Students and staff Linda Schneider, Cand. scient. PhD-student Funded by the Faculty Rikke Thorsteinsson Master student (with Dr. L.B. Pedersen) Home Students & Staff Research Publications CV Teaching Links, promotions and interviews Institutionel website Images and movies Christian A. Clement, Cand. scient. PhD-student Funded by the Faculty Aashir Awan, PhD post doc (with Dr. A.G. Byskov) Funded by the Lundbeck Foundation Sonja K. Nielsen Master student (with Dr. I. Novac) Support: The Novo Foundation Pernille L. Jensen Master student Stine Gry Kristensen Master student Anni B. Nielsen Laboratory technician > Iben R. Veland Master student 46

47 Primære cilier i humane embryonale stamceller (hesc) D Primary cilium 0.5 um centrioles tb Oct-4 centrin Kiprilov and Awan et al (2008) JBC > 47