GenPoint indeholder teknologi, som er udviklet af og licenseret fra PERKIN ELMER/NEN LIIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. (U.S. Patent #5,196,306).

Transkript

1 Dako GenPoint Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes Kode K ml Licens til begrænset. anvendelse GenPoint indeholder teknologi, som er udviklet af og licenseret fra PERKIN ELMER/NEN LIIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. (U.S. Patent #5,196,306). Dette produkt sælges og distribueres til slutbrugeren efter licens fra PERKIN ELMER/NEN LIIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. Slutbruger må udelukkende anvende produktet på Dako-instrumenter til manuel eller automatiseret behandling af objektglas eller andre hjælpematerialer (bortset fra microarray og bio-chips), indeholdende celle- eller vævsprøver, som skal undersøges under mikroskop (herunder automatiserede billed- og analysesystemer) med henblik på at detektere målnukleinsyrer eller proteiner. Køb omfatter ikke og giver ikke ret til at videresælge eller overføre dette produkt enten som enkeltstående produkt eller som en komponent i andre produkter. Enhver anvendelse af dette produkt til andet end den licenserede anvendelse er strengt forbudt uden udtrykkelig skriftlig tilladelse fra PERKIN ELMER/NEN LIIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Denne vejledning gælder for GenPoint Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes. GenPoint (kode K0620) er et meget følsomt signalamplifikationssystem til detektering af biotinylerede prober i vævs- og cellepræparater. Det er kompatibelt med alle typer biotinylerede prober og kan benyttes til at forstærke signaler fra enten DNA- eller RNA-hybridiseringer. Præparater og biotinylerede prober skal leveres af bruger. GenPoint-procedure 1. Hybridisering af biotinyleret probe. 2. Anvendelse af primært streptavidin-hrp-konjugat. 3. Anvendelse af tyramidsubstrat (amplifikationsreagens). 4. Anvendelse af sekundært streptavidin-hrp-konjugat. 5. DAB-konvertering. ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 1/6

2 Resumé og forklaring Leverede reagenser In situ hybridiseringsmetoder (ISH) benytter mærkede prober til at lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser på subcellulære niveauer. Biotin benyttes almindeligvis til mærkning af prober til ikke-radioaktiv detektion. 1-6 Biotin kan visualiseres ved hjælp af flere detektionsmetoder med avidin eller streptavidin, som begge har en meget høj bindingsaffinitet for biotin. 7 Standardmetoderne til detektion af biotin benytter enzymkonjugater af streptavidin til fremstilling af præcipiterede farvesignaler fra kromogene enzymsubstrater. GenPoint systemet danner et yderligere amplifikationsniveau til biotindetektion. Efter begyndelsesbindingen af streptavidinperoxidase til den biotinylerede probe katalyserer peroxidasen oxideringen af biotinyltyramid 8, der straks danner kovalente bindinger til aromatiske grupper i prøven. Denne reaktion udfælder store mængder biotin på hybridiseringsstedet. Den ekstra biotin benyttes til indfangning af mere streptavidin-peroxidase. Denne amplifikationscyklus med streptavidin-peroxidase > biotinyltyramid > streptavidin-peroxidase kan gentages for yderligere at forøge tilvæksten af biotin. Signalet udvikles til sidst ved tilsætning af det kromogene indikationsfarvestof diaminobenzidin (DAB), der oxideres af peroxidaseenzymet og giver et mørkebrunt præcipitat på hybridiseringsstedet. Komponenterne i sættet rækker til behandling af 65 objektglas i en enkelt amplifikationscyklus. Mængde Beskrivelse 30 ml Stringensvaskkoncentrat 0,2 ml Primært Streptavidin-HRP-koncentrat 15 ml Primær Streptavidin-HRP-diluent 10 ml Biotinyltyramidopløsning 10 ml Sekundær Streptavidin-HRP 0,2 ml DAB-kromogenkoncentrat 10 ml DAB-subtratbuffer Nødvendige materialer, der ikke medfølger Biotinylerede prober Hybridizer (S2450 eller S2451, 110V eller 220V) Target Retrieval Solution (kode S1699 eller S1700) Proteinase K (kode S3004 eller S3020) eller Pepsin (kode S3002) TBST Tris-Buffered Saline/Tween-20 (kode S3306) anbefales som vaskebuffer ved automatiseret og manuel farvning 0,3% H 20 2 i metanol Alkoholopløsninger (95% og 100%) Deioniseret eller destilleret vand Monteringsmedium, så som Faramount (kode S3025) eller Glycergel (kode C0563) Xylen eller Histoclear Kontrastfarve (valgfri); Hematoxylin (kode S3302) anbefales Farvningsstativer eller Coplin-glas Silaniserede eller på anden måde klæbebehandlede objektglas; ISH-kvalificerede silaniserede objektglas kan fås hos Dako (kode S3003) Varmeplade eller ovn Inkubator Ovn Vandbad ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 2/6

3 Dækglas til hybridisering (18 mm x 18 mm) Dækglas til montering Absorberende servietter Handsker Fugtkammer til inkubation af objektglas Standard lysmikroskop Forholdsregler 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Dette produkt indeholder natriumazid (NaN 3), som er et kemisk stof, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly- og kobberinstallationer og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazider i afløbssystemet. 11,12 3. Minimer mikrobiel forurening af reagenser, da der ellers kan forekomme en øget uspecifik farvning. 4. Som med ethvert produkt af biologisk oprindelse, bør de korrekte håndteringsprocedurer benyttes. 5. Brug egnet sikkerhedsudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 6. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. 7. Sikkerhedsdataark er til rådighed for professionelle brugere på anmodning. Fare Stringent Wash Concentrate: 1-5% Polyoxyethylene octyl phenyl ether; 1-5% Natriumchlorid H318 Forårsager alvorlig øjenskade. P280 Bær øjen- eller ansigtsbeskyttelse. P264 Vask hænder grundigt efter brug. P305 + P351 + VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern P338 + P310 eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Advarsel Primary Streptavidin-HRP Diluent: 10-30% Glycerol H320 Forårsager øjenirritation. P280 Bær øjen- eller ansigtsbeskyttelse. P264 Vask hænder grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. Advarsel Biotinyl Tyramide:10-30% Glycerol H320 Forårsager øjenirritation. P280 Bær øjen- eller ansigtsbeskyttelse. P264 Vask hænder grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. Opbevaring Fare DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P202 Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P281 Anvend de påkrævede personlige værnemidler. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. Reagenser fra GenPoint-systemet skal opbevares i mørke ved 2 8 C. Må ikke fryses. ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 3/6

4 Forberedelse af reagens Tris-Buffered Saline/Tween (TBST) Opløs TBST Concentrate (kode S3306) 1:10 i deioniseret eller destilleret vand. Den fortyndede opløsning er stabil i en måned ved 2 8 C. Kasser bufferen, hvis den er uklar. Stringensvaskopløsning Opløs stringensvaskkoncentratet 1:50 i deioniseret eller destilleret vand og opvarm til en passende temperatur i vandbad. Kasser ubenyttet, fortyndet opløsning. Primær streptavidin-hrp-opløsning Opløs det primære streptavidin-hrp-koncentrat 1:100 i den leverede primære streptavidin-hrp-diluent 30 minutter før anvendelse. Kasser ubenyttet, fortyndet opløsning. DAB-kromogen Opløs DAB-kromogen-koncentratet 1:50 i den leverede DAB-substratbuffer. Den fortyndede substratbufferopløsning er stabil ved stuetemperatur i en dag eller i op til fem dage, når den opbevares ved 2 8 C. Procedure ISH-procedure Afparaffinisering Alle paraffinindstøbte præparater skal afparaffiniseres for at fjerne indstøbningsmediet og derefter rehydreres før in situ hybridisering og farvning. Undgå ufuldstændig fjernelse af paraffin, da paraffinrester vil resultere i en øget uspecifik farvning. Afparaffinisering kan udføres ved først at opvarme vævssnittene i en ovn ved 60 C i 30 minutter for at blødgøre paraffinen og derefter nedsænke objektglassene i to hold xylen eller Histoclear i hver fem minutter. Rester af xylen eller Histoclear kan derefter fjernes ved at nedsænke objektglassene i to hold 100% alkohol, fulgt af tre hold 95% alkohol, i 1 minut i hver. Objektglassene rehydreres derefter med flere hold vand. Prøveforbehandling Celle- og vævspræparater fremstillet med tværbindingsfiksativer, såsom formalin, kræver forbehandling for at give hybridiseringsproben adgang til målnukleinsyresekvenserne. Prøveforbehandlingen kan udføres ifølge en af følgende metoder: 1. Target retrieval-forbehandling: Nedsænk objektglassene i forvarmet Target Retrieval Solution (kode S1700) i minutter ved 97 C (± 2 C) efterfulgt af 2 0 minutters afkøling i opløsningen. Skyl objektglassene flere gange med destilleret vand for at fjerne rester af Target Retrieval Solution. 2. Pepsin-forbehandling: Nedsænk objektglassene i 0,4% 0,8% Pepsin (kode S3002, opløs pakken i ml 0,2N saltsyre) ved 37 C i 1 10 minutt er. Skyl derefter objektglassene flere gange i destilleret vand for at fjerne pepsinrester. 3. Target Retrieval- og pepsinforbehandling: Behandl objektglassene med Target Retrieval Solution som beskrevet herover, efterfulgt af en mild pepsinbehandling. Generelt bør behandling med 0,005% 0,01% pepsin i 0,2N saltsyre i minutter ved stuetemperatur være tilstrækkeligt. 4. Proteinase K-forbehandling: Behandl objektglassene med Proteinase K, RTU (kode S3020) i minutter. Skyl objektglassene flere gange med destilleret vand for at fjerne Proteinase K-rester. De optimale forbehandlingsbetingelser skal, uanset om det sker med Target Retrieval, protease-digestion eller en kombination af disse, fastlægges for hver præparattype. For mange præparater er forbehandling med enten Target Retrieval eller proteolytisk digestion tilstrækkelig. I almindelighed kræver cytologiske præparater en mindre aggressiv behandling end væv. Præparater, som er fremstillet med ikke-tværbindende fiksativer, så som acetone, kræver almindeligvis ikke nogen forbehandling. Hvis det anses for nødvendigt, bør forbehandling af sådanne prøver være mild, da de let beskadiges. Følgende procedure anbefales til behandling af væskebaserede cytologiske præparater: Anbring objektglassene i 50% alkohol i 30 minutter. Efterfikser derefter i 10% neutral bufferet formalin i 30 minutter. Skyl objektglassene i flere hold deioniseret vand, og inkuber med Proteolytic Enzyme (kode S3007) ved stuetemperatur i 3 minutter. Skyl snittene i flere hold deioniseret vand efter den enzymatiske digestion, og anbring dem derefter i 0,3% H 2O 2 i methanol i 5 minutter. Skyl objektglassene i flere hold deioniseret vand. Med henblik på baggrundsreduktion kan objektglassene inkuberes med Biotin Blocking System (kode X590). Påfør Avidin Block i 10 minutter efterfulgt af Biotin Block i 10 minutter (skyl med flere hold deioniseret vand både før og efter hvert trin). Objektglassene skal holdes fugtige før anvendelse af probe. Probespecifikationerne omfatter anbefalinger vedrørende hybridisering og stringensvask. Følg nedenstående anvisninger for detektion med følgende undtagelse: Fortynd primær streptavidin-hrp i et forhold på mellem 1:100 og 1:300 med henblik på inkubation i minutter. Baggrundsundertrykkelse Dette trin er nyttigt til reduktion af baggrund i visse væv ved destruktion af endogen streptavidinbindingsaktivitet og undertrykkelse af enhver peroxidaseaktivitet, der måtte være til stede i prøven. En typisk protokol omfatter eksponering af objektglasset overfor 0,3% H 2O 2 i metanol ved stuetemperatur i mindst 20 minutter. Dette bør efterfølges af vask i destilleret vand i 10 minutter. ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 4/6

5 Hybridisering og stringensvask Optimale temperaturer for hybridisering og stringensvask for Dako biotinylerede prober er angivet i den vejledning, der følger med hver specifik probe. Til brugerleverede prober skal den optimale temperatur for hybridisering og stringensvask fastlægges. Som tommelfingerregel er den optimale hybridiseringstemperatur 25 C under den beregnede T M (smeltetemperatur for den hybridiserede probe), og temperaturen for stringensvask ligger mellem C under den bere gnede T M. Formlen til beregning af T M findes i Current Protocols in Molecular Biology. 10 Ved enkeltstrengede prober og mrna-mål er der mindre behov for at denaturere materialerne før hybridisering. Ved dobbeltstrengede prober og/eller DNA-mål er et denatureringstrin obligatorisk. Denaturering af mål- og/eller probe- DNA opnås normalt ved opvarmning af proben og/eller objektglassene til C i 5 minutter på en var meplade. Farvningsprocedure Bemærk: Protokoller til anvendelse med Dako-instrumenter kan fås hos Dako teknisk support. TRIN 1 PRIMÆRT STREPTAVIDIN-HRP Det primære streptavidin-hrp-koncentrat skal fortyndes 1:100 i den leverede primære streptavidin- HRP-diluent inden brug. Fremstil ca. 150 µl primær streptavidin-hrp-opløsning pr. objektglas. Efter stringensvask skylles objektglassene flere gange i TBST-vaskebuffer. Fjern overskydende TBST-vaskebuffer og aftør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne resterende væske. Tilsæt 3 4 dråber fortyndet primær streptavidin-hrp-opløsning, så det dækker præparatet, og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Skyl objektglassene i TBST-vaskebuffer og anbring dem i tre friske TBST-vaskbufferbade, 5 minutter i hver, for at fjerne rester af primær streptavidin-hrp-opløsning. TRIN 2 TRIN 3 BIOTINYLTYRAMID (AMPLIFIKATIONSREAGENS) Fjern overskydende TBST-vaskebuffer og aftør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne resterende væske. Tilsæt 3 4 dråber biotinyltyramid, så det dækker præparatet, og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Skyl objektglassene i TBST-vaskebuffer og anbring dem i tre friske TBSTvaskebufferbade, 5 minutter i hver, for at fjerne rester af biotinyltyramid-opløsning. SEKUNDÆR STREPTAVIDIN-HRP Fjern overskydendetbst-vaskebuffer og aftør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne resterende væske. Tilsæt 3 4 dråber sekundær streptavidin-hrp-opløsning, så det dækker præparatet, og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Skyl objektglassene i TBST-vaskebuffer og anbring dem i tre friske TBST-vaskebufferbade, 5 minutter i hver, for at fjerne rester af sekundær streptavidin-hrpopløsning. TRIN 4 TRIN 5 TRIN 6 KROMOGEN REAKTION Fortynd DAB-kromogenkoncentrat 1:50 i DAB-substratbuffer umiddelbart før brug. Forbered ca. 150 µl kromogen pr. objektglas. Fjern overskydende TBST-vaskebuffer og aftør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne resterende væske. Tilsæt 3 4 dråber fortyndet DAB-kromogen, så det dækker præparatet, og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Stop kromogenreaktionen ved at nedsænke objektglassene i vand i 1 minut. Skyl objektglassene med flere hold vand for at fjerne DAB-rester. KONTRASTFARVE Hematoxylin (kode S3302) giver en blå kernekontrastfarve, der er i god kontrast til de brune DAB-signaler og permanent i enten vandige eller organiske monteringsmedier. Nedsænk objektglassene i et hæmatoxylinbad. Inkubationstiden afhænger af styrken af den benyttede hæmatoxylin. Hvis der benyttes Hematoxylin (kode S3302), er en inkubationstid på 1 4 minutter normalt tilstrækkeligt. Skyl objektglassene i TBST og derefter i vand flere gange før montering. MONTERING Dæk præparaterne med enten et vandigt eller et permanent monteringsmedium. Ved vandig montering, anbefales Glycergel (kode C0563). Kvalitetskontrol Forskelligheder i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan give en betydeligt varians i resultaterne og nødvendiggøre regelmæssige kontroller på stedet. Udførelse af farvningsproceduren med relevante kontroller vil påvise en korrekt anvendelse af reagenser og tekniske procedurer. Positivt kontrolvæv og/eller positiv kontrolprobe Kendt positivt kontrolvæv til testproben og/eller kendte positive kontrolprober til testpræparater bør benyttes til overvågning af den korrekte effektivitet af det behandlede væv, testprober og reagenser. Positive Control (Human DNA) Biotinylated DNA Probe (kode X1414) kan benyttes til at påvise genomisk DNA i kernen. Detektionsreagensers specificitet kan påvises ved at udføre hybridiseringsproceduren uden probe. Tilstedeværelsen af baggrund med denne kontrol indikerer en uspecifik binding af detektionsreagenserne. Dette problem kan forekomme, hvis snittene tørrer ud under detektionsproceduren. ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 5/6

6 Negativ kontrolprobe Benyt en negativ kontrolprobe i stedet for testproben med et snit af hvert testpræparat til evaluering af uspecifik farvning og specificiteten af hybridiseringsreaktionen med testproben. For at bestemme specificiteten af hybridiseringsreaktionen kan en ikke-hybridiseringsmærket probe benyttes som negativ kontrol, f.eks. Negative Control (Plasmid DNA) Biotinylated DNA Probe (kodenr X1415). Fortolkning af farvningen Positive kontrolpræparater bør undersøges først for at sikre, at alle reagenser virker korrekt. Positive signaler, svarende til hybridiseringsområder, ses som brune eller sorte områder inden for de enkelte cellers grænser. Manglende specifik membranfarvning af negative kontrolpræparater bekræfter specificiteten af testproben. Hvis der forefindes uspecifik farvning, vil den have et plettet eller diffust udseende. GenPoint -systemets høje følsomhed skyldes det høje amplifikationsniveau; enhver tilstedeværende uspecifik baggrundsfarvning bliver også forstærket. Derfor anbefales det at anvende negative kontrolprober på testpræparater som en hjælp ved fortolkning af farvningsresultater. Begrænsninger Negative resultater kan opstå pga. forkerte inkubationstemperaturer og -tider, forkert fortynding af reagenser og ikke-optimale fikserings- eller forbehandlingsbetingelser. Passende fikserings- og forbehandlingsbetingelser skal fastlægges af brugeren for hver prøvetype. Den høje følsomhed i dette detektionssystem muliggør detektion af lav-kopigener og lav tilstedeværelse af mrna-mål. Detektion af enkeltkopigener eller meget lav tilstedeværelse af mrna-mål med dette detektionssystem afhænger imidlertid af, hvor godt testproberne mærkes (f.eks. tætheden af biotinmærkning pr. probe) og størrelsen af proberne og målene. Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidaseaktivitet kan forekomme i hæmoproteiner, så som hæmoglobin, myoglobin, cytochrom, katalase og i visse leukocytter. 7 Denne aktivitet kan elimineres ved inkubation af prøver med 3% hydrogenperoxid i 5 minutter ved stuetemperatur (trin 1 i farvningsproceduren) før anvendelse af proben. Væv indeholdende hepatitis B overfladeantigen (HBsAg) kan udvise uspecifik farvning med peberrodsperoxidase. 13 Fejlfinding Problem Mulig årsag Foreslået afhjælpning 1. Intet signal. 1a. Lavkopi-målsekvenser eller lav hybridiseringseffektivitet. 1b. Ikke optimal forbehandling. 1a. Forøg probekoncentrationen. Forøg hybridiseringstiden. Forøg antallet af amplifikationscyklusser. 1b. Titrer fikserings- og/eller forbehandlingstider. 2. Høj baggrund. 2a. Overudvikling af signal. 2b. Endogen peroxidaseaktivitet. 2a. Forøg fortynding af primært streptavidin-hrp. Reducer DAB-udviklingtid. 2b. Udfør peroxidaseinhibition. BEMÆRK: Hvis problemet ikke skyldes nogen af ovenstående årsager, eller hvis foreslåede afhjælpningshandlinger ikke løser problemet, så ring til Dako teknisk service for at få yderligere assistance. Referencer 1. Al-Hakim AH and Hull R. Chemically synthesized non-radioactive biotinylated long-chain nucleic acid hybridization probes. Biochem J 1988; 251: Saffran WA, et al. Preparation and characterization of biotinylated psoralen. Nuc Acids Res 1988; 16: Levenson C, et al. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridization probes. Methods Enzymol 1990; 184: Nelson PS, et al. Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone. Nuc Acids Res 1992; 20: Gebeyeju G, et al. Novel biotinylated nucleotide analogs for labeling and colorimetric detection of DNA. Nuc Acids Res 1987; 15: Langer PR, et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: Green NM. Avidin. Adv Prot Chem 1975; 9:85 8. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood, body fluids, and tissue. (Tentative guideline; Second Edition) Villanova, PA Order code M29-T2 10. Preparation and analysis of DNA. In: Ausubel FM (eds.). Current Protocols in Mol Biol. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1999: Chapter Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Centers for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, Omata M, Liew C-T, Ashcaval M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 6/6

7 Edition 07/15 ( ) P04030DK_ 01_K0620/ p. 7/6