Deltagermateriale OGM. HPLC metodeudvikling og optimering

Transkript

1 Deltagermateriale OGM HPLC metodeudvikling og optimering November 2006

2 Polaritet og intermolekylære kræfter. En måde til at forstå og kunne udnytte kemisk viden om hvilke kræfter, der optræder i et chromatografisk system, er at man i første omgang kan benytte polaritetsbegrebet. Dernæst at kunne gennemskue typen af intermolekylære kræfter mellem stationær og mobil fase samt prøvens molekyler. Polaritetsbegrebet bygger på, at atomer har forskellig elektronegativitet. Elektronegativitet er et mål for et atoms evne til at trække bindingselektronerne i en kovalent binding til sig. Der findes talværdier for atomernes elektronegativitet i Paulings skala. Fluor er det mest elektronegative af alle atomer. Elektronegativitet F > O > Cl, N > Br > C, H Den kovalente binding opstår ved at 2 atomer deler et eller flere elektronpar. Således at de fælles elektroner tilhører begge atomer og afstanden er ens for de to atomer. H H C : H H I methanmolekylet findes bindingen mellem H og C. Da der ikke er væsentlig forskel i deres elektronegativitets værdier, betegnes metan for et upolært molekyle. Dette betyder at lange kulstofkæder, som for eksempel C 18 H 38 er upolære. H : O H I vandmolekylet findes bindingen mellem H og O. Da der her er væsentlig større forskel i deres elektronegativitetsværdier vil bindingselektronerne være forskudt mod det mest elektronegative atom, oxygen. Molekyler med en ladningsforskydning er polære molekyler og kan betegnes som en permanent dipol, fordi ladningsforskydningen altid er tilstede. Dette medfører at alkoholer, syrer, estere og amider er polære molekyler. I stedet for at se på de enkelte bindinger i et molekyle, kan man se på molekylets indhold af funktionelle grupper -C00H > -C0NH 2 > -NH 2 > =C=0 > -CH 2 0H > -C00R > -CH0, > -N0 2 > -Cl > CH 3 1

3 De funktionelle grupper er opstillet efter faldende polaritet. Ved at sammenligne molekylers indholdet af funktionelle grupper, kan man få et indtryk af deres polaritet i forhold til hinanden. En blanding af følgende stoffer adskilles på en omvendt fase kolonne: OH CH 3 CH 3 HO HO CH 3 phenol 4-methylphenol 1,2-dimethyl-4-hydroxybenzen OMe OC 2 H 5 Methoxybenzen Ethoxybenzen. Figur 1: Blanding af aromater. Efter eluering kommer phenol først ud efterfulgt af 4-methylphenol, 1,2-dimethyl-4- hydroxybenzen, methoxy- og ethoxybenzen. Stofferne adskilles først efter polaritet og dernæst efter molvægt. De intermolekylære kræfter som optræder indenfor chromatografi er hovedsagelig af elektrostatisk natur. Elektrostatiske kræfter kan inddeles i ion-ionbinding, dipol-dipolbinding og ion-dipolbinding. Ion-ionbindingen eksistere f.eks. i salte, hvor der opstår en tiltrækning mellem positive og negative ladninger. Ionforbindelser optræder ved ionparchromatografi. Dipol-dipolbindingen er tiltrækning mellem den positive del af et polært molekyle og den negative del af et andet polært molekyle. En speciel dipol-dipolbinding er hydrogenbindingen, i hvilken hydrogen optræder som bro mellem to elektronegative atomer. Hydrogenbindinger kan kun dannes, når oxygen eller nitrogen er tilstede. Polære stoffer kan blandes med polære mobile faser, idet de er istand til at gå ind og erstatte mobil fases hydrogenbindinger. Hydrogenbindingerne opstår i omvendt fase eller ved normal fase chromatografi. Ion dipolbindingen er tiltrækningen mellem for eksempel en positivt ladet ion og den negativt ladede del af et polær mobil fase. Disse kræfter er ret stærke og favoriserer opløsning af ioniserbare forbindelser eller salte i polære opløsningsmidler som vand, methanol og acetonitril. 2

4 Opløseligheden af ikke ioniserbare forbindelser i mobil fase afhænger af deres polaritet og evne til at danne hydrogenbindinger. Upolære eller svagt upolære stoffer, som for eksempel carbonhydrider og alkylhalogenider er kun blandbare med mobile faser af samme polaritet. Upolære forbindelser er ikke blandbare med mobile faser af høj polaritet, idet disse holdes sammen af hydrogenbindinger, som upolære stoffer ikke kan bryde. Mobile faser med permanent dipol kan introducere en midlertidig ladningsforskydning i prøvemolekylet, som bevirker en elektrostatisk tiltrækning mellem disse. Endvidere optræder van der Waals kræfter, der har en kort rækkevidde og de virker kun mellem molekyler, der er i tæt kontakt. Kontakten sker på molekylernes overflade. Der er altså sammenhæng mellem styrken af van der Waals kræfter og molekylets størrelse og form. Figur 2: Molekyler af ens polaritet giver ordnede væske molekyler. Figur 3: Molekyler af uens polaritet giver uordnede væske molekyler. Når der skal vælges eluent er det en stor fordel, at man kender dets eluotrope styrke. Det vil sige hvor hurtigt det eluerer et givent stof. Den eluotrope styrke afhænger af eluentens polaritet. I praksis fortages optimeringen af HPLC-metoder hovedsagelig i form af en optimering af eluentens sammensætning, idet denne, når først stationær fase er valgt, har langt den største indflydelse på separationen. 3

5 Chromatografiske parametre: I HPLC ønsker man at adskille en prøves komponenter, således at hver komponent ses som en top på chromatogrammet. Man ønsker en god adskillelse, smalle, symmetriske og veldefinerede toppe samt en kort retentionstid. Det er imidlertid ikke nok at beskrive et chromatogram i løse vendinger. Derfor har man udviklet en række chromatografiske parametre til beskrivelse af chromatogrammer, og disse parametre kan således bruges som en del af dokumentationen. På figur 4 ses et chromatogram, hvor alle anvendte størrelser er defineret: Figur 4: Chromatogram af en stofblanding Der findes en række parametre til beskrivelse af chromatografiske systemer. Disse parametre anvendes til en vurdering af et chromatograms kvalitet og derved en metodes anvendelighed. Derfor anvendes de chromatografiske parametre indenfor kvalificering af udstyr, samt metodeudvikling og -optimering. I det følgende beskrives effektiviteten, kapaciteten, selektiviteten og resolutionen. Toppens udseende: Det er vigtigt at toppene er smalle og symmetriske. Asymmetrifaktoren er en parameter som udtrykker toppens form, og den beregnes på følgende måde: hvor b A s = a A s = asymmetrifaktoren b = bredden af sidste tophalvdel målt i 10% højde a = bredden af første tophalvdel målt i 10 % højde 4

6 Hvis toppen er symmetrisk opnås værdien 1, men en acceptabel værdi for asymmetrifaktoren er mellem 0,7 og 1,4. Hvis asymmetrifaktoren er mindre end 0,7 kaldes fænomenet for leading, og skyldes en overbelastning af kolonnen på grund af en for stor prøvemængde. Når værdien af asymmetrifaktoren bliver større end 1,4 kaldes fænomenet tailing, og kan skyldes, at der er opstået et dødvolumen. Et dødvolumen er et hulrum i det chromatografiske system, som bevirker at prøvens komponenter fortyndes op med mobilfase, og derved bliver til et bredere bånd. Det kan også skyldes arten eller pakningen af den stationære fase, og endelig kan fænomenet skyldes en slidt kolonne. Endelig kan tailing skyldes en dårligt reguleret ph. Effektivitet: Effektiviteten udtrykker en kolonnes evne til at indstille en balance. I HPLC vil en kolonnes effektivitet være et udtryk for hvor god kolonnen er til at indstille en ligevægt mellem stationær fase og mobil fase. Effektiviteten kan betegnes som antallet af teoretiske bunde (n) og udtrykker prøvekomponenternes fordeling mellem stationær fase og mobil fase, dvs. en koncentrationsligevægt som afhænger af prøvekomponenternes art. Antallet af teoretiske bunde beregnes efter følgende udtryk: N = 5,545 t r b 2 hvor N = antal teoretiske bunde t r = toppens retentionstid b = bredden målt i halv højde Bredden skal være så lille som mulig, idet jo smallere toppe, des flere komponenter kan man adskille, hvilket betyder en høj effektivitet. Samtidig ønsker man en relativ kort retentionstid, og det er derfor optimalt, hvis N ligger mellem 1000 og Antallet af teoretiske bunde bruges ofte til sammenligning af kolonner eller til at undersøge kolonnens beskaffenhed f.eks. før og efter en forsøgsrække. Derfor er det en vigtig parameter i kvalificering af udstyr. Antallet af teoretiske bunde afhænger bl.a. af længden af kolonnen og derfor anvendes størrelsen HEPT (Heigt Equivalence of a Theoretical Plate), når man sammenligner kolonner af forskellig længde. HEPT beregnes på følgende måde: HEPT = kolonnelængde N hvor HEPT = højde af en teoretisk bund N = antal teoretiske bunde 5

7 Kapacitet: Tiden det tager en komponent at passere det chromatografiske system, fra injektion til detektor, kaldes for retentionstiden. Retentionstiden er sammensat af to størrelser - den tid komponenten befinder sig i den mobile fase (t 0 ) og den tid som komponenten bliver tilbageholdt af den stationær fase (t r ). Dette kan skrives som: hvor t r = t + 0 t r = retentionstiden t 0 = dødtiden t' r = den reducerede retentionstid t' r t 0 kan bestemmes ved at injicere en komponent som ikke tilbageholdes af den stationære fase, men som giver anledning til en absorbans (f.eks. tartrazin eller natriumnitrat). Fordelingen af komponenterne mellem den mobile fase og den stationære fase spiller en vigtig rolle i separationen af komponenterne. Idet jo længere tid en komponent befinder sig på den stationære fase, des længere retentionstid. Dette udtrykkes ved kapacitetsfaktoren (k) i følgende ligning: hvor t r t 0 k = = t 0 k = kapacitetsfaktoren t' r = den reducerede retentionstid t 0 = dødtiden t' r t o k defineres som den tiden, hvor komponenten er i forbindelse med stationær fase i forhold til den tid, hvor komponenten befinder sig i den mobile fase. Kapacitetsfaktoren bør være mindst 1 for at sikre en chromatografisk effekt, og den bør ikke overstige 15, da chromatograferingstiden så vil være for lang. En optimal værdi for kapacitetsfaktoren vil være mellem 2 og 5. Selektivitet: Selektiviteten udtrykker hvor langt to toppes maximum befinder sig fra hinanden. Selektiviteten udtrykkes ved hjælp af separationsfaktoren, der beregnes som forholdet mellem de reducerede retentionstider: hvor α = t' r,b t' r, A α = separationsfaktoren t' r,a = den reducerede retentionstid for den første top t' r,b = den reducerede retentionstid for den anden top 6

8 Størrelsesmæssigt er separationsfaktoren altid større end 1, men ligger fortrinsvis mellem 1,05 og 2,0. Selektiviteten fortæller altså noget om adskillelsen af to komponenter med hensyn til retentionen, men ikke noget om adskillelsen med hensyn til basislinien. Separationsfaktoren anvendes dog også til identifikation, og betegnes derfor også som relativ retention. Den relative retention beregnes ved at definere en referencetop, og denne tops reducerede retentionstid anvendes til at beregne kapacitetsfaktorerne for de øvrige komponenter. Den relative retention beregnes udfra følgende udtryk: α = k B k A hvor α = den relative retention k A = kapacitetsfaktoren for den første top k B = kapacitetsfaktoren for den anden top Størrelsen kan benyttes ved sammenligning af resultater fra forskellige systemer, men under forudsætning af, at det er samme metode - det vil sige samme mobil fase, temperatur og kolonne type. Resolution: Resolutionen er den størrelse som udtrykker toppenes adskillelse ved basislinien, idet både retentionen og topbredden har indflydelse på værdien. Resolutionen kan beregnes på flere måder: eller R s R S = 1 4 = 1,18 α 1 α t 2 b k 2 k 2 t 1 b 2 N 2 hvor R s = Resolutionen t 1 og t 2 = Er retentionstider for de to toppe b 1 og b 2 = Er bredden i halv højde for de to toppe α = Separationsfaktoren k 2 = Kapacitetsfaktoren for den anden top N 2 = Antallet af teoretiske bunde for anden top 7

9 Størrelsen af R s er ideel ved 1,5, da det lige netop betyder basislinieadskillelse. Resolutionen må helst ikke komme under 1, hvilket svarer til omkring 90% adskillelse af toppene, da det herved bliver kompliceret at beregne arealer af de enkelte toppe. Ved ændring af de enkelte parametre kan resolutionen påvirkes. Jo højere k, α og N, des højere resolution. Separationsfaktoren og kapacitetsfaktoren ændres ved at variere indholdet i den mobile fase. Ved at gøre den mobile fase mere polær opnås en længere retentionstid og derved en højere kapacitetsfaktor og separationsfaktor. Antallet af teoretiske bunde afhænger blandt andet af den stationære fase, men også af flow og viskositeten af den mobile fase. Jo lavere flow des højere effektivitet, og jo lavere viskositet des større effektivitet. 8

10 Metodeudvikling. Ved metodeudvikling forstås udvikling af en metode til bestemmelse af en eller flere komponenter i en prøve. Det kan være valg af en analytisk metode f.eks. HPLC og efterfølgende fastlæggelse af forskellige parametre som f.eks. art af mobil fase eller type af stationær fase. Ved optimering forstås en tilpasning eller forbedring af en metode, hvor man undersøger om det er muligt at opnå et bedre resultat ved at ændre på en parameter. I praksis vil en optimering være en del af metodeudviklingen. Metodeudvikling kan systematiseres og inddeles i seks punkter, som skitseret på figur 5: Definition af problemstilling Litteratursøgning Valg af analysemetode Anskaffelser/indkøb Udvikling Dokumentation og validering Figur 5: Plan for metodeudvikling I det følgende beskrives de seks punkter hver for sig. 9

11 Definition af problemstilling: Det er vigtig at gøre sig klart, hvilket mål man har med metodeudviklingen, og hvilke krav der skal opfyldes. En målbeskrivelse skal indeholde, hvilke komponenter og prøver det drejer sig om. I målet beskrives også om det er en identifikation af et stof, om det er en kvantitativ bestemmelse eller om det er en oprensning. Målet kan f.eks. opstilles af det laboratorium som skal udføre analysen eller myndigheder. F.eks. kan det være målet at lave en kvantitativ bestemmelse af konserveringsmidler i benfri sild. Det er samtidig vigtigt at tage højde for de krav som er gældende. Det kan være indenfor økonomi, tid og omfang. Man skal gøre sig klart, hvilke økonomiske midler der er tilrådighed. Tidsmæssigt skal man overveje, hvor lang tid der er afsat til udviklingen og hvor lang tid det må tage at analysere en prøve. Endelig er det også vigtigt at overveje, hvor mange prøver det drejer sig om. Litteratursøgning: Det er altid lettest at tage udgangspunkt i en tidligere metode eller tidligere erfaringer med beslægtede forbindelser. Man må foretage en omfattende litteratursøgning både med hensyn til metoder, men også med hensyn til prøvens art. Til dette findes der databaser f.eks. adskillige bibliografiske databaser. Analytical abstract er en meget stor og omfattende database. Herud over skal nævnes de gældende pharmakopeer og forskellige internetadresser f.eks. chemfinder.com. I litteraturen vil man i første omgang lede efter tidligere analyser som bestemmer netop de komponenter som man har beskrevet i målet eller efter beslægtede forbindelser. Hvis der ikke findes sådanne kilder vil man finde information som beskriver karakteren af prøvekomponenterne og prøvematrix. Når prøvekomponenterne beskrives er der en lang række egenskaber, som er vigtige på molekylniveau. Når prøven kendes er det også muligt at beskrive prøvematrix. Disse egenskaber er beskrevet i tabel 1. Prøvekomponenter Prøvematrix Stoftype Hvor kommer prøven fra Opløselighed Prøvens art (væske eller fast stof) Molekylvægt Mulige interferende stoffer Arten af de funktionelle grupper Frie elle bundne komponenter Koncentrationsniveau Uopløselige komponenter Detektorprincip (UVchromoforer/flouroforer grupper) Prøveforberedelse Ionisk eller ikke-ionisk pk A -værdier Polær eller upolær Stabilitet Tabel 1: Prøveegenskaber. Når karakteren af komponenter og prøver er fastlagt kan man vælge en analysemetode. 10

12 Valg af analysemetode: I dette kompendium vil vi antage at HPLC er valgt som metode, men udfra en beskrivelse af prøvekomponenter og prøvematrix kunne det lige så vel have vist sig at være bedst med en anden metode f.eks. gaschromatografi eller kapillar-elektrofoerese. Der er imidlertid flere forskellige former for HPLC. Her skal nævnes omvendt fase chromatografi, normal fase chromatografi, ionpar, ionchromatografi (IC) eller størrelseschromatografi (SEC). Når man skal vælge hvilken af disse metoder kan man benytte følgende flowsheet: Figur 6: Væskechromatografiske metoder.[1] Den første inddeling sker efter komponentens molvægt. I tilfælde af biologiske prøver vil molvægten være over 2000, og for kemiske og biokemiske vil oftest være under Herefter vil der være en række parametre som f.eks. opløselighed, polaritet eller ionisk karakter, der bestemmer hvilken form for HPLC, der kan anvendes. 11

13 Andre faktorer som er vigtige for valget af metode er beskrevet i kravene til tid og ressourcer. Samtidig kan målbeskrivelsen anvendes, da man her skal tage højde for arten af analysemetoden (identifikation, kvantificering eller oprensning). Hvis det er en kvantificering skal man beslutte om det skal være intern standard eller ekstern standard, og hvis det er en oprensning må man overveje, hvilken renhed man ønsker at opnå. Endelig er arbejdsmiljøet også en vigtig faktor, da det er ønskværdigt at arbejde med ufarlige stoffer og materialer. Anskaffelser/indkøb: Igen i dette afsnit tages der højde for kravene til ressourcer. Udstyrsmæssigt er det vigtigt med et fleksibelt udstyr, hvor man let kan variere mange forskellige parametre. F.eks. vil det være vigtig at have to pumper, således at det er let at ændre indholdet i den mobile fase. Et HPLC-system med følgende muligheder kan bruges som udgangspunkt: Udstyrsparametre Kolonne Længde 15 cm Diameter: 0,46 cm Partikel størrelse: 5 μm Stationær fase: C 8 eller C 18 Mobilfase Vand:methanol A: 90:10 B: 10:90 Flow 1,0 2,0 ml/min. Temperatur C Prøvemængde Loopstørrelse: < 25 μl Koncentration: < 0,005 % komponent Tabel 2: Udstyrsparametre Med hensyn til kolonnen vil det oftest være en C 18 -forbindelse, og når man vælger mobil fase et det på forhånd defineret at opløsning B har den største eluetrope styrke. Ud over selve HPLC-systemet skal der indkøbes diverse kemikalier og referenceforbindelser. Udvikling: Efter valget af metoden er foretaget påbegyndes den praktiske udvikling og optimering. De første forsøg omhandler selve detektionen og prøveforberedelsen. Under optimale forhold kan disse forsøg køres samtidig. Ved prøveforberedelse skal man overveje om det er nødvendigt med en oprensning for at skåne den stationære fase mest muligt, og hvis komponentkoncentrationen i prøven er lav kan det være nødvendigt med en opkoncentrering. Der er forskellige former for prøveforberedelse. Det kan være alt fra en simpel opløsning af prøven til fast fase ekstraktion (SPE). 12

14 De indledende detektorforsøg laves oftest ved hjælp af et spektrofotometer, hvis komponenten indeholder chromoforer grupper. Når der er fundet et absorbansmaximum, tages det chromatografiske system i brug. Det er skal være muligt at transportere komponenten gennem systemet med en forholdsvis kort retentionstid. Til alle de indledende forsøg anvendes et standard stof. Når man skal finde arten af den mobile fase anvendes prøven med matrix, da det oftest vil være et spørgsmål om at få separeret komponenten eller komponenterne fra resten af prøven. Når prøven er kommet gennem det chromatografiske system og komponenterne er blevet detekteret, er det tid til en optimering. Optimeringen skal indeholde valg af stationær fase, valg af mobil fase og en undersøgelse af flow, temperatur og prøvemængde. Dokumentation og validering: Dokumentationen for en metode kan være mere eller mindre omfattende. Jo flere komponenter eller jo flere prøvetyper der indgår i metoden des mere omfattende bliver dokumentationen. I HPLC er det direkte resultat et chromatogram. Ud fra dette kan der f.eks. beregnes en koncentration af komponenten, men chromatogrammet skal leve op til de stillede krav med hensyn til separation. Til beskrivelse af separationen anvendes de chromatografiske parametre. Det er derfor vigtig at gøre sig klart, hvilke chromatografiske krav der stilles. Herunder ses en tabel med chromatografiske krav: Chromatografiske krav Veldefinerede, smalle toppe med acceptabel retentionstid (mindre end 15 min.) Simpel mobilfase, Isokratisk kørsel Robust metode Relativ standard afvigelse mindre end 2% Resolution: R s > 1,5 Topsymmetri: A s : 0,7-1,4 Kapacitet: k: 2 5 Antal af teoretiske bunde: N>1000 Tabel 3: Chromatografiske krav En del af dokumentationen indeholder valideringen. En validering er en vurdering af metoden med hensyn til linearitet, præcision og nøjagtighed. En bestemmelse af linearitet kan indeholde fastlæggelse af detektionsgrænse, kvantifikationsgrænse og linearitetsgrænse. En undersøgelse af præcisionen foretages ved gentagne målinger ved samme betingelser og med korte tidsrum, mens reproducerbarheden undersøges ved at variere en parameter af gangen. Samtidig undersøges robustheden. Når man undersøger robustheden kan vægten lægges på ph, ionstyrke eller polaritet. Endelig er nøjagtigheden vigtig, og det er derfor også nødvendigt med veldefinerede referenceforbindelser. 13

15 Optimering: En optimering vil indeholde en række forsøg, hvor man prøver at forbedre en allerede eksisterende metode. Ved en optimering kan man ændre på flere forskellige parametre f.eks.: Stationær fase, mobil fase, flow, temperatur og prøvemængde. Valg af stationær fase. Ved normal fase chromatografi skal den stationære fase være forholdsvis mere polær. Kolonnematerialer med disse egenskaber kan for eksempel være silica, aluminiumoxid og nitril eller aminomodificeret silica. Silica har sur karakter, medens aluminiumoxid er basisk. Silicakolonner er de mest anvendte. Til adsorptionschromatografi bør kolonnerne være aktiverede, det vil sige at systemet skal gøres vandfrit. Vandet binder sig til silicakolonnen, hvorved det kommer til at deltage i separationen, med det resultat at reproducerbarhed og selektivitet forringes. Ved omvendt fase chromatografi skal den stationære fase være relativ upolær. Silica anvendes som bæremateriale og forskellige upolære ( hydrofobe ) forbindelser bindes kovalent til silicaoverfladen. De almindeligste organiske upolære forbindelser der bindes til silicaoverfladen er C-18 eller C-8, men også phenyl, nitril og amino anvendes. Polariteten er stigende fra C-18, phenyl,c-8, nitril til amino. Strategi for valg af kolonner. Som udgangspunkt kan følgende kolonneparametre anvendes: Kolonneparametre Kolonnelængde og diameter 15 cm og 0,46 cm Partikel størrelse 5 μm Pore størrelse 80 til 100 Å Partikel overflade areal 150 til 350 m 2 / g Kemisk bunden fase C 8 eller C 18 (omvendt fase ) CN og diol (normal fase) Tabel 4 : Kolonne parametre. Som regel vil et laboratorium vælge en kolonne type, som allerede anvendes på stedet, idet man så allerede har kendskab til egenskaber hos stationær fase. De krav, som kan opstilles, hvis man vælger at skifte til en anden kolonne type er : Høj batch til batch reproducerbarhed, høj kolonne til kolonne reproducerbarhed, symmetriske toppe og stort antal bunde ( høj effektivitet ). Valget af kolonne har indflydelse på analyse tid, selektivitet og specificitet. 14

16 Opbygning af stationær fase. Den mest udbredt kolonne type, der anvendes er octadecylsilan ( RP C 18 ), hvor den upolære kulstofkæde er kemisk bundet til kiselgelens (silica) overflade. Dette sker ved en derivatisering af silanolgrupperne ved hjælp af alkylchlorsilaner, der danner stabile bindinger til silica. Mange kemisk bundne faser er endcapped, det vil sige at antallet af ureagerede silanol grupper er derivatisrede med trimethylchlorsilan. Figur 7: Encapped.[2] Afhængigt af antallet af chloratomer i silan-reagenset dannes forskellige lag. Der kan dannes en cross-linking af kulstofkæderne, dette resultere i et højt kulstof indhold og en upolær stationær fase. Denne form for stationær fase er syre-, base deaktiveret. Denne fase udviser høj sterisk selektivitet. Figur 8: Cross-linking af kulstofkæder.[2] Andre stationære faser er basedeaktiverede og med en tæt monomerisk overflade- dækning. Den tætte overflade af alkylgrupper giver en stabil fase, som finder anvendelse i forbindelse med sporanalyser i forbindelse med LC / MS. Figur 9: Deaktiveret kolonne med tæt monomerisk overfladedækning.[2] 15

17 Der kan også indbygges polære grupper i kulstofskelettet, der reagerer med rest - silanolgrupperne og dermed afskærmer analytten. Figur 10: Indbygning af polære grupper i kulstof skelettet. [2] Der anvendes tit basedeaktiverede stationære faser, da rest silanol grupperne også deltager i den chromatografiske proces ved adskillelse af basiske og polære komponenter. Dette kan medføre brede toppe og dårlig detektor følsomhed. Valg af mobil fase. Ved omvendt fase chromatografi er basiseluenten vand. Hvis vand alene udgør den mobile fase, vil analysetiden normalt blive for lang. Derfor tilsættes en eller flere organiske væsker for at mindske polariteten af eluenten. Som organiske modifiere anvendes ofte methanol, acetonitril eller tetrahydrofuran med methanol som den mest polære og acetonitril som den mindst polære. Ved normal fase er basiseluenten hexan eller heptan. Lavere alkoholer som for eksempel propanol tilsættes i varierende mængde for at gøre eluenten mere polær. Tilsætning af sure eller basiske væsker kan være nødvendige til adskillelse af ioniserede forbindelser. Strategi ved valg af mobil fase. For både normal og omvendt fase gælder det, at k-værdien optimeres først ved at ændre på polariteten af mobil fase. Hvis dette ikke er tilstrækkeligt til at opnå en god separation ændres den kemiske sammensætning, det vil sige arten af modifier, således at selektiviteten øges uden af kapaciteten påvirkes væsentligt. For at opnå uændret kapacitet skal mobil fases polaritet så vidt muligt holdes uændret. Der findes flere metoder til bestemmelse af den eluotrope styrke. De mest kendte er Hildebrandts index (ε o ) og Snyders polaritets index bestemt på henholdsvis Al 2 O 3 og C

18 Solvent Klasse Viskositet cp UV-Cutoff Nm ε o Polaritet Al Polaritet C 18 Heptan 0 0, ,01 0,1 Toluen 7 0, ,29 2,4 Chlor- Benzen 8 0, ,7 Ether 1 0, ,43 2,8 Tetra- Hydrofuran 3 0, ,45 4,0 4,5 Chloroform 9 0, ,40 4,1 Ethylacetat 6 0, ,58 4,4 Acetonitril 6 0, ,65 5,8 3,2 Ethanol 2 1, ,88 Methanol 2 0, ,95 5,1 2,6 Eddikesyre 4 1,20 stor Vand 9 1,0 stor 10,2 0 Tabel 5: Eluotrop række og solvent egenskaber. [3] Udover at solventerne er opstillet efter stigende polaritet, er de også inddelt i klasser efter selektivitet. Stofferne i samme klasse har ens chromatografiske egenskaber. Udskiftes en eluent med en anden, der har samme polaritets indeks, men som tilhører en anden klasse, må man forvente helt anderledes resultater. Flow, temperatur og prøvemængde. Et højt flow kan sænke analysetiden betydeligt, men det kan blive et problem, hvis trykket bliver tilsvarende højt eller effektiviteten (N) bliver lavere. Chromolith-kolonner er derimod opbygget, således at der kan transporteres store mængder eluent gennem kolonnen uden at trykket stiger, samtidig med at den store overflade sørger for separationen af komponenterne. Med disse kolonner kan flowet varieres fra 1 ml/min. til 9 ml/min. Det er derfor muligt at optimere en metode ved at lave en flowgradient. Det er en fordel med en kolonneovn, således at temperaturen kan varieres. Jo højere temperatur des kortere analysetid. En forøgelse af temperaturen på 1 C vil normalt betyde en formindskelse af retentionen (k) på 1-2%. En påvirkning af k medfører samtidig en ændring i α og er kan derfor få en betydning for resolutionen. Det er langt lettere at optimere på temperaturen end det er at skifte stationær eller mobil fase. Temperaturoptimering er mest fordelagtig ved chromatografering af ioniserbare forbindelser og nogle neutrale forbindelser. Nogle ulemper kan være, at den stationære fase 17

19 ikke er stabil ved højere temperaturer, og den mobile fases viskositet og damptryk kan også sætte begrænsninger for temperaturvalget. Prøvemængden varieres lettest ved hjælp af en autosampler, men man kan også variere loopstørrelsen. I de fleste tilfælde har prøvemængden ingen indflydelse på retentionen, effektiviteten eller resolutionen. Prøvemængden afhænger af kolonnens dimensioner og mængden af stationær fase. I det tilfælde hvor man arbejder med sporstofanalyser kan det være interessant at arbejde med så store mængder prøve som muligt. Man kan ved store mængder prøve få meget brede toppe, og derved vil effektiviteten falde og resolutionen bliver dårlig. 18

20 Gradienteluering. Ved eluering af neutrale stoffer af uens polaritet kan elueringsproblemet undertiden løses ved gradienteluering d.v.s. en eluering, hvor den mobile fase ændrer polaritet under elueringen. Gradienteluering kan kun udføres, hvis man enten har en binær pumpe ( blanding på lavtryksiden ) eller to isokratiske pumper, der styres af en solventprogrammer ( blanding på højtryksiden ). Gradienten opbygges på baggrund af isokratiske elueringer med høj og lav polaritet i eluenten eller ved en lineær gradient i det valgte polaritetsområde. Typisk vil der anvendes en gradient, der for eksempel starter ved 10% acetonitril og som ender med 100 % acetonitril over 10 minutter. Figur 11 : Lineær gradient. Gradienteluering kan overvejes, hvis resolutionen er dårlig for stoffer, der elueres for hurtigt eller for langsomt i den isokratiske eluering eller hvis blandingen er meget kompleks (f.eks. kulhydrater og proteiner). Hvis gradienteluering vælges bør man tage hensyn til, at gradienten er forsinket i forhold til pumpeprogrammet. Det betyder at mobil fases sammensætning i pumpen er forskellig fra mobil fases sammensætning på kolonnen. Ulemperne ved gradient eluering skyldes primært, at kolonnen ikke når at komme i ligevægt, da mobil fases sammensætning ændres under elueringen. Manglende ligevægt medfører dårlig repeterbarhed i systemet. Dette kan tildels afhjælpes ved at afslutte en gradienteluering med et vaske- og ekvilibreringsstep. Basislinien er ofte mere urolig end ved isokratiske elueringer, hvilket skyldes manglende ligevægt, urenheder eller gradientens programmering. Da der ændres polaritet under gradient elueringen vil urenheder fra vand, der oftes 19

21 akkumuleres i toppen af stationær fase elueres. Det er derfor nødvendigt at køre et antal blind, indtil basislinien er stabil. Figur 12: Akkumulerede urenheder, der elueres ved lineær gradient eluering. På figur 12 ses en blank gradient (eluering uden injection af prøve). Mobil fase A = H 2 O, B = CH 3 CN, O % B til 1OO % B. Når man skal udvikle en gradient og man vil undgå luftdannelse i blandekammeret, kan man benytte to forblandede eluenter f.eks. 90/10 methanol/vand og 10/90 methanol/vand eller indskyde en degasser i systemet. Pumperne, som anvendes til gradienteluering skal kontrolleres. Man undersøger om de udfører en korrekt blanding. Dette gøres ved et gradientprogram, hvor mængden af 0,1 % acetone i vand stiger over en bestemt tid. Udfra gradientens forløb kan blandingen beregnes. Dette er meget ofte beskrevet i manualerne ofte under enten specifications eller under performance. Gradienteluering kan også anvendes som et indledende trin i metodeoptimeringen, idet man ved en enkelt kørsel får overblik over chromatografien, om der f.eks. skal tilsættes buffer m.m. Hvis man kan arbejde under isokratiske forhold er dette at foretrække, idet repeterbarheden bliver bedre. 20

22 Chromatografi af ionogene stoffer. Separationen af ionogene stoffer kræver specielle forholdsregler. Uden sådanne ville disse stoffer, når de er på ionform, næsten udelukkende være i den mobile fase d.v.s. de næsten ikke tilbageholdes af stationær fase. (t r svarer næsten til t 0 eller k = 0). Der er to muligheder for at påvirke de ioniserede stoffer, så de tilbageholdes af stationær fase. Der kan anvendes ionsupression eller ionparchromatografi. Ionsupression. Når der anvendes ionsupression (ionundertrykkelse), skal chromatografisystemets ph fastlægges med henblik på minimal ionisering af prøvemolekylerne. Der skal arbejdes med en buffer, hvor ph skal fastlægges afhængig af stoffernes pka-værdier. ph i bufferen skal vælges ± 1, ±2 enheder fra stoffets pka værdi. Samtidig skal bufferen have maksimal kapacitet d.v.s. der skal findes et buffersystem, hvor ph i bufferen skal være tæt på pka-værdien af bufferstoffet. Bufferen skal være 0,1 0,001 M. Bufferen må ikke absorbere i UV-området. Ved metodeoptimering i en blanding af uladede og ionogene stoffer vælges oftest, at finde frem til den rigtige polaritet af mobil fase ved hjælp af metanol/vand, det vil sige at k fastlægges for uladede forbindelser. Derpå erstattes vandet med en passende buffer, således at de ionogene molekyler kommer på uladet form. Anvendes en ph lavere end 2 vil de kemisk bundne C 18 -kæder fraspaltes. Dette medfører en ændring af kolonnens selektivitet og anvendes ph større end 8 vil kiselgelen (bærematerialet) opløses. Dette kan konstateres ved, at alle toppe viser opsplitning på chromatogrammet. Den analytiske kolonne kan beskyttes ved at anvende forkolonne. Da stationær fase kun kan anvendes ph 2 ph 8 betyder dette, at kun svage syrer og baser kan chromatograferes, uden at stationær fase nedbrydes. 21

23 Chromatogram for prøve der indeholder benzoesyre og chlorbenzoesyre og ethylbenzoat. Benzoesyre og chlorbenzoesyre kan ikke adskilles i et almindeligt omvendtfase system med methanol:vand. Der ses en pæn k-værdi for ethylbenzoat. Der kan ske en separation baseret på ph. Ved ph 2 er de to syrer uladede. Separationen sker efter polaritet. Ethylbenzoat har tilnærmelsesvis samme k-værdi. Stødpudens ph og styrke skal vælges med omhu. Men også arten af stødpudens anioner og kationer har betydning. Blandt stødpude anionerne er især polariteten af betydning. Phosphat er betydelig mere polær end acetat og citrat. Dette medfører i et omvendt fase system vil phosphat, anvendt som buffer, have mindre kapacitetsfaktorer end et tilsvarende system med ph justeret med citrat. Stødpudens kationer har som funktion at nedsætte effekten af restsilanolgrupperne. Kaliumioner er mere effektive end natriumioner. I tabel 6 er opskrevet de mest anvendte buffere. Trifluoreddikesyre Phosphorsyre / Kaliumdihydrogenfosfat pka Bufferområde UV Cut-off 1,5 2,5 210 nm pka 1 = 2,1 pka 2 = 7,2 Citronsyre pka 1 = 3,13 pka 2 = 4,77 pka 3 = 5,40 1,1 3,1 6,2 8,2 2,1 6,4 < 210 nm 230 nm 30 mm Eddikesyre 4,76 3,8 5,8 210 nm, 10 mm Tabel 6 : Anvendte buffere til ionsuppression og ionparchromatografi. 22

24 Er ionsupression ikke mulig, da stoffernes pka værdier er sådan, at ph i bufferen vil ligge udenfor området ph 2 8, vil alternativet være at anvende ionparchromatografi. Ionparchromatografi. Ionparchromatografi bygger på den kendsgerning, at en ioniseret forbindelse ved tilsætning af en passende anden ioniseret komponent med modsat ladning (modion) har mulighed for at danne et uladet ionpar. Modionen tilsættes mobil fase og det dannede ionpar vil tilbageholdes af stationær fase. Eksempelvis vil pyridoxinchlorid ( pka = 4,9 ) i mobil fase ph = 2,5 være ioniseret. RNH 2 + H + RNH 3 + Tilsættes natriumpentansulfonat i mobil fase ved ph = 2,5 vil følgende ion-pardannelse finde sted : RNH C 5 H 11 S0 3 RNH SH 11 C 5 i mobil fase uladet ionpar. t 0 t r Der er tre faktorer, som har indflydelse på ionpardannelsen og hermed påvirker retentionstiden, det er ph, modion koncentrationen og arten af modion. I et ionchromatografisk system skal ph vælges, således at såvel prøvemolekyler og modionen er ioniserede. Den nødvendige buffer koncentration til styring af ph er mm, alt efter typen af buffer. Figur 13: Den molære modion koncentrations indflydelse på retentionen. [4] Den molære koncentration af modionen har betydning for retentionen af det dannede ionpar. Er modionkoncentrationen tilstrækkelig vil retentionstiderne være reproducerbare og toppene vil være symmetriske. 23

25 Figur 14: Antal kulstof atomers indflydelse på retentionen. [4] Arten af modion har betydning, idet der kan vælges mellem mere eller mindre upolære modioner. Separationen kan således optimeres, idet retentionen på den upolære kolonne vil være afhængig af det dannede ionpars upolære karakter. Generelt vil retentionen følge antallet af kulstofatomer. Til chromatografi af svage syrer og baser anvendes forskellige typer af modioner, idet ionpardanneren vil være afhængig af ladningen på det pågældende molekyle. Separation af baser Separation af syrer Natriumpentylsulfonat Tetrabutylhydrogensulfat Natriunhexylsulfonat Tetrahexylhydrogensulfat Natriumheptylsulfonat Sodiumdodecylsulfat Tabel 7 : Anvendte modioner. Alle typer af modioner, såvel uorganiske som organiske kan anvendes. Ved omvendt fase f.eks. af proteiner anvendes H 2 P0 4, som modion til det positivt ladede proteinstof ved lav ph. Valg af buffertype kan være kritisk ved UV - detektion, hvorfor det altid vil være en nødvendighed at scanne bufferen inden den tages i brug. 24

26 Ionchromatografi. Separationen af ionogene molekyler kan foretages ved at anvende ionsuppression, ionpar eller ved ionchromatografi. Metoden relateres til HPLC, idet det udstyr der anvendes er det samme. Uorganiske og organiske forbindelser kan analyseres, hvis der er polaritet tilstede i molekylerne. Mange prøver af biologisk oprindelse (aminosyrer, oligonucleotider, peptider, proteiner, nucleinsyrer) analyseres ved denne teknik. Separations princip: Den mobile fase er sædvanligvis en ionisk vandig opløsning og den stationære fase er en ionbytter. Detektionen kan ske ved UV-absorbans eller fluorecens måling, som ligeledes anvendes indenfor HPLC. Der anvendes ofte en ledningsevnedetektor, der er baseret på tilstedeværelsen af ioner i en opløsning. Separationen af ioner og polære komponenter sker på ioniske steder på stationær fase. Jo større ladning, jo længere vil ionen blive tilbageholdt på stationær fase. For prøver af biologisk oprindelse (proteiner) kan der anvendes en gradient med stigende ionstyrke. Dette opnås ved f.eks at begynde med 10 % KCl el. NaCl og 90 % acetonitril/vand blanding og sluttes med 90 % KCl el. NaCl. Anion bytning. Stationær fase er en polymer, der indeholder fastsiddende kvarternære ammoniumgrupper og mobile hydroxylioner. Den mobil fase er basisk, og oftest anvendes NaHC0 3, idet HC0 3 udskiftes nemmere end 0H. A + (resin- NR 3 ) + HC0 3 mobil fase HC0 3 mobil fase + (resin- NR 3 ) + A Under ionbytningen bindes anionen til stationær fase og HC0 3 vil være i mobil fase. Kation bytning. Stationær fase indeholder fastsiddende sulfonsyre grupper og den mobile fase er sur. Me + + (resin- S0 3 ) H + H + + (resin- S0 3 ) Me + mobil fase mobil fase Metalionen bindes til stationær fase og H + vil være i mobil fase. Elueringen afhænger af forskydningen af ligevægtene. Der kan tilsættes methanol til eluenten, der fremmer opløseligheden af nogle stoffer. 25

27 Figur 15: Ligevægte under elueringen.[1] Stationær fase. Den stationære fase kan bestå af polymere af polystyren og divinylbenzen. Disse polymere er hårde nok til at kunne modstå trykket i kolonnen og stabile under ekstreme ph-værdier. Ved sulfonering af benzen indføres sulfonsyre grupper (kationbytter). En anionbytter startes fra samme polymere og ved hjælp af en chlormetylering kan polymeren reagere med sekundære eller tertiære aminer (anionbytter). Der anvendes også porøse silica partikler, der fungerer som bærestof for alkylphenylgrupper indeholdende sulfonsyre- og kvarternære ammoniumgrupper. Ledningsevnedetektor. Denne detektor måler ledningsevnen i mobil fase, som indeholder ioner fra analyt og mobil fase. Det er vanskeligt at detektere analyttens signal i denne blanding. Derfor anvendes en suppressor kolonne, der skal reducere ledningsevnen i mobil fase så kun analyttens ioner detekteres. Neutralisation af mobil fase ved eluering af kationen Me + : Figur 16: Supressorprincippet.[1] En kationbytning sker på en kationbytter kolonne med en mobil fase, der er gjort sur med saltsyre. Efter kationbytningen indeholder mobil fase Me +, Cl og H +. Mobil fase kommes på en ny kolonne, en anionbytter, herved opnås at Cl bytter plads med anionbytterens 0H. 26

28 Hydroxylionerne reagerer med hydrogenionerne i mobil fase under dannelse af vand. Efter suppressionen vil der være Me + og 0H tilbage, hvor Me + kan detekteres. På figur 17 ses en ionchromatografisk adskillelse af forskellige anioner. Figur 17:Ionchromatografisk adskillelse af anioner. 27

29 Størrelseschromatografi Størrelseschromatografi (Size Exclusion Chromatography, SEC) kaldes gelfiltrering, når den mobile fase er vandig, og gel permations chromatografi (GPC), når den mobile fase er et organisk opløsningsmiddel. Metoden relateres til HPLC, idet udstyret, der anvendes, er det samme. Men effektiviteten er ikke så god som ved konventionel HPLC. Størrelseschromatografi anvendes til adskillelse af syntetiske og naturligt forekommende makromolekyler. Separationsmekanisme: Princippet i størrelseschromatografi er en adskillelse efter molekylstørrelse (vægt). Da prøvemolekylerne har forskellige størrelser, vil deres evne til at trænge ind i den stationære fases porer også være forskellige, og dette medfører en adskillelse af molekylerne. Der anvendes materialer med en lille partikeldiameter (5 10 μm), med lille partikelstørrelse og porediameter. Molekylerne kan trænge længere eller kortere ind i stationær fases porer efter deres molekylstørrelse. Små molekyler kan diffundere længst ind i de porøse partikler og tilbageholdes derfor mest. Molekyler, som er for store til at trænge ind i de porøse porer følger med mobil fases og forsinkes derfor ikke. Det totale volumen ( V M ) i kolonnen kan deles i to, V I repræsenterer væskevolumnet udenfor porerne og V p repræsenterer væskevolumnet i porerne. V I repræsentere det volumen, der er nødvendigt for at transportere et stof, som er så stort at det ikke kan komme ind i stationær fases porer. V M = V I + V p repræsenter volumnet for et lille molekyle, der kan trænge ind i porerne. Elueringsvolumet ( V e ) består af V M og V I. For et molekyle af passende størrelse fås : V e = V I + K V p. Dette medfører K = (V e V I )/ V p Når K = 0 er molekylet så stort, at det ikke kan trænge ind i porerne. K = 1, når molekylet kan trænge ind i alle porer. Figur 18: Separations princip ved størrelses chromatografi.[1] 28

30 Stationære faser. Stationære faser inddeles i hydrofile faser, der anvendes sammen med en vandig mobil fase, og lipofile faser, der anvendes sammen med organiske opløsningsmidler som tetrahydrofuran eller chloroform. Stationære faser bestående af polyvinylalkoholer polymeriserede med polyvinylacetater eller porøse silicageler indeholdende glycerylpropylgrupper anvendes til separation af hydrofile (polære) forbindelser. Styren divinylbenzener anvendes til separation af syntetiske molekyler opløst i et organisk opløsningsmiddel. Tetrahydrofuran er et godt opløsningsmiddel for mange polymere, og bliver ofte anvendt som mobil fase. Kalibrering af en kolonne med en given porestørrelse og porestørrelsesfordelingsområde og med en bestemt eluent foretages ved at chromatografere standarder med kendt molekylvægt. Kalibreringskurven optegnes ved at afbilde log (M) som funktion af elueringsvolumnet, hvor M er massen af en komponent. 29

31 Detektorer Diode array detektoren. UV-detektoren i form af en variabel bølgelængde detektor er langt den mest anvendte detektor, idet den er : Universel Følsom Ikke særlig følsom for pulsationer eller temperatur ændringer Robust. Detektion i UV-området bygger på at, stoffer absorberer UV-lys afhængigt af deres molekylstruktur. Det er indholdet af chromofore grupper, der afgør hvilken bølgelængde, der skal anvendes ved HPLC analysen. ε molær absorbanskoefficent Funktionel gruppe Chromofor Bølgelængde,nm Aldehyd -CHO Keton C=O Nitrat -ONO Benzen C 6 H Brom -Br Tabel 8: Funktionelle gruppers absorbans. De anvendte mobile faser, som vand, methanol, acetonitril og tetrahydrofuran har en uvæsenlig UV-absorption ved bølgelængder over 210 nm. Ved meget lave bølgelængder under 210 nm ses stor absorbans, idet mange stoffer og specielt oxygen opløst i mobil fase absorberer her. Under metodeudvikling/optimering sker identifikationen af stofferne ved hjælp af retentionstider eller ved spiking. Næsten samme retentionstid mellem prøve og standard sandsynliggør identitet. En symmetrisk top sandsynliggør, at toppen kun indeholder et stof. Det kan være svært, at afgøre om der er et eller to stoffer, der har samme retentionstid og derfor vil skygge for hinanden. 30

32 Ved at anvende en fotodiode array detektor kan man samtidig optage et spektrum af den chromatografiske top og hermed få information om identiteten og homogeniteten af den enkelte top. Diode array detektoren scanner samtidig hele bølgelængde området igennem, under kørslen. Dette foregår, idet der sendes polychromatisk lys til detektorcellen. Efter opsplitning i monochromatoren sendes viften af lys til en række fotodioder, sådan at der en detektor for hver femte bølgelængde. Behandlingen af data sker i en tilsluttet computer. Nedenfor er det chromatografiske system skitseret : 1. Injektion 2. Separation 3. Integration og kvantificering 4. Renhedscheck af top 5. Identifikation af top 6. Udskrivning af chromatogram 7. Udskrivning af rapport Chromatogrammet udskrives og Spektre lagres på hard disken. Sammenligning af spektre ved toppens start, maksimum og slut. Renhed, identitet og mængde. Ved brug af diode array detektoren udbygges mulighederne for sikker identifikation, idet denne detektor har faciliteter til under chromatograferingen : 1. At scanne hele detektorens bølgelængde område 2. At optage stoffernes UV- spektrum ved topstart, topmaximum og topslut. Når chomatografien er slut, er der mulighed for at behandle data, beregne og udskrive f.eks. 1. Absorbans ratio 2. Peak purity indeks 3. Totale absorbansspektre fra et hvert punkt på chromatogrammet og foretage overlay 4. Absorbans profil mapping. Dette medfører, at diode array detektoren anvendes på laboratorier, hvor der arbejdes med metodeudvikling/optimering, stabilitetsundersøgelser, kinetiske undersøgelser og renhedsbestemmelser. 31

33 Figur 19: Adskillelsen af acetyl- og salicylsyre. På figur 19 ses et chromatogram fra en analyser, hvor man har forsøgt at adskille acetylsalicylsyre og salicylsyre. Diode array detektoren udskriver chromatogrammer ved to udvalgte bølgelængder. Herudover kan aflæses: 1. Spektrum number 2. Peak retention time 3. Peak purity indeks 4. Wavelength of maximum absorbance. I stedet for at måle ved to bølgelænger kunne man vælge, at detektoren skulle beregne absorbans ratio. Absorbans forhold. Ved bestemmelse af absorbance ratio bestemmes absorbansen ved forskellige bølgelængder (punkter på toppen). Hvis dette forhold er ens for bestemte bølgelængder, er det sandsynligt, at der kun findes et stof i toppen. Dette princip anvendes også til renhedsbestemmelser af et stof, idet der foretages en sammenligning af spektre optaget på forsiden og bagsiden af en top. 32

34 Bestemmelse af renhed. Peak purity indeks kan her sammenlignes UV- spektre fra forskellige scaningspektre fra forskellige steder på chromatogrammet. Hvis spektrene er identiske vil purity indeks være 1. Dette gælder også selvom stofferne foreligger i forskellig koncentration. Hvis spektrene er fra forskellige stoffer, vil purity indeks være større end 1. Sammenligning af spektre. UV- spektre kan printes ud over hele bølgelængde området. Ved at benytte overlay kan spektre lægges oven i hinanden. Figur 20: Ovenstående spektre er optaget af acetyl- og salicylsyre. Chromatogrammet repræsenteret tredimentionalt. Absorbance profile mapping præsenterer chromatogrammet tredimentionalt. Abcissen er bølgelængen i nm og ordinaten er tiden. Hver top er markeret med en cirkel og størrelsen af cirklen indikerer absorbans. Nedenfor ses et profil map af acetyl- og salicylsyre. For hvert af de små streger på ordinat aksen er optager et spektrum, og til hver streg svarer en bestemt retentionstid. Cirklernes størrelse viser den pågældende absorbans. Små cirkler repræsenterer absorbancer på 0,001 0,002. De store cirkler repræsenterer absorbanser på 1,0 1,5. 33

35 Figur 21: Absorbance profil map 34

36 MS detektoren Til mange formål er massespektrometer (MS) detektoren mere følsom og specifik end andre LC detektorer. Den kan detektere analytter, der ikke indeholder chromoforer grupper og identificere komponenter, selvom disse ikke er ordentlig separeret ved f.eks LC. MS anvendes både til kvantitativ og kvalitativ bestemmelse af organiske forbindelser. Princip. Ved energitilførsel vil molekyler fragmenteres til ioner og neutrale molekyler: MOLEKYLE + Energi MO + + LE + + KYLE + + MOLEKYLE + + andre De dannede ioner sorteres nu efter deres masse/ladnings-forhold (m/z) i et massefilter og vha. en detektor og software produceres et massespektrum. Instrumentering. Af nedenstående figur ses principopbygningen af et massespektrometer. Figur 22: Opbygning af MS 35

37 Ionkilde. Der findes en række forskellige ioniseringsteknikker: Electron Impact (EI) Chemical Ionization (CI) Electro Spray (ES) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI) EI: CI: ES: Bombardement af prøvekomponenter med elektroner, hvorved prøvekomponenter ioniseres: M + e- M+ + 2 e- En gas f.eks methan indføres sammen med prøve i en elektronstråle. Gassen ioniseres og overfører ladning til prøvekomponenter: CH4 + e- CH e- CH4+ + M CH4+ + CH4 Prøve forstøves fra en spids, der har høj spænding i forhold til en modelektrode. Aerosoldråberne bliver ladede og pga. coulomb eksplosioner kommer ioner på gasform. Figur 23: Electro spray APCI: Eluent og prøve forstøves. Eluenten ioniseres ved elektroner fra en coronanål. Eluenten overfører ladning til prøvekomponenterne, hvorved disse lades. 36

38 Figur 24: APCI APPI: Eluent og prøve forstøves. Prøvekomponenterne ioniseres ved fotoner fra en UV-lampe. Figur 25: APPI Massefilter. I massefilteret sorteres de forskellige ioner efter deres masse/ladnings-forhold. De mest udbredte er: Quadropol Time-of-flight (TOF) Ion trap 37