Blod, en spotguide. Leukocytter /µl Neutrofile gr. 60% manan.dk INGEN!!!

Transkript

1 Blod, en spotguide Blodet kan groft deles op i 2 dele: Formede og uformede del. Den formede består af celler og thrombocytter, mens den uformede del består af plasma, dvs væske med opløste proteiner og elektrolytter. Hvis en blodprøve centrifugeres vil der opstå 3 faser: Den nederste er rød (erythrocytter). Procentdelen af samlet blodprøve = hæmatokrit (43-35% normalt. Undtagelser ved visse sygdomme + cykelryttere). Dernæst er der et tyndt hvidt lag (leukocytter og thrombocytter). Øverst er der plasma (klar, gullig væske). Type Antal Funktion (især, kort fortalt) Størrelse Cytoplasma Kerne Erythrocytter 5 mio /µl Transport af ilt fra lunger til væv. Ca. 7 µm LM: Homogent eosinofilt med central INGEN!!! opklaring. 1% har basofile klumper i spec. farvning (retikulocytter). EM: specielt cytoskelet ligeu nder overflader giver store elasticitet. Thrombocytter /µl Lukning af sår Igangsættelse af koagulations-kaskader Ca. 3 µm Leukocytter /µl Neutrofile gr. 60% LM: central, granuleret zone = granulomeret. Perifær lys zone = hyalomeret. Diskosformet. EM: indeholder alpha granula (PDGF, von Willebrand faktor, fibronogen) og deltagranula (serotonin, ADP). Form opretholdes af ring af mikrotubuli Fagocytose Ca µm LM: fine, lysbrydende ufarvede granula, få farvede granula. EM: 2 typer granula: mod. Primære lysosomer (ca. 0,5µm) + sekundære granula med bakteriocider Eosinofile gr. 3% Bekæmpelse af parasitter Ca µm LM: Stærkt eosinofile granula. EM: Store vesikler (0,5-1µm). Indeholder lysosomale proteiner. Basofile gr. 0,5% Ukendt / som mastceller Ca µm LM: Stærkt basofile granula, farves metakromatisk. EM: vesikler (ca. 0,5µm) indeholder bl.a. heparin (GAG) og histamin (som mastceller) Monocytter 5% Forstadier til makrofager Ca µm LM: Fint granuleret. Ofte formet efter omg. Erythrocytter (kanter) EM: vesikler ca. 0,4µm = mod. Primære lysosomer Lymfocytter 30% Humeralt & cellulært immunforsvar Ca. 7-9 µm LM: meget lidt. EM: få lysosomer INGEN!!! Er ikke celler, men cytoplasmafragmenter 3-5 lapper (stavkernede og hypersegmenterede variationer ses) 2 lapper (briller) forbundet af cytoplasmabro 2-3 lapper ofte skjult af granula Nyreformet Stor, mørk, rund med indkærvning

2 Spotguide til kirtler Erik Brandt, 2003 Endokrine Afgiver produkt til blodbanen Celler ligger trabekulært ( hulter til bulter, uden entydig struktur) (trabekulær endokrin kirtel) Undtagelse: Kirtelepithel i Gl. thyroidea danner follikler omkring en proteinmasse, der farves homogent eosinofilt. Kaldes en follikulær endokrin kirtel. Mange blodkar, evt. med blod (erythrocytter) Ingen udførselsgang Exokrine Udmunder via udførselsgang på ydre/indre overflade Ligger i veldefinerede endestykker Få blodkar Mange udførselsgange Exokrine Kirtler Unicellulære kirtler = Bægerceller (udelukkende) Multicellulære kirtler Secernerende epithelflader (kun i mavesækken) Intraepitheliale kirtler (inde i epithel) Egentlige kirtler Består af endestykker: Serøs eller mukøs Serøse kan ligge for sig selv Mukøse er altid sammen med serøse (varierende forhold) Sekretets art Serøse Mukøse Endestykke Små, regelmæssigt runde Store, uregelmæssige Undt.: Von Ebnerske halvmåner Lumen Lille, ses sjældent i LM Stort, tydeligt Undt: Tydeligt lumen i gl. lacrimalis Kerner Runde, basale halvdel af cellen Flade, ligger helt basalt, basofile(mørke) Cellegrænser Utydelige Tydelige Cytoplasma Relativt mørkt (HE, VGH), basal basofili (HE) Meget lyst (HE, VGH). Stærkt PASpositive. Mørkeblå i Alcian Blue. INGEN Svar muligheder: basal basofili. Rent serøs (gl. parotis, pancreas, gl. lacrimalis) Blandet, overvejende serøs (gl. submandibularis) Blandet, overvejende mukøs (gl. sublingualis) (ellers findes mange spredte endestykker i øvre del af fordøjelseskanalen: mukøse & serøse) Udførselsgange (har følgende karakteristika i modsætning til endestykker) Stort lumen, Kerner ligger centralt Pancreas Faldgruber Blandet kirtel med exokrin del (serøs) og endokrin del (trabekulær) Endokrint væv findes spredt i exokrine væv som øer (Langerhanske øer) Ses som lysere end omgivende væv, ses bedst på LAV forstørrelse Hvad skriver man??? Rent Serøs exokrin kirtel med øer af trabekulært endokrint væv Pancreas: Hvis kirtlen er rent serøs.kig EFTER LANGERHANSKE ØER Gl. Lacrimalis: Lille kirtel, ligger typisk på hele dækglas. Rent serøs. Bemærk dog at den har tydeligt lumen

3 Erik Brandt 03 Muskelvæv spotguide Glat Muskulatur Længdesnit Tværsnit Små celler (korte, smalle, tenformede) (oftest mange) Central, aflang kerne INGEN TVÆRSTRIBNING Lille diameter; kerne ses kun i største (pga tenform) 1 Central kerne Hjertemuskulatur Længdesnit Tværsnit Små celler i forhold til skeletmuskulatur (ca. 15µm i diameter/bredde) TVÆRSTRIBNING Indskudsskiver 1 Central kerne Mange kapillærer (-> erythrocytter) i væv omkring (tænk på funktion) FIND STED I PRÆPARAT MED LÆNGDESKÅRET Findes altid (stort set) pga vekslende fiberretninger MANGE kapillærer (-> dermed mange erythrocytter) (central kerne) Skeletmuskulatur Længdesnit Tværsnit MEGET lange, brede celler (fibre) MANGE perifere kerne TVÆRSTRIBNING Stor diameter Flere perifere kerner i hver fiber

4 Erik Brandt 2003 Spotguide - Differentialdiagnoser 1 Generelt: Spot aldrig ud fra 1 karakteristika (mærkelige farvninger/ snit kan snyde) Hvis du ser 1 egenskab, check for de andre... Giv det mest logiske bud Kig rundt i præparatet, så man ikke bliver snydt af artefakter / mærkelige snit!!!! SPOT EN MASSE!!! Når man først kender præparater / har set dem før -> Så er det rimelig let!!! Diagnose: Udseende (HE) (VGH) Kerner Længdesk. glat musk. Diagnose = glat musk. Kraftigt eosinofil sammenhæng. masse, Kerner spredt i massen Ikke lysbrydende Grøn/gul sammenhæng. Masse (cytoplasma), evt. lidt rødt imellem (kollagen) Aflange, ovale (franskbrød) Tæt, regelmæssigt bindevæv Store parallelle fiberbundter, kerner imellem disse. Svagt/ikke eosinofilt Lysbrydende Kraftige røde fiberbundter, ikke andet ses. Helt affladede (basofile streger) Ligger i rækker mellem fiberbundter Længdesk. perifer nerve Lange, bølgende opklaringer (=axoner) Væv m. Kerner herimellem (Kollagen) Opklaringer(evt. grønlige) med rødt bindevæv imellem Små, mørke (fra Schwannske celler) Forekomst Fx fordøjelseskanal Sener, ligamenter Perifere nerver Andet ofte sammen med tværskåret glat muskulatur. Evt kan man se tværstribet skeletmuskulatur tæt på. Præparat Fx 61, 69, 93 (mange steder) 85 99

5 Erik Brandt Biofysik Indholdsfortegnelse Aktionspotentialet 2 Aktionspotentialets propagering 5 Almen muskelfysiologi 6 Almene sensoriske receptormekanismer Cellulær Signalering 14 Signaltransduktion via G-protein Impulstransmission over cellegrænser Interneuronal transmission. 23 Membranpotential Perifere Nerver. 28 Transportprocesser

6 Erik Brandt Biofysik Aktionspotentialet Alt eller Intet loven Stimulus -> fyrer fuldt aktionspotential -> ikke fyre (subliminalt stimulus) under tærskelværdien -> falder langsomt tilbage til hvilepotential Aktionspotential vil altid have samme form / amplitude Varighed & Amplitude Intracellulært Varighed Ca. 1msek Amplitude Ca. 100mV Extracellulært Varighed Ca. 1msek Amplitude 0,01 1 mv Ionteorien for aktionspotentialet 1) Stimulus (over tærsklen) 2) -> åbning af voltage-gated Na + kanaler -> influx af Na + (grundet dets ligevægtpotential) -> hurtig depolarisation af membranen og Overshoot til spidsværdi (+30mV) 3) -> inaktivering af voltage-gated Na + -kanaler -> åbning af voltage-gated K + -kanaler (Delayed) ->efflux af K + (pga ligevægtspotential) -> repolarisering af membran og Efter-hyperpolarisering (5-15mV < Vm) 4) -> voltage-gated K + kanaler lukker (når -> under åbningstærskel) -> inaktivering af Na+ -kanaler fjernes OG kanalen lukkes (ved repolariseringen) 5) ->Hvilemembranpotentialet genetableres langsomt (-70mV) Voltage-gated Na + -kanaler Aktiverings-gate Den gennemsnitlige gate åbner ved tærsklen (-50mV) Hurtig respons -> hurtig åbning af gaten (kanalen) Selvforstærkende kobling mellem Membrandepolarisering og g Na Idet Åbning af Na+ kanal -> yderligere depolarisation ->større sandsynlighed for åben kanal ( kædereaktion) 2

7 Erik Brandt Biofysik Åbning -> stigning af g Na -> forskydning af V eq m mod E Na (+55mV) -> øget influx af Na + ->depolarisering af membranen (Trin 2) Inaktiverings-gate Begynder at lukke ved tærsklen Forsinket respons -> inaktivering ca. 1msek efter aktiverings-gaten Lukning -> fald i g Na Åbner først ved repolarisering (uanset yderligere depol.) Sænkning af extracellulær Na + koncentration -> fald af aktionspotentialets amplitude ->E Na bliver mindre(pga fald i koncentrationsforholdet int./ext.) Delayed K + -kanaler (voltage gated) Åbning -> øget g K -> forskydning af V eq m mod E K (-90mV) -> øget efflux af K + -> repolarisering af membran Den gennemsnitlige kanal begynder at åbnes omkring tærkslen Langsomt respons g K Peaker når aktionspotentialet er halvt repolariseret ->hurtig repolarisering (sammen med fald i g Na ) Lukning Fald i g K Gennemsnitlig lukning af kanaler ved repolarisering INGEN inaktivering Langsomt respons ->efter-hyperpolarisering Refraktærperioder Her kan axonet/excitable celle ikke exciteres så let som i hvile Absolut refraktær periode Axonet/cellen kan slet IKKE exciteres Relativ refraktær periode Excitation er mulig, men sværere end i hviletilstanden Årsag Inaktivering af Na + -kanaler Aktivering af K + -kanaler (virker som shunt) Hyperpolarisering TEGN AKTIONSPOTENTIAL & KONDUKTANSER Se FIGUR 3-5 s. 34 i B&L Forklaring af alt-eller-intet -loven Ligevægtspotentialerne er konstante Ion-bevægelserne ikke ændrer på koncentrationerne(ikke måleligt) Maximum for g Na er tidsbestemt (inaktivering) 3

8 Erik Brandt Biofysik Ion påvirkninger på excitabilitet Na + erstattes af K + i ydermediet (el. Høj extracellulær K + koncentration) ->membranen depolariserer ->aktionspotentialet blokerer inaktivering af Na + -kanaler -> ingen excitabilitet gk har størst betydning for hvilemembranpotentialet ved høj [K + ]extr : E K -> mod 0 ->Vm -> vægtet sum af betydende ioners ligevægtspotentialer Klinik Kraftige forstyrrelser -> DØD Foretrukne henrettelsesmetode i US stater(i.v. K + injektion) Lav extracellulær K+ koncentration E K mere negativ ->hyperpolarisering forhøjet Ca 2+ el. Mg 2+ koncentration ->hæver tærsklen for udløsning af aktionspotentialet alle negative ladninger på membranproteiner skærmes (af X 2+ ) ->transmembran potentialgradient bliver stejl (spændingsafhængige ionakaneler udsættes for fuld pot.forskel) ->hæver tærskel (stor depol. for at udløse aktionspot.) Klinik Hypercalcæmi Hypotoni (med svækkede reflekser) Nedsat motilitet i tarmene Depression Konfusion Overledningsblok i hjertet Evt. asystole Lav extracellulær Ca 2+ koncentration ØGET excitabilitet INGEN negative ladninger er skærmet -> affladet potentialgradient ->lavere tærskel Klinik (optræder allerede ved <1,15mM) Let Paræstesi karpopedalspasmer Svær Kramper Epileptiforme angreb (uden bevidsløshed) Hjertearrytmier m. Hjerteinsuficiens livstruende 4

9 Erik Brandt Biofysik Aktionspotentialets Propagering Strømsløjfen SE TEGNING I RAPPORT FIG 8 el. FIG s. 39 B&L Ioner i strømsløjferne (bærerne) Extracellulært Na + Cl - Intracellulært K + Transmembran Na + (ind) K + (ud) Axondiametrets betydning for nerveledningshastigheden Større diameter -> større nerveledningshastighed Ved stor diameter -> ri mindre (indre modstand) -> længdekonstanten ( = rm ri ) -> stor Betydning af myelinisering for nerveledningshastighed Højere grad af myelinisering (lag) ->større nerveledningshastighed Længdekonstant øges Myelinisering -> rm større (membran modstand) (isolerer) Ranvierske indsnøringer (nodi) Huller i myelinisering (hver 1-2mm; 1µm bred) ->aktionspotentialet kun regenereret ved nodi (ca. 20µsek) ->øger hastigheden betydeligt = saltatorisk konduktion (impulsudbredning) Monofasisk/ Difasisk aktionspotential Monofasisk AP kortere varighed end difasisk AP (1msek 2msek) Monofasisk AP optegnes under passage af 1 elektrode Difasiske under passage af 2 elektroder 5

10 Erik Brandt Biofysik Almen Myskelfysiologi Alment om Kontraktilitet Sliding Filament Model Cross-bridge cycle 1. trin Myosin hoved bundet til aktin (45 stilling) Rigor konfiguration (jvf. Rigor mortis) ATP/ADP binding site frit 2. trin Binding af ATP (siden af hovedet vendende væk fra aktin) ->medfører konformationsændring ->frigivelse af myosin-hoved (lavere affinitet) 3. trin Spaltning af ATP -> ADP + P(vedbliver bundet til binding site) -> konformationsændring ->spænding af hovedet: 45 > 90 - konfiguration ->flytter sig 5nm herved myosinhoved - løs binding til aktin 4. trin svag binding fra før -> Fraspaltning af P -> kraftig binding af myosin-hoved til aktin 5. trin Fraspaltning af ADP (midt i power-stroke) -> Power-stroke = konformationsændring 90 -> 45 -> bevægelse af aktin (5-10nm) myosin går mod plus-enden 6. trin Tilbage til udgangsposition -> og så videre Vigtigste ATP-kilder under kontraktion 1) Frit ATP ringe mængde kun tilstrækkeligt til ca. 10 enkeltkontraktioner 2) Hurtig transfosforylering mellem ADP og kreatinfosfat ADP + CP -> ATP + C 3) Anaerob glykolyse 4) Oxidativ fosforylering af ADP Funktionelle forskelle mellem muskulatur Skeletmuskulatur Kun kontrolleret af somatiske nervesystem Adskilte fibre Hurtigt system p.g.a. Ca 2+ mobilisering ved hvert sarcomer Hjertemuskulatur Funktionelt syncytium med elektriske synapser (gap junctions) Autorytmik med frekvensmodulation via autonom innervation 6

11 Erik Brandt Biofysik Glat muskulatur Stor heterogen gruppe af korte fibre uden tværstribning Ofte funktionelle syncytier Bevaret evne til celledeling Tonus med overlejrede langsomme og ofte langvarige kontraktioner Kontrolleret af det autonome nervesystem i forbindelse med Forskellige modulerende faktorer Fx hormonale Kontraktionstyper og Mekaniske Egenskaber for en Tværstribet Skeletmuskel Kontraktionstyper Isometrisk Kontraktion med konstant længde Altså uden forkortning af muskelbugen Dog forkortes kontraktile elementer Isotonisk Kontraktion med konstant belastning (ydre) forkortning af muskelbugen Mekanisk latenstid Tiden fra stimulering (aktionspotentialets depolariseringsfase) -> mekanisk respons (isometrisk kraftudvikling) Perioden dækker over excitations-kontraktionskoblingen Hvilelængde (= ligevægtslængde) Længde, hvor ikke kontraherede muskel er udstrakt, men ikke udvikler passiv spænding Tegn længde-spændingsdiagram for muskel i hvile under kontraktion SE FIGUR 17-8 A;B i B&L (s. 278) Tegn sammenhæng mellem & GØR REDE FOR Isometrisk kontraktile kraft / muskellængde ved forsk. Stræk. SE FIGUR 17-8C i B&L (s. 278) Stimuleringsfrekvensens indflydelse på isometriske kontraktionshastighed SKITSER!!!!!! SE FIGUR 18-4 s. 285 B&L Enkeltkontraktion (twitch) Submaximalt respons til enkelt aktionspotential Summation af 2 eller flere stimuli Flere aktionspotentialer -> summation af twitches = partiel tetanus (inkomplet tetanus) Glat tetanus Mange aktionspotentialer -> summation = Komplet tetanus (maximal kontraktion) Der kræves stimulering med vis minimumsfrekvens (fusionsfrekvens) -> for at opretholde maksimal kontraktion (glat tetanus) Dette skyldes den faldende intracellulære Ca 2+ kontraktion Mellem stimuli (aktiv transport / symport) Skitser forkortningshastighed / afhængig af belastning isotonisk SE FIGUR 17-9 s. 280 B&L Isotonisk forkortningshastighed 7

12 Erik Brandt Biofysik Initiale forkortningshastighed er uafhængig af stimuleringsfrekvensen Kontraktile system opnår fuld aktivitet efter 1. stimulus Skitser ydre mekanisk effekt som funktion af belastning Effekt er maximal ved ca. 30% af max. Belastning SE FIGUR 17-9 s. 279 B&L Muskelkraft ved store belastninger Muskelkraft kan overstige max. Kraft som kan ydes af kontraktionsmekanismen større end kryds-broerne kan bære = excentrisk kontraktion (forlængelse af musklen) musklen kan klare 1,6*Fo efter ->kryds-broer brydes mekanisk -> hurtig forlængelse -> muskelskader fibersprængning, sene ruptur, muskelruptur SE FIGUR 17-9 s. 279 B&L Muskelfiberens Funktion I Relation Til Finstrukturen Ændringer i filament-systemers indbyrdes placering under Passiv strækning Filamenter glider væk fra hinanden Mindre overlap ( færre kryds-broer) Forkortelse af fiberen under kontraktion Filamenter glider ind over hinanden Større overlap (flere kryds-broer) Isometrisk kontraktion Næsten ingen forskydning; lidt større overlap Titin-filamenter Titin ( MW) Titin filament(1 polypeptid største kendte) 4nm i diameter (ses ikke normalt i EM) ca. 1,25µm lange Går fra M-linie til Z-skive Bestanddele Del bundet til myosin i hele længden Elastisk fri del i I-båndet Holder myosin-filamenter fast i midten Giver elasticitet til myofibriller (modvirker overstræk) Væsentligt bidrag til fiberens hvilespænding Tværbroers betydning for sliding filament mekanismen Tværbroer = myosinhoveder SE UNDER SLIDING FILAMENT MEKANISMEN Excitations-Kontraktionskoblingen i Tværstribet Muskulatur Begivenhedsforløb af excitations-kontraktionskobling 1) EPP i motorisk endeplade (ME) 2) -> aktionspotential i sarcolemma omkring ME 3) -> breder sig over sarcolemma & i T-tubuli 8

13 Erik Brandt Biofysik > videre via mekanisk kobling Duhydropyridin -> ryanodin-receptor (Ca 2+ -kanal) 4) -> stigning af intracellulær Ca 2+ koncentration især fra Sarcoplasmatisk Reticulum 5) -> binding af Ca 2+ til troponin (4 / troponin - kooperativt) 6) -> flytning af tropomyosin åbning af myosin-binding site på aktin-filament 7) -> påsætning af krydsbroer (binding af myosin-hoveder) 8) -> Sliding Filament Cycle Muskelaktionspotentialets funtionelle betydning Trigger -mekanisme for udløsning af kontraktionsprocessen alt-eller-intet karakter P.G.A. Stort overshoot af Ca 2+ (i forhold til åbning af Ca 2+ -kanaler) Kan ikke nå at pumpes ud ved gentagne stimuli ->summation -> kontraktion fastholdes (se tetanus) Aktionspotentialet -90mV -> +30mV Ca 2+ kanaler i SR Åbnes allerede ved 50mV -> påbegyndelse af kontraktionen her (mest effektiv ved ca. 20mV) T-tubuli Fungerer som elektrisk signalsystem mellem overflademembranen og SR Sarcoplasmatisk Reticulum Fungerer som lager for Ca 2+ Bundet til Calsekvestrin Lav-affinitets Høj-kapacitet Reducerer SR [Ca 2+ ] fra 20mM -> ca. 0,5mM Ca 2+ frigives under excitations-kontraktionskoblingen Via Ca 2+ ionkanal (koblet mekanisk til T-tubulus via Ryanodin recep.) ->betydning for intracellulær [Ca 2+ ] (hævning) ->Kontraktion Stort konstant influx af Ca 2+ i SR Høj-affinitets Ca 2+ -pumpe (Ca 2+ ATPase) -> hurtig sænkning af intracellulær [Ca 2+ ] ->relaxation Udvikling af Rigor (muskelstivhed) ATP-depletion i musklen Rigor mortis Tværbroerne fast bundet til aktin SE UNDER SLIDING-FILAMENT-CYCLE Tegn Membranpotentialvariationer som funkion af tid (angivelse af koordinater) For pacemakercelle i hjertet (SA node - sinusknuden) SE FIGUR / 20 s. 343 B&L (Se også Fig.22-22) Tilgrundsliggende Ionstrømme (konduktansændringer) Influx af Ca2+, ica Hyperpolarisations-induceret influx af Na +, if Efflux af K +, ik 9

14 Erik Brandt Biofysik Detaljer Fase 4 Diastolisk depolarisation Accelereres af ICa aktiveres ved 55mV (slutningen af fasen) If medvirker (aktiveres ved 50mV) MODVIRKES af ik (efflux af K + ) forsinket K + kanal Virkning ophører langsomt grundt langsom depol. Fase 0 / Fase 3 SE FYSIOLOGI-NOTER (HJERTET/KREDSLØB) Tegn et aktionspotential som funktion af tid i(angivelse af koordinater) OG resulterende KONTRAKTIONSRESPONS Skeletmuskelceller (enkeltkontraktion) Hjertemuskelceller SE FIGUR 18-3 s.284 SE FIGUR 22-1 og.22-2 s. 330 B&L Forskel m.h.t. mobilisering af aktiverende Ca 2+ Skeletmuskelfibre Aktiveres (næsten) udelukkende af Ca 2+ fra SR Kan kontrahere sig i Ca 2+ -frit medium Hjertemuskelfibre Kontraktion Calcium-depot i SR utilstrækkeligt til normal kontraktion Kræver influx af Ca 2+ via cellemembranen Svækkes / går i stå ved lav extracellulær [Ca 2+ ] Posttetanisk potentiering (beskriver obs. efter udførelse af bestemt muskelforsøg) Efter tetanus -> pause Efterfølgende stimulering -> potentialændring langt større end forventet Skyldes forandringer i det præsynaptiske område -> frigives større mængde neurotransmitter end ved enkelt stimulus binding af flere vesikler til membran Mere Ca 2+ i forvejen Facilitering Stimuli med pause imellem Større potentialændring end forventet Samme grund som posttetanisk potentiering 10

15 Erik Brandt Biofysik Almene Sensoriske Receptormekanismer Sensorisk receptor Definition En biologisk transducer, som omformer fysisk/kemisk energi til elektrisk energi i form af mebranpotentialændringer Adækvate stimulus En sensorisk receptor er specielt følsom for en bestemt type fysisk eller kemisk energi = det adækvate stimulus Inddeling af sensoriske receptorer (baggrund af ædekvate stimulus) Foto- receptorer Kemo- receptorer Mekano- receptorer Termo-receptorer Nocireceptorer (registrerer vævsbeskadigelse af kemisk/fysisk art) (Elektro-receptorer (hos visse fisk fx elefantfisk) Funtionelle fælles træk Transduktion Omsætning af absorberet energi -> receptorpotential (generatorpotential) transformation af receptorpotentialet -> impulser i tilhørende aff. axon Frekvens stiger med stimulationsstyrken Receptorsystemer (typer) Primære (1 celle receptorer) Indeholder hele primære transmissionskæde (absorption -> ledning af aff. Impulser) ->knyttet til 1 celle (sensorisk neuron) fx Vater Pacini følelegeme perifere terminal specialiseret til følsomhed for stimulus (mekanisk tryk) Sekundære (2 celle receptorer) Sensorisk neuron synaptisk forbundet -> specialiseret sekundær receptorcelle Stimulus -> frigivelse af kemisk transmitter -> neuronet exciteres Tertiære (3 celle receptorer) Fx i retina Bipolære neuroner indskudt mellem Sensoriske neuroner Stave & tappe (tertiære receptorceller) ->Konvergering (pre-processing) Frekvens Sensorisk neuron formidler information til CNS Frekvensområde på ca Hz Øvre grænse 300Hz bestemt af axonets refraktærperiode Nedre grænse af membranens Kalium-konduktans 11

16 Erik Brandt Biofysik Adaptationsmønstre Adaptation Impulsfrekvensen falder som funktion af tiden (ved fastholdt stimulusstyrke) Fuldstændig adaptation Fasiske receptorer Impulsfyringen ophører Registrerer kun ændringer i receptorens omgivelser ->kraftigt signal om (relativt høje frekvenser) karakter af stimulationens dynamiske fase størrelse hastighed af ændringen af adækvate stim. = påvirkningsændringer Ufuldstændig adaptation Toniske receptorer Adapterer til stationær fyringsfrekvens (fastholdt stim.) Informerer om Som Fasiske PLUS Vedvarende om konstant påvirkning stimulationens stationære fase Adaptations mekanismer (kan skyldes mekanismer fra flere steder) Adaptation i modtagerdelen ->ændringer i sammenhæng mellem stimulus-styrke generatorpotential mindskede generatorpotential ->faldende generatorstrøm ->faldende fyringsfrekvens fx. Mekaniske egenskaber i omgivende strukturer (pacini) Spaltning af rhodopsin i retina Inaktivering af kanaler ->generatorpotentialet Adaptation i afsenderdelen Ses som ændringer i frekvens TRODS fastholdt generatorstrøm Årsag (i reglen) Langsom forøgelse af kalium-konduktansen ->hyperpolariserende ->forsinkelse af depolarisering til tærskel Kalium-kanaltyper Forsinkede K + kanaler Sikrer hurtig afslutning af hver impuls (aktionspotential) Voltage-gated (langsommere end Na + -kanaler) Tidlige K + kanaler Sikrer mulighed for lavere frekvens ->hæmme depolarisering Voltage-gated (åbner ved depolariseret membran) (lidt før Na-kanalers tærskel) Indeholder inaktiverings-gate Åbnes ved repolarisering (kanal - ingen effekt før) 12

17 Erik Brandt Biofysik Ca 2+ -aktiverede K + kanaler (ved adaptation) Stigning af Ca 2+ (intracellulært) -> åbning af kanalerne (øget K + konduktans) stigning, p.g.a. voltage-gated Ca 2+ kanaler under aktionspotentialet Ca 2+ ATPase (aktiv transport ud af cellen) Når ikke at pumpe alt Ca 2+ ud ->opbygning af Ca 2+ -> medfører øget hyperpolarisering af K + ->længere tid om at nå tærsklen(lavere frekvens) Fyringsfrekvens når fast niveau (adaptation) -> øget Ca 2+ når fast niveau idet nettoflux af Ca 2+ = 0 Sensorisk Receptors Dynamikområde Forholdet mellem største og mindste stimuleringsenergi, som receptoren kan håndtere Skal kunne indkodes i frekvensbåndet 2-300Hz fx Strækreceptor begrænset dynamikområde (let at indkode) Fotoreceptorer 1:10 10 Akustiske Mekanoreceptorer 1:10 11 Centralt betinget adaptation ( volumenkontrol ) IDET -> Svære at indkode i snævre frekvens Udøves via accesoriske strukturer Øjets pupilreaktion (lys-refleksen) Iris som blænde (m. Sphincter/dilatator pupillae) Øret har m. Stapedius & m. Tensor tympani 13

18 Erik Brandt Biofysik Cellulær Signalering Extracellulære signaler Parakrin Lokale mediatorer Virker i umiddelbare omgivelser af signal-cellen Synaptisk Videreførsel af elektriske impulser mellem celler Dette via synapser og neurotransmitter s Hurtigt Store afstande (axoner) Endokrin Hormoner Via blodbanen Spredt i hele kroppen Afhænger af diffusion / blod strøm Langsom (forhold til synaptisk) Autokrin Signallering af cellen til sig selv / celler af samme type Signal-cellen har overfladereceptorer for egne signalmolekyler Fx Eicosanoider (ofte autokrint signalmolekyle) Fedtsyre-derivater (arachidonic acid) Kløves fra membranphospholipider af phospholipaser Nedbrydes hurtigt 4 forskellige klasser prostaglandins prostacyclins thromboxanes leukotrienes Mange forskellige funktioner Inflydelse på kontraktion af glat muskulatur thrombocyt-samling deltager i smerte/inflammations responser Signalmolekylers funktion/ levetider Kombinatoriel signalering Hver celle har adskillige receptorer Kan reagere på mange signalmolekyler Celle reagerer på kombinationer af signaler Ingen signaler => apoptose Forskellig respons Kan forekomme ved det samme signalmolekyle/ forskellig celle Fx Acetylcholin Skeletmuskulatur Kontraktion Hjertemuskulatur Relaxation Sekretorisk celle 14

19 Erik Brandt Biofysik Sekretion Levetid (Vend tilbage hertil efter opslag i anden bog) Kort levetid -> hurtig turnover = hurtig syntetisering og nedbrydning Lang levetid Omvendt Nitrogenoxid (NO) som signalmolekyle Dannes af enzymet NO synthase Ved fraspaltning fra Arginin Kan diffundere let over membraner ->Ud af signal-cellen -> modtager cellerne virker kun lokalt kort levetid (5-10sek.) -> hurtig effekt I mange celler (fx endothel) Reagerer med jern i aktivt site i Guanylyl cyclase -> produktion af Cyklisk GMP Acetylcholin -> Gq system -> IP 3 -> ser -> [Ca 2+ ] -> Ca 2+ /CalModulin kompleks aktiveres -> aktivering af NO synthase Arginin + O 2 -> citrullin + NO NO diffunderer til modtager celle (glat muskulatur) -> reagerer med hæm-gruppe (Fe) i guanylyl cyclase denne er opløst i cytosol Heterodimer med hæm i midten -> produktion af cgmp -> relaxation af kar via aktivering af cgmp-dependent protein Kinase Brugt af makrofager / neutrofile granulocytter Hjælpe med at dræbe invaderende mikroorganismer Brugt af mange typer nerve celler Signalering til nabo-celler fx acetylcholin ->endothel celler -> produktion af NO -> afslapning af glatte muskelceller Forklarer virkningen af Nitroglycerin (behandling af angina) Afslapper karrene -> mindre arbejdsbyrde på hjertet Afgivelse fra autonome nerver i penis -> øget blodtilstrømning ->erektion 15

20 Erik Brandt Biofysik Ionkanaler (Transmitter-gatede ion kanaler) Funktion Lade ellers impermeable ioner passere membranen Hurtig synaptisk signalering mellem excitable celler Virkning Ved et lille antal neurotransmittere Åbner/lukker kanalerne midlertidigt Bruges ved opbygning af Membranpotential Aktionspotential Enzym-koblede Receptorer Funktion Som enzymer / associeret med enzymer Oftest protein kinaser Receptor udenfor / katalytisk del indenfor membranen (oftest) Eksempel (Receptor Tyrosine Kinaser) Danner dimer -> GRB2 -> SOS -> RAF -> RAS -> MEK -> MAP-kinase (etc) 16

21 Erik Brandt Biofysik Signaltransduktion via G-protein G-protein koblede overflade receptorer Tilhører en superfamilie af homologe 7-pass transmembran-proteiner Medierer celle-responser til en masse forskellige signal molekyler Fx 9 til adrenalin 5 eller flere Acetylcholin min. 15 til Serotonin,...altså flere til samme ligand Trimeric GTP-binding proteins (G-proteiner) GTPaser (GTP aktiv, GDP inaktiv) Ligand bindes til overflade-receptor koblet til G-protein -> Ændrer konformation og inducerer G-protein til at slippe GDP Og optage GTP = aktivering Opbygget af 3 forskellige polypeptid-kæder (subunits) α binder og hydrolyserer GTP β & γ danner et tæt-kompleks binder G fast til plasma-membran via en lipid-kæde (prenyl gr.) kovalent bundet til γ-subunit trimer med GDP bundet α-subunit fraspaltes ved GTP binding (aktiverer/inaktiverer målenzym) Aktiverer kæde af reaktioner -> Ændrer koncentration af 1 el. flere små intracellulære signal-molekyler Fx camp, Ca 2+ Stimulatoriske G-proteiner (Gs) Involveret I enzym activation Via camp amplifikations kaskade Cyklisk AMP Intracellulære koncentration <= 10-7 M Gs stimulerer adenylyl cyklase, der danner camp fra ATP Nedbrydes af camp phosphodiesterraser til 5 AMP (kort levetid) A-Kinase (cyclic-amp-dependent protein kinase) Aktiveres af camp Katalyserer overførslen af P fra ATP til seriner el. Threoniner på specifikke proteiner. >=2 basiske aminosyrer amino-terminalt (for Ser/Thr) Opbygget af: 2 regulatoriske subunits 2 camp på hver (hver øger affinitet for andre) 2 catalytiske subunits Tetramer en splittes op efter camp binding Serine/Threonin phosphoprotein phosphataser Proteinphosphatase I Spiller vigtig rolle i forhold til camp Dephosphorylerer proteiner phosphoryleret af A-kinase 17

22 Erik Brandt Biofysik Proteinphosphatase IIA Bred virkning. Vigtig function I cellecyklus Proteinphosphatase IIB (calcineurin) Aktiveres af Ca 2+. Stor forekomst I hjernen Reaktionskæden: β-adrenerge receptorer binder Adrenalin (epinephrine) αs aktiverer adenylyl cyclase camp aktiverer A-kinase A-kinase phosphorylerer Phosphorylase kinase Phosphorylerer glycogen phosphorylase Aktiveres og spalter glucose-1-phosphat fra glucogen Glycogen synthase Inhiberes og stopper hermed glycogen syntesen Phosphatase inhibitor protein Binder til protein phosphatase I og inaktiverer denne CREB Se nedenfor Protein Phosphatase I Dephosphorylerer alle proteinerne netop nævnt β-blockers virker ved at blokere β1-adrenerge receptorer i hjertemuskulatur og forhindrer adrenalins effekt fx Practolol. CREB (Cyclic-AMP Response Element Binding protein) Proteiner er bundet til CRE-sekvensen uanset hvad Denne sekvens er en del af somatostatin-genet (peptid-hormon) CRE findes også i andre regulatoriske gener, aktiveret af camp CREB Phosphoryleres af A-kinase på 1 serin Aktiveres og tænder for transkription af gener Cholera toxin Enzym fra bakterie(vibrio Cholerae) katalyserer ADP-ribosylation af αs Kan ikke længere hydrolysere GTP Adenylyl cyklase bliver permanent aktivt Langvarigt forhøjet camp koncentration Strøm af Na + og vand ind i maven (slem diarrhea, dehydrering) Inhibitoriske G proteiner (Gi) Kan indeholde samme βγ kompleks Forskellig α-kæde Begge komplekser inhiberer adenylyl cyklase α- Direkte βγ direkte binding til adenylyl cyklase (nogle isoformer) indirekte binding til αs-kæder Åbner K + kanaler i plasma membran (se nedenfor) 18

23 Erik Brandt Biofysik Pertussis toxin (whooping cough) (Bordetella pertussis) Enzym fra bakterien katalyserer ADP-ribosylation af αi-subunit Kan ikke slippe GDP Kan dermed ikke inhibere adenylyl cyklase G-protein regulerede Ion-kanaler Acetylcholin-receptorer Muskarin-kolinerge receptorer (hjertemuskelceller) Kan aktiveres af fungal alkaloid muscarin Acetylcholin receptorer aktiverer Gi Reducerer rate + kraft af hjertemuskulatur Sammentrækning Via hyperpolarisering (K + kanaler) = Metabotrop Inhiberes af atropin Nikotin-kolinerge receptorer (Skeletmuskulatur) Kan aktiveres af nikotin IKKE G-protein reguleret = Ionotrop Inhiberes af α bungarotoxin (kobragift); curare 19

24 Erik Brandt Biofysik Impulstransmission over cellegrænser Synapse Definition Sted hvor elektriske signaler transmitteres fra en celle til en anden Transmissionmekanismer (2 forskellige former) Elektrisk transmission Elektrisk lavresistent forbindelse Gap junction (nexus) Mellem præ- og postsynaptiske område Strømsløjfer ledes under transmission direkte ind i postsynaptiske membranområde Fordel Transmission uden forsinkelse Eksempel Hjertemuskelcellers elektriske kobling Kemisk transmission Præ- og postsynaptiske områder totalt adskilte (om end i nærkontakt) Kemisk transmitterstofs præsynaptiske frigørelse, diffusion over til / virkning på postsynaptisk membran Kræver tid (synaptisk forsinkelse) Fordel Muliggør funktionel mangfoldighed Excitatoriske /inhibitoriske synapser Transmission med forstærkning Regulering m.m. Neuromuskulær Transmission Motorisk enhed 1 motorisk neuron og de muskelfibre(3-1000), neuronet innerverer Struktur Lille pladelignende fortykkelse (hvor nerven muskel) 1 motorisk endeplade / muskelfiber sidder tæt på fibrens lineære midte Primære synaptiske kløfter Fordybninger i musklen Axonterminalerne er lejrede heri Sekundære synaptiske kløfter Snævre forsænkninger Schwannske celler strækker sig ikke ned i synaptiske kløfter Axolemma Sarcolemma ligger op ad hinanden 50nm spalte Ekstern lamina Beklæder både primære & sekundære synaptiske kløfter Postsynaptisk membran Tæt beklædt med acetylcholinreceptorer ( ) Axoplasma Mitochondrier 20

25 Erik Brandt Biofysik Vesikler i axoplasma Svarer til synaptiske vesikler 50nm i diameter vesikler indeholder acetylcholin (neurotransmitter) synteseres her Elektrisk impulsoverførsel Aktionspotential ankommer til terminale axon -> depolarisering af præsynaptisk membran -> midlertidig åbning af voltage-gated Ca 2+ ionkanaler influx af Ca 2+ (øget Ca 2+ koncentration i terminale axon) -> fusion af vesikler med membran = frigivelse af acetylcholin til synaptiske spalte (exocytose) ->Acetylcholin diffunderer over synaptiske spalte ->binder til acetylcholinreceptorer på postsynaptiske membran Acetylcholin spaltes hurtigt af acetylcholinesterasen (få msek) Elimineres herved Spaltningsprodukterne (Cholin og acetat) diffunderer tilbage til axon-terminal -> resyntetiseres og deponeres som acetylcholin cholin-o-acetyltransferase Binding af acetylcholin Receptoren er en transmitter-gated ionkanal (ligand-gated) -> midlertidig øgning af permeabiliteten for Na + og K +. (postsynaptisk) Ved hvilemembranpotential er drivkraften for Na + ind i cellen Meget større end K + ud af cellen -> netto indadrettet flux af positive ioner -> depolarisering af postsynaptiske membran = Endepladepotentialet Endepladepotentialet (EPP) Definition: Et lokalt, ikke propagerende postsynaptisk potential, som skyldes permeabilitetsændringer i den postsynaptiske membran og medfører depolarisering til fyringstærskel i naboområdet. Funktion ved impulstransmission EPP søger mod værdi på ca. 15mV -> depolarisering af omgivende, excitable muskelfibermembran til over tærskelværdien Ethvert aktionspotential i den motoriske nerve -> aktionspotential i muskelfiberen Tidshorisont Se Fig. 4-2 s. 45 i B&L Ca. 10msec (VEND TILBAGE TIL DETTE) Rumlig udbredning Ved forhindring af aktionspotentialets udløsning ved curarisering ->EPP kan registreres indtil ca. 4mm fra endepladeregionen (med mikroelektroder) Udbredning uden for endepladen skyldes passiv elektrotonisk proces (ikke propagerende) Miniature-EndePladePotentialer (MEPPs) 1 Kvantum Acetylcholin 21

26 Erik Brandt Biofysik = mængde acetylcholin indeholdt i 1 vesikel MEPPs er små, spontane depolariseringer (ca. 0,4mV) ->skyldes spontan frigivelse af 1 Kvantum Acetylcholin i synapse spalten frekvensen er tilfældig (gennemsnit ca. 1/sek ) Samme tidshorisont som EPPs EPP & MEPP har samme respons mod mange medikamenter EPP = mængde MEPPs samtidigt (principielt) Påvirkning af den synaptiske transmission Præsynaptisk membran Ændret frigørelse af transmitter Fx elimineret ved forgiftning med botulinustoxin Udskilt fra baktierer, der vegeterer under anaerobe forhold i fx konserverede madvarer = pølseforgiftning Synaptisk spalte Nedsat elimineringshastighed af acetylcholin med anti-cholinesteraser ->EPP størrelse og varighed øges Antiacetylcholinesteraser (fx) Plantealkaloidet Fysostigmin (terapeutisk anv.) Visse krigsgasser (irreversibel effekt) Række insekticider (irreversibel effekt) Postsynaptisk membran Receptorblokade Fx med curare /curare-lignende stoffer α-toxiner i kobra-gift (α-bungarotoxin) Hemicholiniums Re-uptake inhibitors Hæmmer genoptagelse af cholin -> udtømmer indhold af acetylcholin ->til sidst nedsætter acetylcholin-indhold i hver kvantum Klinik Myasthenia gravis Patienter har antistoffer mod acetylcholin-receptor protein ->ude af stand til at vedholde kontraktion af skeletmuskulatur 22

27 Erik Brandt Biofysik Interneuronal Transmission Synapser Kan have forskellig virkning på dendritter og somamembran Exciterende (depol.) Forøger tendens til start af propageret aktionspotential (fra axonhøjen) Inhiberende (hyperpol.) Hæmmer tendensen Excitatorisk PostSynaptisk Potential (EPSP) Postsynaptiske konduktansændringer og ionbevægelser bag EPSP Øget g Na Medfører indadrettet Na + -strøm Øget g K postsynaptisk membrans potential (under påvirkning af transmitter) -> ca. 0mV (mod reversal potential ml. E Na og E K ) Resulterende strømudbredning (som kan medføre fyring af AP i axonhøjen) Elektrisk strøm (fra depolariserede områder; dendritter, soma) -> axonhøj og axon ->depol. (evt. Til axonhøjens særligt lave tærskel) Inhibitorisk PostSynaptisk Potential (IPSP) Konduktansændringer og ionstrømme Øget (g K ) og g Cl postsynaptisk V m -> reversal potential mellem (E K ) og E Cl -> disse strømme modvirker somaets depolarisering (evt. Medføre hyperpolarisering mod 80mV) Start af propageret Aktionspotential i neuronets tilhørende axon kræver samtidig stimulering af stort antal exciterede synapser SUMMATION - SE UNDER DEN PERIFERE NERVE!!! Vigtige Excitatoriske neurotransmittere Salte af aminosyrerne Glutaminsyre Asparaginsyre ATP Serotonin Acetylcholin Vigtigste inhibitoriske neurotransmittere Glycin γ-aminosmørsyre (GABA) 23

28 Erik Brandt Biofysik Membranpotential Ligevægtpotential & Diffusionspotential Selektivt permeabel membran Definition: Membran tillader passage af enten kationer / anioner Ligevægtspotential Definition: Den potentialforskel, der skal etableres over membranen, for at der er ligevægt for den diffusable ion mellem de 2 faser, kaldes for ligevægtspotentialet for ionen ved den pågældende koncentration Eksempel 2 kamre (faser), adskilt af en selektivt permeabel membran Der skal være en koncentrationsgradient mellem de 2 kamre Kammer 1 lav koncentration (af pågældende ion) Kammer 2 høj koncentration -> medfører nettoflux af pågældende ion 2 -> 1 -> hurtigt optræder en elektrisk gradient (=potentialforskel mellem to kamre) idet membranen er selektivt permeabel ingen nettoflux af counter-ion (modion) denne modvirker yderligere nettoflux 2 -> 1 efter noget tid Relativt få ladninger udgør opladning af membran til ligevægtspotential Cion i væskerne ændres ikke måleligt En ligevægt indstiller sig (mellem to gradienter) Potentialforskel mellem 1 & 2 har præcis værdi, Som hindrer nettoflux af ioner 2 -> 1 Derfor er nettoflux = 0 (for den pågældende ion) Nernst-ligningen 2 eq RT C j V j = ln 1 z j F C j, hvor R er gaskonstanten (8,314 J/mol). T er temperaturen i Kelvin. Zj er ladningen af ionen. F er Faraday s tal (96491 Coulomb / mol) Cj er koncentrationen for den pågældende ion i det pågældende kammer. Ligevægtspotentialet afhænger altså af T, z, forholdet med C1 & C2 Diffusionspotential Definition: Potentialforskel som hersker i et ikke ligevægtssystem, og som skyldes diffusion af ioner med forskelle mellem de enkelte iontypers mobiliteter, kaldes et diffusionspotential. Eksempel: 2 kamre, adskilt af membran med forsk. permeabilitet for forsk. ioner Der skal være en koncentrationsgradient mellem de 2 kamre 24

29 Erik Brandt Biofysik Kammer 1 Ionerne X + og Y - i samme konc. Kammer 2 vand (eller lavere konc. end i kammer 1) P.g.a. koncentrationsgradient nettoflux af begge ioner 1 -> 2 Permeabiliteten for X + er mindre end for Y -. -> X + diffunderer langsommere igennem end Y -. -->efter kort tid passer koncentrationsprofilerne ikke helt -> ladningsneutraliteten ophæves = overskud af ladninger i 2 i forhold til 1 = overskud af + ladninger i 1 i forhold til 2 -> danner et elektrisk felt (går fra 1 -> 2) ->hastighed for X + fra 1-> 2 øges noget ->hastighed for Y - fra 1-> 2 mindskes noget potentialforskel (diffusionspotential) og ioner diffunderer med samme flux -> Nettostrømmen = 0 (bæres af diff. ioner) Systemet bevæger sig mod ligevægt = ensartet fordeling af ionerne = udslukt potentialforskel Goldmann-ligningen Vi antager, at det elektriske felt er konstant gennem Membranen og at der er makroskopisk neutralitet gennem membranen. Desuden at det er diffusion gennem en homogen membran Itotal = 0 For opløsninger med K +, Na + og Cl - ioner (2) (2) (1) RT P + C + + P + C + + P C K K Na Na Cl Cl V m = ln (1) (1) (2) F P + C + + P + C + + P C K K Na Na Cl Cl Hvor P er permeabiliteten for de enkelte ioner Forklar tegn/konstanter Ved kun permeabilitet for 1 ion: Goldman -> Nernst-ligningen Og Vm -> V eq Osmose Ideel semipermeabel membran Definition membran permeabel for opløsningsmidlet, ikke-permeabel for opløste stoffer (vand i vores tilfælde) Semipermeabel membran Se Donnan-ligevægt Osmose Definition Spontane bevægelse af vand over en semipermeabel membran Fra mere fortyndet opløsning -> mere koncentreret opløsning Mekanisme Skal være koncentrationsgradient for vand(pga. opløste stoffer) -> denne vil forsøge at udligne sig ->bevægelse af vand over semipermeabel membran 25

30 Erik Brandt Biofysik Osmotisk tryk Definition Det tryk, der skal til for at forhindre vand i at løbe ind i en opløsning over en semipermeabel membran, der adskiller 2 opløsninger med koncentrationsgradient imellem. Beregning Π = R*T*C (van t Hoffs ligning) = R*T*(Φ*i*C), hvor Φ = osmotisk koefficient (variation fra ideal) pga. dissociation af stoffer (->ioner),r=gaskonstant; T = absolut temp.; C = konc. ; i = antal ioner i dissocieret stof Måling ved frysepunktsdepression T Π = *22,4atm 1,85 Donnanligevægt Betingelser Semipermeabel membran (ikke ideelt) Def.: Gennemtrængelig for vand og nogle opløste stoffer her lavmolekylære anioner, kationer, vand =permeable stort ioniseret makromolekyle (anioner i cellen prot.) = impermeabelt Forskellig koncentration af diffusible ioner mellem 2 faser elektrisk spændingsforskel over membranen osmotisk trykforskel mellem faserne bestemt af polyelektrolyts/diffusable ioners koncentration Udtryk for ligevægtsfordeling af permeerede ioner [X + ] A [X + ] B = [Y - ] A [Y - ] B (eks. Ioner) Beregning af Donnanpotentialet Permeable ioner er ALLE i elektrokemisk-ligevægt ->Nernst ligning kan bruges V eq D = RT F C ln C (2) + X (1) + X = RT F C ln C (1) Y (2) Y Den Levende Celles Membranpotential Værdier for ion-koncentrationer i axoplasma / extracellulært Ion Intracellulært /mm Extracellulært /mm (blod) K Na Cl HCO Mg 2+ 0,8 1,5 26

31 Erik Brandt Biofysik Ca 2+ <0,0002 1,8 Gennemtrængelighed af uexciterede membrans permeabilitet Nerven P Na : 1 P K : 40 P Cl : 30 Hvilemembranpotentialet Hersker koncentrationsforskelle over membranen (se ) 2 faser adskilt af membran har forskellig permeabilitet for de forskellige ioner opfylder betingelserne for et diffusionspotential idet membranen er permeabel for mere end 1 iontype =diffusionspotential, IKKE ligevægtspotential Størrelsen Ca. 70mV i hvile (axon) Afhænger af ISÆR permeabiliteten af enkelte ioner i forhold til hinanden Koncentrationsforskellene Hver ion driver membranpotentialet mod sit eget ligevægtspotentiale -> grad bestemmes af permeabiliteten Ved 37 C Ion K + Na + Cl - Ligevægtspotential Udregning herfra...membranpotential = -91mV (millman) Kalium er den styrende ion for potentialet (og Chlorid) Opretholdelse af skæve ionfordeling over membran (i længere tid) Se Aktiv transport 27

32 Erik Brandt Biofysik Almen Nervefysiologi Perifere Nerver Nerveimpulsen Elektrisk signal (aktionspotential), som ledes uformindsket gennem hele axonets længde Rimelige værdier for aktionspotentialet (mennesket opgivet til forelæsning) Hvilemembranpotentialet -70 mv Tærskelpotentialet -50 mv Spidsværdien +30 mv Efter Hyperpolarisering 5-15 mv lavere end Hvilemembranpotential Påvirkning af hvilemembranpotential Ændring af ydre K + konc. Permeabiliteten for K + er stor p.g.a. K + leak channels (altid åbne) -> Stor påvirkning Ændring af ydre Na + konc. Permeabiliteten for Na + er lav Idet Na + ionkanalerne er voltage-gated e -> ikke væsentlig påvirkning Subliminal ( Subthreshold ) stimulering Local response (Se figur 3-11 s. 39 I B&L) (Strømsløjfen) Ved lokal depolarisering, der ikke overskrider tærskelværdien -> Lokale potential-forskelle -> lokale strømme løber (ioner) -> depolariserer membranen ved siden af start-stedet ->depolariserer membran ved siden af dem ->etc Mekanismen kaldes Elektrotonisk konduktion Conduction with decrement Konduktion med tab af depol. styrke Længde-konstant Afstand inden styrke = 1/e af max. Styrke(37%) omkring 1-2 mm = r r m in, rm = membran-resistans rin = cytoplasma-resistans Dør stort set helt ud efter 5mm 28

33 Erik Brandt Biofysik Summation af subliminale stimuli EPSP (Excitatorisk PostSynaptic Potential) (1-2mV / PSP) =midlertidig depolarization I postsynaptiske neuron dannet af aktionspotential i presynaptisk axon IPSP (Inhibitorisk PostSynaptic Potential) =midlertidig hyperpolarization I postsynaptiske neuron dannet af aktionspotential i presynaptisk axon Spatial summation -> 2 spatialt seperate stimuli forekommer næsten på samme tid ->summation af de 2 potentialer EPSP & IPSP udbredes uden tab af styrke over hele membran ->grundet korte afstande i cellen(rel. til længde-konst.) 2*EPSP = fordobling af depolariseringen 1*IPSP & 1*EPSP = udhvisker hinandens effekt Temporal summation -> 2 (eller flere) aktionspotential er i 1 presynaptisk neuron forekommer lige efter hinanden, så de resulterende postsynaptiske potential er overlapper hinanden tidsmæssigt Finder sted p.g.a. membranens kapacitive egenskaber -> tager vis tid før subliminale depolarisering svinder en ny stimulation kan så summeres til foregående ->evt. Førende til overstigning af tærskelværdi Stimulering ved eksterne elektroder SE BIOFYSIK RAPPORT 2 (NERVEØVELSEN) 29

34 Erik Brandt Biofysik Transportprocesser Stoftransport i et frit, ubegrænset medium Flux (=Transportstrømtæthed = J) Definition Mængde af stof, som per sekund passerer en arealenhed anbragt vinkelret på transportstrømmens retning (enhed: mængde/m 2 *s) Transportligning J = N*v = B*N*X Gnidningkoefficient & mobilitet Partikel påvirket af kraft, X (positiv i x-akse) Har hastighed v til tiden t påvirket af modsatrettet gnidningskraft, Xf Xf = -β*v Xsamlet = X+Xf. dv -> m = X - β*v (Newton s 2. lov) dt dv Ved konstant hastighed, = 0 dt -> X = β*v v -> B = 1 = (1.6) β X (B= partiklens mobilitet /mekaniske bevægelighed) Migrationsflux Suspension af ens partikler (ensartet fordelt i væsken) Betragter flade med areal A Vinkelret på bevægelsesretning for stoftransport M = antal partikler, der passerer A i tiden t. ; v = stationær middelhastighed (for partiklerne) N = antal partikler / m 3, (i betragtede prisme) M = NAv t M J = (mængde partikler/areal*tid) ( A t) J = Nv (1.7) J = NBXmigr (flux = koncentration*mobilitet *drivende kraft) Diffusionsproces Karakteristiske træk 1) uensartet fordeling af stoffets molekyler 2) stoftransport foregår i retning stofkoncentration aftager 3) transporthastighed størst i område med stejleste koncentrationsprofil Fick s lov (Adolf Fick, 1855) dc J = D dx, hvor dc/dx = koncentrationsgradienten mål for stejlheden af koncentrationsprofilen i betragtet punkt x 30

35 Erik Brandt Biofysik , og D = diffusionskoefficienten Diffusionsflux er proportional med koncentrationsgradienten MEN med modsat fortegn = stoftransport forløber i retning svarende til aftagende konc. Diffusionskoefficienten (=D) Karakt. for diffunderende molekyltype under givne betingeler Måles i m 2 /s RT D = 6 Πrη N A Bestemmende faktorer Bestemmende for hastighed Størrelse Form Egenskaber ved omgivende medium (fx viskositet) Diffunderende stofs koncentration Mekanisme på det molekylære plan Skyldes tilfældige termiske bevægelser af atomer/molekyler = Brownske bevægelser De resulterende bevægelser er sandsynligheder Normalfordelt (Gauss) -> karakteristiske zig-zag bevægelser sandsynlighed for ene retning = den anden retning (p.g.a. bombardement af partikler) = Random walk mange muligheder for at komme fra 1 punkt ->næste punkt Ved forskellige koncentrationer Sandsynlighed -> udligning af koncentrationsforskellen ->nettoflux (høj konc. -> lav. Konc.) Sammenhæng mellem middelforskydning & diffusionskoefficient Einstein-Smoluchowski-ligningen 2 s D = 2 t middelforskydning: x = 0, 8s, hvor s = afstand; t = tid Sammenhæng mellem diffusionskoefficient og molekylbevægelighed Einstein-relationen D = ktb,hvor k = Boltzmann s konstant; T = absolut temperatur ; B = mobilitet Størrelsen af stoftransport ved elektrodiffusion (Eks. På migration+diffusion) Variation gennem rummet af Elektrolytkoncentration -> diffusion Elektrisk potential -> migration dc J = BCX migr D (Smoluchowski-ligningen) dx 31

36 Erik Brandt Biofysik el dψ X migr = X + = z+ qe dx, hvor ψ(x) = elektrisk potential (i punkt x) D + = ktb dc+ dψ -> J + = ktb+ z+ qe B+ C+ (Nernst-Planck ligning) dx dx For kation (tilsvarende findes for anion) -> se Documenta Biochimica & Biophysica Membrantransport Permeabilitetskoefficienten (P) For stof, der kan trænge igennem membranen P = αktb (dimension m/s) h,hvor α=fordelingskoefficienten (olie/vand) k = Boltzmann s konstant T = absolut temperatur B = mobiliteten af stoffet h = tykkelsen af membranen Transport gennem Cellemembraner Passive Transportmekanismer Cellemembranens passive permeabilitetsegenskaber Virker som permeabilitetsbarriere Simpel diffusion Alle molekyler (stort set) kan diffundere over Hastigheden varierer MEGET Afhænger af relativ opløselighed i olie (som permeabilitet) Og størrelse. Og lineært med koncentration. Se Membrantransport Transporterede stoffer Hydrofobe molekyler Små, uladede, polære molekyler Faciliteret diffusion ( carrier-mediated diffusion ) Stof bindes til carrier-protein (membran-bundet) ->konformationelle ændringer ->transporteres ind i cellen ->frigives Hurtig transport (Langsommere end kanaler) Mætningskinetik C Vtransport (mod Vmax) Transport system = mættet ved Vmax. Kemisk specificitet Kun molekyler med specifik kemisk struktur transporteres (fx D-glucose, ikke L-glucose) 32

37 Erik Brandt Biofysik Kompetitiv hæmning Strukturelt lignende molekyler kan konkurrere om transport ->den ene hæmmer den anden Hæmning af strukturelt ikke-relaterede stoffer Kan inhiberes, så affinitet for substrat mindskes (=non-kompetitiv hæmning?) Transporterede stoffer Store uladede, polære stoffer (fx glucose, sucrose) Fx (se evt fig 39-4 s. 649 B&L...SGLT1 = symport; GLUT5 = uniport) Uniport Symport Antiport Kanaler Danner hydrofile kanaler gennem membranen Tillader passage af specifikke stoffer Meget hurtigere end med carrier-proteiner Transporterede stoffer Ioner (især uorganiske, små) Elektrodiffusion Sker gennem ionkanaler Veksler mellem åben og lukket tilstand Afhængig af (alt efter følsomhed) Fysiske påvirkninger (fx Voltage-gated) Kemiske påvirkninger (fx ligand-gated) Aktiv Transport ( primær ) Definition Aktiv transport medieret af carrier-proteiner koblet direkte til energi-kilde Karakteristiske træk Transport mod koncentration/elektrokemisk-potential gradient Forbruger energi (altid ATP fra cellen) ->konformationelle ændringer = transport ATPase typer P Phosphoryleres 2 konformationer (E1, E2) V Fx lysosomer F Fx ATP Synthase ATP dannelse oxidativ fosforylering Eksempler Na + /K + ATPase Ca 2+ ATPase (både membran & SR) H + /K + ATPase (mavesæk) H + ATPase (lysosomer, osteoklast) ATP synthase (reversibel...) Væsentligste betydninger Opretholdelse af iongradienter Na +, K +, Ca 2+ etc 33

38 Erik Brandt Biofysik forudsætning for sekundær aktiv transport Osmotisk ligevægt over membran Stabilisering af cellevolumen Na + /K + ATPase 3 Na + ud / 2K + ind Cotransport (symport), Antiport og sekundær aktiv transport Na + -gradient (aktivt etableret) Energetiske grundlag for transport af visse andre stoffer imod deres koncentrationsgradient. ( sekundær aktiv transport ) Eksempler Na + /glucose Na + /aminosyre Na + /H+ antiport 34

39 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Indholdsfortegnelse DNA Reparation... 2 DNA Replikation.. 4 DNA Teknologi. 6 Enzymer 10 Genetisk Rekombination. 11 Genregulation i Eukaryote Celler.. 13 Golgi Sortering af secernerede proteiner Hormoner..17 Klassifikation af RNA Polymeraser Kloning af DNA 19 Metabolisme Generelt.. 21 N & O Glykosylering Plasmamembranen.. 25 Posttranskriptionel modifikation af RNA. 28 Protein Translokation over ER Proteinstruktur 32 RNAs rolle ved translation.. 34 Syntese af ATP i mitochondrierne..35 trna & Proteinsyntesen. 38 1

40 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Opdeling Base Excision Repair Apurinic Excision Nucleotide Excision Repair Mismatch Repair Dobbelt DNA-strengs brud reparation (Proof-reading 3 -> 5 exonuclease) DNA Reparation Base Excision Repair Ændret base (ioniserende stråling; spontant) Deamineret C -> U Ca. 100 baser / genom / dag Deamineret A -> Hypoxanthin / G -> Xanthin Alkylerede / Oxiderede baser Baser med åbnede ringe Kul-kul dobbeltbindinger -> enkeltbinding -> DNA glykosylaser 1 til hver ændret base Katalyserer hydrolyse af den ændrede base (N-glucosid bindingen) -> AP Endonuclease (Apyrimidinic eller Apurinic) Klipper 5 -enden af phosphodiester-rygraden -> Phosphodiesterase Klipper 3 -enden af phosphodiester-rygraden -> DNA-Polymerase Resyntetiserer -> DNA Ligase Limer Apurinic Excision Purin Hydrolyseres spontant (ved N-glycosid-binding) Kan skyldes Varme eller Syre Ca puriner / dag / celle Nucleotide Excision Repair Genkender / Fjerner store ændringer I DNA dobbelt-helix en Fx sammenkoblede pyrimidin-dimer (T-T, T-C, C-C) Tilkobling af store carcinogener (fx benzopyren) Skyldes UV-lys (sol) -> Skaden klippes i hver ende (præcis hvor afhænger af skaden) fx T-T dimer hos E. Coli 8 bp upstream for T-T 4-5 bp downstream for T-T -> Helicase fjerner stykker -> DNA Polymerase Resyntetiserer -> DNA Ligase 2

41 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Limer Mismatch Repair Virker kun umiddelbart efter replikationen Finder fejlparrede basepar Fx Prokaryote GATC-sekvens A methyleret i 6 position Stort stykke klippes ud Eukaryote Lignende system MEN Scanner efter nick (tror man) Klipper basepar ud -> Helicase -> Enkelt-strengs exonuclease -> DNA Polymerase -> DNA Ligase Ende-sammenføjnings Reparation af Ikke-homolog DNA Overvejende Ku-proteiner -> endestykkerne -> Helicase åbner HVER dobbeltstreng -> Kort homolog enkelt-streng i hver parres med andet DNA -> Uparrede 5 regioner fjernes -> DNA Ligase Noget information tabes Transkriptions-koblet Reparation Observeret fænomen Meget hurtigere fjernelse af DNA-skader i aktivt transkriberede områder Unit Evolutionary Period Definition Den gennemsnitlige tid, det tager, for 1 aminosyrer I en sekvens på 100 aminosyrer ændres til en anden Hæmoglobin 5*10 6 år Histon H4 500*10 6 år 3

42 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi DNA Replikation DNA Templating (Lav fejl 1/10 9 ) Semikonservativ Komplementær baseparring (Watson-Crick) G-C A-T Deoxyribonukleosid triphosphater (bruges 2 energirige bindinger per påsætning) Foregår i cellens S-fase ::: Replikations origin Humane genom Begge veje replikationsgaffel (Bidirektionel) (replikations bobbel) Initiator protein åbner -> Helicase åbner videre -> DNA Primase bindes til Helicase DNA Polymerase 5 -> 3 Replikationsgaffel Leading strand Lagging strand Okazaki fragmenter (1-200 i eukaryoter) DNA Polymerase Enkelt strenget DNA som substrat Sætter deoxyribonukleosid-phosphater på efter en template Skal have en 3 OH ende af base-parret primer-streng Sidder DNA Pol på BÅDE leading og lagging strand Multiple subunits (bl.a.->) 3-5 proofreading exonuclease subunit Clamp-dimer-subunit (β-subunit dimer) Holder polymerasen fast til DNA DNA Primase -> RNA primer til lagging strand & start RNA fordi -> reducerer fejlraten sletter RNA streng bagefter DNA Helicase Åbner DNA-dobbelt helix (HUSK:::2 fingre, der går) =ATPase På Lagging strand (kontaktes af Pol fra leading strand) Sidder med DNA Primase på Lagging = Primosom SSB (Single Strand Binding Protein) Helix destabilising protein Stabiliserer enkeltstrenget DNA uden at dække baser DNA kopieres med SSB på Sidder på begge strenge Stort stykke dækket (mange) på Lagging strand 4

43 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Forhindrer dannelse af små hårnale helices Fleste af proteinerne holdes sammen i et multienzym-kompleks DNA Topoisomeraser Forhindrer supercoils (filtring) under replikation DNA Topoisomerase I Enkelt streng Danner brud i 1 streng Afsnoning Opløser super-coiling (foran helicasen) DNA Topoisomerase II Dobbelt streng Brud i begge strenge Udfiltrer dobbelt helix snoede i hinanden (møde ml. 2 origins) Limer dem sammen 5

44 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi DNA Teknologi Restriktionsenzymer (eksempler se tabel 7-1 s. 213 Lodish) Enzymer, som klipper en DNA dobbelt helix ved specifikke sites -> restriktionsfragmenter Site-specifik endonuclease Disse er ofte 6 basepar lange (4-8) (ofte) Palindrome sekvenser Udvundet fra bakterier (restriktions nucleaser) Forsvar mod fjendtligt DNA Egne lignende sekvenser methyleres på A/C Vha modifikationsenzym -> beskyttelse mod klip. Endestykker 3 Overhang (på øverste streng) 5 Overhang Blunt end Fx EcoRI fra E.Coli Klipper G.AATTC (hvor. angiver klip-site) Restriktionskort Kan laves over DNA sekvens Viser angrebspunkterne for restriktionsenzymer i forhold til hinanden Gel Elektroforese Bruges til at adskille DNA-fragmenter af forskellig størrelse (fx klippet af ) Simplere end for proteiner Idet DNA i forvejen har negativ ladning Skal farve DNA med fx (ellers ikke synligt) Ethidium bromid Flourescerer i UV-lys, når bundet til DNA 32 P afgiver β-partikler detekteres ved autoradiografi Forskellige geler alt efter fragmenternes størrelse Polyacrylamid (special designet) Fragmenter op til 2000 nukleotider Agarose (udvundet fra tang) Medium-porer Større fragmenter (300 10,000 nukletider) Pulsed-field gel elektroforese Retning af det elektriske felt skiftes periodisk Agarose gel Store fragmenter (op til 10 7 ) DNA Sekventering Kemiske metode (Maxam-Gilbert metoden) Dobbelt helix denatureres Mild behandling med kemikalie, der ødelægger 1 af de 4 baser Kemikalie selektivt for 1 base Kun 1 base i hvert DNA molekyle ødelægges Tilfældigt hvilken en 6

45 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi > giver fragmenter af forskellig længde afslører position af den specifikke base i DNA molekylet Proceduren køres igennem for hver af de 4 baser DNA et er mærket med 32 P (den ene ende) Gel elektroforese -> aflæsning af basepositionerne (=DNA sekvens) korte fragmenter kører længst etc... Enzymatiske metode (Sanger metoden) DNA et (som skal sekventeres) bruges som template in vitro syntese udført af DNA polymerase -> forskellige længde fragmenter begynder samme sted; men slutter forskellige steder Der bruges en mærket primer Stort overskud af deoxy-nukleotid (fx datp) Mindre mængde dideoxy-nukleotid (fx ddatp) Dideoxy-nukleotider stopper syntese ved påsætning forskellig længde fragmenter; 1 fragment for hver baseposition (via tilfældig påsætning) Gøres for hver af de 4 baser -> Gel elektroforese og direkte aflæsning af DNA-sekvens DNA Footprinting Bruges til at bestemme nukleotid sekvens, hvorpå DNA-bindende prot. Sidder Modifikation af den kemiske metode Et rent DNA fragment mærkes på en ende med 32 P -> Kløves med nuclease / kemikalie Laver tilfældige snit i enkelt-streng -> DNA-fragmentet denatureres køres gennem gel-elektroforese (og autoradiografi) Sammenligner gel for DNA-fragment med DNA bindende protein Med DNA-fragment uden I den med DNA-bindende protein findes et aftryk ( footprint ) over den interessante DNA-sekvens DNA Hybridisering (Denaturering / Renaturering) Denaturering Adskillelse af dobbeltstrenget DNA -> enkelt-strenget Ved opvarmning til 100 C eller stærke baser (ph >=13) Renaturering (= Hybridisation) Gendannelse af dobbeltstrenget DNA fra 2 enkeltstrengede Ved forlænget periode ved 65 C Hybridisation Begrænset af kollisionsfrekvensen af de 2 enkeltstrengede DNA Kan bruges til at bestemme koncentration af RNA / DNA i 1 opløsning DNA probe Et fragment, som bruges til dette formål Er komplementær i sekvens til ønskede RNA / DNA Fragmentet skal være mærket Radioaktivt (radioisotop) Kemisk 7

46 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Kan være fra 15-tusinder af nukleotider lang Kan detektere så lidt som 1 molekyle DNA DNA (fx) Kan bestemme hvor mange kopier af en sekvens / genom Med til at finde gen i mennesker (hvis kendt i mus/andet) RNA (fx) Vise, om en celle udtrykker et bestemt gen Blotting Generelt Blotnings-princip Kar med buffer Heri findes en svamp Herpå ligger gel en Ovenpå ligger nitrocellulose papiret Øverst papir (til at suge) -> DNA/RNA/etc suges op fra gel en til nitrocellulosen Northern Blotting (RNA) Hvis man fx ønsker at undersøge defect I gen Samler og høster en masse prøver fra mutant og rask Adskiller DNA og RNA fra resten af cellebestandelene Adskiller DNA og RNA fra hinanden Forskellige opløseligheder i alkohol Degraderer uønsket type med RNase eller DNAse -> Gel elektroforese af mutant og rask RNA (og størrelses reference) Blotning fra gel -> papir med nitrocellulose (gel giver ikke adgang for DNA probe) -> Hybridisering med mærket DNA probe -> autoradiografi /detektering af proben. Kan se om rask eller syg... Southern Blotting (første teknik udviklet; af Edwin Southern) Samme princip, dog undersøger man DNA-sekvens Western blotting For proteiner RFLP Markers (Restriction Fragment Length Polymorphism) Genetisk markør Kan være ethvert sted I genomet, hvor der er forskelle I DNA-sekvens Som kan detekteres Mutation Sjælden variation Polymorphism Hvis variationen er almindelig RFLP manglende skærested for restriktionsenzym hos forsk. Personer Fremkommer ved base-insertion/sletning (SE JORDE fig 3-12 s.43) RFLP markør DNA-stykke mellem 2 restriktionsenzym cutting sites RFLP kan fjerne cutting site -> ændre RFLP markør 8

47 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Prænatal diagnostik af gentiske sygdomme Bruger DNA oligonukleotid som probe (med markør) Kan være syntetisk fremstillet Skal kende eksakte nukleotid sekvens af mutationen Bruger DNA oligonukleotid prober( En til normal gen sekvens En til muteret gen sekvens Southern blotting -> Hybridiserer med DNA (som man undersøger) Gøres ved temperatur, hvor kun en perfekt parret helix er stabil = Prober matcher eksakt -> Skelner mellem de 2 gener (og kendt normal til reference) Kan se, hvor mange kopier af mutation, der er Recessiv sygdom = 2 gener muterede (1 bånd muteret sekvens for recessiv) Hvis eksakt nukleotid sekvens ikke er kendt Kan bruge RFLP markør, tæt op ad genet -> Southern blot 9

48 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Definition Stærkt specifikke protein katalysatorer Enzymer Apoenzym Protein-delen af enzymet Uden co-factorer og andet Coenzym Organisk co-faktor, nødvendig for virkning af visse enzymer Holoenzym Det katalytisk aktive enzym Alt inkluderet Substrat Molekyle som er bundet i det aktive site OG som ændres af enzymet Bindingsite Fakta om enzymer Hastigheden af enzymatiske reaktioner kan øges ved, at de enzymer, der deltager i en reaktionssekvens, forekommer som multienzymkompleks. Enzymers aktivitet kan reguleres ved binding af ligander, der reversibelt ændrer enzymers konformation. Den energi, der frigøres ved enzymatisk hydrolyse af ATP, kan få andre enzymers katalyserede, men energisk ufavorable, processer ril at forløbe Et enzym molekyle kan omsætte et stort, men begrænset, antal substrat molekyler per sekund Enzymer øger hastigheden af specifikke kemiske reaktioner uden at forskyde ligevægten. Nedsætter aktiveringsenergien Allosteri Ændring af affinitet for substrat ved binding af ligand et andet sted end aktive Site Kan være substrat, inhibitor, aktivator Kinetik Vmax Km Maximal rate af transport / mætning Koncentration ved ½ Vmax 10

49 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Genetisk Rekombination Generel Rekombination = Udveksling af genetisk materiale mellem et par homologe DNA sekvenser Mekanismen Dannelse af nick i den ene DNA-streng RecBCD udfører dette (hos E. Coli) Fungerer også som Helicase -> laver enkelt-strengs whisker Hydrolyserer ATP undervejs (ATPase) Binding af RecA til Whisker og 2. dobbelt-strenget DNA Fungerer bl.a. som SSB DNA-afhængig ATPase Tæt bundet til DNA med ATP bundet Branch-migration Krydser enkelt-strenget over på dobbelt strenget DNA Polymeriserer langs DNA-strengen Tread-milling (som fx mikrotubuli) -> Zipning af de to DNA molekyler Danner hetero-duplex joint Mulige udfald Overførsel af lille stykke enkeltstrenget DNA Ombytning af DNA dobbelt-strengene fra Holliday-junction (ombytningssted) og videre Sker slet ikke noget Ingen rekombination Ved for få Watson-Crick basepar dannet Site-Specifik Rekombination Konservativ Site-specifik Rekombination Modtager DNA-molekyle Åbnes ved specifik-site (af integrase) Mobil DNA sekvens sættes ind (fx virus DNA) Denne åbnes også site-specifikt Reversibel proces Mobil DNA-sekvens kan tages ud igen (igen integrase) UDEN at ændre oprindelige modtager DNA Fx Bakteriofag Lambda Mange molekyler Lambda integrase bindes til modtager DNA Hertil kan mobil Lambda DNA-sekvens integreres ->Sker ved klipning og limnings reaktion ved kort region af sekvens homologi (danner lille hetero-dupleks joint) Viralt DNA kan tages ud igen Transpositional Site-specifik Rekombination Mobil DNA-sekvens klippes til site-specifikt Integrase klipper i hver ende af denne 11

50 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Direkte angreb af disse ender på modtager DNA molekyle IKKE specifik sekvens på modtager DNA-molekyle -> Dannes 2 enkeltstrengede huller efter indsætningen Udfyldes af DNA polymerase (reparation) Limes af Ligase Fx Bakteriofag Mu 12

51 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Genregulation i Eukaryote Celler Gen Del af DNA som transkriberes til RNA Gen Kontrol Region Promoter Ca. 10 -> -35 TATA-boks Del af promotor Ca. 25 Findes på næsten alle promotor e af PolII Generelle Transkriptionsfaktorer samles her TFIID (mange subunits) TBP (=TATA Binding Protein) TFIIB RNA Polymerase II (+TFIIF) Indeholder CTD (Carboxyl Terminal Domain) Consensus heptapeptid sekvens W-S-P-T-S-P-S Gentages mange gange på subunit af PolII 52 gentagelser for pattedyr Det er denne, der fosforyleres TFIIE TFIIH En subunit = protein kinase = helicase Phosphorylerer PolII (bruger ATP) = nøgletrin i initiering -> Transkription 5 -> 3 Frigivelse af generelle transkriptionsfaktorer Undtaget TBP Initiator Alternativt promoter element; med C (-1) A (+1) Ikke så fast konsensus-sekvens CpG islands Alternativt promoter element basepar lang C&G rig strækning (umethyleret; normalt CG er methylerede) Indenfor 100 bp af start-site (5 region) CG-strækninger er underrepræsenterede i vertebrater Genkendes af SP1 TF Regulatoriske Sekvenser Binding af gen regulatoriske proteiner = specielle transkriptions faktorer kontrollerer samlingsprocesserne ved promoteren 13

52 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Enhancer- / Silencer-sekvenser Kan kontrollere gener helt op til nukleotidpar væk Før, efter el i introns (oftest intron 1) DNA-strengen kan bøje tilbage Gen aktivator proteiner Accelererer binding af transkriptionsfaktorer /initiering af trans. Består af aktiverings domæne + bindings-domæne Gen repressor protein Kompetitiv DNA binding Om regulatorisk DNA-sekvens med aktivator Virker ved Binding til aktivators aktiverings-domæne Direkte interaktion med Gen. TF s -> blokering af videre samling af TF s Inaktivation af aktivator ved heterodimerization (HLH) Gen Regulatoriske Proteiner Gen - genkendelse Kan læse ydersiden af DNA-dobbelt-helix Via Major groove (4 forskellige mønstre) Binding ved spec. Nukleotid sekvenser -> kan ændre lidt på DNA-helix geometrien -> Helix twist > eller < end 36 bøjning Binder ved hydrogen-bindinger Indeholder strukturelle motiver Helix-Turn-Helix 2 α-helices forbundet ved kort kæde af aminosyrer C-terminal helix = recognition helix Meget forskellige (diverse) udover 2 α Ofte symmetriske dimer -> K 2 (øger affinitet meget) fx Homeodomæne (Homeotic Selector Gene) Kontrol udviklings switches (Husk: flue øje på ben) Zinc Finger motiver Meget variable Zn 2+ -ion indgår Fx α-helix & β-sheet holdt sammen af Zn 2+ α binder DNA β-sheets Bruger β-sheet til genkendelse Leucin-Zipper motiver 2 α-helices (dimer) Danner kort coiled-coil Holder på DNA som tøjklemme 14

53 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Holdes sammen af hydrofobe interaktioner Fra sidekæder på hver α (ofte på Leucin) Helix-Loop-Helix Kort α-helix, Loop, længere α-helix (DNA bindings helix) Homodimer el heterodimer -> Mange kombinationer Nogle HLH proteiner mangler DNA-bindings helix ->inaktiverer dimer (se Gen repressor prot.) Lac-Operon (E.Coli) Gener til et formål samlet Laktose stofskifte; under lavt sukker Lac repressor Ikke bundet laktose (lav konc. laktose) Bindes til 5 -> +20 af Lac Operon Forhindrer transkription af Lac Operon Bundet laktose Kan ikke binde til DNA skevens (tillader transkription) CAP (Catabolite Activator Protein) Høj camp (bundet) (ved lav glucose konc.) Bindes til promoter; øger affinitet for polymerase -> meget øget transkription af Lac Operon Lav camp (ikke bundet) (ved høj glucose konc.) Kan ikke binde til promoter 15

54 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Golgi s Rolle ved Sortering af Secernerede Proteiner Secernerede proteiner foldes i ER -> Overføres default til Golgi -> Går gennem Golgi cisternerne -> Sorteres i Golgi-Trans-netværket Konstitutiv sekretorisk vej Default til exocytose Beklædes med coatomér-coat ved afsnøring Afstødes inden exocytose Fx Vækstfaktorer Enzymer Komponenter til extracellulære grundsubstans Regulerede Sekretoriske vej Signal til sortering (som regel signal patch) Specielle receptor-proteiner (mekanismen kendes ikke helt) Afsnøres ved hjælp af en Clathrin-coat Afstødes kort efter afsnøring Ligger i sekretoriske vesikler Udløses v.h.a. signal til exocytose Fx. Midlertidigt [Ca 2+ ] hævning Fx Mange enzymer og Hormoner (Endosomer ikke secernered eprot.) M6P sættes på i Golgi Opkoncentreres ved M6P-receptor Afsnøres ved clathrin-coat -> primært lysosom ->fusionerer med sekundært lysosom 16

55 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Hormoner Klassifikation af hormoner Lipofile hormoner (intracellulær receptor) Diffunderer over membranen Fx steroid-hormoner,thyroidea hormoner, Retinoid er, Vitamin D Hydrofile hormoner (overflade receptor) Fx catecholaminer (adrenalin, noradrenalin) Lipofile hormoner (overflade receptor) Fx diverse Growth Factors, Insulin? Hormon-receptor Receptor som tager hormon som ligand Herved sker en allosterisk ændring Steroidhormoner Transporteres i blodet via carrier-proteiner Diffunderer over plasma-membranen i mål-cellerne Ligand (hormon) bindes til receptor - regulerer direkte transkription af gener Intracellulære receptor superfamilie (steroid-hormon receptor superfamilie) Består af 4 domæner Hormon-bindings site Hængsels-region DNA-bindings site Transkriptions aktiverende domæne Indeholder i inaktiv tilstand et inhibitorisk protein-komplex Flyttes til nucleus Bindes til specifik DNA-sekvens (aktiveret) tæt på genet Inducerer primært respons (ca. 30min) Disse produkter aktiverer andre gener inducerer forsinket sekundært respons slukker for primær respons gener Transkription af gener kan afhænge af andre gen regulatoriske prot. 17

56 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Klassifikation af RNA Polymeraser De 3 karakteriseres ved forskellig sensitivitet til α-amanitin (Amanita Phalloides) RNA Polymerase I Sensitivitet for α-amanitin Lav Danner 45S rrna (rrna) RNA Polymerase II Sensitivitet for α-amanitin Meget Høj Danner Alt mrna RNA til Snurps RNA Polymerase III Sensitivitet for α-amanitin Middel Danner Små stabile RNA Herunder trna 5S rrna 7S RNA (fra Signal Recognition Particle) U6 (fra splicing) 18

57 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Kloning af DNA-sekvenser/gener Kloning v.h.a. Plasmid-vektorer Plasmid-vektor Cirkulært dobbeltstrenget DNA (fra bakterieceller) Adskilles let fra kromosomalt DNA ved centrifugering Forekommer naturligt i visse bakterier (fx E.Coli) Deriveret fra størrere plasmid Polylinker ofte indsat = kunstig sekvens med sites for mange restriktionsenzymer se fx Lodish s, 214 Klippes med restriktions enzym -> lineær DNA-molekyle DNA (til biblioteket) klippes med samme restriktions enzym Disse sættes sammen til rekombinante cirkulære DNA-molekyler Limes sammen med DNA ligase (ATP tilstede) Transfektion Rekombinante plasmid-vektorer sættes ind i bakterie-celler Disse gøres midlertidigt permeable for DNA (salt-opl., stød) Fx CaCl 2 (eller andre divalente kationer) -> celler kaldes herefter kompetente Celler vokser, fordobler antal hver 30. minut Herunder kopieres det fremmede DNA også (=kloning) Udvælgelse Ikke alle bakterier bliver transficerede Der findes gener for antibiotika-resistens i visse plasmider Derfor dyrkes bakterier på medium m. pågældende antibiotika Fx ampicillin i E.Coli Kun transficerede bakterier vil overleve Genom DNA biblioteker Genom klippes med restriktionsenzym & plasmider dannes (evt Cosmider, YACs ( kb)) klippes ufuldstændigt -> mange overlappende segmenter -> transficeres Denne samling af plasmider udgør biblioteket Ikke alle plasmider indeholder gener (meste DNA ukodende) Mange DNA kloner indeholder dele af gener cdna bibliotek starter med mrna (udvundet fra væv, man vil undersøge) (kan selvfølgelig gøres med andre typer RNA) dette skilles fra andet RNA v.h.a. polya hale køres gennem en kolonne med oligodt udvindes fra kolonne -> reverse transcriptase -> cdna-rna hybrid RNA hybrid nedbrydes cdna gøres dobbeltstrenget ved DNA polymerase (via hairpin loop) 19

58 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Behandles med S1 nuclease for at nedbryde loop cdna klippes med RE og sættes ind i plasmid vektorer (eller virus) (transf.) Samlingen af kloner fra 1 celles mrna udgør cdna biblioteket cdna kloner indeholder kun del af Genom udtryk som mrna dvs. forskelligt for hver celletype Identifikation af relevant DNA-klon Svært, specielt for genom-bibliotek Blotting-metode Form for in situ hybridization Kolonierne af bakterier blottes over på et stykke filter-papir Disse kaldes replicas Behandles med base -> ødelægger cellen, skiller dobbeltstrenget DNA Papiret inkuberes med kemisk eller radioaktiv (fx 32 P) mærket probe Proben indeholder del af gen-sekvensen Denne metode kan bruges til millioner af forskellige kloner Let at finde del af aminosyre-sekvensen (få mikrogram protein) Fastlæggelse af korrekt klon Metode før giver mange falsk-positive kloner Lettest af fastlægge klon korrekthed, hvis protein er karakteriseret Klonet DNA sættes fx ind i Expressions vektor Proteinet bliver produceret i store mængder i bakterien og udvundet Proteinet sammenlignes så med forventede ved chromatografi Hybrid selektion Celle RNA blandes sammen med enkeltsstrenget klon-dna DNA-RNA hybridization bruges til at finde komplementært mrna mrna -> protein syntese med radiaktive aminosyre i cellefrit miljø radioaktivt protein karakteriseret og sammenlignes med forventet prot. PCR (Polymerase Chain Reaction) Muligt at opformere DNA I cellefrit miljø I store mængder Kun nødvendigt med 1 enkelt DNA-molekyle Skal kende en lille del af nukleotid-sekvensen (til primer e) (1 til hver ende) Primers kan købes fra firmaer Disse er normalt 15-25bp lange 1) varmebehandling for at skille DNA-strenge (95C) Der bruges Taq DNA polym. (fra thermofil bak.thermus aquaticus) Denne virker helt op til 72C 2) nedkøling sammen med stort overskud af 2 DNA primer nukleotider (35-65C) 3) inkuberes med Taq DNA pol. & 4 deoxyribonukleotider (70-75C) Proceduren gentages gange Hver cyklus tager ca. 5 min. Metoden kan bruges til faderskabstests, retsmedicin Kan kun bruges ves få kbp lange sekvenser 20

59 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Metabolisme Generelt Biologiske omsætning af kulstof (Biosfærens carboncyklus) 6CO H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6O 2 Kulstof føres ind i cyklus af planter -> i cyclus af dyr Anabolske Processer Opbyggende processer Katabolske Processer Nedbrydende processer Nedbrydning af næringstoffer Fase 1 Nedbrydning af makromolekyler -> monomer form Foregår i tarmen Protein -> aminosyrer Polysaccharider -> monosaccharider Fedtstoffer -> fedtsyrer + glycerol Fase 2 Fase 3 Glykolyse Glycose -> pyruvat (SE FIG. 2-21& 2-22 s. 69 i Alberts) Foregår i cytoplasma -> Pyruvat Dehydrogenase komplex pyruvat -> AcetylCoA Foregår i mitochondrie matrix β-oxidation Fedtsyre -> (Fedtsyre 2C) + AcetylCoA Foregår i mitochondrie matrix (SE FIG , s. 659 i Alberts) TCA-cyclus Oxidativ Phosphorylering SE SYNTESE AF ATP I MITOCHONDRIERNE (SE FIG s. 72 & s. 661 i Alberts) NAD+, NADH, ADP, ATP s rolle i cellulære stofskifte SE SYNTESE AF ATP I MITOCHONDRIERNE (SE FIG s. 72 & s. 661 i Alberts) ATP-dannelse C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO H 2 O + 36 ATP Glucose s nedbrydning under anaerobe forhold (muskel) C 6 H 12 O 6 laktat +(regenererer NAD+) +2ATP (fra glykolyse) (gær) C 6 H 12 O 6 CO 2 + ethanol+(regenererer NAD+) +2ATP(fra glykolyse) 21

60 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Slutprodukter ved oxidation af AcetylCoA 1 mol Acetyl CoA -> 3 mol NADH 1 mol FADH 2 2 mol CO 2 1 mol GTP 22

61 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi N- & O Glykosylering N-Glykosylering Sættes på N på Asparagin Asn-X-Ser/Thr X alt UNDTAGET Prolin 14 Oligosaccharid sættes på en bloc i ER Oligosaccharyl Transferase Membranbundet, aktiv del i lumen Overføres fra Dolichol (spec. Lipid molekyle) Sidder på dolichol ved høj-energi binding Pyrophosphat binding (energi til overførslen) 2 N-Acetylglucosamin 9 Mannose 3 Glucose Klippes til i ER Glucosidase I (- 1 Glucose) Glucosidase II (- 2 Glucose yderligere) ER Mannosidase - 1 Mannose -> Overførsel til Golgi Alt opdelt strengt biokemisk Høj Mannose Oligosaccharider Ingen nye saccharider på Som i ER (måske lidt færre Man) Komplekse Oligosaccharider Klippes yderligere til Fx Golgi mannosidase I -3 Mannose Cis cisterne Golgi Mannosidase II -1 Man ; -1 Man Medial cisterne Ting tilsættes Fx O-Glykosylering Foregår i Golgi apparatet Mindre udbredt Sukker på OH-gruppe af Serin Threonin N-acetylglucosamintransferase I Medial cisterne Galactose Trans cisterne Sial syre (NANA = N-acetylneuraminsyre) Trans Golgi netværk 23

62 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Hydroxylysin (i kollagen) Saccharider er nucleosid mono-/di-phosphater -> energi til overførslen Katalyseret af en række glycosyl transferase enzymer (som N) 1 ad gangen (sættes på) N-acetylgalactosamin først (dog galaktose ved hydroxylysin) Flere sukkere Få eller over 10 Funktion Hovedfunktion: UVIS Rolle i foldning (N-glucosylering en bloc) Med til at danne glycocalyx Beskytter glycoprotein mod proteaser Med til at bestemme blodtype Celle-celle adhæsionsprocesser 24

63 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Plasmamembranen Membran Lipider Ca lipidmolekyler i en lille dyrecelle Ambifile Hydrofob ende (upolær) Hydrofil ende (polær) Phospholipider hydrofilt hoved glycerol phosphat forskellig hovedgruppe 2 hydrofobe hydrocarbon haler (fedtsyrer) mellem C-atomer ofte 1 mættet 1 enkelt umættet (1 cis dobbelt-binding) = lille knæk i halen 4 almindeligste (over 50% af membranens masse i fleste celler) phosphatidylcholine sphingomyelin phosphatidylserin (sidder ALLE på cytosol-siden) phosphatidylethanolamin Andre lipider forekommer Inositol phospholipider (se cellesignalering) Glycolipider Membran lipider danner spontant i vandig opløsning lipid dobbeltlag eller miceller = kugler (Hydrofil del udad, hydrofob indad) Lipid-dobbeltlag (membranen) er en 2D væske Stor lateral-diffusion (Diffusionskoefficient = 10-8 cm 2 /sek) Flip-flop sjældent syntetisk(hjælpes af fosfolipid translocator enzymer) lipidmolekyler roterer meget hurtigt om egen akse Hydrocarbon-kæderne er flexible Fluiditet Fluiditeten prøves at holdes konstant (hindre fase-transition) Afhænger af membranens sammensætning Kortere kæder & dobbeltbindinger øger fluiditet Cholesterol Øger membranens permeabilitets-barriere egenskaber Mindsker permeabilitet - små vandopløselige stoffer Mindsker fluiditet MEN hindrer fase-overgang/sammenpakning af kæder Syntetiske lipid-dobbeltlag Liposomer (spheriske vesikler) Black membranes (dannet over hul mellem 2 vandige opl.) Glycolipider Lipider med sukker påsat (i Golgi) Findes kun på ikke-cytoplasmisk side Gangliosider 25

64 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Mest komplekse glycolipider Med 1 eller flere NANA (negativ) Mange af disse i nervecelle membran (5-10% lipid) Membranens assymetri Lipiderne er ikke jævnt fordelt I menneskeligt rødt blodlegeme Næsten kun phosphatidylcholin & spingomyelin på yderside2 andre næsten kun på indersiden Phosphatidylserin er netto negativ Med til at aktivere protein Kinase C Dermed betydelig forskel i membran ladning (ind/ud) Membranens proteiner Ingen flip-flop Rotationel diffusion (perpendicular til lipid bilaget) Mange proteiner har lateral diffusion Patching (blanding af protein-typer over membranen - diffusion) Capping (samling af proteiner af samme type -> en cellepol) Hastigheden kan måles ved FRAP Flourescense Recovery After Photobleaching Blegning af påsatte antistoffer Målning af tid, før proteiner er tilbage i området Størstedelen af dem er glycosylerede (vendende udad) (glycocalyx) Celler kan afgrænse proteiner i specielle områder af sin membran Fx i epithel-celler (apicalt / basolateralt domæne) Dette sker ved hjælp af tight-junctions (zonulae occludentes) Kan også forekomme uden intracellulære junctions Transmembrane proteiner Hydrofob kæde ofte α-helix (20-30 aminosyrer med meget hydrofobicitet) (men porin = β-barrel, skal kun bruge 10 eller færre hydrofobe) Cystein i prot. danner S-S udenfor, ikke i cytosol Single pass transmembran proteiner En gang over membranen Multipass transmembran proteiner Flere gange over membranen Svære at opløse Kan gøres ved detergenter Disse er ambifile molykyler fx SDS (SodiumDodecylSulfat) (ladet) denne denaturer proteinet er meget stærk proteiner kan efterfølgende analyseres via SDSpolyacrylamid-gel elektroforese Triton-X-100 (ikke ladet) Mild detergent Denaturerer IKKE proteinet Perifere membranproteiner Proteiner som ikke selv går ind i lipid-bilaget Fx forbundet ved glycosylphosphatidylinositol-anchor (GPI) 26

65 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Forbundet til andre membran-proteiner Disse er lette at opløse Fx v.h.a. meget høj/lav ionisk opløsning Ekstreme ph-værdier Lipoprotein Fx bundet direkte til lipids polære hoved Proteinindhold i forskellige Komponenter Myelin Ca. 25% Indre Mitochondriemembran Ca. 75% (67) Normal plasmamembran Ca. 50% 27

66 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Posttranskriptionel modifikation af RNA mrna primært transkript (fra RNA polymerase II) hnrna (heterogenous nuclear RNA)= alle primære transkripter intron (bruges ikke I det modne mrna) extron (bruges I det modne mrna) co-transcriptionel 5 cap (af dimerisk capping enzym, associerer med CTD) ca. efter 30 nukleotider 7-methylGuanosin danner 5 5 forbindelse til første nukleotid herimellem er indskudt 3 P. 7mGMP -> 2P ende 3P Funktion: Vigtig for initieringen af protein-syntese Forhindrer degradering af det voksende transkript Post-transkriptionel Methylering af 1-2 første nukleotider (2 C = OCH 3 ) Poly A hale (på alle mrna; undtaget histon-mrna) Signal til kløvning (AAUAAA) ca nukleotider upstream + mindre veldefineret nedstrøms-signal GU/U-rig strækning Ca. 50 nukleotider indefor kløvning påsætning af A til 3 enden (umiddelbart efter kløvning) poly-a polymerase RNA pol II transcriberer videre efter kløvning Dette nedbrydes med det samme (uden 5 cap) Funktion: Hjælper modent mrna ud af kernen Indflydelse på stabilitet af nogle mrna i cytoplasma Genkendelsessignal for ribosomet (sammen med 5 cap) hvis mrna ikke er intakt, skal protein syntesen ikke startes. Via PABI (Poly A Binding Protein) Agerer med subunit af uif4 Laver cirkulært mrna Halen gør, at man let kan udvinde mrna ved hjælp af en kolonne med poly dt koblet til en fast støtte. RNA splicing Introns fjernes (reducerer størrelsen af RNA meget) HnRNP partikler (pakkes med det samme) Ca. 500 nukleotider pakker omkring protein kompleks Diameter på 20nm (dobbelt størrelse af nukleosomer) Protein-komplekset består af mindst 8 forskellige proteiner (flere indeholder konserveret 80 aminosyre-sekvens) RNA bindingsmotiv β-sheet (4 strenge; 2 binder RNA) 2 α helices på en side snrnp s ( snurps ) (small nuclear ribonucleoproteins) 28

67 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi proteinkomplekser af protein med små stabile RNA s (<250) U1, U2, U3...U12 Ca daltons Individuelle snurps genkender specifikke nukleotid-sekvenser vi RNA-RNA base-parring Introns ( nukleotider) Indeholder 2 konserverede sekvenser (næsten invariant) én ved 5 splice site (donor site) (GU) én ved 3 splice site (acceptor site) (AG) (Branch Point A) ofte pyrimidin rig region upstream for 3 splice site spliceosome (sedimenterer ved 60S) stort ribonucleoprotein-kompleks består af U1, U2, U5, U4/U6 + nogle andre proteiner Splejsning-mekanismen U1 binder sig til 5 splice site via 9-nukl. konsensus sekvens U2 sætter sig på Samlingen af spliceosom finder sted Branch-point A i intron tæt ved 3 splice site (U2 sidder her) Angriber 5 splice site og kløver) Herved dannes lasso-form ved kovalent binding af enden til A 2-5 phosphodiester binding 3 OH enden af første exon sætter sig på 5 -enden af 2. exon Herved frigøres intron-sekvens som lariat (lasso-form) -> 2 transesterificering Selv-splejsning af introns kan forekomme, nogle mitochondrie-gener =RNA katalyseret splicing mrna kan ikke transporteres til cytoplasma inden splicing er færdig Mutationer Enkelte nukleotid forandringer, der inaktiverer et splice-site. Dette forhindrer ikke splejsning Ændrer splejsning til et andet kryptisk sted tæt på Resulterer i flere forskellige splejsninger (og dermed prot.) Thalassemia syndromer Har et abnormt lavt hæmoglobin-niveau rrna mange kopier af rrna gener (omkring 200 pr. Haploide genom) disse er spredt over 5 kromosomer (acrocentriske) Tandem-arrangeret med spacer DNA mellem (længde/sekvens varierer) Christmas-tree udseende RNA polymerase-molekylerne er tæt pakket (giver udseende) 45S rrna (ca nukl.) transkriberes af RNA polymerase I kløves inden i nucleolus 28S rrna (ca nukl.) 18S rrna (ca nukl.) 5,8S rrna (ca. 160 nukl.) resten nedbrydes I nucleus(spiller måske midl.rolle I ribosom-samling) 5S rrna (ca. 120 nukl.) 29

68 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Transkriberes af RNA polymerase III Transkriberes udenfor nucleolus Vandrer herefter ind i nucleolus Ca kopier af genet (tandem-arrangeret) Disse findes langfra det andet rrna Samlingen af ribosomet Underenheder samles i nucleolus 40S 18S rrna ca. 33 proteiner 60S 28S rrna 5,8S rrna 5S rrna ca. 49 proteiner trna Transkriberes af RNA polymerase III Mange af nukleotiderne modificeres Foldes til 3d L-form CCA på 3 ende sættes på Stykke på 5 ende klippes af (+andre) 30

69 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Protein Translokation over ER-membranen Signal peptid 5-10 hydrofobe aminosyrer N-terminalt Del-kode 4 C-terminalt kan gøre dem til permanente ER-beboere = KDEL-sekvens SRP (Signal Recognition Particle) Består af 6 proteiner 1 SRP RNA (scrna) (7S RNA via RNA pol III) Bindes til Signal peptid & ribosom Straks efter translation af signal-peptid-stykke -> pauser translation -> Finder en SRP-receptor i ER-membranen SRP-Receptor (Docking Protein) Transmembrant protein -> Binder komplekset (SRP + ribosom + mrna) -> Hjælper til at samle overførselskanal Videre Proces -> SRP frigives -> Polypeptidet overføres Co-translationelt Energi kommer fra protein-syntesen -> Signal peptid klippes af til sidst af en signal-peptidase Membranbundne proteiner Start/Stop-signal 1. signal aktiverer overførsel 2. stopper. Variende antal gange, alt efter hvor mange membran-krydsninger Andre Translokations former Post-translationel overførsel KAN forekomme Energi fra ATPase 31

70 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Definitioner Peptider En aminosyre Peptidbinding Amid binding mellem 2 peptider Proteiner = polypeptider (evt. Flere) mange peptider bundet sammen Proteinstruktur Struktur Primære struktur Aminosyre-sekvens Sekundær struktur Regelmæssige hydrogen-binding interaktioner danner: α - helix 1 polypeptidkæde drejer om sig selv (=cylinder) findes ofte i transmembran-del af transmembran prot. Ikke stabil alene i vandig opløsning 2 identiske helices kan danne coiled-coil (fx keratin) β - sheet (foldebladsstruktur) 1 polypeptidkæde, der folder frem og tilbage meget rigid struktur antiparallel lagene er modsatrettede parallel lagene er rettede i samme retning Super-sekundær struktur (=motiver) α - helices & β - sheets kan kun kombineres på begrænset antal måder motiverne går igen i mange proteiner fx Hairpin beta motiv 2 antiparallele β - strenge bundet sammen af polypep.-loop beta-alpha-beta parallele β - strenge, forbundet af α - helix Tertiær struktur (3D foldning; rumlig placering af motiver) Domæner Forskellige kombinationer af motiver danner domænet Subunit (monomer) Dannes af domæner, forbundet med polypeptid-kæde-stykker Kvarternær struktur Flere subunits kan gå sammen i komplex (dimer, trimer etc.) Disse er bundet sammen af svage non-kovalente bindinger Ofte stabiliseret af disulfid-bindinger (ikke i cytosol pga red. enzymer) Foldning Fleste polypep. kæder foldes til 1 specifik konformation (af sig selv) Upolære side-kæder har en tendens til at folde indad mod hinanden Polære sidekæder har tendens til at blive rettet ud(mod vandig miljø) Foldningen hjælpes af chaperone-proteiner (fx BiP) 32

71 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Denaturering Dette er når et protein foldes ud af sin konformation Kan gøres ved behandling med visse opløsningsmidler Renaturering Protein foldes tilbage til sin konformation efter denat.(ofte spontant) Signalområder Signal peptid Sammenhængende stykke kæde normalt aminosyrer langt efter sortering klippes signal-peptid (ofte) af, af signal peptidase fx signal-peptid til ER translokering 5-10 hydrofobe aminosyrer N-terminalt videre til Golgi, medmindre indeholder specifik 4 aminosyrer C-terminalt = permanent i ER Signal patch Forekommer kun i det foldede protein Specifik 3-D atom-arrangement på proteinet s overflade Aminosyrer-sekvenserne kan være langt fra hinanden Fx visse enzymer som skal til lysosomer (lysosomale hydrolaser) Signalpatch en initierer påsætning af Mannose-6-phosphat Dette sker på N-kædede-oligosaccharider i Golgi cis netværk -> Golgi trans netværk her bindes disse proteiner til M6P-receptor proteiner afsnøres fra Golgi (clathrin-coated-vesicles) -> sammenkobling med sent endosom -> lysosom 33

72 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi RNA s rolle ved Translation mrna (messenger RNA) Koden til proteinet 3 nukleotid kode ( A,U,G,C) 4 3 = 64 muligheder 20 aminosyrer -> Degenereret kode 5 cap (7-methylGuanosin) PolyA hale (ca. 200) AUG start-kodon (Methionin) Eukaryot mrna er monocistronisk 1 species polypeptid / mrna Stop-kodons UAA UAG UGA trna (transfer RNA) 61 kodons 31 forskellige trna molekyler Wobble-base-pairing 2 første positioner konstant Sidste fri (kan wobble) Kobling mellem mrna-kode og aminosyrer Antikodon (komplementær til mrna nukleotider (CCA slutning) rrna (ribosomalt RNA) 80S 60S 28S 5,8S 5S + prot. 40S 18S + prot. Syntese apparat Katalysator for translation af mrna P-site (peptidyl-trna-binding site) Polypeptid-koblet A-site (aminoacyl.trna-binding site) Incoming site 34

73 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Syntese af ATP i mitochondrierne Glucose Glykolyse (cytoplasma)) Glucose -> 2*pyruvat (+2 NADH + 2 ATP i alt) Pyruvat dehydrogenase komplex (i matrix) Pyruvat -> AcetylCoA (+1 NADH) Fedtsyrer β-oxidation (fedtsyre oxidations cyklus) foregår i matrix fedtsyre (påsat coa) -> fedtsyre 2C (påsat coa) + 1 acetylcoa (+1. trin FADH trin NADH) ->cyklus fortsætter Citronsyrecyklus (TriCarboxylicAcid cycle, Krebs cyklus) Se figure I Alberts, s. 661 Oxaloacetate + AcetylCoA -> citrate (+ CoA) isocitrate α-ketoglutarate (+ NADH + CO 2 ) succinyl CoA (+ NADH + CO 2 ) succinate (+ GTP + CoA) fumarate (+ FADH2) malate oxaloacetate (+ NADH + CO 2 ) (3NADH + 1 FADH 2 + GTP + 2 CO 2 ) Respirationskæden Sidder I den indre mitochondrie membran Udnytter energi fra NADH / FADH2 (elektronerne) Trinvis videreførelse til lavere energistadie via 3 store komplekser transport af H+ ud af matrix endelig reduktion af O 2 til H 2 O Skaber ph gradient og membranpotential, der forstærker hinanden Koblet med ATP Synthase til dannelse af ATP udfra protongradienten Multiple feed-back systemer til at stoppe/starte produktion af ATP Elektron carriers Cytokromer (6) Har alle en heme gruppe (Fe 3+ > Fe 2+ ) Porphyrin-ring Fe-atom bindes ved 4 N-atomer Jern-svovl centre (på et protein) (+6) 2 el. 4 Fe-atomer bundet til samme antal S-atomer + S på cystein sidekæder Coenzym Q (ubiquinon) Lille hydrofobt molykyle Opløst I lipid-dobbeltlaget Kan optage 1 eller 2 elektroner Medbringer H + Flavin (1) 35

74 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Kobber-atomer (2) Respirations enzym komplekser NADH dehydrogenase kompleks Største respirationskæde kompleks Ca daltons +22 polypeptid kæder flavin min. 5 jern-svovl centre får 2 elektroner fra NADH pumper simultant 4 H + ud -> CoQ (transporterer fra første til andet kompleks) Cytochrom b-c1 kompleks dimer Ca daltons Hver monomer har Min 8 forskellige polypeptidkæder 3 cytochromer (heme-grupper) 1 jern-svovl protein pumper 4 H + ud (pr. Elektronpar) -> cytochrom c (giver sin elektron til 3. kompleks) Cytokrom oxidase kompleks (cytochrom aa 3 ) Dimer Ca daltons Hver monomer har Min 9 forskellige polypeptid kæder 2 cytochromer 2 kobber atomer accepterer elektroner fra cytochrom c -> O 2 et jern- og kobber-atom holder O 2 fast indtil modtagelsen af 4 elektroner (så reaktiv superoxid radikal undgås) pumper 2 H + ud (pr. Elektronpar) ATP-synthase (F0F1 komplekset) Sidder i den indre mitochondriemembran Består af 2 dele F1 F0 ATPase Knappenålshoved (sidder ind mod matrix) Transmembran H + carrier Ca. 15% af indre membran protein Danner ATP v.h.a. protongradienten (3-4 H + pr. ATP) H+ flyder igennem og driver F1 til at danne ATP Kan fungere omvendt spalte ATP (kommer an på koncentrationerne) ADP + ATP koncentrationerne holdes v.h.a. antiporter 36

75 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Afkoblere 2,4 dinitrophenol Kortslutter ATP syntese Er hydrofobt og opløseligt i membranen Er protonbærer Fører H + over membranen til matrix (fjerner protongradienten) ATP synthase fungerer ikke Accelereret respiration -> varme Brunt fedt Thermogenin (naturlig afkobler) Danner varme Brunt p.g.a. indhold af mitochondrier Dyr i hi, polar-dyr Babyer/nyfødte har det på følsomme områder (bl.a. ml. skulderblade) G 0 for hydrolyse af ATP -> ADP = -11 -> -13 kcal / mol 37

76 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Proteinsyntese trna s funktion i proteinsyntesen Tegn struktur af trna (s. 228 i Alberts, fig. 6-8) trna lille RNA molekyle (70-90 nukleotider) kløverbladsstruktur i 2 d L formet i 3d (ved røntgen krystallografi) CCA i 3 enden aminosyre sidder på A i 3` enden T-loop tættest på 3 D-loop tættest på 5 Anticodon loop i midten (aminosyre er 3`->5` komplementær) Indeholder anticodon sekvens Indeholder mange modificerede nukleotider Findes 31 forskellige trna Binding af aminosyrer til trna Aminoacyl-tRNA-synthetaser 20 forskellige (1 til hver aminosyre) har 2 bindings-sites 1 til aminosyre 1 til trna genkender trna ud fra 3d struktur (bl.a. anticodon, ikke kun) -> undgår fejl -> lavere fejlrate aminosyren adenyleres (ATP ->aminosyreamp) har hermed energi til trna tilkobling bærer energien til påsættelse af næste trna trna og adenyleret aminosyre sættes sammen (under fraspaltning af AMP) Sættes på 3 enden af trna (A) på OH gruppe på 3 C el. 2 C Hhv Klasse 2 og Klasse 1 (50% af hver) Translation Ribosomer Stort kompleks af RNA og protein (80S) Stort og lille subunit (40S & 60S) 40S 18S rrna (ca nukleotider) ca. 33 proteiner Indeholder A, P & E sites A = Aminoacyl-tRNA-binding site P = Peptidyl-tRNA-binding site E = Exit site 60S 28S rrna (ca nukleotider) 5S rrna (ca. 120 nukleotider) 5,8S rrna (ca. 160 nukleotider) ca. 49 proteiner 38

77 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi Initiering EIF3 + eif1a sættes på 40S 3 & 6 tjener til adskillelse af 40S og 60S -> Binding af eif2-gtp-met-trna i Met til 40S eif2 + GTP kan fosforyleres på serin -> inhib. Af proteinsyntese bindes til Met- trna i Met eneste trna som kan binde til P-site (og initiere) Forskellig fra normal trna Met Samme synthethase -> Samling af kompleks 40S eif4 Sæt proteiner (genkender 5 cap) MRNA Forbrug af 1 ATP -> Scanning efter AUG (start-codon) ofte første AUG Kozak-sekvens Omgiver AUG start-site ACCAUGG (første A vigtigst) Forbrug af 1 ATP -> Binding af Met- trna i Met til P-site afgivelse af eif1a eif3 eif4 -> Binding til 60S Fraspaltning / forbug af eif5 eif2-gdp IRES (internal ribosome entry site) Nogle virale mrna. ingen 5 cap Ligesom nogle cellulære mrna Ribosomer starter her Elongering 1. trin aminoacyl-trna danner komplex med Elongering Faktor (EF-1) EF-1 påsættes også en GTP Komplekset er en kinetisk proofreading, Komplekset bindes til A-site (codon-anticodon parring) (sidder en peptidyl-trna i P-site) Forhindrer elongering af polypeptid-kæde (pauser) Første codon-anticodon parring medvirker GTP->GDP Derefter elongering af polypeptidkæde Hvis oprindelige codon-anticodon parring ikke er stærk nok, spaltes komplekset fra ribosomet i pausen. 2.trin polypeptid-kæde kobles fra trna i P-site -> 39

78 Erik Brandt Biokemisk Cellebiologi aminosyre fra trna i A-site (kondensation) katalyseret af peptidyl transferase (en del af rrna i 60S) 3. trin peptidyl-trna i A-site flyttes til P-site (ribosomer flytter 3 nukleotider) energikrævende trin (hydrolyse af GTP) Katalyseret af EF-2 trna i E-site frastødes Hver cyklus tager 1/20 sekund Terminering Release factors Proteiner; binder til stop-kodons Form som trna = molecular mimicry RF1 -> UAG; RF2 -> UGA (hos bakterier) -> påsætter vand på polypeptidkæde forbrug af 1 GTP fra RF3-GTP (hos bakterier) Genetisk kode Kodon = 3 nukleotider 4 forskellige nukleotider = 4 3 = 64 muligheder. 3 stopkodons (UAA, UAG, UGA) 61 forskellige codons til kun 20 forskellige aminosyre Genetisk kode = degenereret Wobble-base-pairing Nogle trna vil kun have præcis parring på 2 første positioner (Nogle aminosyrer kan også have mere end 1 trna) Kan tolerere en mismatch (=wobble) på sidste plads (tættest på 5 ) 20 aminosyrer 61 codons 31 trna Hæmning via Antibiotika Kun virkning på prokaryoter Tetracyclin Blokerer binding af aminoacyl-trna til A-site Chloramphenicol Blokerer peptidyl transferase reaktion på ribosomer SE TABLE 6-1 s. 240 i Alberts Virkning på både Prokaryoter & Eukaryoter Puromycin Medfører for tidlig afgivelse af dannende polypeptidkæde Kun virkning på Eukaryoter Cycloheximid Blokerer translokations-reaktionen på ribosomer α-amanitin blokerer mrna syntese via RNA Polymerase II 40

79 Erik Brandt Antistoffer Klon Selektions Teorien Hver lymfocyt kan reagere med specielt antigen Dette fra FØR at have mødt antigenet ready-made response møder antigen -> antigen-specifik lymfocyt opformeres (klones) Antigen (Antibody Generator) Substans i stand til at fremkalde immunrespons Epitop (Antigen determinant) Del af antigen, der kombineres med bindingssite på antistof Kan være mange på hver antigen Hapten Lille molekyle, der ikke i sig selv er antigent Bliver antigent ved binding til større molekyle Immunodominant determinant Determinant som er mere antigent end andre Dominerer respons et Polyklonalt Mange B-lymfocytter, der genkender antigenet Oligoklonalt Få B-lymfocytter, der genkender antigenet Mono 1 B-lymfocyt, der genkender antigenet Immuniseringsforløb Primært immun respons Sker ved 1. udsættelse for antigen Immun respons sker efter et par dage -> Stiger hurtigt og exponentielt > lavt niveau -> Falder gradvist igen Virgin-cells møder antigen 1. gang -> De stimuleres til at formere sig -> aktiverede celler (aktive i at lave et respons) T-celler (celle-medieret respons) B-celler (antistof sekretion) (Især IgM ses her) kort levetid (dage) hukommelses celler (danner mange = clonal expansion) er ikke aktive, men kan hurtigt blive det ved udsættelse for antigen på senere tidspunkt. Lang levetid (måneder, år) Sekundært immun respons Ved følgende udsættelser for antigen Immun respons kommer hurtigere -> Meget stærkere respons (bl.a. p.g.a. clonal expansion og ) Hukommelses-cellerne reagerer meget mere på antigen end virgin-cells B-lymfocytter

80 Erik Brandt Receptor har højere affinitet for antigen T-lymfocytter Adhererer stærkere til andre celler Videregiver extracellulære signaler mere effektivt -> danner hukommelses & aktive celler Antigener kan forblive i lymfoidt væv i lang tid, og forlænger hukommelsen Immunologisk tolerance Immun systemet kan lære at tolerere antigener Naturlig Tolerance for egne antigener Acquired Tolerance for fremmede antigener Ved kontinuerlig tilstedeværelse inden modning af immunsystemet Opnåelse ved Clonal deletion Drab af selv-reaktive lymfocytter Clonal anergy Funktionel inaktivering af lymfocytter Holdes dog stadig i live Sker især i primære lymfoide organer Immunoglobuliner Udelukkende syntetiseret af B-lymfocytter & plasmaceller Udgør 20% af plasma-protein Y-formet antistof Har 2 identiske antigen-binding sites (bivalent) Hvis antigen har 3 epitoper, så kan det bindes sammen i netværk Dette kan så fagocyteres Består af: (hvert domæne er på 110 aminosyrer) (har hver 1 intra-kæde disulfid binding ->) (er derfor foldet i lignende kompakte domæner) 2 identiske light chains (L) hver ca. 220 aminosyrer Variabel region 1 domæne VL Konstant region 1 domæne CL 2 identiske heavy chains (H) hver ca. 440 el. 550 aminosyrer Variabel region (N-terminalt) 1 domæne VH Konstant region (C-terminalt) Hængselsregion 3 domæner CH 1,2,3 ( µ & ε har 4 konstante domæner)

81 Erik Brandt Dimensionelt (IgG) Immunoglobulin foldning 2 antiparallele sheets 1 på 3 strenge 1 på 4 strenge bundet sammen ved disulfid binding Variable regioner 3 små hypervariable regioner (loops) 5-10 aminosyrer er antigen-bind.sites på hver de resterende framework regioner (rimeligt konstante) Kæderne holdes sammen af disulfid-bindinger Papain spalter antistoffer over hængslet -> 2* identiske Fab (Fragment antigen binding) hver med 1 antigen-bindings site 1* Fc fragment (krystalliseres let, derfor navnet) Pepsin spalter antistoffer under hængslet -> 1* F(ab )2 fragment består af 2 F(ab) fragmenter inklusiv hængselsregion kan stadig kryds-forbinde antigener resten af molekylet nedbrydes (Fc underfragmenter) Disulfid reducerende reagens -> 2* light chains (udfoldede) 2*heavy chains (udfoldede) kan ikke binde antigener 5 Klasser af antistoffer (immunoglobuliner) IgA α-heavy chain subclasses store klasse Ig I sekretioner spyt tårer mælk respiratorisk fordøjelses Den er secerneret Dimer J-kæde (se senere) Yderligere peptidkæde= sekretorisk komponent (SK) Denne beskytter IgA mod fordøjelse af proteolytiske enzymer i sekretion transporteres via sekretoriske epithel celler -> extracellulær rum -> binding til speciel transmembran Fc-receptor -> (receptor indeholder SK + transmembran del) receptor medieret endocytose -> transporteret over cytoplasma i vesikler->

82 Erik Brandt secerneret i lumen ved exocytose SK kløves fra transmembran del IgD IgE IgG IgM δ-heavy chain Virgin B-lymfocytter producerer disse som overfladereceptorer secerneres sjældent ε-heavy chain binder med MEGET høj affinitet (K a = ca L/mol) til specielle Fc receptorer Mast celler (væv) Basofile granulocytter (blod) Virker som receptorer for antigen på cellerne Antigen binding -> Sekretion af biologisk aktive aminer (især Histamin) Skaber dilation og øget permeabilitet i blodkar Hjælper hvide blodlegemer, Ig til betændelsen Men skyld i astma, hø feber etc Secernerer faktorer -> Tiltrækker eosinofile gran.(parasit-bekæmpelse) γ-heavy chain 4 subclasses γ 1, γ 2, γ 3 & γ 4 Udgør største klasse Ig I blodet (75%) Produceret I storemængder under sekundært immun respons Aktiverer komplement-systemet Med bundet antigen (på Fab) -> bindes Fc til makrofager & neutrofile -> binder, fagocyterer og destruerer mikroorg. (nogle kan ødelægge uden fagocytose) Eneste Ig, der kan gå fra moder -> foster via placenta Via Fc receptorer fra moderblod-> receptor medieret endocytose -> Transporteret igennem cellen i vesikler -> Exocytose i fosterblod (transcytose) (kan også gå fra modermælk->barn via mave) µ-heavy chain første klasse Ig, produceret af B-lymfocyt (overfladereceptor)-> bliver til virgin B-cells (kan binde antigen) Secerneret form største klasse i det primære antistof respons pentamer (5 Y-subunits) d.v.s. 10 antigen binding sites

83 Erik Brandt J chain (joining) (rest fra polymerisering 4 fraspaltes, 1 bliver tilbage) binding af antigen til pentamer (på Fab region)-> Fc regioner binder til og aktiverer 1. komponent i complement systemet. (biokemisk angreb på mikroorg.) Monoklonale antistoffer Myeloma protein Multiple myeloma (sygdom) Kræft -> enkelt plasma celle Bruges til at fremstille store mængder Hybridomas Fusion af 1 B-lymfocyt med myoloma celle(ikke-secernerende) Rekombination Affinitet Et antistofs affinitet til en antigen determinant beskriver styrken af bindingen mellem 1 antigen determinant og 1 antigen-bindings site. Er uafhængig af antallet af bindinger [ AgAb] Affinitets konstantet K a = = ligevægtskonstant [ Ag] [ Ab] Aviditet Den samlede styrke af et multivalent antistof til et multivalent antigen Antistof Diversitet Kombinatorisk diversifikation (Tallene stammer fra mus) Under modning af B-lymfocyt Light-chain C-region 1 C gen segment V-region 300 V gen segmenter 4 J gen segmenter (Joining) -> 300*4 = forskellige light chains Heavy-chain C-region 5 C gen segmenter V-region 1000 V gen segmenter 4 J gen segmenter (Joining) 12 D gen segmenter (diversity segment) -> 1000*4*12 = forskellige heavy chains -> 1.200* * 10 7 forskellige antigen binding-sites Humane tal V J C κ (2) λ (22)

84 Erik Brandt V J C D Heavy (14) Junctional diversification Hvert gen segment afsluttes af konserverede DNA-sekvenser Bruges til site-specifik rekombination ->rigtig sammenkædning Rag-1 & Rag-2 (Recombination Activating Genes) Udgør lymfocyt-specifikke V(D)J rekombinations system Ved rekombination her mistes ofte tilfældige nukleotider Tung kæde gen-segmenter kan påsættes nukleotider Især øget diversitet i 3. hypervariable region Omkostning Læserammen forskydes ofte -> Ikke-funktionelt gen Sker ofte i udviklende B-lymfocytter Somatisk hypermutation Affinitets modning Sker i hukommelses B-lymfocytter ved deling Dette findet sted i follikler i sekundært lymfoidt organ Punkt mutationer forekommer i V-region(=somat. hypermut.) Raten er 1*10 6 gange højere end normalt = 1 mutation / celle generation Kun FÅ celler vil have større affinitet -> disse prolifererer ved stimulation Resten af cellerne -> apoptose Allel Exclusion B-lymfocytter er mono-specifikke -> Kun 1 VL kæde -> Kun 1 VH kæde B-lymfocytten er diploid (som andre somatiske humane celler) 2*1 Tung kæde 2*2 Lette kæder (κ & λ) Hver celle må vælge mellem moder og faders let-kæde og tung-kæde pools = Allel eksklusion Vælger den tung kæde (2 muligheder) -> rekombination ( råd til 1 fejl) -> sendes til overflade med let-kæde surrogat -> extracellulært signal -> Valg af let kæde (4 muligheder) ->rekombination af denne ( råd til 3 fejl) =færdigt Ig til overflade Membranbundne/ Opløselige Antistoffer Kun forskel i CH kæden, C-terminalt Membranbundne

85 Erik Brandt Hydrofobt anker til membran C-terminalt Opløselige Hydrofil C-terminus Møde med antigen skift i RNA transkript-processering membranbundet langt RNA transkript ene intron indeholder stop-kodon (til det opløselige) splejses ud -> opløseligt kort RNA transkript Class Switching (dannelse af forskellige antistoffer) Vigtig, idet affinitet for antigen bibeholdes i forskellige antistoffer (kun skift af tung kæde Fc del) Naive B-lymfocytters dannelse af IgM & IgD Alternativ splejsning af langt transkript Indeholder både Cµ & Cδ Class Switch Rekombination Ved modning af aktiveret B-lymfocyt sker irreversibel ændring i DNA Alle C upstream segmenter for ny C-kæde i DNA slettes Medieret af en switch recombinase

86 Immunsystemet Det Lymfatiske System 2 Lymfekar 4 Lymfeknuder 6 Thymus 10 Milt 14 1

87 Det Lymfatiske System (Systema Lymfaticum, Det Lymfoide System) Komponenter Primært lymfoidt væv Knoglemarv (B-lymfocyt) Thymus (T-lymfocyt) Sekundært lymfoidt væv Milt Lymfeknuder MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Tonsiller Peyer ske plaques Appendix Vermiformis Diffust lymfoidt væv SALT (skin associated lymphoid tissue) Enkelte lymfocyt Enkelte Makrofag Enkelte plasmacelle Lymfocytter Produktion T-Lymfocytter Produceres i thymus Fra stamceller Kommer hertil fra knoglemarven B-Lymfocytter Produceres i knoglemarven Fra stamceller i marven Migration Modnes til naive lymfocytter i primært lymfoidt væv -> forlader primært lymfoidt væv -> recirkulerer imellem blod, lymfoidt væv og lymfe indtil møde med specifikt antigen -> aktivering Hvis ikke sker -> dør efter 4-8 uger Lokalisation i sekundære lymfoide væv SE SPECIFIKKE VÆV Morfologi & Funktion Lymfocytter SE BLOD T-lymfocytter & B-lymfocytter Kan ikke skelnes morfologisk Kan funktionelt typebestemmes ved hjælp af deres overfladereceptor Plasmaceller SE BINDEVÆV / ANTISTOFFER 2

88 Immunapparatets Opdeling Cellulær (T-lymfocytær) Produceres store mængder T-effektorceller -> eliminerer fremmede substans aktivering af prof. Fagocytter direkte drab af celler (ind. Fremmede substans) via MHC-I (med non-selv endogent fragment) =MHC-I restriktiv Humoral (B-lymfocytær) Udvikling af cirkulerende antistoffer Secerneret af plasmaceller/b-lymfocytter -> binding af FAB-del til antigen -> Opsonisering ->Fc binding til prof. Fagocytter eller start af komplement-system ->drab af fremmede celler MHC-II restriktiv (MHC-II + non-selv exogen fragment) 3

89 Lymfekar (vasa lymphatica) Opbygning Lymfekapillærer Op til 100µm i diameter Væggen 1 lag stærkt affladede endothelceller kun kerner ses (LM) Bindevæv Omgiver endothelcellerne Forankringsfilamenter Afgives fra nærliggende kollagene fibre Hæfter til endothelcellers ydre overflade Hvis trykket omkring vokser -> holdes karret udspilet Basallamina Ingen / kun usammenhængende Junctions Ingen kontaktkomplekser Små samlekar Væg Tyndvæggede Minder om små vener Ikke tydelige vægzoner Omgivet af variende mængder bindevæv / glat muskulatur Anastomoserer livligt Omhyller ofte netagtigt vener Klapper Tætliggende Endothel-fold med indre plade af kollagene fibre Vigtigste faktor i kontrol af strømretning -> perlekæde udseende Afbrydes af lymfeknuder langs forløb -> fortsætter efter i større kar Kontraktile Udviser peristaltiske bølger ->fremmer transport af lymfe Større samlekar Tendens til egentlig lagdeling Tunica intima, media og adventitia Forekomst Findes i fleste væv og organer Dog IKKE i CNS Knoglemarv Thymusparenchym Bulbus Oculi Det Indre Øre Histologiske snit Vil ofte kunne findes langs vener og arterier 4

90 Dannelse af Lymfe Dræning af overskydende vævsvæske -> tilbageføre overskud af vand & opløste bestanddele Opstår -> difference ml. filtration og reabsorption i kapillærer->blodet Sammensætning Ultrafiltrat af blodplasma Proteinindhold 2-5% Tarmens lymfekar Absorberet cholesterol Langkædede fedtsyrer Før gennemløb af lymfeknude Antigener Lymfocytter Efter gennemløb af lymfeknude Immunoglobuliner Betydning som transportvej Har betydning ved spredning af betændelse og af tumorceller 5

91 Lymfeknuder (Nodi lymphatici) Form/størrelse: Små, affladede bønneformede organer Indskudt i forløbet af samlelymfekarrene Få mm til 2cm Findes ofte i grupper (regionale knuder) ->forekomst Struktur: Kapsel Tæt, kollagent bindevæv Går yderst over i omgivende bindevæv Septa (trabekler) (variende antal) Strækker sig fra kapslens indre overflade -> lymfoide væv Tæt bindevæv Hilum Indhak på den ene kant Kapslen er her fortykket Efferente lymfekar forlader her lymfeknuden Blodkar kommer ind/ud her Subkapsulær sinus (randsinus) Affladet hulrum mellem kapsel og cortex Klapper, der forhindrer tilbageløb i afferente og efferente kar Cortikale sinus (trabekelsinus) Afgår fra subkapsulær sinus Forløber langs trabeklerne Medullære sinus Adskiller marvstrengene Størrere, uregelmæssigere, talrigere end cortikale sinus Går ved hilum ->efferente lymfekar Sinusvæggen Beklædt med affladede endothel lignende celler Ingen kontaktkomplekser mellem cellerne Ingen basalmembran Makrofager ligger tæt omkring sinus Sender udløbere ud i lumen Lumen krydses af talrige udløbere fra reticulumceller Disse omskeder retikulære fibre Afstiver væggene Fortsætter over i kollagene skelet i kapsel & trabekler Går over i retiklet i det omgivende lymfoide parenchym 6

92 Stroma Spinkelt reticulum (grovmasket) Retikulære fibre Argyrofile Reticulum celler Store ovale lyse kerner Frie celler (udover i de enkelte tilfælde) makrofager Cortex (bark) Ydre cortex Follikler (noduli) Kugleformede ansamlinger af lymfoidt væv Adskilt af diffust interfollikulært lymfoidt væv Knoglemarvsafhængige zone (B-lymfocytter) Primære follikler Ensartet masse af små lymfocytter Tæt relation til udløbere fra follikulære dendritiske celler B-lymfocytter Især naive Også hukommelses Sekundære follikler (-> ved antigen-stimulation) Germinalcentret (kimcentret) Central, oval lysere opklaring Lys zone (mod kalot) Follikulære dendritiske celler Færre små lymfocytter = Centrocytter Plasmablaster makrofager Mørk zone (væk fra kalot) Tætpakkede store lymfocytter =Aktiverede B-lymfoblaster = Centroblaster -> undergår livlig proliferation Kalot Mørkt cellerigt væv omkring lys zone Små ustimulerede oprindelige lymfoc. = celler fra fortrængt primær follikel Dybe cortex (paracortex) Diffust lymfoidt væv Thymus-afhængige zone (T-lymfocytter) Interdigiterende dendritiske celler Medulla (marv) Flere lymfatiske sinus (medullære sinus) -> mere eosinofilt udseende (i HE) Marvstrenge strengformede fortætninger af lymfoidt væv 7

93 adskilt af sinus Indhold små lymfocytter immature/mature plasmaceller makrofager Lymfeknuder kan indholde et stigende antal fedtceller med alderen Lymfens Vej: Afferente lymfekar -> Flyder langsomt gennem sinus -> retiklet virker som mekanisk filter nedsætter passagehastigheden for infektiøse mikroorganismer andre celler -> lettere bytte for fagocytose af makrofager I stand til at tilbageholde 90% af tilført antigen -> efferente kar Lymfen passerer mindst 2 lymfeknuder -> blodet Filterfunktion Ved akut infektion -> hurtig dilatation af sinus -> indvandring af neutrofile granulocytter -> fagocyterer bakterier forøger evnen til at hæmme spredning af bakterier -> hvis ikke nok forøgelse af makrofager i lymfeknuden Filterfunktionen fører til forstørrelse/ømhed ved Infektiøse sygdomme Maligne sygdomme Karforsyning: Arterie -> hilum -> afgiver arterioleforgreninger i trabeklerne -> marvstrengene (kapillærer) -> cortex (kapillærnet) -> postkapillære venoler løber igennem dyb cortex -> marvstrengene -> følger arterioler ud af knuden Postkapillære venoler (kun dem i den dybe cortex) Kubisk -> cylindrisk endothel = High Endothelium Venules (HEVs) små recirkulerende lymfocytter blod -> parenchym gennem HEVs Funktion i Immunreaktion: Stimulation ved antigen for første gange -> optages og præsenteres af interdigiterende dendritiske celler follikulære dendritiske celler 8

94 makrofager -> primært respons (cellulært og humoralt) herunder dannelse af germinalcentre Stimulation ved antigen senere -> sekundært respons (cellulært og humoralt) hurtigere og mere effektivt 9

95 Thymus (Brissel) Thymus generelle Opbygning (makroskopisk) Placering Bag sternum Vægt 50g (største vægt i barndom) Lapdeling 2 lapper højre & venstre sammenhængende på midten Udvikling Ektodermale & endodermale i hhv. Ydre og indre 3. branchialfure ->omdannes senere til lymfo-epithelialt organ Histologisk opbygning Kapsel Tynd bindevævskapsel Septa Strækker sig til cortico-medullære grænse Opdeler hver lap i mange lobuli Polyhedrale 0,5-2mm i diameter hver er opdelt i cortex og medulla medulla er dog sammenhængende i organet Cortex (Bark) Mørk Cellerig Stroma Epitheliale reticulumceller (e.r.) Rigeligt eosinofilt cytoplasma Stor, oval, meget lys kerne 1-2 nucleoli Stellat forgrenede Talrige spinkle udløbere ->andre reticulumceller -> cellulært reticulum dannes ingen retikulære fibre Endodermal oprindelse DOG subkapsulære celler ektodermalt deriveret Flere undertyper Affladet sammenhængende lag I periferi af cortex SAMT omkring blodkarrene Lag beklædt m. Basallamina(el. Svarende hertil) -> adskiller parenchym/bindevæv kapsel, septa, kar Nurse celler Speciel type epithelial reticulum celle Subkapsulære cortex Lange udløbere m. indfoldninger I cellemembr Kan være lejret talrige lymfocytter/celle 10

96 Parenchym Lymfocytter Sub-kapsulært 15µm i diameter livlig mitose T-lymfocytter i modningsproces (lymfoblaster) Cortikalt 7µm i diameter Makrofager Moderat antal i cortex ofte indeholder kernerester (lymfocyt) Cortico-medullære grænse (og medulla) Interdigiterende dendritiske celler Lange forgrenede udløbere Kontakt m. Mange lymfocytter Udtrykker MHC-I & II Medulla (Marv) Stroma Epitheliale reticulumceller Flere end I cortex Samme opbygning som cortex Ektodermal oprindelse Hassall ske legeme Afrundede/ovale strukturer Koncentriske lag af affladede e.r. celler Som skæl i et løg Forekommer kun i Thymus µm i diameter bliver større med alder kraftigt eosinofilt centralt kan være keratiniseret indeholder Immunoglobuliner (i følge Grays) Parenchym Lymfocytter Langt færre end i lymfocytter Små (se før) Makrofager Større antal end i cortex Ellers som før Interdigiterende dendritiske celler Som før Mikroskopisk karforsyning Arterier via bindevæv i kapsel/septa Arterioler cortico-medullære grænse ->langs barkens parenchym afgiver kapillærer 11

97 ->løber ud i cortex medulla modtager talrige arterioler ->danner kapillærnet Kapillærer Cortex Anastamoserende net Returnerer kapillærer ind mod medulla løber sammen over i venoler ved cortico-medul. grænse nogle forlader cortex langs periferi ->vener i interlobulære bindevæv Medulla Kapillærnet ->tyndvæggede venoler i medulla Venoler Venoler langs cortico-medullære grænse ->bindevævssepta ->interlobulære vener Vener Interlobulære vener ->tømmer sig i enkelt fraførende thymusvene Struktur Kapillærers endothel Omgivet af tyk basal-lamina epitheliale reticulumceller Blod-thymus barriere Makromolekyler passerer vanskeligt fra kapillærer ->parenchym i cortex pga. Zonulae occludentes (tætte) cortikale kapillærers endothel Vækstforhold Thymus er udviklet fuldt ved fødslen Alders Involution ->vægt af parenchym begynder at aftage ved 1 år(langsomt) -> erstattes af fedtvæv Funktion Produktion af T-lymfocytter Vedligeholdes af stadig tilførsel af stamceller fra knoglemarv 98% af thymocytter -> apoptose (ædes af makrofager) Immature T-lymfocytter (thymocytter) Dobbelt negative (- CD4, CD8) Subkapsulær-cortex ->begynder at arrangere TCR-gener (T-celle-receptor) -> Dobbelt positive (+ CD4, CD8) Dybere i cortex (nurse celler) ->begynder meget livlig proliferation -> positiv selektion 12

98 kan genkende selv-mhc ->proliferation ikke genkende -> apoptose Enkelt positive (CD4+ eller CD8+) Vandrer ind i medulla Negativ selektion Ved kontakt med Interdigiterende dendritiske celler Makrofager Præsenteres for selv-antigen Hvis TCR har stærk affinitet for selv-antigen -> apoptose Hvis TCR har lav affinitet for selv-antigen -> får lov til færdigmodning => Tolerans -> Mature lymfocytter CD4+ Th-lymfocytter CD8+ Tc-lymfocytter forlader thymus (-> blodbanen) Immunreaktioner Thymus er under normale forhold ikke sæde for immunreaktioner Hormonproduktion (fx...mange andre) Thymus Humoral Factor (thymosin) 13

99 Milt (splen, lien) =Sekundært lymfoidt organ Makroskopisk opbygning Form Kile -> tetrahedron (formet efter omgivende strukturer) Størrelse Ca. 150g 4*8*12cm Beliggenhed Øverste venstre posteriore del af bughulen Under venstre diaphragmakuppel Struktur af kapsel/trabekler Kapsel 1,5mm tyk meget kollagen (+lidt elastisk) Ydre lag / Indre lag Vekslende forløb af kollagene fibre (øger styrke) Forekomst af sparsom glat muskulatur Trabekler Strækker sig ind i organet fra kapslen De største kommer ind via hilum Tæt bindevæv Kollagene fibre Elastiske fibre Omskeder kar/nerver Mikroskopiske struktur Rød pulpa (grundet højt indhold af erythrocytter) Udgør omkring 75% af milt Miltstrenge (Billroth s) Svampeagtig vævsmasse Omgiver sinusoiderne Reticulum Reticulum celler Retikulære fibre Makrofager Plasmaceller Alle blodets formede elementer (blod tømmer sig herud) Miltsinusoider Forlængede ovoide kar Op til ca. 50µm i diameter Endothel celler Aflange, tilspidsede ender Her små zonulae occludentes Ligger parallelt med sinusoidens længderetning Kontakter hinander Dog stort set INGEN kontaktkomplekser 14

100 ->passeres let af blodets formede elementer Basallamina Heri store spaltelignende fenestrationer Nærmest cirkeltløbende bånd 1µm 5µm spalter imellem Hvid pulpa (hvid i forhold til rød pulpa) Reticulum Reticulumceller Retikulære fibre Lymfoidt væv Omskeder arterielle kar (forlader trabekler->danner kapillærer, næsten) = PALS (Periarteriel Lymphatic Sheath) Består af T-lymfocytter = thymus-afhængige zone Malpighiske miltlegemer Fortykkelser af skeden =lymfe folliker (primære el. Sekundære) Består af B-lymfocytter = Knoglemarvs afhængige zone Makroskopisk synlige (0,25-1mm) Marginalzonen Afgrænser hvid pulpa mod rød pulpa Rig på B-lymfocytter Interdigiterende dendritiske celler Miltens Kar & Intermediære cirkulation A. Lienalis ->Rami lienales ->Trabekelarterier -> centralarterier (hvid pulpa) Miltsinusoider -> Pulpavener -> Trabekelvener -> V. Lienalis Centralarterien (Arteriole) 1-2 lag glatte muskelceller afgiver talrige radierende grene løber mod periferi af hvid pulpa få forsyner hvid pulpa marginalzonen * direkte til rød pulpa *Til Marginalzonen Marginale sinus Ligger mellem hvid pulpa og marginalzonen 5-10µm bred væg diskontinuær mod marginalzonen ->Største del ud i rød pulpa (miltstrenge) -> perimarginale kavernøse sinus (mindre del) ->sinusoider 15

101 Hovedgrenen -> deler sig i penicilli (lige før / efter -> rød pulpa) =penselarterier næsten kubisk endothel 1 lag glat muskulatur -> hver deler sig i stort antal kapillærer kan være omgivet af ellipsoide skede af makrofager & retikulære fibre =hylsterkapillær -> åbne & lukkede cirkulation Lymfekar Findes kun i kapsel & trabekler Kun fraførende lymfekar Hypoteser og miltens kredsløb Åbne kredsløb Hvor kapillærerne tømmer sig direkte ud i miltstrengene 10% af blodet/tidsenhed transittid minutter Indeholder hovedmængde af blod i milt til givet tidspunkt Lukkede kredsløb Hvor kapillærerne tømmer sig i sinusoiderne 90% af blodet/ tidsenhed passerer igennem her transittid ca. 2 minutter Funktion Filter i blodbanen Åbne kredsløb, hvor blod siver igennem miltstrrenge Immunologisk funktion Initiering af T- og B-lymfocytter (antigen præsentation) Som i andre 2. lymfoide organer Destruktion af udslidte blodlegemer Aldrende / skadede erythrocytter fagocyteres af makrofager i rød pulpa Bloddepot Ikke voldsomt hos mennesker (hunde, geparder..kontraktil miltkapsel) Hæmopoiese i fosterliv I 2. trimester af graviditeten (aftager i 5. fostermåned) 16