På langt sigt vil det måske være muligt at dyrke patientspecifikke reservedele ud fra patientens egne stamceller. Af Kirsten Fink og Ole Terney

Transkript

1 Nr. 222 Januar 2015 iff nyt IndustriFarmaceutForeningen (IFF) er en interesseorganisation for den farmaceutiske industri, hvor medlemmerne kan holde det faglige og sociale netværk ved lige. Bestyrelsesmøde i IFF Den 2. februar kl i Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 afholdes der bestyrelsesmøde i IFF. Mødet er kun åbent for medlemmer af IFF. Molecular strain typing methods for investigations in the Pharmaceutical industries The lecture takes place the 22.of January. Læs side 6 Dyrkning af humane organlignende strukturer i laboratoriet På langt sigt vil det måske være muligt at dyrke patientspecifikke reservedele ud fra patientens egne stamceller. Af Kirsten Fink og Ole Terney Såkaldte organlignende strukturer kan i fremtiden komme til at spille en stor rolle i studiet af organers funktioner og årsager til organsvigt. De organlignende strukturer vil også være værdifulde ved udvikling af nye lægemidler, hvor afprøvning af lægemiddelkandidater i en human organlignede struktur forventes at give mere relevante resultater end anvendelse af dyreforsøg. På langt sigt vil det måske være muligt i laboratoriet at dyrke organlignende strukturer, som stammer fra patientens egne stamceller, og som kan danne udgangspunkt for patientspecifikke reservedele (1). fortsættes næste side... Drug-Device ERFA gruppemøde fortsættes næste side... Mødet finder sted den 23. februar kl i Symbion, Mødet afholdes af Risk Manage-ment, Stine Klitgaard Hansen, ALK- Abelló.

2 IndustriFarmaceutForeningen Fruebjergvej 3, Postboks 87 DK-2100 København Ø Tlf: Mail: Web: Bestyrelsen Formand: Tina Kjøller, Næstformand: Gitte Hassan, Kasserer: Schiønning Brønnum Bruun, Bestyrelsesmedlemmer: Per Grønlund, Christina Guldberg, Suppleanter: Susanne Devantié Hansen, Styregrupperne MIKROBIOLOGI Ditte Hougaard, Tina Albæk Lorentsen, Nina Pringler, Lars Henrichsen, QUALITY MANAGEMENT (QM) Brian S. Jensen, Grethe Elmholdt, Conni Hornuff, Schiønning Brønnum Bruun, Johan Nielsen, SENIORGRUPPEN Jørgen Jensen, , Günther Fedders, IFF-nyt Bestyrelsen er ansvarshavende redaktion. Indlæg sendes til sekretariatet. Artikler i bladet udtrykker ikke nødvendigvis foreningens mening. DEADLINE 9. februar marts 2015 Kolosal udvikling af vævsdyrkningsteknologier på bare 15 år Siden isolering og dyrkning af den første humane embryoniske stamcellelinie ud fra humane blastocytter i 1998 (2) er der sket en omfattende udvikling af vævsdyrkningsteknologier og dermed en kolossal udvikling af, hvilke typer af væv, man kan frembringe i laboratoriet. Indtil for ikke så lang tid siden var fokus på rene populationer af bestemte stamcelleafledte celletyper, men dette har ændret sig meget. Det er nu muligt at dyrke tredimensionale strukturer med blandede celletyper til frembringelse af en organlignende struktur, som er blevet kaldt et organoid (dvs et lignende et organ ). De åbenlyse muligheder, der ligger i at udvikle organoider, som for eksempel ligner tarm, nyre, hjerne, retina og lever, har fået dette forskningsfelt til at blomstre. Hvad betyder ordet organoid? Et organoid er en samling af organspecifikke celletyper, som udvikles fra en stamcelle eller et organforstadier, og som udviser nogle af de funktionsegenskaber, der er kendetegnende for det organ, det skal efterligne. For at man kan tale om et organoid, skal cellerne organisere sig på lignende måde som i det organ, det skal efterligne. Udgangsmateriale for organoider Normale kropsceller er produktet af en specialisering (differentiering), hvor der er blevet lukket for de gener, som cellen ikke længere gør brug af i den funktion, som cellen har fået i kroppen. Sådanne differentierede celler kan kun bruges som udgangsmateriale for organoider, hvis det er muligt at tænde for slukkede gener ved hjælp af forskellige reguleringsfaktorer, f.eks. transskriptionsfaktorer. En sådan aktivering giver som regel kun multipotente celler, der stadig har nogle begrænsninger. Det bedste udgangsmateriale for et humant organoid er en human pluripotent stamcelle eller en embryonisk stamcelle, som har kapacitet til at udvikle sig til mange forskellige specialiserede celler. Cellers selvorganisering er grundlaget for dannelse af organoider Når et organoid skal dannes ud fra forskellige celletyper, som alle har deres oprindelse i den samme pluripotente stamcelle, er det nødvendigt, at de forskellige celletyper kan finde hinanden, f.eks. skal de celler, der skal danne den øverste del af tarmsystemet, finde sammen, og de celler, der skal danne den mellemste del af tarmsystemet skal finde sammen osv. Den samme type celler finder hinanden, fordi de enkelte celletyper udtrykker forskellige vedhæftningsmolekyler, hvor celler med samme vedhæftningsmolekyler finder sammen (1). Status for udvikling af organoider Organoider udviklet fra humane pluripotente stamceller er indtil nu etableret for tarm, nyre, hjerne og retina (1). Denne udvikling er sket i løbet af de sidste 5 år (1). Forskerne er nok nået længst med at udvikle tarmorganoider, idet det er lykkedes at indsætte tarm-organoider under nyrekapslen i mus, hvorved tarm-organoidet kan tilføres næring i form af blod fra musen (3,4). Tarm-organoider Mave-tarmkanalen udvikler sig primært fra endodermen, som danner et rørformet epithelrør, der udvikler sig til tre distinkte tarmområder: fortarmen, mellemtarmen og bagtarmen. Fortarmen giver ophav til mundhulen, spiserøret, luftrøret, maven, bugspytkirtlen og leveren (1). Mellemtarmen giver ophav til tyndtarmen og colon ascendans (1). Bagtarmen giver ophav til tyktarmen og endetarmen (1). Fordelingen af celler til disse tre domæner sker som reaktion på vækstfaktorer, som påvirker cellerne til at være foran i samlingen af celler, i midten eller bagerst i samlingen af celler. Denne retningsorienterende egenskab er en forudsætning for, at det overhovedet kan lade sig gøre at frembringe et tarmorganoid. Det tager forskerne cirka en måned at skabe et humant tarm-organoid ud fra en human pluripotent stamcelle (5). Første trin er at behandle en pluripotent stamcelle med Activin A, der er en transformerende 2

3 De åbenlyse muligheder, der ligger i at udvikle organoider, som for eksempel ligner tarm, nyre, hjerne, retina og lever, har fået dette forskningsfelt til at blomstre. vækstfaktor. Efter 3 dage opstår endoderm væv, der udtrykker markørerne FOXA2 og SOX17, som man ved er markører for endoderm væv (5). Man kan således følge processen ved at måle tilstedeværelse af FOXA2 og SOX17. Efter induktion af endodermen kan de pluripotente stamceller påvirkes med vækstfaktorerne fibroblast vækstfaktor4 (FGF4) og signalmolekylet WNT3a. I løbet af 4 dage dannes sfæroidt tarmvæv indeholdende væv fra den mellemste og bagerste del af tarmen. Dette væv var positiv for markøren CDX2+ (5). Udviklingen af sfæroider i kultur til tarmvæv tager ca 1 måned, hvor sfæroiderne gennemgår en serie af udviklingstrin, som ligner udviklingen af tarmvæv in vivo. I løbet af de første 14 dage dannes pseudostratificeret epitel, som udtrykker de føtale transskriptionsfaktorer CDX2, SOX9 og KLF5. I løbet af de næste 14 dage omdannes dette pseudostratificerede epitel til søjleepitel, og der dannes tarmvæv, som har en apical-basal-orientering herunder en lumenoverflade. Villuslignende strukturer vokser ind i lumen (4). Transplantation af tarm-organoid til mus Der dannes ikke kar i tarm-organoidet, så der er ingen blodtilførsel. For at sikre næring til tarm-organoidet blev det efter 6 uger sat ind under nyrekapslen i en mus med undertrykt immunsystem (4). Derved lykkedes det at få tarm-organoidet til at vokse 50 til 100 gange i størrelse og danne kar (4). Transplantationen var meget succesfuld, idet 92% af de transplanterede organoider udviklede sig inde i musene (4). Visuel undersøgelse af tarmvævet i fortsættes næste side... 3

4 organoider dyrket inde i mus og nativ tarmvæv Ved visuel undersøgelse af tarmorganoidet kan ses en tarmmorfologi med slimfyldt lumen og veludviklet ark af tarmtrevler, som hver har deres egen centrale kapilarnetværk (4). Histologisk ligner det transplanterede væv nativ tarmvæv med tarmtrævler og underliggende laminerede submucosale lag omfattende lamina propria, et tyndt lag muskler (muscularis mucosa) og submucosa, som består af bindevæv, lymfevæv og nerver, samt ydre glatmuskulaturlag (4). Sammenligning af tarmorganoider dyrket i kultur med tarm-organoider dyrket inde i mus Sammenlignet med tarm-organoid dyrket i kultur var det i mus dyrkede tarm-organoid mere modent og differentieret med tilstedeværelse af alle de vigtigste tarmcellelinier, herunder enterocytter, goblet-celler, Paneth-celler, enteroendocrin-celler og tuft-celler på de rigtige steder (4). Paneth-celler lå som de skulle i kryptbasis og var ikke spredt i epitelet (4). Med transmissionselektronmikroskop kunne der påvises en børstekant med veludviklede tætte forbindelser som i tarm-organoidet dyrket i kultur, men I 2013 publicerede forskere, at det var lykkedes dem at dyrke en mini, human hjerne i laboratoriet ud fra en human pluripotent stamcelle. Hermed var det første gang lykkedes at frembringe et hjerneorganoid. modne goblet -celler og enteroendocrineceller, som fandtes i det i mus dyrkede tarm-orgnanoid, blev ikke fundet i tarmorganoidet dyrket i kultur (4). Den relative ekspression af gener, der er karakteristisk for celletyper i epitelet var forøget i det i mus dyrkede tarm-organoid i forhold til det i kultur dyrkede tarm-organoid. Der endnu flere parametre som stemmer over ens med, at der er sket en betydelig modning af tarm-organoidet efter indsættelse i mus og oprettelse af en blodforsyning (4). Hjerne-organoider Menneskets hjerne er meget kompleks og meget anderledes end hjernen hos de forsøgsdyr, vi ofte anvender som modeller. Det giver ikke så mange nyttige oplysninger at studere hjernen hos et forsøgsdyr. Der er derfor gjort forskellige forsøg på at dyrke dele af hjernevæv i laboratoriet. Men det gav ikke noget helhedsindtryk af hjernen. I 2013 publicerede forskere, at det var lykkedes dem at dyrke en mini, human hjerne i laboratoriet ud fra en human pluripotent stamcelle (6). Hermed var det første gang lykkedes at frembringe et hjerne-organoid. En pluripotent stamcelle blev anbragt i en lille dråbe af gel, som skulle være støttelaget for vækst af vævet, således at der kunne dannes en tredimensional struktur. De celleholdige gelstykker blev anbragt i et dyrkningskammer i bevægelse (spinning bioreactor), således af cellerne blev badet i næringsvæske 4

5 og ilt. Stamcellerne differentierede først til neuroektodermt væv, hvilket er de lag af celler, der i sidste ende bliver til et fosters nervesystem. På mindre end en måned voksede stamcellerne til hjernelignende organoider, der målte 3-4 mm og indeholdt strukturer, der svarede til mange områder i hjernen (6). For eksempel indeholdt alle de hjerne-organoider, som forskerne fremstillede, dele af cortex. Cirka 70% indeholdt choroid plexus, som er det område, hvorfra spinalvæsken produceres, og cirka 10% indeholdt retinalt væv (6). Cellernes evne til at organisere sig indbyrdes er ganske forunderlig. Det fremstillede hjerne-organoid indeholdt de væv, der bliver dannet i en tidlige udvikling af hjernen. F.eks. fandt forskere ikke cerebellum (lille-hjernen), der er den del af hjernen, som blandt andet styrer motorik og sprog (6). Dette er et område, der udvikles sent i forsterudviklingen. Med hjerne-organoidet kan man opnå indsigt i, hvad der kan gå galt under den tidlige udvikling af hjernen. Der findes en tilstand, hvor hjerne ikke udvikler sig til normal størrelse (mikro-cefali). Denne tilstand kan undersøges ved at dyrke et hjerne-organoid fra en person med mikrocefali. Her viste det sig, at den periode, hvor stamceller deler sig, er kortere end i den normale hjerne. Det resulterer i, at der ikke er nok neuroner til at danne en normal hjerne. Forskerne kunne vise, at det nedsatte antal af neuroner i mikrocefali-modellen kunne forbindes med mangel på et bestemt protein, det såkaldte CDK5RAP2. Hvis dette protein blev tilført til mikro-cefali-organiderne, blev antallet af neuroner forøget. I 2013 var det muligt at frembringe hjerne-organoider, der svarede til hjernen hos et foster, der er 9 uger gammelt. Problemet med at nå en mere udviklet hjerne er mangel på blodtilførsel. Forskerne har ikke fået stamcellerne til at differentiere til blodkar. Terapeutisk potentiale Det forventes, at humane organoider kan få stor betydning for afklaring af sygdomme og ved frembringelse af nye behandlingsmetoder. Tarm-organoider er f.eks. blevet brugt til undersøge infektiøse sygdomme, tumorbiologi og tilstande, der skyldes genetiske ændringer (1). På langt sigt vil det måske være muligt i laboratoriet at dyrke organlignende strukturer, som stammer fra patientens egne stamceller, og som kan danne udgangspunkt for patientspecifikke reservedele (1). Kilder (1) Lancaster, M.A. og Knoblich, J.A. (2014), Science, 345 (6194) 283, til , Organogenesis in a dish: Modelling development and disease using organoid technologies, doi: /science (2) Thomson, J.A. m.fl. (1998), Science, 282, , Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts, doi: /science (3) Connor, S. (2014), The Independent, 20. Oktober, Human intestine grown in mouse for the first time as scientists say there is hope to create spare parts for people (4) Watson, C.L. m.fl. (2014), Nature Medicin, published online 19. October, doi: /nm.3737, An iv vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells (5) McCracken, K.W. m.fl. (2011), Nat. Protect., 6(12), , Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells, doi: /nprot (6) Lancaster, M.A. m.fl. (2013) Bestyrelsesmøde i IFF Den 2. februar kl i Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 afholdes der bestyrelsesmøde i IFF. Mødet er kun åbent for medlemmer af IFF. Farmaceutisk efteruddannelse Februar GMP for indkøbere Marts Pharmacovigilance - en introduktion Procesvalidering Kvalificering af produktionsudstyr EU-GMP regler - krav og fortolkninger. Afsluttende eksamen Statistisk stikprøvekontrol QP er - Qualified Person GMP-opdatering, udfordringer og dilemmaer April Kontrol af råvarer GDP-regler - krav og fortolkninger. Afsluttende eksamen Maj Lægemiddelformulering - en introduktion Validering af analysemetoder Statistisk kvalitetskontrol 20. GMP for ledere 21. Kosttilskud, Naturlægemidler, Kosmetik og Medicinsk udstyr 28. Urenheder og nedbrydningsprodukter i råvarer og lægemidler Læs mere om de enkelte kurser på vores kursusdatabase på -industri.dk Tilmelding på dk, til Inge Fabech, if@pharmakon. dk, Er du interesseret i yderligere oplysninger, kan du kontakte uddannelseschef, cand. pharm. Ella Ulbak, eu@pharmakon.dk, Kurserne afholdes på: Pharmakon Milnersvej Hillerød 5

6 Molecular strain typing methods for investigations in the Pharmaceutical industries Selection of appropriate methods, performances and how to interpret Guest speaker: Dr. Arnaud Carlotti, Eurofins IDmyk, France Strain typing is an integral part of investigation of sterility test failure, media fill test failure and generally tracing the route of contamination in pharmaceutical industries. Methods for distinguishing among bacterial strain of a same species (typing) have improved dramatically over the past ten years, with extensive use of molecular technology. Not all molecular techniques are equally effective for typing all organisms moreover interpretation of the data is critical to determine what they mean. We will explain strain typing, review the main methods of interest and use industrial case studies to figure out what interpretation could be done and how typing can help in the root cause analysis, implementation of corrective action and evaluation. Time and place The lecture takes place the 22.of January from in Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 København Ø. There will be served breckfast from Participation is free for members of IFF. For non-members participation costs DKK 450. Arranged by Michael Timm and the board of IFF. Drug-Device ERFA gruppemøde Mødet finder sted den 23. februar kl i Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 København Ø Deltagelse er forbeholdt medlemmer af IFF. Mødet afholdes af Risk Manage-ment, Stine Klitgaard Hansen, ALK-Abelló. Er du ikke IFF-medlem? iff Medlemskab af IFF giver dig en række fordele - f.eks. kan du deltage gratis i en masse faglige arrangementer. Hvis du ikke er IFF-medlem, vil du blive opkrævet en deltagerafgift. Meld dig ind i IFF for 975 kr. pr. medlemsår på Bliv skribent for IFF Er du god til at skrive og har du gode ideer til artikler med emner inden for f.eks biotek, medicinalindustrien, GXP, kvalitetssystemer eller måske ideer til historier om spændende virksomheder eller personer, så er dette sikkert noget for dig. Skriv til os på iff@iff.nu eller ring Problemer med kontakten? Ret dine data online! På IFF s Medlemsliste kan du som IFF-medlem slå andre IFF-medlemmer op. Kryds de ønskede oplysninger af på Min side / Rediger Stamdata Husk at logge dig på for at få adgang til disse medlemsfunktioner 6