nyt Mange medicinalvirksomheder afprøver stoffer, der hæmmer syntesen af Axl-receptortyrosinkinasen eller hindrer dens funktion.

Transkript

1 Nr. 221 November 2014 iff nyt IndustriFarmaceutForeningen (IFF) er en interesseorganisation for den farmaceutiske industri, hvor medlemmerne kan holde det faglige og sociale netværk ved lige. Nytårskur i IFF med Peter Lund Madsen Kom til nytårskur den 1 5. j a n u a r o g h ø r Peter Lund Madsen fortælle om hjernen, champagnen og omstillingsparatheden. Læs side 6 Nye lægemidler til bekæmpelse af kræftmetastaser er på vej Mange medicinalvirksomheder afprøver stoffer, der hæmmer syntesen af Axl-receptortyrosinkinasen eller hindrer dens funktion. Af Kirsten Fink og Ole Terney Kræftdødsfald skyldes hyppigt, at det ikke er lykkedes at bekæmpe kræften, før kræftceller har revet sig løs fra den primære kræftknude og via blodbanen eller lymfesystemet har bredt sig til andre steder i kroppen, hvor der kan ske aggressiv vækst, såkaldte metastaser. Når kræftceller først har dannet metastaser i andre organer, er det uhyre vanskeligt at bekæmpe kræften. I dag anvendes kemoterapi mod kræftspredning, men det er ofte ikke tilstrækkeligt og giver alvorlige bivirkninger. Forskerne har derfor været på jagt efter enzymer og cellemekanismer, som er vigtige for kræftspredning i håbet om at kunne påvirke sådanne mekanismer. Her har det fortsættes næste side... Molecular strain t y p i n g m e t h o d s for investigations in the Pharmaceutical industries The lecture takes place the 22.of January. Læs side 7 fortsættes næste side... PH.D-defence P h a r m a c o l o g i c a l a n d f u n c t i o n a l properties of class C G p r o t e i n - c o u p l e d receptors. Læs side 8

2 IndustriFarmaceutForeningen Fruebjergvej 3, Postboks 87 DK-2100 København Ø Tlf: Mail: Web: Bestyrelsen Formand: Tina Kjøller, Næstformand: Gitte Hassan, Kasserer: Schiønning Brønnum Bruun, Bestyrelsesmedlemmer: Per Grønlund, Christina Guldberg, Suppleanter: Susanne Devantié Hansen, Styregrupperne MIKROBIOLOGI Ditte Hougaard, Tina Albæk Lorentsen, Nina Pringler, Lars Henrichsen, QUALITY MANAGEMENT (QM) Brian S. Jensen, Grethe Elmholdt, Conni Hornuff, Schiønning Brønnum Bruun, Johan Nielsen, SENIORGRUPPEN Jørgen Jensen, , Günther Fedders, IFF-nyt Bestyrelsen er ansvarshavende redaktion. Indlæg sendes til sekretariatet. Artikler i bladet udtrykker ikke nødvendigvis foreningens mening. DEADLINE 12. januar februar 2014 vist sig, at et bestemt transmembranprotein, receptortyrosinkinase Axl, er særdeles interessant som et mål for medicinsk behandling. Celleregulering involverer ofte transmembranproteiner Et signal fra cellens yderside til cellens inderside formidles ofte af proteiner, som strækker sig gennem cellemembranen, de såkaldte transmembranproteiner. Transmembranproteinets ydre del danner en receptor, som binder signalmolekyler. Binding af et signalmolekyle kan medføre, at der sendes signaler videre i ind cellen om, at der skal ske tilpasning til de ydre påvirkninger. Receptortyrosinkinaser er en sådan gruppe af transmembranproteiner. De har vist sig at spille en helt central rolle i mange cellulære processer, såsom reguleringen af cellecyklussen, cellemetabolismen, cellens overlevelse, proliferation og differentiering samt cellemigration. Receptortyrosinkinaser Receptortyrosinkinaser har en receptor på overfladen af cellen, hvorved der kan sendes et signal om, at et målmolekyle inde i cellen skal påvirkes. Herved overføres effekten af en ydre påvirkning til en ændring inde i cellen, som kan forplante sig gennem kaskader af reaktioner inde i cellen (1). Der er hos mennesket påvist 58 gener, som koder for forskellige receptortyrosinkinaser (1). Det er over halvdelen af de 90 unikke tyrosinkinasegener, der er blevet påvist i menneskets genom hvilket afspejler, hvor vigtigt det er, at receptorer formidler påvirkninger fra overfladen af cellen ind til cellens indre. Overproduktion af receptortyrosinkinasen Axl er relateret til kræft og spredning af kræft Axl er en unik receptortyrosinkinase, der bliver aktiveret af proteinet Gas6 (2). Betegnelsen Gas6 står for growth arrestspecific gene 6. Receptortyrosinkinasen Axl blev første gang isoleret i 1991 fra patienter med kronisk myeloid leukæmi. Senere har mange forskere bevist, at Axl er opreguleret ved en række kræftformer, såsom brystkræft, mavekræft, prostatakræft, ovariekræft og lungekræft (non-småcellelungekræft) (2,11). Navnet Axl er afledt af det græske ord anexelekto, der betyder ukontrolleret. Opregulering af Axl giver en dårligere prognose for overlevelse (2). Det er ligeledes blevet vist, at opregulering af Axl medfører resistens mod kemoterapeutiske stoffer (2). Mekanismen bag denne kemoresistens kendes ikke, men det bidrager selvfølgelig til, at der er stor interesse for Axl inden for kræftforskningen og kræftbehandlingen. Fokus på Axl som et mål for behandling I de 25 år, der er gået siden Axl og dets sammenhæng med kræft blev påvist første gang, er der sat mange ressourcer ind på at finde en effektiv måde til at forhindre overproduktion af Axl uden at det virker uhensigtsmæssigt i andre sammenhænge (3,4,5,6). Produktionen af Axl kan nedsættes med mikro-rna Mikro-RNA (mirna) er en klasse af RNAmolekyler (ca. 22 nukleotid lange), som har vist sig at være involveret i at regulere geners aktivitet på RNA-niveau. mirna koder ikke for proteiner. Det var en overraskelse, at der fandtes en stor gruppe af disse små ikkeproteinkodende RNA-molekyler. Og det var endnu mere overraskende, at der også findes andre regulatoriske RNA-molekyler, som ikke koder for protein. Det blev omkring 2001 påvist, at kun ca. 2% af menneskets genom koder for proteiner. Teorier om, at resten af genomet var junk-dna, florerede i en årrække, indtil National Human Genome Research Institute i 2003 iværksatte et kæmpeprojekt E n c y c l o p e d i a o f D N A E l e m e n t s (ENCODE), hvori deltog 442 forskere fra 32 laboratorier verden over. De mange forskere skulle identificere alle funktionelle elementer i den humane genomsekvens. Det viste sig, at der er mange ikke-kodende RNA-typer med regulatoriske funktioner. mirna var en af de første typer af ikkekodende RNA-molekyler, der blev fundet. Nu ved man, at reguleringen af aflæsningen af menneskets genom er meget kompleks med indvirkning af mange forskellige ikkekodende RNA-molekyler samt påvirkes en lang række af andre faktorer. 2

3 Axl er en unik receptortyrosinkinase, der bliver aktiveret af proteinet Gas6. Betegnelsen Gas6 står for growth arrest-specific gene 6. Axl blev første gang isoleret i 1991 fra patienter med kronisk myeloid leukæmi. I mange kræfttyper har man fundet, at niveauerne af de enkelte mirna er er forstyrret, således at der både ses over- og undertrykte mirna er i kræftvæv, hvilket ikke ses i de tilsvarende normale væv. Forskere, der arbejdede med regulering af Axl i kræftvæv, undersøgte om Axl kunne reguleres med mirna (3). Det er nemlig kendt, at mirna bindes til den del af specifikke mrna, som ikke bliver translateret til protein og bevirker, at mrna ikke aflæses til protein. Ved at sammenligne de ikke-proteinkodende nukleotidsekvenser af Axl med kendte mirna-sekvenser fandt forskerne 3 mirna-kandidater: mirnaa, mirna-199 og mirna-199b, der alle baseparrede med den ikke-translaterede del af Axl-mRNA (3). Det viste sig, at mirna-34a og mirna-199a i høj grad hæmmer produktionen af mrna, der koder for Axl. Dette blev også bekræftet ved, at der blev produceret mindre Axl-protein (3). Produktionen af Axl- mrna, Axlprotein, mirna-34a og mirna-199a/b blev målt i et panel af celleliner af nonsmåcellelungekræft, brystkræft og tyktarmskræft og blev korreleret med cellernes evne til at vokse invasivt. Der blev fundet en positiv korrelation mellem Axl-mRNA/Axl-proteinproduktion og cellernes invasive karakter (3). mirna-34a hæmmede produktion af Axl og cellernes invasive karakter. Virkningen af mirna- 34a og mirna-199a på metastasevækst blev også testet på levermetastase i kyllingefostre. Begge mirna er gav en stor reduktion af metastasevækst i forhold til kontrol-mirna (dvs. en ikke relevant mirna) (3). fortsættes næste side... 3

4 Det har vist sig, at patienter med nonsmåcellelungekræft overlever i længere tid, hvis mirna-34a-niveauet er opreguleret. MiRNA-34a-målinger kan således bruges som et prognostisk værktøj inden for lungekræft (3). Produktionen af Axl kan nedsættes med antistoffer Kræft i bugspytkirtlen er meget vanskelig at behandle. Når diagnosen stilles, har omkring 80% af de kræftramte allerede dannet metastaser, og den gennemsnitlige overlevelse er kun 5-6 måneder (4). Franske forskere gik på jagt efter monoklonale antistoffer, som kunne bindes til den ekstracellulære del af Axl (4) og dermed hindre Axl s funktion. Forskerne fremstillede monoklonale antistoffer, som ikke krydsreagerede med andre nærtbeslægtede receptortyrosinkinaser (Tyro3 og Mer). Antistoffernes virkning blev testet i adskillige cellelinier fra bugspytkirtelkræft og på nøgne mus transplanteret med bugspytkirtelkræftvæv. To af de fremstillede monoklonale antistoffer inducerede nedregulering af Axl og hæmning af den Gas6-inducerede fosforylering i kræftcellelinierne. Test på musene viste nedsat vækst af kræftvævet. Der sås en bedre effekt end med standardbehandlingen med gemcitabin, og musene overlevede i længere tid (4). Axl s aktivitet kan hæmmes med R428 R428 er en polycyklisk heteroarylsubstitueret triazol, der selektivt hæmmer Axl-kinase, og blokerer spredning af kræft Axl-varianten blev afprøvet i mus med aggressiv brystkræft eller ovariekræft. Mus med brystkræft, der blev behandlet med Axl-varianten, havde 78% færre metastaseknuder end mus, der ikke blev behandlet med Axl-varianten. i modeller af metastatisk brystkræft samt forlænger overlevelsen (5). Afprøvning af denne triazol-forbindelse har været meget lovende. Det norske firma BergenBio erhvervede i 2011 rettighederne til R428, som de nu kalder BGB324. Det bliver den første Axlhæmmer, som bliver afprøvet i kliniske forsøg i 2013 (8). Aktiviteten af Axl kan nedsættes med en RNAbaseret aptamer Aptamerer er korte, strukturede enkeltstrengede RNA- eller DNA-molekyler, som binder til deres målmolekyle med høj affinitet (6). Aptamerer har som terapeutisk reagens mange fordele i forhold til proteiner. De er nemme og billige at producere og modificere, de fremkalder ikke en immunreaktion, de trænger hurtigt gennem væv og de er langtidsholdbare (6). De rapporterede forsøg med aptamerer er udført med en 2 -fluorpyrimidin-rnaaptamer kaldet GL21.T, og forsøgene viser, at GL21.T kan nedsætte aktiviteten af Axl (6). Gas6 kan hindres i at nå receptordelen af Axl Megen forskning har altså været rettet mod Axl, hvorimod der ikke har været så stor interesse for bindingspartneren Gas6. Forskere fra Stanford University valgte imidlertid at koncentrere sig om at gøre Gas6 utilgængelig for binding til den naturlige Axl-receptor i cellemembranen. Hertil fremstillede forskerne en opløselig udgave (saxl) af den del af Axl, der stikker uden for membranen og indeholder bindingsstedet for Gas6. Forskerne brugte derefter dette molekyle til at optage Axl s bindingssted på Gas6 for derved at forhindre, at Gas6 overhovedet nåede frem til Axl-receptoren i cellemembranen (7). Men først undersøgte forskerne produktionen af Axl i normalt ovarievæv, i primær ovariekræft og i metastaser hidrørende fra ovariekræft (7). I det normale ovarievæv fandt forskerne ingen produktion af Axl, mens Axl blev produceret i omkring 75% af kræftvæv og metastaser (7). Det bekræfter, hvad andre forskere har fundet i andet kræftvæv. Den opløselige, forkortede udgave af Axl (saxl) blev nu testet i humane ovariekræftcellelinier, hvoraf nogle producerede meget Axl på grund af metastaser og andre meget lidt (7). Det viste sig her, at saxl hæmmede metastaseudvikling (7). I en musemodel reducerede saxl tumorvægten med 63% i forhold til en kontrolterapi (7). saxl blev testet for toxicitet ved at behandle mus i 21 dage. Der kunne ikke påvises nogen toxicitet (7). Det var således lykkedes forskerne at blokere Axl-Gas6-signalvejen med saxl på en ikke-toxisk måde. Forskere på Stanford universitet har senere blokeret det normale Axl-Gas6- signal ved at fremstille og anvende en gensplejset Axl, som binder Gas6 firs gange bedre end naturlig Axl (8). Forskerne fremstillede over 10 millioner Axl-varianter, som de så screenede for bindingsaktivitet til Gas6. Herved fandt de en variant, der bandt 80 gange bedre end naturlig Axl (8). De støvsugede så at sige Gas6 væk, således at der ikke opstod et naturligt Axl- Gas6-signal. Axl-varianten blev afprøvet i mus med aggressiv brystkræft eller ovariekræft. Mus med brystkræft, der blev behandlet 4

5 med Axl-varianten, havde 78% færre metastaseknuder end mus, der ikke blev behandlet med Axl-varianten. Mus med ovariekræft, som blev behandlet med Axl-varianten, havde 90% færre metastaseknuder end mus, der ikke blev behandlet med Axl-varianten (8). Axlvarianten var ikke giftig og afprøvningen på mus var således særdeles lovende. Firmaet Ruga Corp, der er en opstartsvirksomhed i Palo Alto i USA, har købt rettigheder (licens) på denne lovende teknologi for at gå videre med yderligere afprøvning. Stanford forskerne Jennifer Cochran og Amato Giaccia, som har været med til at udvikle teknologien, er videnskabelige rådgivere for Ruga Corp. Axl kan nedsætte effekten af kemoterapi Kemostoffet Cetuximab er et monoklonalt antistof, der forhindrer, at epidermal vækstfaktor-receptor EGFR fungerer normalt (10). Cetuximab har været anvendt til at nedkæmpe forskellige kræfttyper. Men det har vist sig, at mange kræfttyper bliver modstandsdygtige over for Cetuximab (10). Forskere har for nylig vist, at også her spiller Axl en rolle. Med den erkendelse kan effekten af Cetuximab opretholdes, hvis Axl samtidig hæmmes (10). Behandlingsstrategier Det er mere og mere overbevisende, at hæmning af Axl vil kunne få en stor betydning inden for kræftbehandling. Mange medicinalindustrivirksomheder er i fuld gang med klinisk afprøvning af en lang række stoffer, som hæmmer Axl (9,11). Kilder (1) Wikipedia Receptor tyrosine kinase, print 29. September 2014 (2) Paccez, J.D. m.fl. (2014), Int. J. Cancer, 134, , The receptor tyrosine kinase Axl in cancer: biological functions and therapeutic implications, doi: / ijc (4) Leconet, W. m.fl. (2013), Oncogene, doi: /onc , Preclinical validation of AXL receptor as a target for antibody-based pancreatic cancer immunotherapy (5) Holland, S.J. m.fl. (2010), Cancer Research, 70(4), , R428, a selective small molecule inhibitor of Axl kinase, blocks tumor spread and prolongs survival in models of metastatic breast cancer, doi: / can (6) Cerchia, L. m.fl. (2012), Molecular Therapy, 20(12), , Targeting Axl with high-affinity inhibitory aptamer, doi: /mt (7) Rankin, E.B. m.fl. (2010), Cancer Res., 70(19), , Axl is an essential factor and therapeutic target for metastatic ovarian cancer, doi: / CAN (8) Kariolis, M.S. m.fl. (published online: 21 September 2014), Nature Chemical Biology, doi: /nchembio.1636, An engineered Axl decoy receptor effectively silences the Gas6-Axl signaling axis (9) Sheridan, Cormac (2013), Nature Biotechnology, 31(9), , First Axl inhibitor enters clinical trials (10) Brand T.M., m.fl. (2014), Cancer Research, 74(18), , Axl mediates resistence to Cetuximab therapy, doi: / can (11) Xiaoliang, W. m.fl. (2014), Oncotarget, publ. online Oct 16, 2014, Axl kinase as a novel target for cancer therapy Farmaceutisk efteruddannelse December Statistisk forsøgsplanlægning Farmaceutiske vandsystemer i teori og praksis Februar GMP for indkøbere Marts Pharmacovigilance - en introduktion Kvalificering af produktionsudstyr EU-GMP regler - krav og for- tolkninger. Afsluttende eksamen Statistisk stikprøvekontrol QP er - Qualified Person GMP-opdatering, udfordringer og dilemmaer Læs mere om de enkelte kurser på vores kursusdatabase på -industri.dk Tilmelding på til Inge Fabech, if@pharmakon.dk, Er du interesseret i yderligere oplysninger, kan du kontakte uddannelseschef, cand. pharm. Ella Ulbak, eu@pharmakon.dk, Kurserne afholdes på Pharmakon Milnersvej Hillerød (3) Mudduluru, G. m.fl. (2011), Oncogen, 30, , Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by mir-34a and MiR-199a/b in solid cancer 5

6 Nytårskur med Peter Lund Madsen IFF holder nytårskur den 15. januar med Peter Lund Madsen. Hjernen, champagnen og omstillingsparatheden Menneskehjernen er håbløst gammeldags og det medfører en masse tåbelig adfærd - ikke mindst når man forlanger at vi skal gøre ting på nye måder. I dette foredrag får man svar på vigtige spørgsmål såsom: Hvad er vigtigst, følelser eller intelligens? Hvad kan man lære en høne? Hvorfor er hjernen så irriterende glad for vaner? Hvorfor er vi altid så bekymrede? Hvor i hjernen sidder omstillingsparatheden? Og: Hvad sker der i hjernen når man drikker champagne? Program Kl Kaffe/te Kl Peter Lund Madsen Kl Champagne og petit four Tid og sted Nytårskuren finder sted den 15. januar kl til i Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 København Ø. Vi er i mødelokale K1. 6

7 Molecular strain typing methods for investigations in the Pharmaceutical industries Selection of appropriate methods, performances and how to interpret Guest speaker: Dr. Arnaud Carlotti, Eurofins IDmyk, France Strain typing is an integral part of investigation of sterility test failure, media fill test failure and generally tracing the route of contamination in pharmaceutical industries. Methods for distinguishing among bacterial strain of a same species (typing) have improved dramatically over the past ten years, with extensive use of molecular technology. Not all molecular techniques are equally effective for typing all organisms moreover interpretation of the data is critical to determine what they mean. We will explain strain typing, review the main methods of interest and use industrial case studies to figure out what interpretation could be done and how typing can help in the root cause analysis, implementation of corrective action and evaluation. Time and place The lecture takes place the 22.of January from in Symbion, Fruebjergvej 3, 2100 København Ø. There will be served breckfast from Participation is free for members of IFF. For non-members participation costs DKK 450. Arranged by Michael Timm and the board of IFF. Glædelig jul Der udkommer ikke noget blad i December. Så IFF s bestyrelse vil allerede nu ønske jer alle glædelig jul og godt nytår. Vi glæder os til mange spændende medlemsaktiviteter i det kommende år og især til at skyde året i gang med nytårskuren den 15.januar. Så vel mødt og glædelig jul og godt nytår til jer alle. Er du ikke IFF-medlem? iff Medlemskab af IFF giver dig en række fordele - f.eks. kan du deltage gratis i en masse faglige arrangementer. Hvis du ikke er IFF-medlem, vil du blive opkrævet en deltagerafgift. Meld dig ind i IFF for 975 kr. pr. medlemsår på Bliv skribent for IFF Er du god til at skrive og har du gode ideer til artikler med emner inden for f.eks biotek, medicinalindustrien, GXP, kvalitetssystemer eller måske ideer til historier om spændende virksomheder eller personer, så er dette sikkert noget for dig. Skriv til os på iff@iff.nu eller ring Problemer med kontakten? Ret dine data online! På IFF s Medlemsliste kan du som IFF-medlem slå andre IFF-medlemmer op. Kryds de ønskede oplysninger af på Min side / Rediger Stamdata Husk at logge dig på for at få adgang til disse medlemsfunktioner 7

8 DET FARMACEUTISKE FAKULTET KØBENHAVNS UNIVERSITET PH.D-defence Pharmacological and functional properties of class C G protein-coupled receptors PhD defence by Lenea Nørskov- Lauritsen. The defence takes place the 26th of November at in the Benzon Auditorium Assessment Committee (Chairperson) Professor Harald S. Hansen, University of Copenhagen Dr Jakob Lerche Hansen, Novo Nordisk A/S Professor Martine Smit, VU University Amsterdam Supervisors Professor Hans Bräuner-Osborne, University of Copenhagen A s s o c a i t e P r o f e s s o r P e t r i n e W e l l e n d o r p h, U n i v e r s i t y o f Copenhagen Department Department of Drug Design and Pharmacology Place of experimental work The experimental work of the PhD study took place at the Department of Drug Design and Pharmacology, University of Copenhagen, and at the Institute of Functional Genomics, CNRS, INSERM, Montpellier, France Thesis abstract Ask for a copy of the thesis lnl@sund.ku.dk Pharmacological and functional properties of class C G protein-coupled receptors In 2012 the Nobel Prize in Chemistry was awarded to Robert J. Lefkowitz and Brian B. Kobilka for their groundbreaking work on the so-called G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are crucial for many physiological functions and hence much studied drug targets. This PhD project has sought to increase our knowledge of a subclass of GPCRs belonging to the class C characterised by large extracellular parts and the unique ability to work as dimers. The aim of the project was in very general terms to further investigate the pharmacological and functional aspects as well as the implication of post-translational modifications (PTMs) of class C GPCRs. Firstly, the calcium-sensing receptor, which is responsible for maintaining Ca2+ homeostasis, was used to optimise a platform based on HTRF technology for studying GPCR signal transduction. Secondly, this platform was used to study the signalling pathways of the GPCR, class C, group 6, subtype A (GPRC6A) receptor. Subsequently, m o d i f i c a t i o n s o f t h e GPRC6A protein after DNA translation were investigated. The role of attachment of oligosaccharides to a s p a r a g i n e r e s i d u e s ( N - g l y c o s y l a t i o n ) a n d covalent binding between cysteine residues were p r o b e d. F i n a l l y, a n intracellular phosphorylation site recently identified in the GABAB receptor mediating an inhibitory signalling in the central nervous system was explored. Several methods were applied to increase our understanding of this site. In conclusion, assays to study GPCR signalling were developed and the roles of important PTMs were elucidated. 8