Institut for Molekylær Biologi

Transkript

1 Indholdsfortegnelse INDHOLDSFORTEGNELSE HOLDFORDELING...4 HOLD A...4 HOLD B...5 HOLD C...6 OVERSIGT OVER ØVELSESKURSET...7 LABORATORIEREGLER....8 HYGIEJNE....8 ARBEJDSPLADS...8 SIKKERHEDSREGLER...9 RAPPORTKRAV...11 LOV OM GENTEKNOLOGI LÆRERE, INSTRUKTORER OG LABORANTER...13 ØVELSE 1: SITE DIRECTED MUTAGENESE VALG AF PRIMERE VALG AF DNA POLYMERASE...19 VALG AF DNA TEMPLATE REFERENCER MUTAGENESE, KORT OVERSIGT MUTAGENESE, DETALJERET PLAN...23 SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE ØVELSE 2: REAL TIME PCR...27 ØVELSESVEJLEDNINGENS INDHOLD...27 OVERORDENT FORMÅL...27 Eksempler på anvendelse af real time PCR fra videnskabelige literatur...27 Generelt om brugen af real time PCR...28 Hvorledes virker real time PCR?...29 Sammenligning af SYBR-Green og TaqMan-probe assays...29 PCR Instrumentet MX Amplifikationskurve og temperatur-dissociationskurve...31 Kvantificering af fluorescensdata, amplifikation og effektivitet...34 SPECIFIKKE FORMÅL MED ØVELSEN...37 INGREDIENSER VED ØVELSENS FORSØG...37 FREMGANGSMÅDE...39 Forsøg 1: SNP-analyse (polymorfier)

2 Indholdsfortegnelse Forsøg 2: Genekspression: myostatin og HO-1 mrna bestemmelse ved brug af TaqMan prober...40 Forsøg 3: Genekspression: myostatin og HO-1 mrna bestemmelse ved brug af SYBRGreen...41 BEHANDLING AF RESULTATER OG RAPPORT...43 ØVELSE 3: 2-HYBRID-ANALYSE...44 REFERENCER HYBRID-ANALYSE, EN KORT OVERSIGT HYBRID ANALYSE, DETALJERET PLAN HYBRID-ANALYSE, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT...51 ØVELSE 4: PULL-DOWN-ANALYSE...52 REFERENCER...54 PULL-DOW- ANALYSE, KORT OVERSIGT...55 PULL-DOWN-ANALYSE, DETALJERET PLAN...56 PULL-DOWN-ANALYSE, SDS-PAGE & WESTERNBLOT...58 PULL-DOWN-ANALYSE, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT...60 ØVELSE 5: SUBCELLULÆR LOKALISERING AF GFP-FUSIONS-PROTEINER...61 REFERENCER...63 SUBCELLULÆR LOKALISERING, EN KORT OVERSIGT...64 SUBCELLULÆR LOKALISERING AF GFP-FUSIONSPROTEINER, DETALJERET PLAN64 SUBCELLULÆR LOKALISERING, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT...64 ØVELSE 6: HETEROLOG EKSPRESSION AF NA,K-PUMPEN I SACCHAROMYCES CEREVISIAE LIGEVÆGTSBINDING AF OUABAIN TIL NA,K-ATPASE LIGEVÆGTSBINDING AF OUABAIN TIL NA,K-ATPASE REFERENCER HETEROLOG EXPRESSION, DETALJERET PLAN SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE ØVELSE 7: KLONING I PROKARYOTER...85 KLONING I PROKARYOTER, KORT OVERSIGT...92 KLONING I PROKARYOTER, DETALJERET PLAN...93 SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE ØVELSE 8: ANVENDELSE AF NETBASEREDE VÆRKTØJER ØVELSE 9: TRANSFORMATION AF GÆR TRANSFORMATION AF GÆR, OVERSIGT

3 Indholdsfortegnelse TRANSFORMATION AF GÆR, DETALJERET PLAN RAPPORT SKEMA SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE ØVELSE 10: ANVENDELSE AF REPORTERGENER OVERSIGT OVER ØVELSE APPENDIX STRATEGIER TIL FORØGELSE AF FRAKTIONEN AF REKOMBINANTER VED KLONING AGAROSE GELELEKTROFORESE FREMSTILLING AF AGAROSEGEL - 0.7% BRUG AF RESTRIKTIONSENZYMER Generel procedure for restriktionsskæring af DNA OPRENSNING AF DNA FRAGMENTER FRA AGAROSE GEL VED HJÆLP AF GFX PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT FRA AMERSHAM BIOTECH DEFOSFORYLERING ALKOHOLFÆLDNING AF DNA OG RNA FENOLISERING AF DNA LIGERING TRANSFORMATION AF E.COLI Kompetente celler af E. coli: Kompetente e.coli celler til nedfrysning PLASMID MINIPREPARATION FRA E. COLI MED GFX TM MICRO PLASMID PREP KIT PLASMID PREPARATION MED FERMENTAS GENEJET TM PLASMID MINIPREP KIT..131 TRANSFORMATION AF GÆR OPRENSNING AF DNA FRA OPLØSNING MED GFXTM PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT OPRENSNING AF DNA FRAGMENTER FRA AGAROSEGELER MED GFXTM PCR DNA AND GEL PURIFICATION KIT LIGEVÆGTSBINDING AF [ 3 H]-OUABAIN TIL GÆRMEMBRANER MÅLING AF β-galaktosidase AKTIVITET PÅ OPRENSEDE CYTOSOL FRAKTIONER MEDIER TIL GÆR OG BAKTERIER FREMSTILLING AF PLADER STANDARD BUFFERE ISOLERING AF GENOMISK DNA FRA FULDBLOD OPRENSNING AF TOTAL RNA FRA VÆV MED AF TRI REAGENT REVERS TRANSSKRIPTION TIL GENEKSPRESSION TAQMAN-PROBER SYBR-GREEN PRIMERE

4 Holdfordeling HOLDFORDELING HOLD A Hold Navne Amossen, Jeppe Resen 1 Andersen, Troels Askhøj 2 Birch, Carsten Bodholdt, Rasmus Poul 3 Christiansen, Kasper Melchior Christophersen, Daniel 4 Davidsen, Peter Kåre Ghadban, Ihab Zohair 5 Gillberg, Linn Maria Ellinor Goth, Christoffer Knak 6 Haarder, Simon Hansen, Andreas Martin 7 Hansen, Niels Ulrik Brandt Hansen, Thomas Arn 8 Hjort, Line Hougaard, Camilla Svare 9 Isidor, Marie Sophie Jaafar, Mostafa 10 Johannsen, Sine Kalsbeek-Hansen, Halfdan 11 Langkilde, Rasmus Haugaard Larsen, Jesper 12 Lolle, Signe Lund, Jeanett 4

5 Holdfordeling HOLD B Hold Navne 13 Martin, Matias Esben Mathiasen, Signe 14 Mellerup, Anders Merrild, Marie Porret 15 Moltke, Ida Møller, Jacob 16 Nielsen, Dennis Kim Nøhr, Mark Klitgaard 17 Pedersen, Annemarie Aarup Pedersen, Maria Hauge 18 Plum, Christoffer Milo Rasmussen, Magnus Wohlfahrt 19 Rasmussen, Rikke Rosberg, Mette Romer 20 Svendsen, Thomas Gerner Sørensen, Grith Parmo 21 Sørensen, Trine Holst Usman, Rabia 22 Vestergaard, Maj Linea Wessely, Dominik 23 Wibroe, Peter Popp Winther, Malene 24 5

6 Holdfordeling HOLD C Hold 25 Navne

7 Laboratorieregler OVERSIGT OVER ØVELSESKURSET Nedenstående skema viser hvor og hvornår hvert enkelt hold skal lave hvilken øvelse. Laboratorium 108 Laboratorium 112 Dato Øvelse Underviser Hold Øvelse Underviser Hold 12/11 3, 4, 5 RHP A 6, 8, 10 DM & PAP B 14/11 3, 4, 5 RHP A 6, 8, 10 DM & PAP B 19/11 3, 4, 5 RHP A 6, 8, 10 DM & PAP B 21/11 3, 4, 5 RHP A 6, 8, 10 DM & PAP B 26/11 3, 4, 5 RHP B 1, 2 HP & SM A 28/11 3, 4, 5 RHP B 1, 2 HP & SM A 3/12 3, 4, 5 RHP B 1, 2 HP & SM A 5/12 3, 4, 5 RHP B 1, 2 HP & SM A 10/12 7, 9 BR B 6, 8, 10 DM & PAP A 12/12 7, 9 BR B 6, 8, 10 DM & PAP A 17/12 7, 9 BR B 6, 8, 10 DM & PAP A 19/12 7, 9 BR B 6, 8, 10 DM & PAP A 7/1 7, 9 BR A 1, 2 HP & SM B 9/1 7, 9 BR A 1, 2 HP & SM B 14/1 7, 9 BR A 1, 2 HP & SM B 16/1 7, 9 BR A 1, 2 HP & SM B Undervisere: BR, Birgitte Regenberg; DM, Daniel Mucanovic; HP, Henriette Pilegaard; PAP, Per Amstrup Pedersen; RHP, Rasmus Hartmann-Petersen; SM, Stine Meinild. 7

8 Laboratorieregler LABORATORIEREGLER. Da arbejde med genmodificerede organismer kræver specielle forholsregler er det vigtigt at sætte sig ind i disse. Se ogå opslaget i laboratoriet med sikkerhedsregler. HYGIEJNE. Overtøj og tasker må ikke medbringes i øvelseslokalet, kun papir til optagelse af notater. Der skal altid bæres kittel i laboratoriet. Kitler udleveres og sendes til vask af instituttet Før laboratoriet forlades skal man vaske hænder med desinficerende sæbe Det er forbudt at drikke og spise i laboratoriet Det er forbudt at ryge i laboratorier, undervisningslokaler og gange mellem disse lokaler ARBEJDSPLADS. Bunsenbrændere skal altid stå på vågeblus af hensyn til varmeudvikling. Ved apparatfejl af centrifuger, vandbade fotometre etc. må man ikke selv begynde at udbedre fejlen men overlade det til lærer/instruktor. Efter endt øvelsesdag skal arbejdspladsen være omhyggeligt rengjort og tørret over med papir vædet i 70% ethanol. Der står en flaske med 70% etanol på hver arbejdsplads. Alle glas og kolber der ikke har været i kontakt med biologisk materiale sættes til opvask. Glasvarer der har været i kontakt med biologisk materiale skal sættes til autoklavering i de dertil indrettede grønne plastikkasser mærket genmodificeret affald og indholdet må ikke hældes i vasken. Reagensglas anbringes i trådkurve. Opløsninger der har været i kontakt med biologisk materiale skal opsamles i de i laboratoriet opstillede flasker til biologisk affald. Fast affald, der har været i kontakt med biologisk materiale, skal opsamles i de på hver arbejdsplads opstillede spande med autoklaveposer. 8

9 Laboratorieregler I tilfælde af mindre spild med genmodificeret materiale renses grundigt med den 0,1% Rhodalon opløsning der står på endebordet i laboratoriet og læreren kontaktes. I tilfælde af større mængder spild kontaktes læreren staks. Kemikalieaffald hældes i mærkede kontainere. Brugte kanyler opsamles i de opstillede plastikdunke mærket kanyler. Der skal slukkes for vandbade ved lyskontakten før man går. SIKKERHEDSREGLER. Arbejde med mikroorganismer indebærer altid en vis risiko for infektion. Det er derfor vigtigt at overholde de almindelige og eventuelt de skærpede laboratorieregler. Husk at laboratorieregler ikke erstatter sund fornuft. Tænk dig om før du udfører et forsøg i laboratoriet. Husk at du ikke arbejder alene; overhold reglerne både for din egen og dine medstuderendes skyld. Arbejde med ukendte mikroorganismer kan frembyde sundhedsfare med risiko for infektion og kræver skærpede laboratorieregler. Arbejde med kendte ikke-patogene mikroorganismer som veldefinerede svampearter, gærceller eller veldefinerede bakteriestammer som Escherichia coli (K-12, B, B/r) eller mælkesyrebakterier kræver kun almindelig laboratoriehygiejne som beskrevet nedenfor: 1. Vask hyppigt hænder med sæbe og tør dem med engangsservietter, især når laboratoriet forlades 2. Berør ikke ansigtet, især ikke næse og mund. Ved indtag gennem munden spyttes ud og skylles adskillige gange. Risikoen for infektion gennem munden er dog langt mindre end gennem rifter i huden 3. Spis, drik og ryg aldrig i laboratoriet 4. Undgå direkte berøring med mikroorganismerne og smittet materiale 5. Undgå aerosol-dannelse ved åbning, overhældning og spild. Der dannes især 9

10 Laboratorieregler aerosoler ved whirly-mixing, sonikering og pipettering 6. Brug altid kittel 7. Opsaml brugte glaspipetter i spande med Rodalon 8. Inficeret udstyr (pipette, podenål, tandstikker m.m.) må ikke lægges på bordene men opsamles i de autoklaveposer der er opstillet ved hver arbejdsplads. Inficeret glasudstyr anbringes i den dertil indrettede plastikkasse mærket genmodificeret affald. 8. Desinficer bordene med 70% ethanol ved slutning af øvelsen 10

11 August Krogh Institutet Rapportkrav RAPPORTKRAV. Til hver øvelse hører et eller flere rapportblade, der beskriver hvorledes data skal organisres og analyseres. Desuden er der en del spørgsmål, som skal besvares skriftligt i rapporten. I rapporten er det ikke nødvendigt at gentage teksten fra øvelsesvejledningen, men husk at gøre rede for afvigelser fra forløbet og eventuelle nye erfaringer med teknik og metoder. Hvis forsøget mislykkes gøres rede for forløbet og årsagen til at fejl opstod. Hvis det er muligt skaffes en fotokopi af resultater fra kolleger med angivelse af kilde og rapporten skrives på basis af disse data. Rapporter afleveres senest to uger efter afslutning af det samlede øvelseskursus. Rapporter afleveres enten til læreren/instruktoren eller i dueslaget på øvelsesgangen. Rapporterne kan også afleveres ved . Rapporterne returneres også hertil enten som godkendte eller med krav om rettelsen. I må selv lige hold øje med om de er godkendt eller der skal rettes i dem. 11

12 Lov om Genteknologi LOV OM GENTEKNOLOGI. Se lovteksten på 12

13 Lærere og instruktorer LÆRERE, INSTRUKTORER OG LABORANTER. Øvelse 1: Lærer: Adjunkt, Ph.D. Stine Meinild Instruktor: Cand. Scient. Mie Jensen Øvelse 2: Lærer: Lektor, Ph.D. Henriette Pilegaard Instruktor: Stud. Scient Helle Adser og Anne Hviid Jakobsen Øvelse 3, 4, 5: Lærer: Adjunkt, Ph.D. Rasmus Hartmann-Petersen Instruktor: Cand. Scient. Jakob Plough Jørgensen Øvelse 6, 8 og 10: Lærer: Professor, Ph.D. Per Amstrup Pedersen Cand. Scient. Daniel Mucanovic Instruktor: Stud. Scient. Janni Vikkelse Jeppesen Øvelse 7 og 9: Lærer: Lektor, Ph.D. Birgitte Regenberg Instruktor: Stud. Scient. Stella Vitt 13

14 Øvelse 1: Site-directed mutagenese ØVELSE 1: SITE DIRECTED MUTAGENESE. Frembringelse og studier af mutanter har altid været vigtige værktøjer i molekylærbiologien. Der findes principielt to måder, hvorpå man kan frembringe mutationer i et bestemt gen; ved random (tilfældig) mutagenese, hvor en population af individer eller gener mutageniseres, således at hver enkelt base har den samme sandsynlighed for at blive mutageniseret eller site-directed mutagenese, hvor man på forhånd vælger hvilken eller hvilke baser i DNA'et der skal ændres. Konstruktion af mutanter var i molekylærbiologiens barndom begrænset til fænotyper man kunne selektere eller screene sig frem til. Som et simpelt eksempel kan nævnes frembringelse af mutationer i en repressor der enten formindsker eller forøger repressorens aktivitet. Mutationerne var oftest enten spontane eller inducerede af kemikalier (Ethyl-methan-sulfonate, hydroxylamine) eller bestråling (UV eller røntgen). Target for disse mutagene komponenter er mere eller mindre tilfældige, så de frembragte mutationer er ikke lokaliseret til et eller flere veldefinerede nukleotider med mindre kun mutationer i en eller flere nukleotider frembringer den ønskede fænotype. Hvis den frembragte mutation kun resulterer i en let nedsat enzymaktivitet vil det i praksis være umuligt at isolere en sådan mutant. Random mutagenese lider således af den svaghed (og styrke) at arten af mutationer og mutationsstedet ikke kan kontrolleres rationelt. I dag kan random mutagenese dog også udføres uden brug af kemikalier og kortbølget lys. Man kan ved at anvende DNA polymeraser uden proofreading system, under betingelser hvor det ene nukleotid er i underskud, få inkorporeret tilfældige mutationer i sit DNA fragment. Med mulighederne for fremstilling af syntetisk DNA ved organisk kemisk syntese blev det gjort muligt at udvikle protokoller til frembringelse af mutanter efter eget valg i et stykke DNA med kendt sekvens (site-directed mutagenese). Siden har syntetisk DNA spillet en større og større rolle i moderne molekylærbiologisk forskning. Det ville i dag være utænkeligt at forestille sig et moderne molekylær biologisk laboratorium uden adgang til syntetisk DNA. Tabel 1 giver en sammenligning af klassisk random mutagenese og site directed mutagenese. 14

15 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Tabel 1 Sammenligning af klassisk random mutagenese og oligonukleotid directed mutagenese. Klassisk mutagenese Oligonukleotid mutagenese Mutant spektrum Meget bredt Meget snævert Mutationsfrekvens Op til 100% Kendskab til target gen Kendskab til mutantens fænotype Genets DNA sekvens behøves ikke være kendt (genet kan endda være ukendt) Mutanten skal have en fænotype Genets sekvens skal være kendt Ligegyldigt om mutanten har en fænotype eller ej. Kendskab til hvilke nukleotider der er vigtige Ikke nødvendigt da de interesante mutationer har en fænotype Nødvendigt at vælge eller forudsige hvilke nukleotider der er interessante Der er efterhånden udviklet en række metoder til site-directed mutagenese med varierende succesrate. Metoderne kan deles op i metoder der anvender M13 fager eller phagmider som templates for syntese af rekombinante DNA molekyler (Kunkel, 1985; Taylor et al., 1985; Vandeyar et al., 1988; Stanssens et al., 1989; Carter et al., 1985) og metoder der involverer PCR amplifikation (Higuchi et al., 1988; Vallette et al., 1989; Kadowaki et al., 1989; Nelson and Long, 1989; Ho et al., 1989). Succesraten for de første metoder varierer i praksis mellem 1% og 80%, medens de for de for PCR baserede metoder i praksis er 100%. I denne øvelse vil vi tage udgangspunkt i plasmidet ppap2306 (figur 1), som er puc19 (kort side 88), hvori der er indsat en stop kodon i lacz α genet og der er lavet en frameshift mutation. Kombinationen af stopkodon og frameshift indebærer, at det tilsvarende LacZ(α) peptid ikke er aktiv, hvorfor en E. coli stamme indeholdende ppap2306 vil være hvid på en X-gal-IPTG plade. Samtidig betyder ændringerne i lacz genet, at der er fjernet et PaeI site i forhold til puc19). Vi vil i denne øvelse ved site directed mutagenese ændre stopkodon og re-etablere læserammen i lacz(α) i ppap2306 til den oprindelige sekvens. Dette indebærer, at E. coli transformeret med det ændrede plasmid bliver blå på en X-GAL-IPTG plade (se side135) og at plasmidet får gendannet sit PaeI site. Princippet i den her benyttede site-directed mutagenese protokol er beskrevet af Ho et al. (1989) og angivet i Figur 2. 15

16 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Før du starter, så nedskriv den nukleotidsekvens af lacz(α) genet, der er resultatet af den udførte site-directed mutagenese og skaf dig et præcist overblik over hvilke ændringer i nukleotid sekvensen og læseramme, det er du foretager dig. 16

17 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Sekvensen af mutant primere: Blåop: 5 -CGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG-3 Blådo: 5 -CGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCG-3 Sekvenser ydre primere: AflIII: 5 -GTTCCTGGCCTTTTGCTGGC-3 AatII: 5 -GCGCACATTTCCCCGAAAAG-3 Figur 1. Nukleotid sekvensen af ppap2306. Lokaliseringen og sekvenserneaf de primere, der anvendes til mutagenesen er angivet. ATG kodon for lacz ()-peptidet er angivet med fed. Husk på sekvensen er en cirkel hvorfor det sidst skrevne nukleotid er kovalent koblet til det første. Se eventuelt kortet over puc19 i side 88. Endvidere er angivet positionen af relevante restriktionssites. SphI genkender sekvensen GCATGC. 17

18 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Figur 2 Skematisk oversigt over den af Ho et al (1989) beskrevne site-directed mutagenese protokol. Dobbelstrenget DNA templates og syntetiske DNA primere er angivet som orienterede linjer. Pilen angiver 5'- 3' orienteringen af den enkelte DNA streng. Mutationsstedet er angivet med en sort firkant. PCR primere er angivet med små bogstaver mens PCR produkter er angivet med store bogstaver, som angiver hvilke primere, der blev brugt til PCR amplifikationen. Den indrammede del af figuren angiver intermediæren under den afsluttende PCR reaktion, hvor de denaturerede initiale PCR fragmenter anneales i de overlappende regioner og hvor de frie 3' ender forlænges af DNA polymerasen. Resultatet er et PCR fragment indeholdende den ønskede mutation. Dette DNA fragment kan nu klones tilbage i plasmidet, idet PCR fragmentet er planlagt således at det i enderne indeholder genkendelsesekvenser for restriktions enzymer. 18

19 Øvelse 1: Site-directed mutagenese I forbindelse med site directed mutagenese udført ved hjælp af PCR teknologi er der nogle kritiske parametre at forholde sig til. Det gælder valg af PCR primere, valg af DNA polymerase samt valg af template. VALG AF PRIMERE. Vi vælger oftest at bruge primere mellem 18 og 21 nukleotider lange afhængig af basesammensætningen omkring mutations stedet og antal mutationer der ønskes introduceret. Mismatchet mellem primer og template lægges midt i primer sekvensen. Primerne vælges også sådan at deres annealing temperatur, T A, ligger omkring de 55 C. Smeltetemperaturen, T m, for oligo nukleotider mellem 14 og 20 nukleotider kan beregnes som følger: T m = 2 X (A + T) + 4 X (G + C) T A = T m - 3 C. Desuden er det vigtigt, at de valgte primere ikke kan anneale til hinanden ved den i PCR proceduren anvendte annealing temperatur, idet man så risikerer at opnå primerdimer amplifikationer. VALG AF DNA POLYMERASE. Der findes efterhånden en række termoresistente DNA polymeraser på markedet. Desværre er der ikke udført gode forsøg der på entydig måde sammenligner deres aktiviteter. Det krav, som er vigtigst at stille til DNA polymerasen i forbindelse med sitedirected mutagenese eksperimenter, er, at fejlinkorporeringen er så lav som overhovedet muligt. In vivo besidder DNA polymeraser et proofreading system der reducerer mutationsfrekvensen betragteligt. Imidlertid er proofreading funktionen (3-5' exonuklease aktiviteten) fjernet fra mange af de kommercielle termoresistente DNA polymeraser. I princippet skulle brugen af en DNA polymerase med proofreading reducere frekvensen af fejlinkorporeringer. Vi har i denne øvelse valgt at anvende AccuPOL, som er en DNA polymerase med proofreading fra firmaet Ampliqon (Cat.No: AMP ). Det er vores erfaring at dette enzym ikke giver fejlinkorporeringer. VALG AF DNA TEMPLATE. Det eneste krav til DNA template er, at DNA sekvensen er kendt, så der er mulighed for at designe primere. Vi bruger som oftest plasmider som templates. For at 19

20 Øvelse 1: Site-directed mutagenese mindske risikoen for fejlinkorporeringer og fordi alt det amplificerede DNA skal sekventeres er det tilrådeligt at amplificere så lille et stykke template som muligt. Valget af templates er ofte betinget af, at der er mulighed for at reklone PCR fragmentet indeholdende den eller de ønskede mutationer i det oprindelige plasmid. Brug af en høj initiel template koncentration minimerer også risikoen for fejlinkorporering idet template hovedsageligt amplificeres under PCR reaktionen. Det er også en god ide at anvende friske nukleotider til PCR reaktionen da partiel nedbrydning af et af de fire nukleotider vil give meget forskellige nukleotid koncentrationer. Dette har vist sig, at give en stor grad af fejlinkorporeinger. Mutagenese arbejde bliver stadigt mere udbredt i undersøgelser af proteiners struktur/funktions sammenhænge. Generelt står man over for det problem at klarlægge hvilke aminosyrer i ens favorit protein, der er direkte involveret i proteinets funktion. I denne situation er det begrænsende trin ikke så meget det tekniske i at fremstille muterede versioner af det tilsvarende gen. Dette kan være en tidskrævende og besværlig proces men er et spørgsmål om praktisk erfaring. Det første begrænsende trin er på et rationelt grundlag at beslutte sig for hvilke aminosyrer, der skal udskiftes, og hvilke aminosyrer de skal ændres til. Dette valg vil desværre ofte være baseret på alt muligt andet end røntgen krystal- eller NMR strukturen af proteinet. Det betyder, at man ofte starter ud på et spinkelt grundlag m.h.t. udvælgelse af interessante aminosyrer. I sådanne tilfælde er det værd at overveje om der kan etableres et selektions- eller screeningssytem til identifikation af vigtige aminosyrer. I et sådant system overlades det til naturen at udvælge de interessante aminosyrer. Kan et sådant etableres vil kombinationen random mutagenese og selektion/screening i første omgang være et meget stærkere værktøj end site-directed mutagenese. I den efterfølgende detail analyse kan site-directed mutagenese derimod være et frugtbart værktøj. 20

21 Øvelse 1: Site-directed mutagenese REFERENCER. Generel PCR håndbog: Dieffenback, CW and Dueksler, GS (eds) (1995):PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mutagenese: Kunkel, T.M.(1985): Rapid and efficient site-directed mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: Taylor, J.W., Ott, J. and Eckstein, F.(1985): The rapid generation of oligonucleotide directed mutations at high frequences using phosphoro-thionate modyfied DNA. Nucleic Acids Res. 13: Vandeyar, M.A., Weiner, M.P., Hitton, C.J. and Batt, C.A.(1988): A simple and raid method for selection of oligodeoxynucleotide directed mutants. Gene 65 : Stanssens, P., Opsomer, C., McKeown, Y.M., Kramer, W., Zabeau, M. and Fritz, H.J.(1989): Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids Res. 17: Carter, P., Bedouelle,H. and Winter, G.(1985): Improved oligonucleotide sitedirected mutagenesis using M13 vectors. Nucleic Acids Res. 13 : Higuchi, R., Krummel, B. and Saiki, R.K.(1988): A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 : Vallette,F., Mege, E., Reiss, A. and Adesnik, M.(1989): Construction of mutant and chimeric genes using the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17 : Kadowaki, H., Kadowaki, K., Wondisford, F.E. and Taylor, S.I. (1989). Use of polymerase chain reaction catalyzed by Taq DNA polymerase for site-specific mutagenesis. Gene 76 : Nelson, R.M. and Long, G.L. (1989): A general method of site-specific mutagenesis using a modyfication of the Thermus aquaticus polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 180 : Ho, S.H., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. and Pease, L.R. (1989): Site directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77 :

22 Øvelse 1: Site-directed mutagenese MUTAGENESE, KORT OVERSIGT. Dag 1. Fremstil ved PCR de to initielle DNA fragmenter. Verificer ved gelektroforese. Dag 2. Kør overlap ekstension PCR med de to initielle produkter som template.verificer overlap PCR ved gelektroforese. Spritfæld. Skær med Aat II og Afl III. Skær ppap2306 (vektor DNA) med Aat II, Afl III, HindIII, EcoRI og Pvu II. Verificer skæringer ved gelektroforese. Ligér og transformér. Udstryg på X-GAL / IPTG plader. Dag 3. Opgør antallet af blå og hvide kolonier. Pod en af hver op overnight (ON). Dag 4. Oprens plasmid DNA fra kulturer. Verificer ved gelektroforese. Skær med SphI. Verificer skæringer ved gelektroforese 22

23 Øvelse 1: Site-directed mutagenese MUTAGENESE, DETALJERET PLAN. Dag 1. Fremstilling af de initielle PCR fragmenter. Følgende blandes i to seperate 0,5 μl PCR rør: 10 μl ppap μl ppap μl AccuPOL buffer (10 ) 10 μl AccuPOL buffer (10 ) 10 μl AflIII primer (2 pmol/ml) 10 μl AatII primer (2 pmol/ml) 10 μl BLÅdo primer (2 pmol/ml) 10 μl BLÅup primer (2 pmol/ml) 10 μl dntp-mix (2.5 mm) 10 μl dntp-mix (2.5 mm) 1 μl AccuPOL 1 μl AccuPOL H O til 100 μl 2 H O til 100 μl 2 Prøverne køres i PCR maskinen ved følgende betingelser: 92 C i 2 min 92 C i 30 sek 55 C i 30 sek 30 cykler 72 C i 40 sek 72 C i 5 min Efter endt kørsel udtages 10 μl PCR-produkt, som tilsættes 3 μl gel loading buffer (GLB) og separeres på en 1.5% agarose gel. På grundlag af resultatet fra gel-elektroforesen fortsættes med overlap extension PCR. Overlap extension. Nedenstående blandes i et 0.5 μl PCR rør: [X] μl initiel PCR produkt 1 + [Y] μl initiel PCR produkt 2 (spørg instruktor) 10 μl AccuPOL buffer (10 ) 10 μl AflIII primer (2 pmol/ml) 10 μl AatII primer (2 pmol/ml) 10 μl dntp-mix (2.5 mm) 1 μl AccuPOL H 2 O til 100 μl 23

24 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Prøverne køres i PCR maskinen ved følgende betingelser: 92 C i 2 min 92 C i 30 sek 55 C i 30 sek 30 cykler 72 C i 80 sek 72 C i 5 min Dag μl overlap PCR-produkt tilsættes 3 μl GLB og separeres på en 1.5% agarose gel. De resterende 90 μl PCR produkt spritfældes (side117), tørres, og resuspenderes i 100 μl TE- buffer. PCR-produkt s amt vektor (ppap 2306) skæres i to seperate eppendorf-rør: 75 μl PCR-produkt 75 μl ppap μl NE buffer 4 (10 ) 10 μl NE buffer 4 (10 ) 10 μl BSA (10 ) 10 μl BSA (10 ) 5 μl enzym-mix (Aat II + Afl III) 5 μl enzym-mix (Aat II, Afl III, HindIII, EcoRI, Pvu II) Skæringerne inkuberes ved 37 C i minimum 2 timer, hvorefter de verificeres på 1.5% agarosegeler. Der loades 10 μl af hver skæring plus 3 μl GLB. Husk at påsætte én uskåret prøve på hver gel. Skåret PCR-produkt og vektor blandes og volumen indstilles til 200 μl med H 2 O. Præcise mængder aftales med lærer på grundlag af gelelektroforese resultatet. Blandingen spritfældes (side 125), tørres og resuspenderes i 20 μl ligase buffer. Der tilsættes 1 μl Quick-Ligase og inkuberes 5 min ved stuetemperatur. Herefter sættes ligeringsblandingen straks på is. 24

25 Øvelse 1: Site-directed mutagenese Kompetente celler (100 μl) transformeres med alle 20 μl ligeringsmix og udplades på X- GAL / IPTG plader som beskrevet i appendix (side 128). Kontrol af kompetente celler: To hold transformerer kompetente celler med ppap 2306 og udstryger på X-G AL / IPTG plader som beskrevet i appendix (side 128). Dag 3. Antallet af fremkomne blå og hvide kolonier på X-GAL / IPTG pladen gøres op. Èn blå og èn hvid koloni overføres med sterile pipette spidser til to seperate rør indeholdende 5 ml LB-medie plus ampicillin. Kolonierne dyrkes op ON ved 30 C på rystebord. Dag 4. Plasmid fra de to kolonier oprenses med GFX TM miniprep kit som beskrevet i appendix (side 130) og verificeres ved elektroforese på en 1,0% agarosegel. Der loades 10 μl plasmid plus 3 μl GLB. Plasmider skæres med SphI i minimum 2 timer: [x] μl plasmid (aftal mængde med lærer) 5 μl NE-buffer 2 (10 ) 1 μl SphI enzym H2O til 50 μl Skæringer verificeres ved elektroforese på en 1,0% agarosegel. Der loades 10 μl skæring plus 3 μl GLB. 25

26 Øvelse 1: Site-directed mutagenese SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE 1. A: Opgør antallet af blå og hvide kolonier efter transformation af jeres ligeringsblanding. Kommentér resultatet. B: Kommenter resultatet efter restriktions skæring af plasmid DNA blå henholdsvis hvide kolonier. isoleret fra jeres C: Hvorfor skærer vi ppap2306 med både AatII, SapI, HindIII, EcoRI og SalI før vi ligerer til det AatII, SapI skårede PCR fragment? Beskriv en alternativ strategi til at opnå det samme. D: Ofte ønsker man at fusionere to DNA fragmenter på et bestemt sted i deres nukleotidsekvenser. Det betyder også, at man oftest ikke kan ligere de to fragmenter sammen, da der ikke er restriktionssites i de ønskede fusionsområder. Tegn og beskriv, hvorledes princippet i den her beskrevne site-directed mutagenese protokol kan bruges til at konstruere en præcis fusion mellem vilkårlige DNA fragmenter med kendt sekvens uden anvendelse restriktionsenzymer. to af 26

27 Øvelse 2: Real Time PCR ØVELSE 2: REAL TIME PCR ØVELSESVEJLEDNINGENS INDHOLD A. Overordnet formål B. Eksempler på anvendelse af real time PCR C. Generelt om real time PCR D. Hvorledes virker real time PCR? E. Sammenligning af SYBRGreen og TaqMan-probe analyser F. PCR instrumentet MX4000 G. Amplifikationskurve og temperatur-dissociationskurve H. Kvantificering af fluorescensdata, amplifikation og effektivitet I. Specifikke formål med de enkelte øvelsesdele J. Ingredienser K. Fremgangsmåde L. Beregninger og rapport OVERORDENT FORMÅL At give de studerende en forståelse af principperne bag real time PCR, og at de studerende stifter bekendskab med brugen af real time PCR til undersøgelse af genekspression og polymorfier. EKSEMPLER PÅ ANVENDELSE AF REAL TIME PCR FRA VIDENSKABELIGE LITERATUR Virus: Analyser til måling af mængden af influenza A and B virus. Analyse af antallet af infektiøse mæslingevirus i virusvacciner Duplex real time assay til detektion og kvantificering af herpes simplex virus type 1 eller herpes simplex virus type 2 i læsioner på huden. Bakterier: Analyse for Escherichia coli, enterobacterier og Campylobacter jejuni ved direkte assay på fæces uden dyrkning. Analyse for patogene protozoer Giardia lamblia og Cryptosporidium parvum i drikkevand. Detektion af patogene periodontale bakterier i mundslimhinden. Væv og celler: Bestemmelser af transcriptionel aktivitet og mrna indhold for et stort antal gener; bl.a i 27

28 Øvelse 2: Real Time PCR skeletmuskulatur før og efter fysisk arbejde, effekt af træning og kost (human, rotter, mus). Induktion af cytokiner i fibroblaster fra hjerte under infektion med coxsackievirus. Kvantitativ analyse af transkripter med lavt kopital, f.eks. transcriptionsfaktorer med omkring 1 kopi per celle. Kvantificering af genmodificering (GMO) i produkter indeholdende majs eller soyabønner. Alleldiskriminering til bestemmelse af polymorfier i gener med potentiel betydning for udvikling af en lang række sygdomme. GENERELT OM BRUGEN AF REAL TIME PCR Real-timniveauer i en prøve. Real time PCR tillader hurtig analyse af genekspression udfra små PCR er den mest sensitive metode til kvantitativ analyse af DNA og cdna mængder udgangsmateriale og bliver i stigende grad valgt som metode ved kvantificering af mrna-indholdet. Ved kvantitativ analyse af mrna er de første trin præparation af total RNA fra celler eller væv og en reverse transkriptionsreaktion (RT), hvor der syntetiseres en cdna kopi af mrna et. Det er også den foretrukne metode til validering af array-analyseresultater og til måling af sirna induceret hæmning af genekspression. Præcis kvantificering af mrna i forhold til proteinprodukt er også essentiel ved karakteristik af translationel regulering af proteinsyntese. Opfindelser indenfor PCR teknologi og udvikling af fluorescensteknikker tillader registrering af DNA/cDNA produkt efter hver enkelt PCR cyklus, og PCR produktet kan således let kvantificeres i den eksponentielle fase af PCR reaktionen efter kørslen, selv om PCR reaktionen er kørt til ende. Tærskelcyklus (Ct, Treshold) kan aflæses som den første PCR cyklus, hvor stigningen i fluorescens er lineær i et semilogaritmisk plot. En standardkurve opnås ved måling af tærskelcyklus for en række fortyndinger af en kendt mængde DNA/cDNA (absolut eller relativ mængde). Efter måling af tærskelcyklus for en ukendt prøve kan mængden af template beregnes udfra standardkurven. Denne analyse er baseret på den antagelse, at effektiviteten af PCR reaktionen er den samme i de prøver der analyseres som ved analyserne til standardkurven. Som forklares senere på efterfølgende sider, kan effektiviteten af PCR reaktionen beregnes udfra hældningen af standardkurven ved afbildning af tærskelcyklus (Ct) som funktion af logaritmen til mængde DNA (eller cdna). 28

29 HVORLEDES VIRKER REAL TIME PCR? Øvelse 2: Real Time PCR Fluorescensmåling Dannelsen af PCR produkt ved real time PCR kvantificeres ved registrering af fluorescens, hvor signalet øges proportionalt med mængden af PCR produkt i reaktionen. Ved real-time PCR sker målingen af fluorescens i hver prøve efter hver enkelt cyklus. Den simpleste og mest økonomiske teknik anvender SYBRGreen, og det mest populære alternativ til SYBRGreen er TaqMan prober. SAMMENLIGNING AF SYBR-GREEN OG TAQMAN-PROBE ASSAYS SYBR Green I real time PCR reaktioner, der benytter SYBR Green (Molecular Probes), udnyttes, at SYBR Green binder til dobbeltstrenget DNA og udsender lys ved ekscitation (ex. 497 nm, em. 520 nm), mens det ikke-bundne SYBRGreen i vandig opløsning har en ca 1000 gange lavere fluorescensintensitet. SYBRGreen har høj affinitet for binding til den lille fure i dobbeltstrenget DNA. Problemet med SYBRGreen er, at det bindes til alt dobbeltstrenget DNA i prøven inklusivt primer-dimere og andre uspecifikke reaktionsprodukter, således at resultatet kan blive en overvurdering af koncentrationen af det specifikke produkt. Når primerne er godt designet, og der er tale om et enkelt PCR produkt uden primer-dimer-dannelse, kan SYBRGreen fungere fint og evt falske eller uspecifikker produkter vil først dukke op ved meget høje cyklusnumre (>35-40). TaqMan prober Ved TaqMan prober er kvantificering af produktet baseret på Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), idet TaqMan proben indeholder en fluorescerende reporter på 5' basen, og en fluorescens-quencher bundet til 3' basen. Så længe TaqMan proben er intakt, vil energien fra den exciterede reporter overføres ved FRET til quenchermolekylet i stedet for at blive udsendt med reporteres karakteristiske bølgelængde (som vil blive registreret af PCR apparatet). Quencheren udsender også lys, men med en anden bølgelængde end reporteren. TaqMan proberne designes således, at de hybridiserer til en region i amplicon mellem forward og reverse primere, og således at proben har en Tm, der er 10 o C højere end for de to primere. Ved PCR reaktionen vil polymerasen starte replikationen af DNA template fra primerne. Inden længe vil polymerasen nå TaqMan proben, der også er bundet til sin specifikke sekvens i DNA et. Polymerasens 5' 29

30 Øvelse 2: Real Time PCR Fig. 1. TaqMan prober. Systemet har to specifikke primere, en forward 5-3 primer (FP) og en revers 3-5 primer (RP), og den specifikke TaqMan probe, (hvor den fluorescerende reporter (R) sidder på 5' basen, mens quencheren (Q) er bundet til 3' basen) placeret mellem de to primere. Totallængden af det amplificerede område vil oftest være baser. Tm for Taqman proben skal helst være ca 10 o C højere end for de to primere. endonuclease-aktivitet vil efterfølgende spalte proben samtidig med, at replikationen af DNA et fortsætter langs DNA template. Herved adskilles den fluorescerende reporter fra quencheren, og reporterens fluorescens hæmmes ikke længere ved energioverførsel til quencheren. Fluorescensen vil øges proportionalt med hastigheden af spaltningen af proben og parallelt med syntesen af det specifikke PCR produkt. Fluorescerende stoffer med forskellige emissions-spektre kan bindes til forskellige TaqMan prober. Dette kan benyttes f.eks i genekspressionsstudier, hvor cdna indholdet af ikke kun targetgenet, men tillige af en endogen kontrol kan bestemmes samtidigt i samme prøve (multiplex PCR). Yderligere har brug af to prober med forskellig reporter dye i samme reaktion fået stor anvendelse ved allelic distrimination, der benyttes, når polymorfier undersøges. Det er klart, at dette ikke kan opnås med SYBRGreen, idet denne probe ikke kan skelne forskellige dobbeltstrengede DNA produkter. TaqMan prober 30

31 Øvelse 2: Real Time PCR tillader analyse af meget små mængder DNA, idet proben kun vil hybridisere til den specifikke sekvens og ikke til primer-dimere og andre falske produkter, der opstår efter et stort antal PCR cykler. PCR INSTRUMENTET MX4000 Fig. 2 Foto af MX4000 QPCR instrumentet (a) og diagram over dets lysvej (b). MX4000 har indbygget en termocykler og et fiberoptisk system. MX4000 instrumentet er styret af en computer. MX4000 programmet styrer thermocycler funktionerne, samt opsamling og analyse af data. Det fiberoptikse system dirigerer en lystråle fra tungstenlampen til hver af de 96 huller i prøve-holderen. Den efterfølgende fluorescens-emission fra prøverne føres tilbage gennem lysleder-kabler til fire photo- der måler intensiteten af multipliere, fluorescenslyset. Da hvert prøverør belyses i sekvens kan instrumentet adskille og kvantificere fluorescensen fra op til fire fluorophorer i samme prøverør (multi-plex). Ved forsøgene illustreret i Fig. 3 og 4, analyseres prøverør for to fluorophorer, SYBR-Green, der svarer til FAM (ex. 497 nm, em. 520 nm) og ROX (ex. 584 nm, em. 612 nm), der fungerer som intern reference. Den grønne fluorescens fra FAM og den røde fra ROX kan adskilles i systemet. Det tillader normalisering af ikke-pcr relateret fluorescens-fluktuation. AMPLIFIKATIONSKURVE OG TEMPERATUR-DISSOCIATIONSKURVE Amplifikationskurve Ved real time PCR måles mængden af DNA/cDNA ved fluorescens-analyse efter hver 31

32 Øvelse 2: Real Time PCR PCR cyklus, hvilket sikrer en registrering og analyse af resultaterne i den eksponentielle fase. Alle real-time PCR systemer er baseret på måling af et fluorescenssignal, der er direkte proportionalt med mængden af PCR produkt i reaktionen. Fig. 3. Direkte plot af fluorescens (Rn) overfor cyklusnummer for fortyndinger (fra venstre): 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 og 10-7 fra SYBRGreen kørsel med myostatin-primere. Fig. 4. Semilogaritmisk plot af log (fluorescens (Rn)) overfor cyklusnummer for fortyndinger (fra venstre): 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 og 10-7 af en prøve fra SYBRGreen kørsel med myostatin-primere. Tærskelcyklus (Ct) aflæses ved den blå linie, der skal placeres i den eksponentielle del af amplifikationskurven. Ct I Fig. 3 ses et direkte plot af fluorescens overfor antal PCR-cykler. I starten af en PCR reaktion er reagenserne i overskud, og koncentrationerne af DNA template og produkt er så lave, at renaturering af produkt ikke konkurrerer med binding af primer til template. I den fase sker amplifikationen af DNA template ved en konstant eksponential hastighed. Denne eksponentielle fase svarer til den hastige stigning i fluorescens ved foden af de sigmoide kurver i Fig. 3, og dette forløb er en lineær funktion i det semilogaritmiske 32

33 Øvelse 2: Real Time PCR plot i Fig. 4. Det tidspunkt, hvor reaktionen ikke længere er eksponentiel og går ind i en lineær fase af amplifikation i det direkte plot i Fig. 3, afhænger af, hvornår renaturering af produkt begynder at konkurrere med binding af primere og af inaktivering af Taq- Senere falder amplifikationen til næsten nul, og kurven ender i et plateau, polymerasen. hvor der ikke dannes mere produkt. Temperatur-Dissociationskurve ved brug af SYBRGReen For at vurdere om evt primer-dimere eller uspecifikke produkter bidrager til signalet fra SYBRGreen konstrueres en temperatur-dissociationskurve. Dette gøers ved efter den egentlige PCR cyklus er kørt til ende at øge temperaturen gradvist fra 55º C til 95º C og registrere ændringen i fluorescens. I Fig. 5 ses, at SYBRGreen fluorescensen falder gradvist ved øgning af temperaturen fra 55º C til 79 o C. Fra 80º C til 95 o C ses et skarpt fald i fluorescens, når dsdna dissocierer og frisætter SYBRGreen: dette er produktets smeltetemperatur. Smeltetemperaturen afhænger af produktets basesammensætning og dets længde. Primer-dimere og andre uspecifikke reaktionsprodukter vil som regel være kortere og have et lavere smeltepunkt end det specifikke produkt, hvilket betyder, at primer-dimere og andre uspecifikke reaktionsprodukter vil føre til en ændring i området o C (se Fig 6). Fig. 5. Temperatur- plot dissociations-kurve er et af normaliseret fluorescens (Rn) over for temperatur ( o C) fra 55 o til 95 o C. 33

34 Øvelse 2: Real Time PCR Fig. 6. Temperatur-dissociationskurve hvor det første differentiale af den normaliserede fluorescens multpliceret med -1 [ -Rn (T) ] er plottet overfor temperatur ( o C) fra 55 o til 95 o C. Topppen af kurven ved 83 o C er smeltepunkt for amplicon i denne reaktion. KVANTIFICERING AF FLUORESCENSDATA, AMPLIFIKATION OG EFFEKTIVITET For både SYBRGreen og TaqMan prober er kvantificering af reaktionen baseret på identifikation af den første signifikante stigning i fluorescens. Jo flere DNA kopier prøven indeholder, jo tidligere vil der observeres en signifikant stigning i fluorescens. Analysen af real-time PCR data er sædvanligvis baseret på den antagelse, at alle de prøver, der analyseres, har samme PCR effektivitet for et givent gen. Standardkurve Hvis man ønsker præcise værdier for antallet af DNA eller mrna molekyler, skal der bruges absolute standarder. En absolut standard består af en kendt mængde template eller amplicon, som pipetteres til en fortyndingsrække (f.eks. 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ). Template kan være en kendt mægde gdna eller cdna (mrna i en revers transkriptionsreaktion). Ved at plotte tærskelcyklus (Ct) overfor fortynding eller mængde DNA fremkommer en standardkurve. De ukendte prøvers indhold af DNA/cDNA bestemmes ud fra standardkurven, og resultatet kan opgives som antal kopier af DNA eller cdna. Relative standarder. En prøve eller typisk en blanding af prøver af DNA/ cdna 34

35 Øvelse 2: Real Time PCR benyttes som udgangspunkt (1x) til en fortyndingsrække. Hverfra laves en fortyndingsrække (f.eks som ovenfor angivet). Herfra kan der genereres en standardkurve, hvor enheden er arbitrær, (relativt indhold i forhold til udgangsprøvens indhold). Relative standarder bruges, når man ønsker at bestemme, hvorledes en prøve adskiller sig fra en kontrol, f.eks. ved undersøgelse af et hormons virkning på mrna ekspressionen af et bestemt gen. Standardkurven i Fig. 7 er et retliniet plot af Ct (tærskelcyklus) som funktion af logaritmen af det initielle specifikke mrna (cdna) indhold i en fortyndingsrække. Kvantificering af mængden af cdna (mrna) i en ukendt prøve opnås ved at måle Ct og beregne mængden af cdna i prøven ud fra en sådan standardkurve. Fig. 7. Eksempel på standardkurve, d.v.s. et plot af Ct (tærskelcyklus) på Y-aksen overfor log(initiel mængde) på X-aksen. Eksemplet er fra fortyndingerne 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 og Formlen for eksemplets rette linie er y = * log(x) + 6.1, hvor er hældningen af den rette linie og 6.1 er skæringen med y-aksen. I et ideelt eksponentielt forløb vil antallet af template DNA fordobles for hver cyklus, svarende til en amplifikation på 2,0. Effektiviteten af PCR reaktionen er den fraktion af template molekyler, der fordobles per cyklus, og PCR effektiviteten er derfor ved en ideel amplifikation lig 1. Standardkurven ved en sådan optimal amplifikation, vil have en hældning på Dette kan ses ud fra formlen for en PCR reaktions 35

36 Øvelse 2: Real Time PCR eksponentielle amplifikation: N c =N 0 * (1+E) c, hvor N c er cdna mængde efter c cykler, N o den initielle mængde, E er effektiviteten af PCR reaktionen og c antal cykler. Hvis amplifikationens effektivitet er E=1, giver dette formlen ved en ideel amplification: N c =N 0 * 2 c. Hvis der beregnes, hvor mange cykler, der skal til for at opnå en 10 ganges stigning fås c=3.32 cykler. Hældningen af standardkurven afspejler således effektiviteten af amplifikationen. Ved udledning af formlen for PCR amplifikation fremkommer udtrykket: A = 10 (-1/slope) hvilket giver en let måde at beregne amplifikationen ud fra standardkurvens hældning. I eksemplet i Fig 7 opnås en hældning på 3.46, og ud fra dette fås derfor amplifikationen: A.46) = 10 (-1/-3 = 1.94, og effektiviteten E = =0.94. Korrelationskoefficienten (r 2 ) for kurven er En værdi for r 2 nær 1.0 er et mål for et godt fit af data til linien. Links: Methods for determination of QPCR Efficiency: Primer design tools: QPCR internet links MX Taq Copenhagen oligonucleotid syntese 36

37 Øvelse 2: Real Time PCR SPECIFIKKE FORMÅL MED ØVELSEN Forsøg 1: 1) At isolere genomisk DNA (gdna) fra fuldblod 2) At undersøge beskrevne polymorfier (på gdna isoleret fra blod) ved brug af real time PCR Forsøg 2 og 3: 1) At benytte real time PCR til at undersøge mrna ekspression 2) Konstruere standardkurve fra fortyndingsrække (relativ) og benytte denne til at beregne mrna indholdet i ukendte prøver. 3) Sammenligne og vurdere anvendelese af SYBRGreen og Taqman prober til bestemmelse af mrna ekspression. INGREDIENSER VED ØVELSENS FORSØG Ved SNP (forsøg 1) og genekspressionsforsøgene (forsøg 2) med TaqMan prober anvendes Universal MasterMix (Applied Biosystems), der er et kit, der indeholder følgende komponenter: AmpliTaq Gold DNA polymerase AmpErase uracil-glycosylase (UNG) dntps med dutp ROX MgCl 2 Bufferkomponenter Ved SYBRGreen-forsøget (forsøg 3) der indeholder følgende komponenter: benyttes et SYBRGreen-kit (Applied Biosystems), AmpliTaq Gold DNA polymerase SYBRGreen dntps med dutp 37

38 ROX MgCl 2 Bufferkomponenter Øvelse 2: Real Time PCR Om ingredienserne: AmpliTaq Gold DNA polymerase er en hot-start polymerase, og PCR reaktionen påbegyndes med et opvarmningstrin, hvor polymerasen aktiveres. Ampli Taq Gold Polymerasen har tillige nukleaseaktivitet, der vil nedbryde TaqMan proben, når polymerasen under amplifikationen møder proben bundet til DNA template. AmpErase UNG behandling forhindrer amplifikation af fragmenter, der dannes inden selve PCR reaktionen påbegyndes; dvs opsætning af PCR reaktionen behøver ikke ske på is. UNG aktive res ved 50 C, 2min efterfulgt af inaktivering ved 95 C. For at UNG behandlingen skal give udbytte benyttes dntp s med dutp (i stedet for dttp s). ROX er pass iv reference, der gør det muligt at tage hensyn til ikke-pcr relateret variation. Primere og prober til at bestemme Myostatin (MSNT) mrna og Heme oxygenase 1 (HO- 1) mrna er selvdesignede forward (FP), reverse (RP) og TaqMan probe-sæt. Ved optimering er fundet at en optimal reaktion opnås ved for både myostatin og HO-1 at bruge 300nM af hver af FP og RP samt 150nM probe. GAPDH primere og probe-sættet, der anvendes, er et færdigudviklet produkt, der fås som en færdigblanding af alle 3 oligo er. SNP-assays består af FP, RP og to prober, der er et færdigudviklet produkt, der fås som en færdigblanding af alle 4 oligo er (20X opløsning; Applied Biosystems). 38

39 Øvelse 2: Real Time PCR FREMGANGSMÅDE FORSØG 1: SNP-ANALYSE (POLYMORFIER) Isolering af gdna fra fuldblod: Der udtages blod fra en armvene i albuebøjningen fra 2-4 frivillige studerende. Fra dette blod isoleres gemomisk DNA, som angivet i appendix Klargøring til PCR OBS: Nøjagtig opsætningsprotokol vil foreligge ved øvelsen, men overordnet: Hvert hold får udleveret 0.5 ml rør Strip med 8 PCR rør og låg. Mastermix (2X opløsning) Enten mix af primere og prober til detektion af bestemt polymorfi i brain derived neutrophic factor (BDNF) eller i myostatingenet (begge som 20X opløsninger). Nuklease-frit vand PCR-kørsel PCR maskinen gøres klar til en almindelig PCR reaktion, hvor det er vigtigt at vælge både FAM, HEX og ROX. (HEX har samme fluorescens-egenskaber som VIC, som er reporter dye på den ene probe). Prøverne placeres i PCR maskinen, og kørslen startes. Temperaturprofil for PCR-reaktionen: Der startes med 2 min ved 50 C (til aktivering af UNG) efterfulgt af 10 min ved 95 C til aktivering af Taq-polymerasen. Derefter er TaqMan reactionen kun et 2-trins program: 40 cykler med 15 sec 95 C min 60 C. Når denne kørsel er forbi, køres endnu en reaktion umiddelbart bagefter, mens prøverne bevares i maskinen. Der vælges Allelic discrimination. Dette er en end-point måling og herved vil programmet analysere prøverne og vurdere hvilken allel, der er i de pågældende prøver. 39

40 Øvelse 2: Real Time PCR FORSØG 2: GENEKSPRESSION: MYOSTATIN OG HO-1 MRNA BESTEMMELSE VED BRUG AF TAQMAN PROBER Til forsøg 2 og 3 udleveres cdna prøver til analyserne. Præparation af total RNA fra human skeletmuskel og revers transskription af mrna til cdna er udført på forhånd (se appendix) og cdna prøver udleveres til hvert hold. Nøjagtig opsætningsprotokol vil foreligge ved øvelsen, men overordnet: Hvert hold bestemmer myostatin eller HO-1 på 5 prøver fra fortyndningsrække samt fra 2 ukendte prøver. Prøverne fra fortyndingsrækken bruges til at konstruere en standardkurve, hvorfra indholdet af myostatin kan bestemmes i de to ukendte prøver. Vi sørger for bestemmelse af GAPDH mrna på jeres prøver, således at I får disse resultater udleveret Hvert hold får udleveret 0.5 ml rør Strips hver med 8 PCR rør og låg (der køres ud over de 7 prøver også NTC (notemplate control) med ved hvert gen. MasterMix (2X opløsning) Myostatin eller HO-1 forward og reverse primers (begge som 5µM) Myostatin eller HO-1 TaqMan probe, 5 FAM mærket (som 5µM) Nuclease-frit vand PCR-kørsel PCR computeren gøres klar til en almindelig PCR reaktion, hvor der vælges FAM for myostatin og HO-1 samt ROX for begge. Prøverne placeres i PCR maskinen og kørslen startes. Temperaturprofil for PCR-reaktionen: Først en cyklus på 2 min ved 50 C (til aktivering af UNG) efterfulgt af 10 min ved 95ºC til aktivering af Taq-polymerasen. Derefter er TaqMan reactionen kun et 2-trins program: 40 cykler: 15 sec 95 C min 60 C. 40

41 Øvelse 2: Real Time PCR FORSØG 3: GENEKSPRESSION: MYOSTATIN OG HO-1 MRNA BESTEMMELSE VED BRUG AF SYBRGREEN Til forsøg 2 og 3 udleveres cdna prøver til analyserne. Præparation af total RNA fra human skeletmuskel og revers transskription af mrna til cdna er udført på forhånd (se appendix) og cdna prøver udleveres til hvert hold. Nøjagtig opsætningsprotokol vil foreligge ved øvelsen, men overordnet: Hvert hold bestemmer samme gen (myostatin eller HO-1) på de 5 prøver fra fortyndningsrækken samt de 2 ukendte prøver som i TaqMan-probe-delen. Prøverne fra fortyndingsrækken bruges til at konstruere en standardkurve, hvorfra indholdet af myostatin eller HO-1 bestemmes i de to ukendte prøver. Hvert hold får udleveret 0.5 ml rør Strips hver med 8 PCR rør og låg (der køres ud over de 7 prøver også NTC (notemplate control) med ved hvert gen. SYBRGreen MasterMix (2X opløsning) Myostatin eller HO-1 forward og reverse primers (begge som 5µM) Nuclease-frit vand PCR-kørsel PCR maskinen gøres klar til en almindelig PCR reaktion, hvor der vælges FAM (hvilket her benyttes for SYBRGreen) for både myostatin og HO-1 samt ROX for begge. Prøverne placeres i PCR maskinen og kørslen startes. Temperaturprofil for PCR reaktion i SYBR-Green forsøget. Der startes med 1 cyklus på 10 min ved 95 o C for at aktivere hot start Taq polymerasen. Derefter 40 cykler med dissociation ved 95 o C i 15 sec, annealing og elongering 1 min ved 60 o C. Derefter 1 cyklus ved 95 o C i 1min efterfulgt af 41 cykler startende med 55 o C i 30 sec og derefter stigende med 1 o C per cyklus til 96 o C. På fig 8 nedenfor ses en lignende temperaturprofil (dog med ekstra trin). 41

42 Øvelse 2: Real Time PCR Fig. 8 42

43 Øvelse 2: Real Time PCR BEHANDLING AF RESULTATER OG RAPPORT 1) SNP-analyse forsøg 1 Angiv resultatet af SNP analysen (allelic distrimination) for de 7 analyserede gdnaprøver (homozygot/heterozygot hvilken allel) for hver af de to gener/polymorfier. Angiv både resultaterne fra jeres egen opsætning (den ene polymorfi), og resultater fra et andet hold, der har undersøgt den anden polymorfi. 2) Genekspression forsøg 2 og 3 der beregnes for begge fremgangsmåder Beregn gennemsnits Ct af 3 bestemmelser for hver prøve i fortyndingsrækken ved at bruge jeres egen række samt to andre holds rækker (herved opnår I alle triplikatbestemmelser). Beregn også gennemsnits Ct fra 3 ens bestemmelser for hver prøve i fortyndingsrækken for det andet gen (myostatin eller HO-I), som I ikke selv satte over. Ud fra gennemsnits Ct-værdierne konstrueres en standardkurve for henholdsvis myostatin og HO-I. Formlen for regressionslinien angives for hver af dem. Vi udleverer GAPDH standardkurve-resultater og GAPDH resultatet på de ukendte prøver. Beregn gennemsnits Ct fra triplikaterne for de 4 ukendte prøver kørt med henholdsvis myostatin, HO-1 og GAPDH. Baseret på hver af de 3 standardkurver beregnes myostatin, HO-1 og GAPDH mrna indholdet i de fire ukendte prøver (indsætter gennemsnits Ct og beregner mrna indhold). Ratio: myostatin/gapdh og HO-1/GAPDH bestemmes for hver af de fire ukendte prøver. Effekten af såvel styrkearbejde som udholdenhedsarbejde på myostatin og HO-1 mrna indholdet beregnes og angives som fold ændring. Sammenlign resultaterne på disse prøver fra forsøg 2 og forsøg 3. 3) Yderligere spørgsmål, der ønskes besvaret i rapporten 1) Angiv 3 fordele ved real time PCR frem for traditionel PCR (hvor PCR produktet visualiseres på efterfølgende gel) og 1 ulempe ved real time PCR. 2) Angiv laboratorie-procedurer, hvor traditionel PCR er mere egnet end real time PCR. 43

44 Øvelse 3: 2-hybrid analyse ØVELSE 3: 2-HYBRID-ANALYSE Især efter genomerne af flere eukaryote organismer, herunder bagegær (Saccharomyces cerevisiae) og spaltegær (Schizosaccharomyces pombe), samt mere udviklede organismer såsom fluen (Drosophila melanogaster) og mennesket, er blevet sekventeret, er mange molekylærbiologers interesse ikke længere fokuseret på identifikationen af nye gener, men mere på forståelsen af genprodukternes (proteinernes) funktion og regulering. Mange molekylærbiologiske værktøjer er blevet udviklet med henblik på at karakterisere et proteins betydning for cellen. F.eks. kan man forsøge at slette det gen, man studerer i en organisme og sammenligne en sådan knockout mutants phenotype med en vildtype. Alternativt kan man forsøge at overudtrykke proteinet for at se om en øget mængde af proteinet bevirker, at cellerne eventuelt mister eller erhverver bestemte egenskaber. Resultaterne af sådanne forsøg kan dog ofte være svære at fortolke, da den observerede phenotype ikke behøver være en direkte og specifik konsekvens af det defekte eller overudtrykte gen. Vil man i stedet forstå proteinets direkte molekylære virkningsmekanisme, må der derfor ofte tages andre metoder i brug. En måde hvorpå man kan få en ide om proteinets funktion er via guilt by association hypotesen (Oliver, 2000), som siger, at hvis to proteiner bindes til hinanden, er de sandsynligvis involveret i samme cellulære funktion. Dvs. ved at undersøge om et protein fysisk binder sig til et andet protein, hvis funktion i forvejen kendes, kan man heraf udlede det første proteins funktion. Finder man f.eks. at et protein X binder sig til actin, da fungerer X muligvis som en komponent i actin-cytoskelettet. Kendskabet til interaktionen mellem X og actin giver altså herved molekylærbiologen et praj om X s funktion, og giver altså også en ide om hvilke efterfølgende teknikker der skal anvendes for mere detaljeret at belyse funktionen af X. En meget anvendt og følsom metode til opdagelsen af nye protein-protein interaktioner er den såkaldte yeast 2-hybrid screen (i det efterfølgende forkortet Y2H). Som antydet af navnet er der tale om en screen for interaktion mellem to hybrid/fusions-proteiner. Nedenfor forklares princippet bag Y2H teknikken kort, men den findes også beskrevet i lærebogens figur (Weaver, 2004). Y2H teknikken udnytter, at en transkriptionsaktivator normalt består af et DNAdisse to domæner ikke bindingsdomæne (BD) og et aktiveringsdomæne (AD), og at overlapper funktionelt. For at undersøge om et protein X binder til et protein Y, kan man derfor udtrykke fusionsproteiner af X og Y fusioneret med hver sit transkriptionsaktivatordomæne (BD eller AD). Hvis X-BD og Y-AD fusionsproteinerne bindes til hinanden inde i 44

45 Øvelse 3: 2-hybrid analyse cellen bringes AD og BD i nærheden af hinanden og transskriptionen af et rapportergen vil kunne aktiveres og måles. Fusionerer man i stedet et cdna bibliotek til AD vil man også kunne bruge Y2H til at fiske efter ukendte proteiner der interagerer med X. Her kaldes X ofte for bait (madding), som bruges til at fange sit prey (bytte) Y. I bagegær har man i flere laboratorier lavet omfattende sådanne Y2H screeninger hvor alle åbne læserammer (ORFs) er blevet screenet overfor hinanden (Uetz et al., 2000; Ito et al., 2001). Dog er screeninger af sådanne størrelser selvsagt ikke helt præcise og de publicerede data er derfor både mangelfulde og indeholder sikkert også mange falske positive resultater. I denne øvelse vil vi forsøge at påvise en interaktion mellem proteinerne Bag1 og Hsp70 vha. Y2H. Bag1 er et forholdsvis ukendt protein, som er opreguleret i visse tumorer og er involveret i apoptose. Det blev for nylig fundet, at Bag1 s molekylære funktion sikkert er forbundet med chaperoner. Chaperoner, herunder gruppen af 70 kda heat-shock proteiner (Hsp70), er vigtige intracellulære ATPaser, som bruger energi fra ATP hydrolyse til at hjælpe proteiner med at foldes, således at de opnår en funktionel 3-dimensionel struktur. For at undersøge om Bag1 binder sig fysisk til Hsp70 er en række plasmider (Tabel 1) blevet fremstillet. Tabel 1 Plasmid # cdna Vektor 1 Bag1 pas2-1 2 Bag1 pact2 3 Hsp70 pas2-1 4 Hsp70 pact2 Bait-vektoren er pas2-1 som indeholder Gal4 DNA-bindingsdomænet (BD) hvortil ens bait fusioneres. Endvidere indeholder plasmidet Amp r (bla) genet til selektion i E. coli og TRP1 til selektion i gær. pact2 er prey-vektoren, der indeholder Gal4 aktiveringsdomænet (AD) hvortil ens prey (eller cdna-bibliotek) fusioneres. Endvidere indeholder plasmidet Amp r (bla) genet til selektion i E. coli og LEU2 til selektion i gær. Plasmidkortene for pas2-1 og pact2 er vist nedenfor (Fig.1). 45

46 Øvelse 3: 2-hybrid analyse Figur 1 Figuren viser plasmidkort for pas2-1 og pact2 plasmiderne til Y2H. Se teksten for detaljer. Figur 2 Figuren viser princippet bag øvelsen. Hvis BD-Bag1 binder Hsp70-AD (transformation med plasmiderne 1 & 4), skulle denne interaktion bevirke transkription af reporter genet HIS3, hvilket bevirker at cellerne selv kan lave histidin og derfor kan gro i fravær af histidin. Som negativ kontrol bruges BD-Bag1 og Bag1-AD (transformation med plasmiderne 1 & 2), da det vides fra andre forsøg, at disse proteiner ikke kan interagere. Man vil i dette tilfælde derfor ikke forvente en transkription af HIS3 genet og derfor heller ingen kolonier på medie uden histidin. Når plasmiderne 1 & 4 eller 2 & 3 transformeres ind i bagegærstammen Y190 (gal4, gal80, his3, trp1-901, ade2-101, ura3-52, leu , met -, URA3::GAL lacz, LYS2::GAL HIS3, cyh r, MATa), udtrykker de Bag1- og Hsp70-fusionsproteinerne. Hvis Bag1 bindes til Hsp70 vil transkriptionen af rapportergenet HIS3 aktiveres (Fig.2), og kolonierne kan derfor gro i fravær af histidin og i tilstedeværelse af 3-aminotriazol (3AT), 46

47 Øvelse 3: 2-hybrid analyse en histidinanalog som hæmmer HIS3 genproduktet. Som negativ kontrol bruger vi Bag1 som både bait og prey (plasmid 1 & 2), da det er kendt fra andre forsøg, at Bag1 ikke kan dimerisere (binde sig selv). REFERENCER Oliver, S. (2000) Guilt-by-association goes global. Nature 403, Ito, T. et al. (2001) A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, Uetz, P. et al. (2000) A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature 403, Weaver, R.F. (2004) Molecular Biology. 3rd edition, McGraw-Hill Publishing, N. Y. 47

48 Øvelse 3: 2-hybrid analyse 2-HYBRID-ANALYSE, EN KORT OVERSIGT Mandag Y190-stammen transformeres med plasmiderne, cellerne plades ud på SCAH og SCA3AT medie og inkuberes ved 32 C. Onsdag Pladerne kontrolleres for kolonier, men det er formentlig for tidligt at aflæse data. Spørgsmålene til rapporten diskuteres. Efterfølgende mandag Pladerne kontrolleres for kolonier og data noteres. 48

49 Øvelse 3: 2-hybrid analyse 2-HYBRID ANALYSE, DETALJERET PLAN 1) Mandag OD 600nm af Y190 kulturen måles og resultatet noteres. 2) Høst 50 ml Y190 ved centrifugering (3000 rpm, 2 minutter). 3) Vask cellerne ved centrifugering (3000 rpm, 2 minutter) med 20 ml vand. 4) Vask cellerne ved centrifugering (3000 rpm, 2 minutter) med 20 ml LiAcTE. 5) Resuspender cellerne i 1 ml LiAcTE. 6) Mærk 3 Eppendorf rør hhv. A, B og C. 7) Tilsæt 3 μl af hvert plasmid til rørene i henhold til skemaet nedenfor. A 3 μl pas2-1-bag1 3 μl pact2-bag1 B 3 μl pas2-1-hsp70 3 μl pact2-bag1 C 3 μl pas2-1-bag1 3 μl pact2-hsp70 8) Tilsæt 50 μl celler til hvert rør og vortex. 9) Tilsæt 300 μl 40 % PEG-4000/LiAcTE og vortex. 10) Inkuber i 30 minutter ved 30 C, og derefter i 20 minutter ved 42 C. 11) Centrifuger cellerne (i en bordcentrifuge, 5000 rpm, 2 minutter). 12) Fjern al supernatant og resuspender pellet i 0.5 ml YPD. 13) Inkuber i 1 time ved 30 C. 14) Mærk 3 plader SCAH og 3 plader SCA3AT med holdnr. og hhv. A, B og C. 15) 200 μl af hver transformation udplades på de mærkede SCAH og SCA3AT plader, som herefter inkuberes v. 32 C indtil næste øvelsesgang. 49

50 Øvelse 3: 2-hybrid analyse Onsdag eller efterfølgende mandag 1) Tæl antallet af kolonier på hver af de 6 plader og noter resultaterne. Hvis der er rigtig mange kolonier på en plade behøver man ikke at tælle dem, men blot notere mange i skemaet. Resultaterne kan indføres i skemaet nedenfor: Antal kolonier på Transformation pas2-1 pact2 SCAH SCA3AT A Bag1 Bag1 B Hsp70 Bag1 C Bag1 Hsp70 50

51 Øvelse 3: 2-hybrid analyse 2-HYBRID-ANALYSE, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT A: Mediet SCA3AT indeholder ikke histidin. Hvorfor? B: Mediet SCA3AT indeholder 3-aminotriazol. Hvorfor? C: Diskuter fordele og ulemper ved 2-hybridsscreening i forhold til andre metoder såsom pull-down analyse? D: Kunne man forestille sig en situation, hvor man har kolonier på SCA3AT for transformati on B, men ikke for transfo rmation C (eller omvendt)? E: Forklar hvorfor de anvendte medier ikke indeholder tryptophan og leucin. F: Forklar hvorfor de anvendte medier indeholder adenin. G: Gærstammen Y190 er cyh r, hvilket betyder at den er resistent overfor cycloheximid, mens pas2-1 plasmidet udtrykker genet CYH2 som gør Y190 transformeret med pas2-1 sensitiv for cycloheximid. Hvad ville der ske hvis man dyrkede en Y190 transformeret med pas2-1-bag1 og pact2-hsp70 i SCAH tilsat tryptophan og cycloheximid? Hvorfor ville evt. man gøre dette? 51

52 Øvelse 4: Pull Down Analyse ØVELSE 4: PULL-DOWN-ANALYSE Denne øvelse er en fortsættelse af 2-hybridøvelsen med Bag1 og Hsp70. Desværre giver Y2H-analyse ofte falske positive, hvorfor man er nødt til at verificere sine Y2H data ved anvendelse af mindst én anden teknik. En meget almindelig metode til at vise protein- s. 122 (Weaver, protein interaktioner er co-immunprecipitering som beskrevet i lærebogen 2004). Her anvendes et specifikt antistof rettet mod et protein X til at precipitere X fra et celleekst rakt. Herefter kan et protein Y, som bindes til X, detekteres ved westernblotting i precipitatet, da dette co-precipiterer med X. Denne metode kræver dog, at man har specifikke antistoffer mod X (til precipitering) og Y (til western blotting). Har man derimod ingen antistoffer til rådighed mod hverken X eller Y, kan man i stedet anvende en såkaldt pull-down -analyse, hvor man i stedet for antistoffer udnytter tilstedeværelsen af forskellige tags på X og Y. For eksempel kan X udtrykkes i E. coli som et fusionsprotein med glutathion-s-transferase (GST). GST binder specifikt og kraftigt til glutathion, og fusionsproteinet kan derfor let precipiteres med glutathion-sepharose. Hvis man inkuberer sit X-GST fusionsprotein med et ekstrakt fra bakterier udtrykkende Y fusioneret med 6 histidiner (6His-tag), kan man detekterer Y med antistoffer rettet mod 6His epitopen. Disse antistoffer er ret specifikke og kan købes kommercielt. Nedenfor er metoden skematiseret (Fig.1). Her anvendes pgex-bag1 til at udtrykke GST-Bag1 og pet6his-hsp70 til at udtrykke 6His-Hsp70. Her er Bag1 cdna henholdsvis Hsp70 cdna indsat i multiple clonings site (MCS) i pgex-kg og pet6his plasmiderne. Plasmidkortene er vist nedenfor (Fig.2). Som negativ kontrol anvendes pgex-kg alene, som kun udtrykker GST-taggen. 52

53 Øvelse 4: Pull Down Analyse Figur 5 Figuren viser princippet bag en pull-down analyse for proteinerne X og Y. Hvis GST-X bindes til 6His-Y, vil 6His-Y kunne detekteres i glutathion Sepharose-precipitatet på et western blot. 53

54 Øvelse 4: Pull Down Analyse Figur 6: Kort over plasmiderne pgex-kg og pet6his. Begge plasmider indeholder bla genet, der bibringer transformerede E. coli stammer resistens over for ampicillin. REFERENCER Weaver, R.F. (2004) Molecular Biology. 3rd edition, McGraw-Hill Publishing, N. Y. 54

55 Øvelse 4: Pull Down Analyse PULL-DOW- ANALYSE, KORT OVERSIGT Dag 1: Kulturerne med E. coli BL21 transformeret med henholdsvis pgex-kg, pgex- KG-Bag1 eller pet6his-hsp70 høstes. Cellerne lyseres ved sonikering. Den opløselige fraktion isoleres ved centrifugering. Ekstrakterne blandes og GST og GST-Bag1 precipiteres med glutathion-sepharose. Precipitaterne separeres ved 12 % SDS-PAGE, hvorefter proteinerne blottes over på nitrocellulose-membran. Membranen blokeres i mælk og inkuberes med primært antistof (mus anti-6his) til dag 2. Dag 2: Membranen inkuberes med sekundært antistof (peroxidase-konjugeret kanin antimuse immunglobulin), blottet fremkaldes og resultaterne diskuteres. 55

56 Øvelse 4: Pull Down Analyse PULL-DOWN-ANALYSE, DETALJERET PLAN Dag 1: 1) Hvert hold høster en 100 ml kultur af E. coli BL21 pgex-kg og pgex-kg-bag1 ved centrifugering i Sorval GSA rotor (15 min, 5000 rpm). Kulturen med E. coli BL21 pet6his-hsp70 høstes af instruktor. 2) Supernatanten overføres til dertil indrettede affaldskolber, mens cellepellet resuspenderes i 5 ml GST-bindingsbuffer (25 mm Tris/HCl ph 7.4, 100 mm NaCl, 5 mm EDTA, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100). 3) Cellerne sonikeres på is 3 gange i 30 sekunder med 30 sekunders pause mellem hver. 4) Ekstraktet centrifugeres i Sorval SS34 rotor (30 min, rpm). 5) Supernatanten (ca. 5 ml) overføres til et 15 ml Nunc rør og tilsættes 5 ml centrifugeret E. coli BL21 pet6his-hsp70 ekstrakt. 6) Til ekstraktblandingen sættes 40 μl 50 % glutathion-sepharose slurry. 7) Der inkuberes på blodvender i 1 time ved 4 C. 8) I ventetiden støber holdene to og to en 12 % acrylamidgel (se vejledningen nedenfor). 9) Efter inkubering ved 4 C centrifugeres der i Eppendorf bordcentrifuge v rpm i 2 minutter og supernatanten aspireres forsigtigt uden at forstyrre pellet. 10) Til pellet sættes der 15 ml GST-bindingsbuffer. 11) Vortex Sepharosen og gentag trin 9 og 10 mindst 2 gange til. 12) Til sidst resuspenderes Sepharose-pelletten i 40 μl 2x SDS-sample buffer. 13) Prøverne koges herefter i 2 minutter, hvorefter de sættes på SDS-gelen. 56

57 Øvelse 4: Pull Down Analyse 14) Gelen køres ved 200 V i 45 minutter, hvorefter den overføres til nitrocellulose ved westernblotting ved 100 mamp/gel i 40 minutter. 15) Nitrocellulose-membranen inkuberes i 5 % tørmælk/tbst i 15 minutter. 16) Membranen vaskes kort i TBST, hvorefter der tilsættes primært antistof (mus anti- 6His) fortyndet 1:1000 i TBST. 17) Der inkuberes ved 4 C indtil næste øvelsesgang. Dag 3: 1) Membranen vaskes 3 x 2 minutter med TBST, hvorefter der tilsættes sekundært antistof (HRP-konjugeret kanin anti-muse Ig) fortyndet 1:1000 i TBST. 2) Der inkuberes ved 4 C i 30 minutter. 3) Membranen vaskes 3 x 2 minutter med TBST. 4) Blottet fremkaldes ved inkubering i peroxidase substrat (Stain-opløsning) indtil båndene er tydelige, hvorefter der inkuberes i 5 minutter med PostStain-opløsning. 5) Blottet tørres forsigtigt mellem 2 stykker køkkenrulle. 57

58 Øvelse 4: Pull Down Analyse PULL-DOWN-ANALYSE, SDS-PAGE & WESTERNBLOT 1) Støbeapparatet samles iflg. instruktorens vejledning. 2) Acrylamid er carcinogent, så husk handsker og fjern evt. spild med køkkenrulle øjeblikkeligt. 3) I et 50-mL Nunc-rør blandes separationsgelen iflg. skemaet nedenfor. 12 % acrylamid separationsgel (10 ml): H 2 O 3.3 ml 30 % acrylamid/bis-acrylamid 4.0 ml 4 x separations buffer, ph % SDS 2.5 ml 100 μl 10 % APS 100 μl 4) Under instruktors opsyn tilsættes 10 μl TEMED, der blandes forsigtigt og gel- opløsningen tilsættes straks til støbeformen. 5) Gelen overhældes forsigtigt med 1 ml H 2 O-mættet 1-butanol. 6) Når gelen er polymeriseret, hældes butanolen fra og stackinggelen blandes i et 50- ml Nunc-rør iflg. skemaet nedenfor. 4 % acrylamid stackinggel (10 ml): H 2 O 5.9 ml 30 % acrylamid/bis-acrylamid 1.4 ml 4 x stacking buffer, ph ml 10 % SDS 100 μl 10 % APS 100 μl 7) Under instruktors opsyn tilsættes 10 μl TEMED, der blandes forsigtigt og gel opløsningen sættes straks til den polymeriserede separationsgel i støbeformen. 8) Kammen føres ned i stackinggelen. 58

59 Øvelse 4: Pull Down Analyse 9) Når gelen er polymeriseret, fjernes kammen og gelen føres fra støbeapparatet til elektroforeseapparatet under instruktors vejledning. 10) Elektroforeseapparatet fyldes med elektrodebuffer. 11) Prøven påføres og separeres ved 200V i 45 minutter. 12) Efter endt elektroforese overføres gelen til nitrocellulose ved westernblotting. 13) Alt det nedenstående er fugtet i transferbuffer. Nederst lægges 8 stykker 3MM filtrerpapir, herefter et stykke nitrocellulose, så gelen, og endelig 8 stykker 3MM filtrerpapir. Undgå luftblærer mellem f iltrerpapiret, nitrocellulosen og gelen. 14) Der blottes ved 100 mamp/gel i 40 minutter. 59

60 Øvelse 4: Pull Down Analyse PULL-DOWN-ANALYSE, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT A: Redegør for båndene på jeres western blot. Der burde findes et bånd ved ca. 70 kda, hvilket protein svarer dette bånd til? B: Forklar hvorfor 70 kda båndet kun burde findes i banen med GST-Bag1. C: Hvis man fandt 70 kda båndet i både banen med GST-Bag1 og i banen med GST, hvad skulle man så ændre i fremgangsmåden en anden gang? D: Stemmer jeres pull-down data overens med resultaterne fra 2-hybrid analysen? Hvis ikke, hvorfor? E: Af pgex-kg plasmidkortet fremgår det, at der er indsat et site for proteasen thrombin mellem GST-taggen og MCS. Vi bruger det ikke selv ved øvelsen, men hvad kunne thrombinsitet tænkes brugt til? F: pgex-kg plasmidet er designet, så det konstitutivt udtrykker laci genet, hvorfor? G: Udover immunprecipitering, pull-down og 2-hybrid-analyse, hvilke andre metoder findes der til at påvise protein-protein interaktioner med? 60

61 Øvelse 5: GFP fusioner ØVELSE 5: SUBCELLULÆR LOKALISERING AF GFP-FUSIONS-PROTEINER Fusionering af proteiner til forskellige tags/epitoper hvortil specifikke antistoffer eller andre komponenter binder, er meget anvendt i forskellige funktionelle studier. Ved pull-down øvelsen anvendes der f.eks. en GST-tag (til præcipitering) og en 6His-tag (til detektion ved western blotting), og ved 2-hybrid-analysen anvendes der fusionsproteiner med forskellige dele af Gal4. Selvom man let kan forestille sig, at fusionering af et protein til et andet ofte vil ødelægge deres struktur og funktion, har dette dog vist sig kun relativt sjældent at være tilfældet, og teknikken bruges derfor ofte, da det for forskeren er tidsbesparende at slippe for f.eks. at fremstille antistoffer. Denne øvelses formål er at illustrere brugbarheden af en anden protein-fusions partner kaldet green fluorescent protein eller GFP. Det fluorescerende protein GFP er oprindeligt isoleret fra en vandmand, Aequorea victoria, som anvender proteinet til at skifte bølgelængden af det lys den udsender fra sine lysorganer, der sidder i kanten af dens klokke. GFP er et tøn deformet protein (Fig. 1), som er meget stabilt, og som ikke interagerer med nogen kendte proteiner. Den fluorogene gruppe dannes ved en spontan oxidationsproces af nogle aminosyrerester inde i tønden, og er derfor beskyttet fra proteinets omgivelser. Figur 1 Den 3-dimensionelle struktur af GFP. GFP kan som de fleste andre tags anvendes til immunpræcipitering og western blotting med GFP-specifikke antistoffer, men er særlig brugbar til at studere transporten af proteiner (Presley, 2005) i levende celler, hvis det vel og mærke ikke interfererer med dette 61

62 Øvelse 5: GFP fusioner proteins normale funktion. Lokaliseringen af GFP kan følges i et fluorescens-mikroskop, og der findes i dag en række GFP-varianter som har andre farver f.eks. RFP (red fluorescent protein) og CFP (cyan fluorescent protein), hvilket muliggør, at transporten af flere forskellige proteiner i den samme celle kan følges samtidigt. Ved denne øvelse vil vi studere lokalisering af en transkriptionsfaktor, Pap1, i gæren Schizosaccharomyces pombe. Pap1 er S. pombe s udgave af den humane transkriptionsfaktor AP-1, som er en homo- eller heterodimer af Zn-finger proteinerne c- Fos og c-jun. Pap1 findes dog kun som en homodimer. I gær spiller Pap1 en afgørende rolle i forbindelse med cellens stressrespons (Toone et al., 1998). I naturen bliver gærceller ofte udsat for forskellige mere eller mindre stressfulde betingelser i form af oxidation, salt, UV og forskellige giftige forbindelser mv. Hvis gæren f. eks. støder på et permeabelt giftstof, vil den derfor for at overleve initiere et stressrespons. En række såkaldte MAP kinaser aktiveres (Wis1 og Sty1) og Pap1 phosphoryleres og bevæger sig nu fra cytoplasmaet ind i kernen. Denne signaltransduktionsvej ligner meget den som varetages af den såkaldte JNK-pathway i mammale celler. I kernemembranen sidder der en eksportfaktor (Crm1) som konstant pumper Pap1 ud af kernen, men denne proces hæmmes også ved stressresponset (Toone et al., 1998). Inde i kernen inducerer Pap1 så syntesen af en række stressresponsgener, herunder et transportprotein kaldet Bfr1. Dette transportprotein translateres ind i ER, som i gær ligger rundt om cellekernen, og eksporteres herefter til plasmamembranen, hvor det så varetager en efflux af giftstoffet. Bfr1-transporteren er ret uspecifik, og er derfor i stand til at holde cytoplasmaet fri for en række forskellige giftstoffer. Dette stressrespons gør derfor ofte celler resistente over for en række forskellige giftstoffer, en fænotype som kaldes for multidrug resistance (MDR). MDR udgør et aktivt forskningsområde, da det netop er den slags processer som gør kræftceller resistente over for forskellige kemoterapeutika. En oversigt over signaltransduktionsvejen er vist nedenfor (Fig. 2). Ved øvelsen udleveres der en vild type (leu2 - ) S. pombe stamme, som er transformeret med plasmidet prep1-pap1gfp (Fig. 3). Vi vil så forsøge at stresse cellerne ved at inkubere dem i 1 time med en lav koncentration af H 2 O 2, hvilket leder til et stressrespons, som dog via en lidt anden pathway end den, der er beskrevet i figuren (Fig. 2) leder til en akkumulering af den GFP-taggede Pap1 i cellekernen, hvilket vi observerer i et fluorescens-mikroskop. Pap1 aktiverer også transkriptionen af en thioredoxin (Trx1). Thioredoxiner er en gruppe proteiner som reducerer oxiderede proteiner, herunder proteiner som er blevet oxideret ved H 2 O 2 behandlingen, og derfor beskytter cellen mod 62

63 oxidativt stress. Øvelse 5: GFP fusioner Figur 2 Signaltransduktionsvejen for stressresponset i S. pombe. Se teksten for detaljer. Figur 3 Plasmidkort over prep1-pap1gfp. P NMT1, en thiamin represserbar promotor; LEU2, markør for selektion i S. pombe; ARS, autosomal replicating sequence; ori, origin of replication for E. coli; bla, β-lactamase; GFP, green fluorescent protein. REFERENCER Presley, J. F. (2005) Imaging the secretory pathway: the past and future impact of live cell optical techniques. Biochim. Biophys. Acta. 1744, Toone, W. M. et al. (1998) Regulation of the fission yeast transcription factor Pap1 by oxidative stress: requirement for the nuclear export factor Crm1 (Exportin) and the stressactivated MAP kinase Sty1/Spc1. Genes Dev. 12,

64 Øvelse 5: GFP fusioner SUBCELLULÆR LOKALISERING, EN KORT OVERSIGT Onsdag Cellerne inkuberes med H 2 O 2 og Pap1GFP-lokaliseringen analyseres ved mikroskopi. SUBCELLULÆR LOKALISERING AF GFP-FUSIONSPROTEINER, DETALJERET PLAN Dag 1: 1) En 20 ml kultur af S. pombe transformeret med prep1-pap1gfp fordeles på 2 rør med 10 ml i hver. 2) Det ene rør tilsættes H 2 O 2 til 0.4 mm og rørene inkuberes i 1 time v. 30 ºC. 3) Cellerne vaskes ved centrifugering i 20 ml vand. 4) Cellerne resuspenderes i 1 ml vand og en dråbe overføres til et objektglas. 5) Man lader dråben lufttørre, hvorefter der tilsættes 1 dråbe monteringsmedie. 6) Der sættes et dækglas på, og man holder nu objektglassene i mørke indtil de skal analyseres i mikroskopet. SUBCELLULÆR LOKALISERING, SPØRGSMÅL TIL RAPPORT a) Hvordan kunne man undersøge, om GFP-taggen påvirker Pap1-GFP s funktion? b) Hvordan kunne man undersøge, om Bfr1 eller Trx1 var induceret efter en times inkubation med H 2 O 2? c) Hvorfor tror du Bfr1-syntesen er underlagt transkriptionel kontrol? d) Hvorfor var alle cellerne ikke lige grønne? og hvordan kunne man sikre sig at de blev det? e) Hvad ville fordelen være ved at lave det samme forsøg i en pap1δ mutant i stedet for i en vildtype stamme? f) Ville du forvente, at en sty1δ mutant er følsom over for giftstof-induceret stress? g) Ville du forvente, at en crm1 mutant er følsom over for giftstof-induceret stress? h) Ville du forvente, at en sty1δcrm1 dobbelmutant var følsom eller resistent over for giftstof-induceret stress? 64

65 Øvelse 6: Heterolog ekspression ØVELSE 6: HETEROLOG EKSPRESSION AF NA,K- PUMPEN I SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Heterolog genexpression (expression af gener fra en organisme/celletype i anden organisme/celletype) er et vigtigt område af molekylær biologien såvel i forbindelse med anvendt forskning som grundforskning. Har vi i laboratoriet isoleret en cdna klon for et af vore favorit gener vil det næste logiske trin være at verificere at cdna'et rent faktisk koder for alle de funktioner vores tilhørende favorit protein besidder. Dette forudsætter enten at det klonede cdna kan udtrykkes i en så stor mængde at proteinproduktet kan karakteriseres funktionelt eller, hvis expression af genet under bestemte omstændigheder er essentielt, at det kan udtrykkes i en værtsstamme der er deleteret for det pågældende gen. Den første situation vil specielt gøre sig gældende i forbindelse med protein engineering arbejde, hvor man ønsker en dybtegående funktionel karakterisering af diverse mutanter. Den anden situation vil specielt gøre sig gældende hvor man kun ønsker at sikre sig at det klonede cdna kan komplementere en tilsvarende deletionsmutant. Industriel heterolog genexpression handler naturligvis om at kunne udtrykke så meget biologisk aktivt protein per celle så billigt som muligt og eventuelt med de rigtige posttranslationelle modifikationer. Det er klart at kravet til posttranslationelle modifikationer varierer alt efter om det er farmaka- eller vaskepulverenzymer der produceres. I forbindelse med heterolog genexpression skal man beslutte, hvilken værtsorganisme man ønsker at anvende og hvilke expressionsvektorer man ønsker at bruge. Med hensyn til valget af værtsorganisme er det i høj grad betinget af om favorit genet stammer fra en prokaryot eller en eukaryot og om hvorvidt proteinet ønskes fremstillet med de korrekte posttranslationelle modifikationer (glykosylering, lipid, ph osphat etc.) eller blot som et "nøgent" protein. 65

66 Øvelse 6: Heterolog ekspression Funktionel expression af et prokaryot gen vil man altid vælge at foretage i en prokaryot, idet prokaryoter er nemmere at arbejde med, og fordi man i princippet altid vil forsøge at udtrykke gener så tæt på den naturlige baggrund som mulig. Ofte vil man også vælge at udtrykke proteiner der ikke kræver posttranslationelle modifikationer i en prokaryot; specielt E. coli. Expression af et umodificeret protein i E. coli anvendes ofte i forbindelse med fremstilling af antistoffer mod det potentielle protein et klonet gen koder for. Ofte vil man kun have cdna klonen (og dermed også nukleotid sekvensen) til rådighed men ikke vide om genet bliver udtrykt som protein eller i hvilke typer væv proteinet findes. Fremstilling af specifikke antistoffer er her et vigtigt værktøj. I forbindelse med antistof fremstilling er det ofte ikke essentielt at immunisere med hele antigenet og heller ikke nødvendigt at bruge et nativt foldet protein. Høj expression i E. coli muliggør oprensning af antigenet, ofte som inclusionbodies. Inclusionbodies er udfældede, denaturerede proteinaggregater der i elektronmikroskopet ses som elektrontætte strukturer. I forbindelse med funktionel expression af eukaryote gener vil man ofte vælge en eukaryot værtsorganisme. Her har man så valget mellem en eukaryot mikroorganisme (diverse gær, skimmelsvampe), mammale cellelinjer og insektceller. Fordelen ved de mikrobielle eukaryoter er, at der er flere værktøjer til rådighed; både moderne molekylær biologiske metoder samt klassiske genetiske screenings- og selektionsmetoder; der kan opnås næsten ubegrænsede mængder af celler og de mikrobielle eukaryoter har de samme organeller og kan udføre de samme posttranlationelle modifikationer som de højere eukarytoter. Expression i mammale celler anvendes ofte når den native posttranslationelle modifikation er påkrævet og/eller når den biologiske effekt af expressionen skal undersøges. Det er dyrt at dyrke mammale cellekulturer, da det kræver foetalt serum og dermed dyrt og ofte praktisk umuligt at få meget materiale til rådighed. Expression i insektceller med baculovirus er meget brugt, da man ofte får et højt ekspressions niveau af opløselige proteiner. Baculovirus angriber insektlarver og er derfor effektive til at inficere insektceller i kultur (der opnås en høj 66

67 Øvelse 6: Heterolog ekspression transfektionseffektivitet). En yderligere overvejelse man skal gøre sig er, om den organisme, man vælger til expression, har nogen endogen aktivitet i forhold til den aktivitet man ønsker at undersøge. Det kan ofte forhindre en gedigen analyse af for eksempel mutanter, hvis værtsorganismen samtidig udtrykker en endogen vildtype aktivitet. I denne øvelse vil vi demonstrere nogle aspekter af heterolog genexpression ved at anvende expression af Na,K-pumpen i Saccharomyces cerevisiae som eksempel. Dette expressionssystem har vi udviklet for at kunne studere struktur/funktions sammenhænge af Na,K-pumpen ved hjælp af site directed mutagenese. Grunden til, at vi har valgt S. cerevisiae, er, at gæren ingen endogen Na,K-pumpe aktivitet har, og at den kan dyrkes i fermentorer, hvorved vi kan få store mængder mutant protein til rådighed til enzymatisk karakterisering. Der er også fremstillet mammale expressionssystemer til Na,K-pumpen, men de lider af den svaghed, at alle mammale cellelinjer udtrykker en høj endogen Na,Kpumpe aktivitet. Den transficerede aktivitet og den endogene aktivitet er af samme størelsesorden så det er umuligt at karakterisere mutanter i en sådan baggrund. Na,K-pumpen er et membran protein, der findes i plasmamembranen i alle højere eukaryoter bortset fra planter (Figur7). Pumpen er ansvarlig for generering af iongradienter over plasmamembranen. Det vil sige, at pumpen er ansvarlig for at opretholde en høj intracellulær K + koncentration og en lav intracellulær Na + koncentration. Pumpen er en heterodimer der består af en α-subunit på aminosyrer og en β-subunit på 302 aminosyrer. β-subunit er et N-glykosyleret protein. Na,K-pumpen er target site for en række glykosider, som fra ydersiden hæmmer Na,Kpumpens aktivitet ved at binde non-kovalent til pumpen med en høj affinitet (K D = 5-20 nm). Ouabain er et exempel på et sådant glykosid. Strukturen af Ouabain er vist i Figur 8. 67

68 Øvelse 6: Heterolog ekspression Figur 7: Massefordelingen af Na,K-pumpen i forhold til plasma membranen. Figuren viser at Na,K-pumpen har bindings sites for ATP, Na +, K + og ouabain O OH OH OH CH 3 O H OH CH3 O O OH OH H H H H OH OH Figur 8: Strukturen af ouabain, bestående af rhamnose, et steroidskelet og en lacton 68

69 Øvelse 6: Heterolog ekspression Til produktion af Na,K-pumpen i gær har vi konstrueret de i Figur 9 viste expressionsplasmider. De to plasmider er ens bortset fra det valgte E. coli origin. Figur 9 Kort over plasmiderne ppap1466 og ppap1666. CYC-GAL, CYC-GAL hybrid promotoren; leu2-d, en dårlig udtrykt allel af β-isopropylmalat dehydrogenase genet; 2µ, 2µ replikationsorigin; α1(pig), α1-subunit genet fra gris; β1, β1-subunit genet fra gris; URA3, orotidine 5'P decarboxylase genet; pmb1, replikationsorigin fra plasmidet pmb1; Amp R, et ampicillin resistens gen; T, gær transkriptionsterminator; p15a, replikationsorigin fra plasmidet p15a. Det vigtige i princippet bag konstruktionen af ppap1466/1666 er, at kopitallet af plasmidet er regulerbart, og at den anvendte promoter er inducerbar. Kopitallet af plasmidet reguleres efter selektionsmetoden for opretholdelse af plasmidet i gærcellerne. Selekteres gærcellerne i URA - LEU + medium er kopitallet omkring 20 per kromosomsæt medens vækst i URA - LEU - medium giver et kopital på cirka 200. Dette skyldes tilstedeværelsen af leu2-d genet, som er en dårlig udtrykt allel af β-isopropylmalat dehydrogenase genet på grund af en promoter-ned mutation. Kun gærceller, der har et højt kopital af plasmidet, er derfor i stand til at syntetisere en tilstrækkelig mængde leucin. Ved vækst i LEU - medium selekteres der derfor for celler med et højt plasmid kopital. 69

70 Øvelse 6: Heterolog ekspression Expressionen af α- og β-subunits er kontrolleret af CYC-GAL promotoren, som er en hybrid promoter mellem den konstitutive CYC (cytochrom C) promoter og den regulerede GAL10 (galaktose) promoter. Det betyder, at promotoren er underlagt de samme reguleringsmekanismer som vildtype GAL10 promotoren. Reguleringen af GAL generne i gær er vist i Figur 10 Figur 10 Galaktose regulering i gær. Generne involveret i regulering og metabolisme samt deres kromosomale lokalisation er vist. Chr.X, Kromosom X; Galaktose omdannes af GAL3 til induceren som forhindrer binding af repressoren GAL80 til GAL4. GAL4 kan derved aktivere transkription fra GAL7, GAL10, GAL1, GAL2 og MEL1. De to proteiner, GAL4p og GAL80p, spiller en essentiel rolle for regulering af galaktosegenerne i gær. GAL4p er en positiv regulator af GAL promotorerne medens GAL80p er en negativ regulator af galaktose generne. GAL4p findes i cellerne i et kopital på cirka 2 per celle, medens GAL80p findes i et kopital på omkring 100 per celle. Ved et meget højt kopital af expressionsplasmidet ppap1466 i gæren vil expressionen fra CYC-GAL promotoren være stærkt begrænset på grund af manglen på GAL4p. For at få 70

71 Øvelse 6: Heterolog ekspression den maksimale expression fra ppap1466 har vi fremstillet de i Figur 11 viste plasmider ppap1488 og ppap1621. ppap1488/1621 er E.coli plasmider, der således ikke kan replikere i gær. De indeholder en GAL10 promoter, et GAL4 gen og en for gær selektiv markør som enten er TRP1 (PR-anthranilate isomerase) eller LYS2 (α-amino adipat reduktase). Ud fra disse plasmider har vi ved homolog rekombination genereret to gærstam mer PAP1500 og PAP1640. PAP1500 indeholder plasmidet ppap1488 integreret i gærens genom ved homolog rekombination mellem plasmidets vildtype TRP1 allel og gærens egen defekte trp1 allel. PAP1640 indeholder desuden plasmidet ppap1621 integreret i gærens genom ved homolog rekombination mellem plasmidets LYS2 allel og gærens defekte lys2 allel. Tilsætning af galaktose til disse stammer vil inducere både GAL10 promotoren og CYC-GAL promotoren og demed inducere syntese af både GAL4p og Na,K-pumpens α- og β-subunits. Hermed vil der opstå en kaskade reaktion, hvor mængden af GAL4p i princippet vil stige exponentielt, og hvor syntesen af Na,K-pumpens α- og β-subunit induceres maksimalt. 71

72 Øvelse 6: Heterolog ekspression Figur 11 Kort over plasmiderne ppap1488/1621. GAL10P, GAL10 promotoren; GAL4, GAL4 genet; pmb1, pmb1 replikationsorigin; Amp R, et ampicillin resistensgen; TRP1, RP-anthranilate isomerase genet; LYS2, α-amino adipat reduktase. De to plasmider er ens bortset fra de selektive markører. 72

73 Øvelse 6: Heterolog ekspression Ofte støder man på det problem, at man ikke kan producere et mutant protein med en eller flere aminosyrer substitutioner i det ekspressionssystem man sædvanligvis anvender. Årsagen hertil kan være, at proteinet ikke kan folde til den korrekte tredimensionelle struktur og derfor bliver nedbrudt i celler af proteaser. For at redde sådanne mutantproteiner fra proteasedøden kan det ofte betales sig, at undersøge om protein akkumulationen er temperatursensitiv. Temperartursensitive mutationer er klassisk blevet karakteriseret som temperatur labile og/eller temperatur sensitive syntesemutationer. Temperatur labile proteiner, der er produceret ved den permissive temperatur, folder korrekt og er aktive ved denne temperatur. Hæves temperaturen imidlertid til den restriktive temperatur, denaturerer proteinet helt eller delvist og mister sin aktivitet. I modsætning hertil, mister temperatur-sensitive-syntese-proteiner produceret ved den permissive temperatur ikke deres aktivitet, hvis temperaturen hæves til den restriktive temperatur. I denne øvelse vil vi karakterisere expressionen af henholdsvis vild type Na,Kpumpe og en mutanter hvor en enkelt aminosyre i et konserveret område er ændret. Vi vil undersøge følgende parametres indflydelse på ekspressionen: 1) Temperaturen: Ekspressionen vil foregå ved 15 o C henholdsvis 30 o C. 2) Stammebaggrund: Indflydelse på ekspression af vildtype Na,K-ATPase 3) Kopitallet af ekspressionsplasmidet: Ekspression fra kromosomet (1 kopi), fra plasmid i lavt kopital (ca. 20 kopier) eller fra plasmid i højt kopital (ca. 200). 4) Medie sammensætning: Indflydelse af tilsætning af samtlige aminosyrer til vækstmediet i ekspressionsfasen. 5) Transkriptionsfaktor: Indflydelse af forøget GAL4p transkriptionsfaktor produktion. 6) Translationsinitiering: Indflydelse af Kozak sekvensen på ekspression af vildtype Na,K-ATPase. 73

74 Øvelse 6: Heterolog ekspression De gærstammer vi anvender har følgende genotyper: BJ5457 α leu2δ1 ura3-52 trp1 his3δ200 lys2-801 pep4::his3 prb1δ1.6r can1 GAL PAP1500 α leu2δ1 ura3-52 trp1::gal10-gal4 his3δ200 lys2-801 pep4::his3 prb1δ1.6r can1 GAL PAP1640 α leu2δ1 ura3-52 trp1::gal10-gal4 his3δ200 lys2-801::gal10-gal4 pep4::his3 prb1δ1.6r can1 GAL BMA64-1B α ura3-52 trp1δ2 leu his3-11 can1-100 PAP3975 α ura3-52 trp1δ2 leu his3-11 can1-100 prb1δ Tabel 1 viser de kombinationer af gærstammer, plasmider og vækstmedium vi vil undersøge og Tabel 2 angiver de omstændigheder hvert enkelt hold skal undersøge. 74

75 Øvelse 6: Heterolog ekspression Tabel 1 Prøve Stamme Plasmid Temperatur Vækstmedium 1 BJ o C + aa - leu 0 x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak vild type Na,K-ATPase 2 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak 30 o C + aa - leu vild type Na,K-ATPase 3 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak 30 o C + aa - leu vild type Na,K-ATPase 4 BJ5457 1x GAL4, kromosomal kopi, gris Kozak 30 o C + aa + leu vild type Na,K-ATPase 5 BJ x GAL4, lav kopi plasmid, gris Kozak 30 o C + aa + leu vild type Na,K-ATPase 6 BMA64-1B 1 x GAL4, høj kopi plasmid, PRB1, gris 30 o C + aa - leu vild type Na,K-ATPase 7 PAP x GAL4, høj kopi plasmid, prb1δ, gris 30 o C + aa - leu vild type Na,K-ATPase 8 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak 30 o C - aa - leu vild type Na,K-ATPase 9 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gær Kozak 30 o C +aa - leu vild type Na,K-ATPase 10 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak mutant 1 Na,Kpumpe 30 o C + aa - leu 11 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak mutant 1Na,Kpumpe 15 o C + aa - leu 12 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak mutant 2Na,Kpumpe 30 o C + aa - leu 13 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak mutant 2Na,Kpumpe 15 o C + aa - leu 14 BJ x GAL4, høj kopi plasmid, gris Kozak vild type Na,Kpumpe 15 o C + aa - leu Forkortelser: - aa, kun tilsat de aminosyrer gæren har krav for; + aa, tilsat alle aminosyrer undtagen leu og isoleu; - leu, ingen leucin i vækstmediet; + leu, leucin i vækstmediet. De vigtigste ingredienser i mediet ud over de i tabel 3 nævnte er 0.5% glukose, 3% glycerol. 75

76 Øvelse 6: Heterolog ekspression Hold Prøver 1 1, høstet 24 timer efter induktion 2, høstet 24 timer efter induktion 2 3, høstet 24 timer efter induktion 4, høstet 24 timer efter induktion 3 5, høstet 24 timer efter induktion 6, høstet 24 timer efter induktion 4 7, høstet 24 timer efter induktion 8, høstet 24 timer efter induktion 5 9, høstet 24 timer efter induktion 10, høstet 24 timer efter induktion 6 11, høstet 24 timer efter induktion 12, høstet 24 timer efter induktion 7 13, høstet 24 timer efter induktion 14, høstet 24 timer efter induktion 8 9, høstet 24 timer efter induktion 10, høstet 24 timer efter induktion 9 1, høstet 24 timer efter induktion 2, høstet 24 timer efter induktion 10 3, høstet 24 timer efter induktion 4, høstet 24 timer efter induktion 11 5, høstet 24 timer efter induktion 6, høstet 24 timer efter induktion 12 7, høstet 24 timer efter induktion 8, høstet 24 timer efter induktion Ta bel 2: Overs igt over de prøver hvert enkelt hold skal lave ouabain binding til. 76

77 Øvelse 6: Heterolog ekspression LIGEVÆGTSBINDING AF OUABAIN TIL NA,K-ATPASE. Ouabain er en specifik hæmmer af Na,K-AT Pasen. Ouabain binder non-covalent til ydersiden af Na,K-ATPasen med en høj affinitet (K D = 5-20 nm). Der findes et enkelt bindingssite for ouabain på hver funktionel Na,K-ATPase. Til målingerne bruger vi to v arianter af ouabain. En radioaktiv form, [ 3 H]ouabain, kaldet hot -ouabain, og en ikke-mærket form, kaldet kold -ouabain. I teorien er målingen simpel: Der tilsættes h ot -ouabain, der binder til Na,K-ATPaserne. Det ikke-bundne ouabain vaskes væk, og membranerne er klar til måling for radioaktivitet. Ud fra måling af radioaktiv iteten i et enkelt ouabain molekyle kan vi beregne mængden af bundne ouabain molekyler til pumpen. Der knytter sig to overvejelser til denne metode. 1) Ouabain bindes som nævnt non -kovalent. Der vil derfor hele tiden være en dynamisk ligevægt mellem bundet og ikke-bundet ouabain. Når cellerne vaskes vil ouabainen i væskefasen forsvinde. Ligevægten bliver derfor ødelagt, idet det bundne ouabain vil dissociere fra Na,K-ATPaserne, indtil en ny dynamisk ligevægt er opnået. Da problemet er rent termodynamisk, kan det reduceres kraftigt ved at køle cellerne før, under og efter vask. Dissociationen af ouabain-proteinkomplekset vil da gå meget langsommere. 2) Den anden overvejelse er også termodynamisk betinget. For binding af en ligand til et enkelt site på et protein gælder følgende reaktion. 77

78 Øvelse 6: Heterolog ekspression En afbildning af [PL](B) mod [PL]/[L f ](B/F) vil give en ret linie med -K D som hældningskoefficient. Linien skærer Y-aksen ([PL]) i punktet [P tot ]. Denne værdi opnås når P f =0, og repræsenterer derfor det maksimale antal bindingssites. Et sådant plot kaldes et Scatchard-plot (Figur 12). 78

79 Øvelse 6: Heterolog ekspression B B max α=-k D B: Bundet ouabain. F: Fri ouabain. B/F ([PL]/[P F ]) Figur 12: Skematiseret Scatchard plot der viser mængden af bundet ouabain som funktion af forholdet mellem bundet og fri ouabain. Hældningskoefficienten er K D 79

80 Øvelse 6: Heterolog ekspression Dette har været den traditionelle måde at behandle bindingsdata på. I dag er det imidlertid nemmere at analysere data på en almindelig PC f.eks. med programmet Sigma Plot. Ud fra definitionen på K D kan vi udlede følgende ligning. K χ D = [ PL] [ Lf ][ Pf ] = [ PL] [ Ptot ][ Lf ] ([ Lf ] + KD) Denne ligning er helt analog til Michaelis-Menten ligningen fra klassisk enzym kinetik. Afbildning af den bundne mængde ligand som funktion af den frie ligand koncentration giver en mætningskurve som vist i Figur 1Figur 3. Ud fra denne kurve kan K D beregnes, som den koncentration af fri ligand, der giver halv maksimal binding. Den koncentration af fri ligand, der mætter halvdelen af bindingssitene, kaldes for [L] ½. Ved denne ligand koncentration er [PL] = ½[P tot ]. Ud fra ovenstående ligning fås: ½ χ [ Ptot ] [ ] [ ] ½ [ L] [ Ptot ][ L] [ L] + K ½ ½ ½ 2 L = L + K χ K D = = D ½ D 80

81 Øvelse 6: Heterolog ekspression B max B pmol/mg ½B ma x KD Ouabainkonc nm Figur 13: Skematiseret mætningskurve med angivelse af K D. Bmax bestemmes ud fra den rette linje, der asymtotisk nærmer sig mætningskurven. For at undgå et stort forbrug af hot -ouabain foretager vi en række målinger med stigende koncentrationer af kold -ouabain og en konstant koncentration af hot - ouabain. I målingen med kun hot -ouabain ser vi naturligvis kun effekten af en total ouabain- koncentration svarende til [ hot ]. I en måling med 50% hot og 50% kold bliver totalkoncentrationen [ hot ]+[ kold ]. Da bindingsaffiniteten af hot og kold er ens, bindes der lige meget af hver. Vi vil kun se et udslag af det bundne hotte ouabain. Derfor vil udslaget i dette tilfælde kun være 50% af den faktisk bundne mængde. Hver enkelt måling skal derfor justeres efter forholdet mellem [ hot ] og [ kold ]. Den enkelte måling normaliseres mod mængden af gærceller i prøven. Derefter kan B max (pumper/celle) og K D findes v.hj.a. et Scatchard-plot eller ved indtastning i SigmaPlot. I denne øvelse vil vi sammenligne ouabain bindings kapaciteten i membranen i de i Tabel 1 viste gærstammer. Da alle de udtrykte pumper har samme affinitet for ouabain vil vi kunne lave binding med en koncentration af ouabain. Bindingskapaciteten ved denne koncentration vil så være proportional med den maksimale bindningskapacitet. Membraner fra de enkelte gærstamme vil blive udleveret. 81

82 Øvelse 6: Heterolog ekspression REFERENCER. Grishammer, R. and C.G. Tate (1995) Overexpression of integral membrane proteins for structural studies. Quart. Rev. Biophys. 28: Schultz, L.D., Hofmann, K.J., Mylin, L.M., Monygomery, D.L., Ellis, R.W. and Hopper, J.E. (1987) Regulated overproduction of the GAL4 gene product greatly increases expression from galactose inducible promoters on multi-copy expression vectors in yeast. Gene 61: Pedersen, P.A., Rasmussen, J.H., Jørgensen, P.L. (1996) Expression in high yield of pig α1β1 Na,K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 271: Pedersen, P.A., Rasmussen, J.H., Jørgensen, P.L. (1996) Consequences of mutations to the phosphorylation site of the α-subunit of Na,K-ATPase for ATP binding and E1-E2 conformational equilibrium. Biochemistry 35, 50: Pedersen, P.A., Rasmussen, J.H.,Nielsen, J.M., Jørgensen, P.L (1997) Identification of Asp804 and Asp808 as Na + and K + coordinating residues in α-subunit of renal Na,K-ATPase FEBS Lett. 400: Nielsen, J.M., Pedersen, P.A., Karlish, S.J.D., Jørgensen, P.L. (1998) Importance of intramembrane carboxylic acids for occlusion of K + ions at equilibrium in renal Na,K-ATPase Biochemistry 37, Pedersen, P.A., Nielsen, J.M., Rasmussen, J.H., Jørgensen, P.L. (1998) Contribution of Tl +, K + and Na + binding of Asn776, Ser775,Thr774, Thr772 and Tyr771 in cytoplasmic part of fifth transmembrane segment in α-subunit of renal Na,K-ATPase Biochemistry 37, Jørgensen, J.R. and Pedersen, P.A. (2001) Role of phylogenetically conserved amino acids in protein folding of Na,K-ATPase Biochemistry 40,

83 Øvelse 6: Heterolog ekspression HETEROLOG EXPRESSION, DETALJERET PLAN. Ouabain er giftigt og må ikke indtages. [ 3 H]-ouabain er radioaktivt og arbejdet må kun foregå på velafdækkede borde. Brug handsker! Bordene tørres af efter brug. Undgå spild. Pipettespidser og lignende der har været i kontakt med radioaktivitet opsamles i hvide affaldsposer, der mærkes 3 H-ouabain. Efter at ouabain er bundet til Na,K-pumpen i membranerne er det essentielt at prøven holdes koldt hele tiden (d.v.s. at centrifugering sker i en 4 o C kold centrifuge og at prøverne eller holdes på is). Så længe prøven holdes kold bliver ouabain siddende på Na,K-pumpen da off rate for reaktionen ved denne temperatur næsten er 0. En forudsætning for at få nogle gode resultater er derfor at huske det med temperaturen. Dag 1. Foretag ouabain binding til de udleverede intakte gærceller som angivet i Appendix side 135. Dag 2. Udregn mængden af bundet ouabain som pmol/mg membran protein. Dag 3. Indfør resultaterne for hele holdet i et skema og diskuter resultaterne. 83

84 Øvelse 6: Heterolog ekspression SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE 6. a) Beregn antal ouabain sites per gærcelle under de anvendte vækstbetingelser. b) Sammenlign resultaterne af dine egne forsøg med resultaterne fra de andre grupper og diskuter, hvorledes de undersøgte parametre har betydning for ekspressions niveauet. c) Foreslå nogle forsøg der kan identificere flaskehalse i ekspressionen af Na,Kpumpen i gær. d) Hvilke yderligere tiltag kan du foreslå for at øge expressionen af Na,K-pumpen i gær? e) Gærcellerne dyrkes i 2 % glycerol og 0,5 % glukose før induktion med 2 % galaktose. Hvad er rationalet bag vækstmediets sammensætning? f) Hvorledes anvender gæren glycerol som kulstofkilde? g) I denne øvelse anvender vi temperatur nedsættelse for at forsøge at redde visse mutant proteiner fra proteasedøden. Kunne du foreslå andre metoder til at opnå det samme? h) Hvordan kan man kvantifisere hvor meget Na,K-ATPase protein der er udtrykt i membranen? i) Hvilke kvalitetskrav må man stille til det reddede protein for at være sikker på, at det har nogen mening, at anvende det til videre karakterisering? j) Diskuter, hvorledes nedsættelse af temperaturen kan redde visse mutant proteiner fra nedbrydning. 84

85 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter ØVELSE 7: KLONING I PROKARYOTER I prokaryoter benyttes ofte plasmider som kloningsvektorer. Plasmider er replikons som mer e eller mindre stabilt nedarves uden at være integreret i værtens kromosom. Plasmider er naturligt forekommende indenfor prokaryoter og varierer i størrelse fra omkring 1 kb til mere end 500 kb (et normalt prokaryot kromosom er omkring 4500 kb). Tilstedeværelsen af et plasmid bibringer ofte værten en ny fænotype som for eksempel antibiotika-resistens. Plasmider, hvis tilstedeværelse ikke har nogen kendt fænotype, kaldes for kryptiske plasmider. De enkelte plasmider har en bestemt "host range". Plasmider med "narrow host range" replikerer kun i den naturlige vært og tæt beslægtede arter, medens "broad host range" plasmider (promiskøse plamider) replikerer i selv fjernt beslægtede arter. De enkelte plasmider består som regel af et replikon, en kopitalsfunktion og en partitioning funktion. Replikon'et sørger for at plasmidet kan replikere, kopitalsfunktionen for at kopitallet (antal plasmid origins/pr. kromosomal origin) holdes konstant og partitioning funktionen som sørger for at de replikerede plasmider fordeles til dattercellerne. Den sidste funktion er specielt vigtig for plasmider med meget lavt kopital (f.eks. F' faktoren som opretholdes i ca. 1 kopi/kromosom). Vi skal i denne øvelse prøve at klone et stykke lambda DNA i et typisk E. coli plasmid ved navn puc19. Der er et vist et restriktionskort over puc19 (Figur 1) og lambda (Figur 2). puc19, der er et højkopi plasmid (ca. 50 kopier pr. kromosom) har et replikon fra det naturligt forekommende plasmid pmbl1 samt et ampicillin resistensgen (β-lactamase). Derudover indeholder puc19 lac promoter/operater regionen fra E. coli fulgt af en polylinker og genet for lacz(α) fragmentet. lacz(α) fragmentet indeholder de 107 N-terminale aminosyrer fra E. coli's β-galaktosidase enzym. Expression af lacz(α) genet er således under kontrol af lac promoteren, som i fravær af glukose induceres af lactose eller isopropyl-β-thiogalactopyranocid (IPTG). lacz(α) fragmentet har ingen enzymatisk aktivitet og er meget ustabilt i E. coli. lacz(α) fragmentet kan imidlertid 85

86 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter sammen med den manglende C-terminale del af lacz danne et aktivt og rimelig stabilt β- galaktosidase enzym. Det betyder, at der dannes et funktionelt enzym, hvis lacz(α) fragmentet udtrykkes i en lac værtsstamme, som udtrykker den manglende C-terminale del af β-galaktosidase genet, f.eks. E. coli XL-1 Blue. Til synliggørelse af β- galaktosidase aktivitet i celler findes der et substrat (X-GAL: 5-bromo-4-chloro-3indolylβ-galaktosid), som, når det spaltes af β-galaktosidase, danner et blåt, uopløseligt farvestof. Celler med β-galaktosidase aktivitet bliver således blå. Klones der et fragment i puc19 plasmidets polylinker ødelægges læserammen i lacz(α) genet, hvilket betyder, at der ikke dannes et funktionelt lacz(α) fragment og derfor heller ikke noget funktionelt β- galaktosidase. En celle indeholdende et puc19 plasmid med et stykke DNA klonet i polylinker regionen vil derfor være hvid på en X-gal, IPTG plade. På denne måde er det let at finde sine rekombinante kloner, idet det ofte kun er de hvide kolonier der er potentielt rigtige. I denne øvelse vil vi restriktionsskære en lambda fag, oprense restriktionsfragmentet fra en agarosegel og klone det i puc19. Ligeringsblandingen transformeres i E. coli og plades ud på en X-gal, IPTG plade. Der laves DNA fra de hvide kolonier og dette DNA restriktionsmappes ud fra den kendte restriktionsmappe af lambda. I Appendix finder i nogle generele kommentarer vedrørende strategier til forøgning af fraktionen rekombinanter ved kloning. E. coli XL1-Blue har følgende genotype: enda1 gyra96(nal R ) thi-1 reca1 rela1 lac glnv44 F'[ ::Tn10 proab + laci q Δ(lacZ)M15] hsdr17(r - K m + K ) nalidixic acid resistent tetracycline resistent (genet ligger på F plasmidet) 86

87 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter Figur 1. Strukturelt kort og restriktionskort over puc19. 87

88 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter 88

89 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter Figur 2 Restriktionskort over Lambda. 89

90 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter 90

91 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter 91

92 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter KLONING I PROKARYOTER, KORT OVERSIGT Dag 1. Skær det udleverede lambda og puc19 DNA med HindIII, støb en agarosegel og kør en analytisk gel af prøverne. Dag 2. Kør en preperativ gel af det skårede DNA og oprens fragmenter. Behandle en 1/2 del af jeres skårede puc19 preparation med alkalisk phosphatase. Liger 5 minutter ved stuetemperatur. Medens gelen kører gøres den udleverede XL1- blue kultur kompetent. Ligeringsblandingingerne transformeres i XL-1 blue og plades ud på X-GAL/IPTG ampicillin plader. Dag 3. Dagen før Dag 3 har laboratoriet podet to hvide transformanter op i 5 ml LB + ampicillin medium. Lav minipreps fra de opvoksede kulturer og skær dem med HindIII. Kør gel af skæringerne. Dag 4. Planlæg og lav diagnostiske skæringer for at avgøre lambda-fragmentets orientering. Kør gel af skæringerne. 92

93 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter KLONING I PROKARYOTER, DETALJERET PLAN. Dag 1. Skær Plasmid og Lambda-DNA For en generel introduktion til brug af restriktionsenzymer, se appendix. Tag 20µl af den udleverede puc19 plasmidpreparation og overfør til et sterilt eppendorfrør. Tilsæt 25µl TE, 5µl 10 X HindIII restriktionsbuffer. Tag 20 µl af den udleverede lambda DNA preparation og overfør til et andet eppendorfrør. Tilsæt 25 µl TE buffer samt 5 μl 10 X HindIII restriktionsbuffer. Tilsæt 1µl HindIII restriktionsenzym til hvert rør, vortex og inkuber rørene ved 37 C i 2 timer. Støb en agarosegel (Gøres af instruktørene) For en introduktion til agarose gelelektroforese, se Appendix. Støb (i mellemtiden) en 0.7% agarosegel til analytisk brug. N.B.! ETHIDIUMBROMID ER MUTAGENT, BRUG HANDSKER, UNDGÅ DRYP, TØR OP VED SPILD. Afvej 0,7 g agarose, blande med 100 ml 1xTBE buffer og smelt i mikrobølgeovnen (gennemkoges i 3-5 min. på laveste effekt). Køl agarosen til ca. 60 C, tilsæt ethidiumbromid til 0.5 µg/ml og hæld op i støbekar med slotformer. Når agarosen er størknet trækkes slotformerne op og gelen lægges over i elektroforesekarret med SAMME buffer som i gelen (med 0.5 µg/ml ethidiumbromid). Verificer skæringerne med agarosegelelektrofores N.B.! ETHIDIUMBROMID ER MUTAGENT, BRUG HANDSKER, 93

94 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter UNDGÅ DRYP, TØR OP VED SPILD. Udtag 5 µl af skæringerne og sæt dem i hvert sit mærkede Eppendorf-rør. Gem resten af skæringerne i -20 C fryseren. Forbered en molekylvægtsmarkør (O GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas), en uskåret puc19 prøve samt en lambda-prøve per gel. Tilsæt 2 µl loadingbuffer til hver prøve. Sæt alle prøver på 0.7% agarosegelen, ved at stikke pipetspidsen ned i brønden og lade prøven flyde langsomt ned på brønden bund. Husk at skrive ned i hvilken rækkefølge prøverne sættes på gelen. Slut elektroderne til strømkilden, husk at DNA'et er negativt ladet og derfor migrerer mod den positive pol. Gelen køres ved 100 V til den blå farve er migreret ca. 2/3 ned i gelen. Gelen lægges på et UV bord og der tages en billed af gelen, billed-filen gemmes og et termoprint laves af gelen. 94

95 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter Dag 2. Iso ler lambda-fragmentet Kør DNAet på en præparativ agarosegel Sæt hele den overstående portionen af HindIII skåret lambda DNA på en præparativ (store brunner) 0.7% agarosegel (gelen er fremstillet af øvelsesvejlederne). Gelen køres i mindst 1 time ved 100 V og inspiceres derefter under langbølget UV-lys (Hvorfor langbølget?). Båndene skal være pænt adskilte. Udvælg det af båndene fra lambda, som du ønsker at klone. Undgå bånd 1 (det største) og 4 som indeholder cos-sites. (Hvorfor kan de ikke anvendes?) Oprens det udvalgte DNA-fragment fra gelen. Der findes forskellige metoder og kommersielle kits for at isolere DNA fra agarose-geler. Vi bruger her GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit fra GE Healthcare. 1. Mærk et tomt Eppendorf rør med jeres hold-nr., vej røret og noter vægten til nærmeste 10 mg. 2. Skær gelstykke indeholdende DNA ud af gelen med en ren skalpel. Skær så tæt ved DNA et som muligt. Skær evt. stykket i flere mindre stykker inden det overføres til Eppendorf rør. 3. Vej røret indeholdende DNA-gelstykket og udregn vægten af gelstykket. 4. Tilsæt en mikroliter Capture buffer for hvert milligram gel. (Maximal kapacitet for søjlen er 300 µl buffer og 300 mg gel.). 5. Luk røret og vortex grundigt. Inkuber ved 60 C indtil agarosegelen er helt opløst (5-15 min). 6. Når agarosen er helt smeltet, centrifugeres Eppendorf røret kort for at samle prøven i bunden af røret. 95

96 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter 7. Mærk en GFX søjle med hold-nr. og placer søjlen i en Collection Tube. 8. Overfør prøven til GFX søjlen. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min. 9. Centrifuger 30 sekunder ved rpm. 10. Smid den gennemløbne væske ud ved at tømme Collection Tube n. Placer GFX søjlen i Collection Tube n igen 11. Tilsæt 500 µl vaskebuffer til søjlen. Spin 30 sekunder ved rpm. 12. Overfør GFX søjlen til nyt, rent Eppendorf rør. Skriv holdnr. på siden af røret og klip rørets låg af. (Ellers går rørets låg tit i stykker under centrifugering). 13. Tilsæt 50 µl elueringsbuffer (TE eller H 2 O) til søjlen. 14. Inkuber prøven ved stuetemperatur i 1 minut. 15. Spin 1 minut ved rpm. 16. Overfør prøven til nyt, mærket, Eppendorf rør (med låg), smid søjlen ud. Dephosphorylering af puc19 Dephosphorylering af 20µl af HindIII skårede puc19 DNA med alkalin fosfatase fra rejer (Fermentas). 1. Tilsæt 1/10 vol buffer (2,2 μl) og 2. 1 unit (1 μl) phosphatase 3. Inkuber i 30 min ved 37 C 4. Inaktiver fosfatasen ved at inkubere yderligere 15 min. ved 65 C. (Hvorfor er dette vigtigt?). Gør E. coli XL1 blue kompetent Dette er den klasssiske CaCl 2 -metoden til at gøre E. coli celler kompetente til optagelse af DNA. Der findes mange forskellige metoder til dette. En alternativ metode, hvor de kompetente cellerne kan opbevares i -80 C-frysere, findes beskrevet i Appendix. 1. Pod ml LBmedium med 0.5 ml af en FRISK overnatskultur. 96

97 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter OD 450 bør være ca Ryst ved 37 C, mål OD 450nm jævnligt. 3. Ved OD 450nm ca. 0.6 høstes 1 X 40 ml kultur i et sterilt centrifugerør med låg, ved at centrifugere ved rpm i 5 min. 4. Pellet opslemmes i 20 ml iskold 10 mm MgSO Cellerne centrifugeres ved rpm i 5 min. 6. Genopslem forsigtigt i 10 ml iskold 50 mm CaCl 2 7. Inkuber på is i 30 min. 8. Centrifuger ved 7000 rpm i 2 min i kold centrifuge, hvorved et hjerteformet pellet opstår. 9. Genopslem, forsigtigt i 1 ml iskold CaCl 2, hold på is. Spritfældning af vektor og insert DNA: Start 3 ligeringsreaktioner i hvert sit rør: I et rør blandes 25µl HindIII skåret, defosforyleret puc19 DNA med halvdelen af det oprensede fragment. I e t andet rør blandes 10µl HindIII skåret, ikke defosforyleret puc19 med halvdelen af det oprensede fragment. Et tredje rør tilsættes 25µl HindIII skåret dephosphoryleret puc19. Alle rør fylde s op til 200 μl med TE buffer og blandingerne spritfældes ved følgende 1. Juster koncentrationen af monovalente kationer i opløsningen til en koncentration af 0.3M NaAcetat (ved at tilsætte 1/10 volumen 3M NaAc stamopløsning). 2. Tilsæt 2-3 volumen kold 96% EtOH og bland godt (Whirlimix). 3. Med meget lidt DNA eller meget små fragmenter (< 1 kb) fældes DNA ved -20 C i 20 min.. 4. Centrifuger ved rpm i 10 min.. 97

98 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter 5. Fjern straks supernatanten ved at vende røret på hovet. Den sidste dråbe kan eventuelt fjernes ved at duppe røret på et stykke køkkenrulle. Bemærk at pellet er usynligt. 6. Vask 2 gange med 200 µl 80% EtOH, idet der spindes 2 min ved rpm mellem hver vask. Efter sidste vask duppes røret på et stykke køkkenrulle. Pellet tørres i en Speed Vac eller i en varmeblok ved 60 o C i ca. 10 minutter. 7. Genopløs DNA'et i hvert rør med 15 µl sterilt vand. Ligere vektor og insert DNA: Vi bruger her Rapid DNA ligation kit (Fermentas). Husk ALTID at holde rørene fra kitet koldt PÅ IS (5X buffer og ligase-enzymet). Til hvert eppendorfrør med spritfældt DNA for ligering, tilsæt: 4 μl 5 X Rapid Ligation buffer 1,0 µl T4 DNA ligase (5 units/µl) Mix, centrifuger eventuelt væsken ned i rørets, inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Transformere E.coli XL-1 Blue 1. Tilsæt 0,1 ml kompetente celler til 20µl DNA. Udover de 3 ligerede DNA-prøver laves: en kontrol for transformationseffektivitet hvor I transformer med 5 µl kontrol DNA (0,2ng puc19/µl). Her forventes en transformationsfrekvens på pr. µg DNA. en sterilkontrol (transformation uden tilsat DNA). 2. Inkubere 30 minutter ved 0 C. 3. Varmechok, 3 min. ved 42 C i en varmeblok. 4. Sæt på is. 5. Tilsæt 1 ml LB per rør. (For udtryk af kanamycin- og tetracyclin- 98

99 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter resistens inkuberes ved rystning ved 37 o C i 30 minutter. Der behøves ikke fænotypisk expression for udtryk af Amp genet). 6. Høst cellerne ved 5000 rpm i 3 min. Fjern 900 μl af supernatenten og 7. resuspender cellerne i den tilbageblevne mængde LB. Udplad på selektive medier: Sterilkontrollen og transformationskontrollen udplades på LBagar plader med 100 μg/ml Ampicillin, 8 μg/ml Tetracyclin. De tre øvrige ligeringsblandinger udplades på LB-agar plader med 100 μg/ml Ampicillin, 8 μg/ml Tetracyclin med X-gal og IPTG tilsat. 99

100 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter Dag 3. Dag en før Dag 3 har laboratoriet podet to hvide transformanter op i 5 ml LB + ampicillin medium. Lav plasmid DNA minipreps fra disse kulturer. Der findes forskellige metoder og kommercielle kits til at isolere DNA fra E.Coli. Her bruger vi GFX TM micro plasmid prep kit fra GA Health Care. Husk at mærke alle rør!! 1. Høst 1. 5 ml O.N. cellekultur i et Eppendorfrør (8.000 rpm, 2 min). Sørg for at fjerne al supernatanten ved at duppe røret på et stykke køkkenrulle. 2. Resuspender cellepellet fuldstændigt i 150 μl Solution I. 3. Tilsæt 150 μl Solution II og bland ved at vende røret gange. Opløsningen skal blive klar. 4. Tilsæt 300 μl Solution III og bland ved at vende røret gange. 5. Centrifuger rpm i 5 min.. Medens centrifugen kører sættes en GFX søjle per oprensning i Collection Tubes. 6. Supernatanten fra 5 tilsættes GFX søjlen uden at der kommer noget af bundfaldet med. Lad være at prøve at få hele supernatanten med. Inkuber 1 minut ved stuetemperatur. 7. Centrifuger 30 sekunder ved fuld hastighed og smid gennemløbet væk. 8. Tilsæt 300 μl Solution III og spind ved fuldhastighed i 30 sekunder. Smid gennemløbet ud. 9. Tilsæt 400 μl Washbuffer. Centrifuger 1 minut ved fuld hastighed. Smid gennemløbet væk og sæt søjlen ned i et Eppendorfrør. 10. Tilsæt 100 μl TE buffer og inkuber ved stuetemperatur i 1 min Centrifuger ved fuld hastighed i 1 min.. Gem gennemløbet (DNAet) ved 4 o C. 100

101 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter Verificere at jeres kloner indeholder plasmider med insert af forventet størrelse. Skær 10 µl miniprep DNA i et totalvolumen på 20µl (10 µl DNA + 7 µl TE + 2 µl 10x HindIII buffer +1 µl 5u/µl HindIII enzym) Inkubere i 2 timer ved 37 C. Fremstil en 0,7% gel og separer jeres HindIII skårede DNA. Når gelen er kørt færdigt, tages en billed af gelen, billed-filen gemmes og et termoprint laves af gelen Dag 4. Diagnostisk skærning af plasmiderne Planlæg ud fra jeres kloning hvilket/hvilke restriktionsenzymer i kan bruge til at verificere: 1) at det er det rigtige fragment i har klonet; samt 2) til at bestemme orienteringen af det indsatte fragment. Bekræfte med instruktørerne at de enzymer ni gærne ville bruge finnes tilstæde. Skær jeres kloner med de enzymer i har planlagt i 2 timer. Separer produkterne på en 0,7% agarose gel. Når gelen køret færdigt, tages en billed af gelen, billed-filen gemmes og et termoprint laves af gelen 101

102 Øvelse 7: Kloning i Prokaryoter SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE 7 A: Opgør antallet af transformanter og indfør resultatet i nedenstående skema. Opgør for hve r enkelt transformation fraktionen af hvide kolonier. B: Udregn antalet af transformanter for kontrollen per 10 6 celler per μg DNA (OD450 n m = 0.2 svarer til 10 8 celler/ml). Er resultatet tilfredsstillende? C: Er der kolonier på sterilkontrollen? Hvis ja, hvorfor så? D: Nogle gange viser det sig at de blå kolonier er de rigtige. Hvordan kan det forklares? E: Nogle gange viser det sig, at et fragment ikke kan klones i puc og puc lignende vektorer men at det godt kan klones i identiske plasmider med et lavere kopital. Hvilke årsager kan der være hertil? ANTAL TRANSFORMANTER: BLÅ BLÅ/TOTAL HVIDE HVIDE/TOTAL Defosfo-pUC19 puc19+ fragment Defosfo-pUC19 + fragment Kontrol (puc19) * * * Steril (- DNA) * * * *Inget IPTG/X-gal tilsat til pladerne. Indsæt billedet af DNA'et fra de korrekte kloner og fra restriktionsmapningen af det klonede lambda fragment. Tegn et restriktionskort af jeres klonede fragment, med angivelse af fragmentstørrelser og begrundelser for restriktionskortets udseende og jeres valg af restriktionsenzymer til kortlægningen. 102

103 Genteknologi Øvelse 8: Internet værktøjer ØVELSE 8: ANVENDELSE AF NETBASEREDE VÆRKTØJER Formålet med denne øvelse er at prøve at anvende nogle af de mange netbaserede værktøjer, der findes. Det er i dag sådan, at næste alle de genteknologiske analyser man ønsker at gennemføre kan udføres med gratis net-baserede værktøjer. Søgning af literatur og on-line adgang til tidsskriftartikler kan ske gennem DNLB hvor alle ansatte og studerende har fjernadgang, så lige meget hvor i verden man opholder sig kan man få lov at læse og printe de artikler som DNLB abonnerer på. Dertil kommer, at en lang række tidsskrifter giver fri adgang til deres artikler et halvt år efter, at de er udkommet. Når i logger jer på DNLB skal i bruges jeres personnummer og jeres personlige KU kode (firecifret kode). DNLB finde på adressen nlb.dk hvor i så klikker på fjernadgang. På DNLB s hjemmeside er der også adgang til web of science hvor man kan se hvormange gange en videnskabelig artikel er blevet citeret af andre forskere. Hvis man ønske r at finde videnskabelig literatur over et bestemt emne eller artikler skrevet af en bestemt forfatter inden for det biologiske/medicinske område kan man lede på PubMeds hjemmeside på adressen ry.fcgi?db=pubmed. Der er desuden adgang til en lang række andre informationer via PubMed s hjemmeside. I search funktionen øverst til venstre kan man foreksempel klikke på nucleotide for at finde nukleotidsekvensen af et bestem gen eller klikke på protein for at finde primærstrukturen af et protein. Der er også en database over alle kendte mutationer i humane gener og de sygdomme de er rerlateret t il. Denne database kaldes OMIM (online medelian inheritance in man). Via PubMed er der adgang til Entrez. Klikker man på about entrez kommer der et adgang til et hav af nyttige databaser. Et vigtig redskab er BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) funktionen. BLAST er et værktøj til at lede i offentlige databaser efter sekvenser (nukleotid- eller aminosyre sekvens) der er homolog til en given sekvens. Har vi f.eks. klonet noget cdna og gerne vil vide om der i de offentlige databaser findes lignende sekvenser, vil vi bruge BLASTN funktionen. Vil vi lede efter om vores det protein vores cdna sekvens koder for ligner noget i de offentlige databaser vil vi bruge BLASTP funktionen. Restriktionsanalyse er et af de værktøjer man bruger allermest. På adressen finder man programmet Webcutter2. Her analyserer 103

104 Genteknologi Øvelse 8: Internet værktøjer programmet en DNA sekvens for genkendelssites for alle kendte restriktionsenzymer. Ofte vil men gerne aligne to eller flere sekvenser (nukleotid- eller aminosyre). Et af programmerne hertil er Mulalin som findes på adressen Der findes også informationsdatabaser for en lang række organismer. Et eksempel er SGD (Saccharomyces genome database) på adressen hvor der er adgang til så at sige alle molekylærbiologiske, cellebiologiske og biokemiske data omkring bagegær. Ønsker man at invertere en DNA sekvens kan man bruge adressen En god værktøjskasse findes også på Expasy på adressen Værktøjerne på denne adresse er mest relateret til proteinanalyser, men indeholder også et godt program til translation af en DNA sekvens. Ønsker man at finde potentielle regulatoriske cis-elementer i en promoter er der et nyttigt værktøj på adressen adressen 104

105 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær ØVELSE 9: TRANSFORMATION AF GÆR. Transformation af S. cerevisiae med rekombinante plasmider eller lineære DNA fragmenter kan fortages på flere måder. I den oprindelige forskrift transformeres gærspheroblaster med DNA i tilstedeværelse af polyethylen glycol (PEG) og CaCl 2 (Hinnen et al. 1978). Det er imidlertid nemmere at transformere LiAc behandlede celler med DNA i tilstedeværelse af PEG (Ito et al. 1983). Endvidere kan gær også transformeres ved elektroporation (Hashimoto et al. 1985). Der er meget forskel på, hvor nemt gærstammer transformeres, men elektrotransformation er som hovedregel den mest effektive, skarpt efterfulgt af spheroplast transformation og LiAc transformation. Hvilken metode der vælges, vil i høj grad afhænge af, hvad formålet med transformationen er. Oftest har man lavet nogle konstruktioner i E. coli, som man blot ønsker at introducere i gær. I en sådan situation er en høj transformationseffektivitet ikke afgørende. Ved konstruktion af genbanker i gær er en høj transformationseffektivitet derimod essentiel. Det transformerede DNA kan opretholdes i gær enten ved integration i et af gærens kromosomer via homolog eller illigitim rekombination, eller som et autonomt replikerende stykke DNA. Autonom replikation er en egenskab som bibringes af ARS sekvenser (autonomous replicating sequence). Disse findes dels i gærplasmidet 2µ, gær kromosomal DNA og i DNA fra andre eukaryote organismer. DNA molekyler uden ARS sekvenser kan kun opretholdes via integration i et af gærens kromosomer ved rekombination. I dennne øvelse vil vi LiAc-transformere gærceller med en episomal gærvektor, YEp352, en ikke restriktionsskåret integrationsvektor YIp352 og en restriktionsskåret integrationsvektor YIp352 og et ERG6-LYS2-ERG6 PCR fragment. YEp står for yeast episomal plasmid, YIp står for yeast integrating plasmid (Figur 1 og 2). Ved hjælp af de transformerede gærstammer vil vi bestemme transformationseffektiviteten og undersøge, hvor stor en procentdel af de rekombinanter der opstår ved transformation med ERG6-LYS2-ERG6 fragmentet der skyldes homolog rekombination. Transformations-effektiviteten bestemmes ved, at bestemme antallet af transformanter pr mikrogram DNA. Fraktionen af homologe rekombinanter efter transformation med ERG6-LYS2-ERG6 fragmentet kan bestemmes ved at afgøre, hvor stor en del af disse, der er sensitive over for Nalidixinsyre. ERG6 koder for enzymet S- adenosylmethionin-delta-24-sterol-c-methyltransferase, som er et af enzymerne i 105

106 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær biosyntesen af ergosterol. Disruption af ERG6 genet betyder, at plasmamembranen bliver mere permeabel end hos vildtypen. Det får den konsekvens, at mange toxiske stoffer kan passere membranen og udøve deres effekt intracellulært. Derfor bliver erg6 mutanter i modsætning til vildtype sensitive over for Nalidixinsyre, der stopper gærcellerne i G1 fasen. De gærtransformanter, der er opstået ved homolog rekombination, vil være lysin autotrofe og Nalidixinsyre sensitive, medens de, der er opstået ved illigitim rekombination, vil være lysin autotrofe og Nalidixinsyre resistente. galaktosidase. Figur 1 Kort over YEp 352 og YIp352. URA3, URA3 genet fra S. cerevisiae; 2μ, 2μ replikations origin fra S. cerevisiae; Amp R, et β-lactamase gen; LacZ,.α-fragmentet fra β- De mest anvendte gærvektorer er shuttle-plasmider. D.v.s. at de kan replikere i mere end en organisme. Episomale S. cerevisiae-e. coli shuttle plasmider indeholder et E. coli replikon, en selektiv E. coli markør, et gær replikon samt en selektiv gærmarkør. De tilsvarende integrative plasmider mangler blot et gær replikon. Den gær vi vil anvende har genotypen ura3 lys2 leu2 ERG6 5' LYS2 ERG6 3' Figur 2 Kort over det ERG6-LYS2-ERG6 fragment der er anvendt til transformation i gær. ERG6 5 endene er 800 bp og ERG6 3 enden er 400 basepar. LYS2 genet med promoter er 4.2 kb. 106

107 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær TRANSFORMATION AF GÆR, OVERSIGT. Dag 1. Gør gærcellerne kompetente og transformer dem med uskåret YEp351, StuI skåret YIp352, uskåret YIp352 og ERG6-LYS2-ERG6 fragmentet. Dag 2. Transformanter er nok stadig for små til at resultatet kan gøres op. Dag 3. Dag kolonier fra transformationen med ERG6-LYS2-ERG6 fragmentet replikeres i mønster til YPD plader med Nalidixinsyre. Resultaterne fra gærtransformationerne gøres op og indføres i skemaet. De replikerede plader aflæses og resultaterne gøres op. 107

108 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær TRANSFORMATION AF GÆR, DETALJERET PLAN. Dag 1. Gør gær kompetent 1. Inokuler 50 ml YPD medium med 3 ml af en frisk overnatskultur (forberedt af instruktorerne). Mål OD 450nm og inkuber kolben ved 30 C med rystning indtil OD 450 = 1.0. Skriv den exakte OD 450nm ned ved hvilken I høster cellerne da I har brug for dette tal for at kunne beregne celleantallet. 2. Høst cellerne ved centrifugering ved x g i 5 min i Heraeus Multifuge 3-SR (eller med SS-34 rotor i Sorvall centrifugen ved rpm.). 3. Vask cellerne en gang ved opslæmning i 25 ml sterilt vand, centrifuger som ovenfor og resuspender cellerne i 1 ml sterilt vand. 4. Overfør cellerne til et Eppendorfrør og spind cellerne rpm i 2 min. 5. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml TE/LiAc og høst som ovenfor. 6. Resuspender cellerne i ml TE/LiAc. 7. Berægne antallet af gærceller per milliliter. OD 450nm = 1 svarer til circa 9.8 x 10 6 celler/ml (for en centimeter brede kuvetter). Transformer gær 1. For hver transformation blandes følgende i et Eppendorfrør: 50 μl celler 5μl (200 ng) DNA 5 μl carrier DNA (10 mg/ml sonikeret, fenoliseret og kogt kalvethymus DNA). Udover de fire DNA-transformationer, skal der laves 2 sterilkontroller (dvs. 2 x 50 μl celler, der udelukkende transformeres med carrier DNA), en på uracil-plader og en på leucin-plader. 2. Tilsæt 300 μl sterilt 40% PEG/TE/LiAc til hvert rør og whirlimix så der opnås homogenitet. Overfør blandingen til 10 ml fladbundede rør og 108

109 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær inkuber disse ved 30 C med rystning i 30 minutter. 3. Overfør blandingen til et Eppendorfrør og anbring det i en varmeblok ved 42 C i 15 min. (varmeshock). 4. Høst cellerne ved rpm i 2 min. og fjern forsigtigt supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml TE buffer og høst som beskrevet ovenfor. Resuspender i 100 μl TE og plad cellerne ud på selektive plader. Dag 3. Evaluering af gærtransformationerne Tæl antal kolonier fra de forskellige transformationer og indfør resultatet i skemaet neden for. Scre en for homolog rekombination Replikere 50 kolonier fra transformationen med ERG6-LYS2-ERG6 fragmentet til YPD plader med 100 γ Nalidixinsyre. Dag 4. De replikerede plader aflæses og resultaterne gøres op. RAPPORT SKEMA Transformation: Opgør antallet af transformanter per μg DNA per 10 6 celler for de enkelte plasmider og indfør resultaterne i skemaet. Antal transformanter per μg DNA per 10 6 celler YEp352 YIp352 YIp352 StuI ERG6-LYS2-ERG6 % homolog rekombination LiAc transformered Steril kontrol* * Der laves kun to sterilkontroller; en på plader uden uracil og en på plader uden lysin. 109

110 Genteknologi Øvelse 9: Transformation af gær SPØRGSMÅL TIL RAPPORT, ØVELSE 9 A: Redegør i tekst og tegning for de molekylære mekanismer bag homolog rekombination. B: Den egenskab at homolog rekombination mellem transformeret DNA og gærgenomet finder sted med en høj frekvens kan anvendes i gene disruption og gene replacement eksperimenter. Forklar i tekst og tegning, hvordan du ved hjælp af et klonet vildtypegen vil disrupte vild type genet og replace vild type genet med en muteret allel. C: I YAC (yeast artificial chromosomes) plasmider kan der klones mere end 500 kbp. I hvilke situationer er det en fordel? Hvilke restriktionsenzymer ville det være specielt fordelagtigt at bruge til skæring af DNA et? D: Diskuter ud fra jeres data fordele/ulemper ved brugen af YIp plasmider i forhold til YEp plasmider. I hvilke situationer er det smart at bruge YIp plasmider henholdsvis YEp plasmider? E: I højere eukaryoter sker homolog rekombination med en meget lavere frekvens end i gær. Hvad betyder det for forsøg med integration af plasmider i for,eksempel mammale celle kulturer og i forbindelse med fremstilling af transgene dyr? F: Hvordan kan man blandt en serie transgene dyr finde de meget få (<1 %) hvor integrationen af et plasmid er sket ved homolog rekombination? G: Opgør transformationsfrekvensen i gær ved hjælp af tabellen oven for. Sammenlign med resultaterne for E. coli transformationen i øvelse 7. H: Hvordan kan man eksperimentelt vise, at de Nal og lysin autotrofe transformanter vi samler op er opstået ved homolog rekombination? I: Efter transformation af gær med ERG6-LYS2-ERG6 PCR produktet opnår vi også nogle transformanter der er Nal R og lysin autotrofe. Hvorledes kan det forklares? S 110

111 Øvelse 10: Reportergener ØVELSE 10: ANVENDELSE AF REPO RTERGENER Anvendelser af reportergener har altid været et vigtigt værktøj i molekylærbiologisk forskning. Klassisk set har reportergener været anvendt til studier af regulering af genekspression både på transkriptionel og translationel niveau. Der er således været anvendt to forskellige typer reportergenfusioner; transkriptionelle fusioner og translationelle fusioner. Forskellen mellem de to typer fusioner er beskrevet i Figur 1. A Promoter Kozak/SD ATG Reportergen B Promoter Kozak/SD ATG Reportergen Figur 1: A, skematisk fremstilling af en transkriptionel fusion hvor kun promotoren kommer fra det det gen,, der skal undersøges, medens Kozak sekvensen/shine-dalgarno (SD) sekvensen kommer fra reportergenet. B, skematisk fremstilling af en translationel fusion hvor reportergenet er fusioneret in frame til en stykke af det gen (angivet som en sort kasse) hvis regulation skal undersøges. En transkriptionel fusion konstrueres ved at fusionere et DNA fragment indeholdende promotoren men ikke Shine-Dalgarno sekvensen og initieringskodon (hvis undersøgelsen skal foregå i bakterier) eller Kozak sekvensen og initieringskodon (hvis undersøgelsen skal foregå i en eukaryot). Det er naturligvis vigtigt at anvende et reportergen, der ikke er reguleret på translationel niveau. Produktion af reporterprotein vil således afspejle transkription fra den undersøgte promotor. En translationel fusion fremstilles ved at reportergenet fusioneres in frame til det gen der naturligt transkriberes af promotoren. Det vil sige at reporterproteinets dannelse afhænger af transktiption af gen-reportergen fusionen samt translation af gen-reportergen messengeren. Translation af reporter messengeren sker således fra detundersøgte gens Shine-Dalgarno sekvens/aug kodon henholdsvis Kozaksekvens/AUG kodon. Er der regulation på translationel niveau vil det således kun afsløres ved at bruge en translationel 111

112 Øvelse 10: Reportergener fusion. Til fremstilling af transkriptionelle og translationelle fusioner er de mest anvendte reportergener lacz (kodende for β-galactosidase) fra E. coli, luciferase fra ildfluen Photinus pyralis eller fra Renilla reniformis eller chloramphenicol acetyl transferase fra transposon Tn3. I planter er gus genet (kodende for β-glucuronidase) fra E. coli det mest anvendte. LacZ aktivitet er nem at måle, idet spaltning af det farveløse substrat orto-nitrophenyl-galactopyranosid frigør orto-nitro-phenyl som er gult og kan kvantifiseres apektrofotometrisk ved måling af OD 420. Luciferase er blevet det mest populære reportergen til måling af promotor aktivitet, idet det er meget sensitivt og nemt kan måles i et luminometer. Luciferase katalyserer oxidation af luciferin i en reaktion der kræver ATP eller coenzym-a samt oxygen. Når overskud af luciferin tilsættes luciferase udsendes der et lyskvant, hvis intensitet er propertional med mængden af luciferase enzym. Intensiteten af dette lyskvant måles i et luminometer. Der finde forskellige luciferase analoger således, at det efter co-transfektion af en cellelinje med to plasmider med hver sin luciferase reporter er muligt at måle begge aktiviteter på det samme preparat i luminometeret blot ved at måle udsendelse af lys ved forskellige bølgelængder. Chloramphenicol acetyl transferase har klassisk set været den mest anvendte rapporter i mammale celler. Chloramphenicol acetyl transferase katalyserer overførsel af en acetylgruppe fra acetyl-coa til chloramphenicol. Anvendes 14 C-mærket chloramphenicol dannes først 1-acetyl-[ 14 C]chloramphenicol og 3-acetyl- [ 14 C]chloramphenicol og dernæst 1,3-acetyl-[ 14 C]chloramphenicol. Reaktionsprodukterne kan separeres ved tyndlagskromatografi og detekteres ved autoradiografi. Assayet kalibreres til at forløbe i et tidsrum, hvor der kun produceres mono-acetylerede chloramphenicol derivater. I dag har anvendelsen af ELISA asssays med anti-catantistoffer for en stor del overhalet radioaktiv mærkning og tyndlagskromatografi. gus genet fra E. coli koder for enzymet β-glucuronidase. Dette enzyms aktivitet kan let bestemmes i intakte planter ved tilsætning af det kromogene substrat 5-bromo-4- chloro-3-indoyl-β-d-glucuronide (sammenlign med X-gal i øvelse 7). Det er imidlertid også muligt at anvende reportergener til at undersøge lokalisering af proteiner i celler. Her er det især anvendelse af Green flourescens protein (GFP) fra vandmanden Aequorea victoria, der har været brugt. Green flourescens protein er et stærkt flourescerende protein, der ikke kræver tilsætning af noget substrat for at flourescere. Dette er derfor velegnet til at visualisere lokaliseringen af fusionsproteiner i levende celler. Dette kan gøres uden at ødelægge cellerne. GFP anvendes således som en 112

113 Øvelse 10: Reportergener translationel fusion til det protein, man gerne vil undersøge lokaliseringen af. Det har nemlig ofte vist sig, at fusion til GFP ikke ændrer den cellulære lokalisering af fusionsproteinet i forhold til det native protein. Der er udviklet en række analoger af GFP, som udsender lys af en anden bølgelængde (farve) end det oprindeligt isolerede GFP protein og hvor flourescensen er kraftigere. I denne øvelse vil vi illustrere anvendelse af reportergener ved at monitorere hvorledes aminosyresult i gær kan inducere produktion af en transkriptionsfaktor Gcn4p på translationel niveau. Derudover vil vi undersøge effektet af protein fejlfoldning i ER lumen på aktivering af en signal transduktionsvej der hedder the unfolded protein response Strukturen af GCN4 genet er vist i Figur 2. Det der er karakteristisk for GCN4 genet er tilstedeværelse af fire små åbne læserammer foran den egentlige GCN4 læseramme. Disse åbne læserammer fungerer som regulatorer af GCN4 translation, idet GCN4 læserammen kun translateres når eif2α er fosforyleret. Kinasen der fosforylerer eif2α hedder Gcn2p. For at monitore GCN4 translation anvender vi en DNA konstruktion hvor lacz genet fra E. coli er fusioneret in frame til starten af GCN4 genet. For at monitorere transkriptionen af GCN4 anvender vi en DNA konstruktion hvor startkodon i de fire små åbne læserammer er ændret fra ATG til GTG og starten af GCN4 er fusioneret in frame til lacz. Et af de gener Gcn4 regulerer er HIS4 genet. For at monitorere om HIS4 transkriptionen forøges under stress situationer anvender vi en DNA konstruktion hvor starten af HIS4 genet er fusioneret til lacz genet. Disse tre lacz fusioner er indsat på kromosomet ved homolog rekombination som angivet i øvelse 9. Strukturen af de tre plasmider er vist i Figur 3. De udleverede cytosol fraktioner er oprenset fra celler før og 24 timer efter tilsætning af 3 amino triazol (3AT) eller før og 24 timer efter induktion af heterolog ekspression. Når man måler reporter gen aktivitet er den interesante parameter reporter protein aktivitet per mg total protein eller eventuelt per OD 450, hvis målingen sker på permeabiliserede celler. I denne øvelse vil vi måle β-galaktosidase aktiviteten i oprensede cytsol fraktioner. 113

114 Øvelse 10: Reportergener Figur 2: Strukturen af genet GCN4 og den muterede version, hvor start kodon for disse læserammer er ændret fra ATG til GTG. 114

115 Øvelse 10: Reportergener NheI SalI GCN4' LYS2 lacz ppap2915 bla PMB1 ori PstI NheI SalI GCN4' LYS2 lacz ppap2983 bla PMB1 ori PstI Figur 3: Strukturelt kort over den translationelle GCN4 reporter ppap2915 og den transkriptionelle GCN4 reporter ppap2983 I begge plasmider transkriberes GCN4-lacZ fusionen fra GCN4 promotoren.. LYS2, α- amino-adipate-genet fra S. cerevisiae; lacz, β-galactosidase fra Ε. coli ; GCN4, et stykke af GCN4 genet; de fire små åbne læserammer er angivet som små stolper ; Amp, ampicilin resistens gen til selektion i E. coli; pmb1, replikations origin fra E. coli. HIS4-lacZ fusionen er magen til ppap2983 bortset fra at GCN4 delen er udskiftet med starten af HIS4 genet. HIS4-lacZ fusionen transkriberes således fra HIS4 promotoren. R 115

116 Øvelse 10: Reportergener OVERSIGT OVER ØVELSE 10. Dag 1: Udfør β-galaktosidase assayet som anført i Appendix side 137. Lav tribelbestemmelser. Dag 2: Beregn β-galaktosidase aktiviteten som angivet i Appendix side 137 og udregn middelvædi og spredning. Reporter gærstamme GCN4-lacZ wt GCN4 Δuorf -lacz wt HIS4-lacZ wt GCN4-lacZ Gcn2Δ GCN4 Δuorf -lacz Gcn2Δ GCN4-lacZ Gcn2m2 GCN4-lacZ S51A Sui2 UPR-lacZ wt UPR-lacZ Hac1Δ UPR-lacZ Ire1Δ Stress Stimuli ± 3AT ± 3AT ± 3AT ± 3AT ±3AT ±3AT ±3AT ± β-me ± β-me ± β-me β-galaktosidase aktivitet snit spredning 116

117 Forøglse af rekombinanter APPENDIX. STRATEGIER TIL FORØGELSE AF FRAKTIONEN AF REKOMBINANTER VED KLONING Ved kloning af DNA kan der spares både tid og penge, hvis man nøje planlægger sin kloning og gennemtænker de mulighede r, der er for udførelsen. D.v.s. valget af vektor, enzymer der skal bruges, donor DNA etc. Nedenstående punkter er forskellige muligheder der enkeltvis eller i kombination kan lette arbejdet med at finde de rigtige kloner. 1) Anvend ordentligt rent vektor og doner DNA, helst søjle-oprenset som angivet i appendix side 133 2) Undgå egentlige blunt-end kloninger (indsættelse af blunt-end fragmenter i blunt- i vektoren). 3) Anvendelse af vektorer der tillader nem screening af inserts, f.eks. kloning i et end site resistensgen, i positiv selektions vektorer eller i lacz som i puc og pbluescript vektorerne. 4) Dephosphorylering af vektor øger frekvensen af kloner med inserts. Phosphatase virker bedst med 5' sticky ender, dårligere med blunt ender og duer ikke til 3' sticky ender. 5) Anvendelse af oprensede fragmenter øger sandsynligheden for den ønskede klon. 117

118 Agarose gelelektroforese AGAROSE GELELEKTROFORESE. Agarose gelelektroforese er den mest anvendte metode til analyse af DNA fragmenter. Agarosegeler adskiller DNA fragmenter efter størrelse. Migrations-længden for lineære DNA fragmenter er tilnærmelsesvis propertional med logaritmen til størrelsen (molekylvægten). Migrationshastigheden for lineære DNA molekyler er langsommere end for de tilsvarende cirkulære, supercoilede molekyler (cccdna). Til analyse af uskåret plasmid DNA, som normalt indeholder såvel cccdna som ocdna (open circular DNA), er 0.7% geler de bedste. På denne gel kører cccdna cirka dobbelt så hurtigt som ocdna, der migrerer lidt langsommere end lineært DNA. Til analyse af skåret DNA må man vælge sin agarose koncentration ud fra tabel. DNA'et i gelen visualiseres med ethidiumbromid (EtBr) som interkalerer i DNA strengene og giver rød flourescence ved belysning med UV-lys. % Agarose Effektiv adskillelsesområde i kb Ønsker man en virkelig god opløsning af fragmenter mindre end 1kb benyttes 8 % acrylamidgeler. 118

119 FREMSTILLING AF AGAROSEGEL - 0.7% Agarose gelelektroforese Til 100 ml gelopløsning: 0,7 g agarose TBE buffer til 100 ml Agarosen afvejes og blandes med buffer og smeltes i mikrobølgeovnen. Gennemkoges i 3-5 min. på laveste effekt. Agarosen nedkøles til ca. 60 C, tilsættes EtBr til 0.5 µg/ml og hældes op i støbekar med slotformer. Når agarosen er størknet trækkes slotformerne op og gelen lægges over i elektroforesekarret med SAMME buffer som i gelen. Prøverne påsættes med en Gilson pipette P20 (den samme spids kan godt bruges til alle prøverne, blot der skylles et par gange imellem hver påsætning med buffer). Der påsættes normalt 15µl pr. slot. Husk altid at påsætte en molekylvægtsmarkør og en uskåret prøve. Gelen køres ved 100V til den blå farve er migreret ca. 2/3 ned i gelen. DNA'et er negativt ladet og migrerer derfor mod den positive pol. Gelen lægges på et UV bord og der tages eventuelt et termoprint af gelen. N.B.! ETHIDIUMBROMID ER MUTAGENT, BRUG HANDSKER, UNDGÅ DRYP, TØR OP VED SPILD. Man kan opbevare agaroseopløsninger ved enten 65 C i flydende eller i fast form, som blot smeltes umiddelbart før brug. EtBr tilsættes umiddelbart før ophældning af gelen. 119

120 Restriktionsenzymer BRUG AF RESTRIKTIONSENZYMER. Samtlige restriktionsenzymer kræver Mg 2+ for at være aktive. Derudover har hvert enzym et bestemt sæt fysisk-kemiske betingelser for optimal aktivitet. Det gælder således ph, ionstyrke, temperatur m.m. Disse betingelser fremgår af de kataloger, der udgives af producenterne. De fleste restriktions enzym bufre er lavet som 10 X koncentrerede stamopløsninger, som opbevares i køleskab eller fryser. Restriktionsenzymskæringer foretages oftest med 0.2-1µg DNA i volumina fra 10-50µl. 1 unit enzym er defineret som den mængde, der skærer 1µg lambda DNA fuldstændigt på en time under de anbefalede betingelser. Prisen på restriktions enzymer er meget forskelligt per unit. Navnene på restriktionenzymer skrives delvist i kursiv som foreksempel EcoRI. Navnet stedfæster i hvilken organisme restriktionsenzymet oprindeligt er identificeret. EcoRI henfører således til Escherichia coli restriktionsenzym nummer 1. Analogt henfører HindIII til Haemophilus influenzae restriktionsenzym nummer III. Restriktionenzymer opbevares normalt ved -20 C. Anvendes de sjældent kan de opbevares ved -80 C. Når man tager enzym foregår det ved fryseren og der anvendes engangs-handsker for at beskytte mod DNA'se kontamination, og der anvendes autoklaverede spidser. Altid en ny spids til hver pipetering. Når man holder på røret med enzym gøres det på toppen af røret for at undgå opvarmning af enzymet. Normalt anvendes 1-2 units enzym pr. prøve, og der inkuberes ved de optimale betingelser i 2 timer. Hvis dit DNA ikke kan skære, er det sandsynligvis fordi det er urent, ikke fordi enzymet er inaktivt. Prøv at spritfælde (evt, fenolisere) dit DNA og skær det igen. Hvis man ønsker at skære sit DNA med mere end et restriktionsenzym, er det ofte muligt at gøre det i et trin. Kontroller enzymernes skæringsbetingelser ved at kikke i kataloget efter afhængighed af ph og salt. Ellers skæres først med det enzym, som kræver mindst salt. Efter den første skæring spritfældes DNA'et, tørres, opløses i TE buffer, tilsættes ny enzym buffer og skæres igen. De firmaer, som forhandler restriktionsenzymer, har udviklet nogle (forskellige!) 120

121 Restriktionsenzymer universelle restriktionsbufre, hvor der med kun 4-5 bufre kan skæres med de fleste enzymer (se skemaet fra New England Biolabs og Promega som ligger fremme i laboratoriet). Man skal være opmærksom på, at nogle enzymer er mindre aktive med supercoilet plasmid DNA (se New England Biolabs kataloget), d.v.s. at samme antal units enzym kræver længere tid for at skære. Man skal også være opmærksom på, at nogle restriktionsenzymer ikke skærer methyleret DNA. Man skal derfor konsultere New England Biolabs kataloget før man skærer sit DNA med et bestemt restriktionsenzym. De fleste E. coli stammer har to methylerings systemer, dam og dcm. Dam methylasen overfører en methylgruppe fra S- adenosylmethionin til N 6 positionen af adenin rester i sekvensen GATC. Dcm methylasen methylerer den interne cytosin rest i sekvensen CCAGG og CCTGG på C 5 positionen. Det kan derfor i visse situationer være nødvendigt at anvende DNA isoleret fra dam - og/eller dcm - stammer. GENEREL PROCEDURE FOR RESTRIKTIONSSKÆRING AF DNA. Restriktions enzym bufre kommer fra firmaet som 10 x buffere, med eller uden BSA. D.v.s., at der til restriktionsskæring tilsættes 1/10 vol 10 x buffer og 1/10 volumen 10 x BSA 2 units restriktionsenzym samt TE buffer til et slutvolumen på typisk 50 μl. Hvis restriktionsbufferen indeholder BSA som ved disse øvelser tilsættes bare 1/10 volumen 10 x buffer. Det er vigtig hver gang man skal foretage en restriktionsskæring at man lige konsulterer hvilken buffer der skal bruges. 121

122 Oprensning af DNA fra gel OPRENSNING AF DNA FRAGMENTER FRA AGAROSE GEL VED HJÆLP AF GFX PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT FRA AMERSHAM BIOTECH 1. Vej et tomt Eppendorf rør og noter vægten til nærmeste 10 mg 2. Skær gelstykke indeholdende DNA ud af gelen med en ren skalpel. Skær så tæt ved DNA et som muligt. Skær evt. stykket i flere mindre stykker inden det overføres til Eppendorf rør 3. Vej røret indeholdende DNA-gelstykket og udregn vægten af gelstykket 4. Tilsæt 10 ul Capture buffer for hver 10 mg gel. (Maximal kapacitet for søjlen er 300 µl buffer og 300 mg gel.) 5. Luk røret og vortex grundigt. Inkuber ved 60 C indtil agarosegelen er helt opløst (5-15 min) 6. Placer en GFX søjle i en Collection Tube 7. Når agarosen er helt smeltet, centrifugeres Eppendorf røret kort for at samle prøven i bunden af røret 8. Overfør prøven til GFX søjlen. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min 9. Centrifuger 30 sekunder ved rpm 10. Smid den gennemløbne væske ud ved at tømme Collection Tube n. Placer GFX søjlen i Collection Tube igen 11. Tilsæt 500 µl vaskebuffer til søjlen. Spin 30 sekunder ved rpm 12. Overfør GFX søjlen til nyt, rent Eppendorf rør. Skriv holdnr på siden af røret og klip rørets låg af. (Ellers går rørets låg tit i stykker under centrifugering) 13. Tilsæt 50 µl elueringsbuffer (TE eller H 2 O) til søjlen. 14. Inkuber prøven ved stuetemperatur i 1 minut 15. Spin 1 minut ved rpm 16. Overfør prøven til nyt Eppendorf rør, smid søjlen ud. 122

123 August Krogh Instituttet Defosforylering DEFOSFORYLERING. med Fermentas Scrimp alkalisk phosphatase 1) Skær DNA'et som sædvanligt 2) Tilsæt 1/10 vol buffer og 1 unit (1 μl) phosphatase og inkuber i 30 min ved 37 C 3) Inkuber 15 min. ved 65 C. Effektiviteten kan checkes ved at ligere og transformere med en del af vektor DNA'et uden tilsat doner DNA. 123

124 August Krogh Instituttet Alkohol fældning af DNA og RNA ALKOHOLFÆLDNING AF DNA OG RNA Alkoholfældninger anvendes til opkoncentrering af DNA og RNA og til at fjerne lavmolekylære stoffer fra DNA og RNA prøver. DNA og RNA fælder ud i tilstedeværelse af monovalente kationer og alkohol. Normalt kræves der som endelig koncentration i den vandige DNA opløsning: mindst 0.3 M NaAcetat eller mindst 0.2 M NaCl eller mindst 2.0 M NH 4 Acetat 1. Juster koncentrationen af monovalente kationer i opløsningen til ovenstående. 2. Tilsæt 2-3 volumen kold 96% EtOH, bland godt (Whirlimix). 3. Med meget lidt DNA eller meget små fragmenter (< 1 kb) kan sættes DNAet til udfældning ved -20 C i 20 minutter. 4. Spind pellet ned ved rpm i 10 min. 5. Fjern straks supernatanten ved at vende røret på hovet. Den sidste dråbe kan eventuelt fjernes ved at duppe røret på et stykke køkkenrulle. 6. Vask 2 gange med 200 µl 80% EtOH, idet der spindes 2 min ved rpm mellem hver vask. Efter sidste vask duppes røret på et stykke køkkenrulle. Pellet (ofte usynlig) tørres i en Speed Vac eller i en varmeblok ved 60 o C (ca. 10 minutter). 7. Genopløs DNA'et i et passende volumen TE eller vand. 8. DNA i TE opbevares i køleskab, DNA i vand opbevares ved - 20 C. Modifikationer A) Fældningen kan også fortages ved -20 C med 0.6 vol isopropanol, hvilket giver et mindre volumen. B) Ved fældning af små DNA fragmenter (<200 bp) kan tilsættes MgCl 2 til 0.01 M. C) Fældning af RNA kræver lidt højere koncentration af alkohol, mindst 2.5 vol EtOH. 124

125 August Krogh Instituttet Fenolisering af DNA FENOLISERING AF DNA. Den sikreste måde at inaktivere og fjerne DNA'ser, restriktionsenzymer, fosfatase, Klenow polymerase eller hvad man nu har anvendt af DNA-modificerende enzymer er phenol ekstraktion. I enkelte tilfælde kan det dog også opnås ved inkubation ved 65 C i 15 min. Dette kan slås op i Biolab kataloget eller i Maniatis. Proceduren udføres i stinkskab iført handsker, phenol er ætsende. Phenolfasen er den nederste. 1. Bland DNA prøven med 1 vol phenol ekvilibreret med TE i et engangs polypropylen rør med tætsiddende låg (eppendorf rør til små prøver), whirlimix til jævn emulsion. Der skal være to faser. 2. Spind 1-3 min ved stuetemperatur, rpm. Faserne skal være helt adskilte. 3. Overfør vandfasen (den øverste) til et nyt rør med engangspipette. 4. Fenolrester fra vandfasen extraheres med 2 gange med 1 vol. kloroform, som fjernes fra bunden. 5. DNA'et spritfældes som angivet i Appendix side 124. Phenol og kloroform overføres til flaske i stinkskabet mærket fenol/kloroform affald. Brugt engangsplast smides i dertil indrettet affaldsbeholder i stinkskabet. Evt. ikk e engangsrør skylles 2 gange i 96% EtOH som hældes i phenolaffaldsbeholderen, og derefter grundigt i postevand før det lægges til vask. Evt. dryp af phenol tørres op, og der aftørres med 96% EtOH. Evt. kontamination af centrifuger fjernes ved vask med 96% EtOH og derefter vand. 125

126 Phenol på huden: skyl grundigt med vand og EtOH. Phenol i øjnene: skyl grundigt med vand. August Krogh Instituttet Fenolisering af DNA 126

127 Ligering LIGERING. 1. Donor DNA og vektor DNA blandes, der fyldes op med TE buffer til 200µl og der phenolekstraheres. Efter cloroform ekstraktion og spritfældning tørres DNA'et. 2. Ligeringsbufferen udtages fra -20 C fryseren; indholdet fra 1 "rødt" rør, et "sort" rør og et "grønt" rør tøes op og indholdet blandes i et af rørene. Dette har vi gjort til øvelserne, så den ligeringsbuffer i får udleveret er en 1 x ligerings buffer. 3. DNA'et opløses i 20µl af ligeringsbufferen. Den overskydende mængde ligeringsbuffer smides væk. 4. Tilsæt 0.5µl T4 DNA ligase. 5. Inkuber 2 timer eller O.N. ved 16 C. Ligeringsmix: Grønt rør 50µl 80 mm DTT Rødt rør 50µl 4mM ATP Sort rør 100µl 100mM Tris + 20 mm MgCl 2 ph 7.5. Rørene opbevares ved -20 C. 127

128 August Krogh Instituttet Kompetente E. coli til nedfrysning TRANSFORMATION AF E.COLI. KOMPETENTE CELLER AF E. COLI: 1. Pod ml LB + evt. antibiotika med 0.5 ml af en FRISK overnats kultur. OD 450 bør være ca Ryst ved 37 C, mål OD 450 jævnligt. 3. Ved OD 450 ca. 0.6 høstes 1 X 40 ml kultur i et sterilt centrifugerør med låg, ved centrifugering rpm i 5 min. 4. Pellet genopslemmes i 20 ml iskold 10 mm MgSO 4 5. Spind cellerne 8000 rpm i 5 min. 6. Genopslem forsigtigt i 10 ml iskold 50 mm CaCl 2 7. Inkuber på is i 30 min. 8. Spind 7000 rpm i 2 min i kold centrifuge (hjerteformet pellet). 9. Genopslem, forsigtigt i 1 ml iskold CaCl 2, hold på is. Transformation af kompetente celler ,1 ml kompetente celler tilsættes 20µl DNA 11. Står ved O C 30 min. 12. Varmechok, 3 min. ved 42 C i en varmeblok 13. Sæt på is. 14. Tilsæt 1 ml LB. For udtryk af kanamycin og tetracyclin resistens inkuberes ved rystning ved 37 o C i 2 timer. Der behøves ikke fænotypisk expression for udtryk af Amp genet. 15. Høst cellerne ved 5000 rpm i 3 min. og fjern 900 μl af supernatenten og resuspender cellerne i den tilbageblevne mængde LB. 16. Udplad på selektive medier. NB. HUSK KONTROLLER FOR STERILITET OG TRANSFORMABILITET. For sterilitet udplades en tilsvarende mængde celler, som ikke har fået tilsat plasmid. For transformabilitet transformeres de kompetente celler med en kendt mængde DNA af kendt koncentration. En transformationsfrekvens på pr. µg DNA er rimeligt. 128

129 August Krogh Instituttet Kompetente E. coli til nedfrysning Der findes desuden en række andre måder til transformation af E. coli samt til nedfrysning af kompetente E. coli celler. KOMPETENTE E.COLI CELLER TIL NEDFRYSNING. 100 ml opløsning A inokuleres med 400 μl ON kultur til OD ved 37 o C. Ved OD 450 = 0.6 stilles cellerne på is i 10 minutter, hvorefter de spindes 8000 rpm i 10 min. Cellerne resuspenderes forsigtigt i 0.8 ml iskold opløsning A. Tilsæt 4 ml sterilfiltreret opløsning B. Bland godt uden at whirli mixe. Fordel de kompetente celler i portioner af 0.1 ml og frys dem hurtigt ved 80 o C. Det er vigtigt at cellerne under de ovenfor beskrevne procedurer bliver holdt på is. For transformation udtages de frosne celler og anbringes på is, hvor de tøs op. Efter optøning tilsættes DNA og indholdet blandes ved at vende røret et par gange. Rørene anbringes i køleskab i 30 minutter, hvorefter de varmeshockes i 1 min ved 42 o C og anbringes på is i 2 min. Hvis transformanterne skal selekteres for Kan, Cam eller Tet resistens tilsættes 1 ml LB og kulturerne sættes til fænotypisk ekspression i 2 timer ved 37 o C, hvorefter cellerne spredes på selektive plader. Ved selektion for Amp resistens tilsættes cellerne 1 ml LB og spindes 5000 rpm i 2 min. 800 μl supernatent suges fra og cellerne resuspenderes i resten af mediet og spredes på Amp plader. Opløsning A: LB + 10 mm MgSO + 0.2% glukose Opløsning B: 36% glycerol + 12% PEG mm MgSO i LB

130 Plasmid preparation GFX PLASMID MINIPREPARATION FRA E. COLI MED GFX TM MICRO PLASMID PREP KIT. 1. Høst 1.5 ml O.N. cellekultur i et Eppendorfrør (8000 rpm, 2 min). Sørg for at fjerne al supernatanten ved at duppe røret på et stykke køkkenrulle. 2. Resuspender cellepellet fuldstændigt i 150 μl Solution I 3. Tilsæt 150 μl Solution II og bland ved at vende røret10-15 gange. Opløsningen skal blive klar Tilsæt 300 μl Solution III og bland ved at vende røret gange. Spind røret rpm i 5 min. Medens centrifugen kører sættes en GFX søjle per oprensning i en Collection Tube. Supernatanten fra 5 tilsættes GFX søjlen uden at der kommer noget af bundfaldet med. Lad være at prøvet at få hele supernatanten med. Inkuber 1 minut ved stuetemperatur. Spind 30 sekunder ved fuld hastighed og smid gennemløbet væk. 8. Tilsæt 300 μl Solution III og spind ved fuldhastighed i 30 sekunder. Smid 9. gennemløbet ud. 10. Tilsæt 400 μl Washbuffer. Spind 1 minut ved fuld hastighed. Smid gennemløbet væk og sæt søjlen ned i et Eppendorfrør. 11. Tilsæt 100 μl TE buffer og inkuber ved stuetemperatur i 1minut. 12. Spind ved fuld hastighed i 1 minut. Gem gennemløbet (DNAet) ved 4 o C 130

131 Plasmid preparation Fermentas PLASMID PREPARATION MED FERMENTAS GENEJET TM PLASMID MINIPREP KIT 1) Høst celler fra 1,5 ml udvokset E. coli kultur ved centrifugering ved rpm i 2 minutter. 2) Resuspender cellerne i 250 μl Resuspension buffer. Alle cellrne skal være resuspenderet. 3) Tilsæt 250 μl lysisbuffer og bland grundigt ved at vende røret 4-6 gange. Opløsningen skal blive viskøs og mere klar. 4) Tilsæt 300 μl Neutralization solution og bland ved at vende røret 4-6 gange. Opløsningen skal blive klumpet og sej. 5) Centrifuger ved rpm i 5 minutter. 6) Overfør supernatanten UDEN celledebris til en GeneJET TM søjle. 7) Centrifuger ved rpm i 1 minut. Kasser gennemløbet (til GMO affald). 8) Tilsæt 500 μl Wash buffer og centrifuger i 1 minut ved rpm. 9) Gentag punkt 8. 10) Kasser gennemløbet (til GMO affald) og centrifuger yderligere 1 minut ved rpm. 11) Overfør GeneJETTM søjlen til et nyt eppendorfrør og tilsæt 50 ml elueringsbuffer. Lad søjlen stå i 2 minutter. 12) Centrifuger ved rpm i 2 minutter. 13) Gem gennemløbet (indeholder DNA) og smid søjlen væk (til GMO affald). 131

132 Transformation af gær TRANSFORMATION AF GÆR 1. Inokuler 50 ml YPD medium med 3 ml af en frisk overnatskultur (er gjort af laboratoriet). Mål OD 450 og inkuber kolben ved 30 C med rystning indtil OD 450 = Høst cellerne i Sorval centrifugen ved 5000 rpm. i 5 min. Vask cellerne en gang i 25 ml sterilt vand, høst som ovenfor og resuspender cellerne i 1 ml sterilt vand. Overf ør cellerne til et Eppendorfrør og spind cellerne 2000 rpm i 2 min. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml TE/LiAc og høst som ovenf or. Resuspender cellerne i ml TE/LiAc. 3. Bl and i et Eppendorfrør 50 μl celler, 5μl (200 ng) plasmid 5 μl (50μg) carrier DNA. Tilsæt 300 μl sterilt 40% PEG/TE/LiAc og whirley mix så der opnås homogenitet. Overfør blandingen til 10 ml fladbundede rør og inkuber disse ved 30 C med rystning i 30 minutter. 4. Overfør blandingen til et Eppendorfrør og anbring det i en varmeblok ved 42 C i 15 min. (varmeshock) 5. Høst cellerne ved 2000 rpm i 2 min og fjern forsigtigt supernatanten. Resuspender cellerne i 1 ml TE buffer og høst som overfor. Resuspender i 100 μl TE og plad cellerne ud på selektive plader. Carrier DNA: 10 mg/ml sonikeret, phenoliseret og kogt kalvethymus DNA. Efter 10 minutters kogning placeres DNAet ved -20 C. 132

133 Oprensning af DNA fra opløsning OPRENSNING AF DNA FRA OPLØSNING MED GFXTM PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT Dette kit vil vi anvende til at fjerne primere, nukleotider, salte etc. fra PCR reaktioner. Placer en GFX søjle i en Collection Tube for hver oprensning. Tilsæt 500 μl Capture Buffer til hver GFX søjle. Tilsæt DNA opløsningen til GFX søjlen. Bland omhyggeligt ved at pipetere op og ned 6 gange. Spind ved fuld hastighed i 30 sekunder i bordcentrifugen. Smid supernatanten ud og placer igen søjlen i Collection Tube. Tilsæt 500 μl Wash Buffer til søjlen. Spind ved fuld hastighed i 30 sekunder. Smid Collection tube væk og placer søjlen i et Eppendorf rør. Tilsæt 50μl TE buffer og inkuber søjlen ved stuetemperatur i 1minut. Spind ved fuldhastighed i 1 minut. Gem eppendorfrøret ved 4oC og smid søjlen ud. 133

134 Genteknologi Oprensning af DNA fra gel OPRENSNING AF DNA FRAGMENTER FRA AGAROSEGELER MED GFXTM PCR DNA AND GEL PURIFICATION KIT. 1) Vej et tomt Eppendorfrør og noter vægten 2) Skræ det stykke agarose der indeholder det ønskede bånd ud af gelen med en skalpel. Skær agarosen i mindre stykker og overfør til det vejede Eppendorfrør 3) Vej Eppendorfrøret med agarose 4) TIlsæt 10 μl Capture buffer for hver 10 mg gel (søjlen kan maksimalt klare 300 μl Capture Buffer). 5) Luk Eppendorfrørert og whirlimix kraftigt. Inkuber ved 60 o C indtil agarosen er opløst (5-15 minutter) 6) For hver oprensning placer en GFX søjle i en Collection Tube. 7) Når agarosen er helt opløst spindes 30 sekunder ved fuld hastighed i centrifugen for at samle uopløst materiale. 8) Overfør prøventil GFX søjlen og inkuber ved stuetemperatur i 1 minut. 9) Centrifuger ved fuld hastighed i 30 sekunder. 10 ) Tøm Collection Tube og sæt søjlen tilbage igen. 11) Tilsær 500 μl Wash buffer. Spind 30 sekunder ved fuld hastighed. 12) Smid Colection Tube væk og placer søjlen i et Eppendorfrør. 13) Tilsæt 50μl TE buffer til søjlen og lad ståe ved stuetemperatur i 1 minut. Centrifuger ved fuld hastighed i 1 minut og gem DNAet ved 4 o C. 134

135 3 [ H]-ouabain binding LIGEVÆGTSBINDING AF [ 3 H]-OUABAIN TIL GÆRMEMBRANER. 1. Optø de udleverede gærmembraner. Sæt derefter straks på is. For hver prøve blandes som i skema fra venstre mod højre. Rør 2 x Bindingsbuffer [ 3 H]-Ouabain 10 mm ouabain Membraner H 2 O ( μl) (1:200) (μl) (μl) (μl) (μl) Inkuber en time ved 37 C i vandbad. Vend jævnligt røret. 3. Inkuber 20min på is. Det er meget vigtigt at alle rør holdes iskolde fra nu af! 4. Vend røret nogle gange så membranerne er homogent resuspenderet og overfør 900μl til et nyt for-kølet eppendorfrør. 5. Overfør 50μl af det resterende volumen til totaltælling i scintilationsrør. 6. De 900μl centrifugeres 14000rpm/30min ved 4 C i kølecentrifuge. 7. Hæld forsigtigt supernantanten fra og vask pellet med 1ml iskold skyllebuffer og centrifuger igen 14000rpm/10min. 8. Gentag vask med 1ml iskold skyllebuffer. 9. Centrifuger igen 14000rpm/10min, hæld supernantanten fra og fjern forsigtigt den resterende buffer med en vatpind. Pellet må ikke røres! 10. Resuspender pellet i 200μl 1 M NaOH ved pipetering. 11. Udtag heraf 150μl til scintillationsrør. 12. Tilsæt 4ml scintillationsvæske til hvert rør (husk rørene fra punkt 5), vortex grundigt og tæl prøverne i scintillationstælleren. 2 x bindingsbuffer 6 mm MgSO 4 2 mm NaTris 2 VO 4 135

136 2 mm EGTA 20 mm MOPS-Tris ph 7.2 1M Sorbitol Skyllebuffer: 3 mm MgSO 1 mm NaTris VO mm EGTA 10 mm MOPS-Tris ph [ H]-ouabain binding 136

137 β-galaktosidase måling MÅLING AF β-galaktosidase AKTIVITET PÅ OPRENSEDE CYTOSOL FRAKTIONER. 1) Sæt den udleverede cytosol preparation på is. For hver prøve overføres 100 μl (svarende til 50μg) til hver af tre glasrør som også placeres på is. 2) Tilsæt i stinkskab 900 μl Z-buffer. Resten af eksperimentet foregår i stinkskab. 3) Inkuber prøverne ved 28 o C i vandbadet i stinkskabet 5 minutter. Den udleverede og optøede ONPG opløsning placeres også i vandbadet i 5 min. 4) Start reaktionen ved at tilsætte 0,2 ml ONPG til hvert rør. Dette gøres nemmest ved at tilsætte til det første rør, vente 30 sek. Og tilsætte til det næste o.s.v. Noter det precise tidspunkt for tilsætningen til det enkelte rør. 5) Når opløsningen bliver svag gul stoppes den ved tilsætning af 0,5 ml Na 2 CO 3 og tidspunktet noteres. 6) Mål OD 420. overfor vand. β galaktosidase aktiviteten udregnes som :1,7 X OD 420 /0,0045 x 0.05 mg x tiden i minutter). Middelværdi og spredning på middelværdien udregnes. Z-buffer: 16,1 g Na 2 HPO 4 7H 2 O 5,5 g NaH 2 PO 4 H 2 O 0,75 g KCl 0,246 g MgSO 4 7 H 2 O 2,7 ml β-mercapto ethanol H 2 O til 1 liter indstil ph til 7,0 og gem ved 4 o C ONPG (o-nitrophenyl-β-d-galactosid) 4mg/ml I Z-buffer Na 2 CO 3 1M i H 2 O ONPG er farveløs medens spaltningsproduktet ONP er gult. 137

138 Medier MEDIER TIL GÆR OG BAKTERIER. LB MEDIUM. (Luria-Bertani medium) Komplekst rigt medium til bakterier. 10 g Bacto Trypton 5 g Yeast Extract 10 g NaCl Fyld op til 950 ml med destilleret vand, indstil ph til 7.4 med NaOH, fyld op til 1000ml med destilleret vand og autoklaver 20 min ved 121 C. YPD MEDIUM. Komplekst rigt medium til gær. 10 g Yeast Extract 20 g pepton 20 g glukose 1 liter destilleret vand. Indstil ph til og autoklaver 20 min ved 121 C. SD MEDIUM. Syntetisk minimal medium til gær. 100 ml ASD ml 20% glukose 1 ml 10% CaCl ml destilleret vand. Eventuelle krav-stoffer tilsættes. Efter autoklavering tilsættes 5 ml V-200. ASD g (NH 4) 2SO4 8,75 g KH2PO g K 2 HPO g MgSO 4 X 7 H 2 O 1.00 g NaCl 1.0 ml H 3 BO 4 0.5% Opl. 0.4 ml CuSO 4 X 5H2O 0.1% Opl. 1.0 ml KI 0.1% Opl. 138

139 Medier 0.4 ml FeCl 3 X 6H 2 O 0.5% Opl. 0.6 ml ZnSO 4 X 7H2O 0.7% Opl. 1.0 ml MnSO 4 0.4% Opl. 0.4 ml NaMO 4 0.5% Opl. Opløses i 1000 ml vand og ph indstilles til V mg Biotin 80.0 mg Thiamin 80.0 mg Pyridoxin mg Inositol mg Ca-pantothenat 40.0 mg Riboflavin 80.0 mg Niacin 0.4 mg Folinsyre 40.0 mg p-aminobenzosyre Opløses i 1000 ml vand, sterilfiltreres, fordeles i 1 ml rør og gemmes ved -20 C. 139

140 Plader FREMSTILLING AF PLADER. Plader indeholdende de ovennævnte substrater laves ved at tilsætte 20g agar pr. liter før autoklav ering. Efter autoklavering nedkøles agaren til ca. 60 C (håndvarmt) og eventuelle antibiotika tilsættes. X-gal + IPTG plader. Der tilsættes X-GAL til en slutkoncentration på 20 eller 40µg/ml. X-gal opløses i diethylformamid ( GIFTIGT). En X-gal stamopløsning kan gemmes i fryseren. Der tilsættes IPTG til en slukoncentration på 10-3 M. IPTG opløses i vand. En 100 mm stamopløsning gemmes i fryseren. Antibiotika plader. Følgende antibiotika koncentrationer anvendes sædvanligvis: 100 γ Ampicilin, 8 γ Tetracyclin, 25 γ Kanamycin, 20 γ Cloramphenicol. γ betyder µg/ml. 140

141 Plader STANDARD BUFFERE TE buffer 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0. Autoklaver. 141

142 Isolering af genomisk DNA ISOLERING AF GENOMISK DNA FRA FULDBLOD Ved brug af GFX Genomic Blood DNA Purification Kit 1. Hæm olyse af de røde blodlegemer Mærk et 1.5ml rør pr. prøve. Tilsæt 900µl RBC Lysis reagens til hvert 1.5 ml rør. Tilsæt 300µl fuldblod (velblandet) til de 900µl RBC Lysis reagens Blandingen vendes adskillige gange (blandes grundigt, men ej vortex). Inkubér 5 min ved stuetemperatur (RT). Centrifugér i minicentrifuge rpm i 20 sek Hæld supernatanten forsigtigt ud - uden at miste pellet (bundfaldet)!!! Resuspendér pellet (hvide blodlegemer) i 20-50µl rest-supernatant (rest fra siderne) 2. Ekstraktion Resuspendér de hvide blodlegemer i den resterende supernantant ved kraftig vortex (fuld drøn) Tilsæt 500µl Extractions Solution Bland prøven grundligt ved vortex (fuld drøn). Inkubér 5 min ved RT Imens placeres en GFX søjle i et opsamlingsrør (et sæt pr. prøve) Note: For-varm buffer eller vand for elution til 70 C 3. DNA binding. Overfør hele ekstraktionen til GFX søjlen, der er placeret i samlerøret Centrifugér 1 min ved 5000 g. (ca rpm) Tøm samlerøret og placér GFX søjlen tilbage i det 4. Vask 142

143 Isolering af genomisk DNA Tilsæt 500µl Extractions solution oven på GFX søjlen Centrifugér 1 min ved 5000 g. Tøm samlerøret og placér GFX søjlen tilbage i det. Tilsæt 500µl Wash Solution til GFX søjlen Centrifugér 3 min ved rpm (fuld drøn) Overfør GFX søjlen til nyt mærket 1.5 ml rør 5. Eluering Tilsæt 100µl for-varmet elueringsbuffer/autoklaveret Millipore H 2 O lige ovenpå GFX søjlens glasfibermatrix Inkubér prøven i 1 min ved RT Centrifugér 1 min ved 5000 g Fjern GFX søjlen. Oprenset gdna vil nu være tilbage i 1.5ml røret 143

144 Isolering af RNA OPRENSNING AF TOTAL RNA FRA VÆV MED AF TRI REAGENT Princippet i ekstraktion af RNA er at vævsprøven umiddelbart homogeniseres i medium med en høj koncentration af guanidinium thiocyanate og at RNA adskilles fra protein og DNA ved ekstraktion med phenol-chloroform. Præparation af væv og homogenisering er de mest problematiske trin i isolation af RNA. Det er vigtigt at RNase hæmmes hurtigt af det denataurerende reagens idet især mrna nedbrydes hurtigt. Der bruges en Polytron homogenisator for at sprænge cellerne umiddelbart efter vævet har fået kontakt med det denaturerende medium. Denne metode egner sig til præparation fra små mængder væv. Der udtages ca 0,25 g væv fra en række organer fra rotte. 1. Homogeniser vævet i 1 min i en Ultra-turax homogenisator ved stuetemperatur. 2. Lad Stå ved stuetemperatur i 5 min. 3. Overfør homogenat til rundbundet 12 ml engangs-rør. 4. Centrifugér rpm i 10 min. 4 o C (SS-34 rotor, x g). 5. Overfør væskefasen til nyt 12 ml rør med pipette, undgå kontakt med overliggende fedtfase og bundfald. 6. Tilsæt 200 μl bromklorpropan og vortex kraftigt i 15 sek. 7. Lad stå ved stuetemperatur i 8 min. 8. Centrifugér rpm i 15 min. 4 o C (SS-34 rotor, x g). 9. Overfør den øvre farveløse vandfase til nyt corexrør, undgå kontakt med den røde phenolfase og interfasen. Efter centrifugering findes RNA i vandfasen, mens DNA samles i phenol fasen idet DNA er protoneret ved det sure ph. 10. Tilsæt 1000 μl isopropanol og inkuber ved stuetemp. i 10 min. 11. Centrifugér rpm i 10 min. 4 o C (SS-34 rotor, x g). 12. Fjern supernatant og tilsæt 2,5 ml 75% EtOH og vortex. 13. Centrifugér rpm i 10 min. 4 o C (SS-34 rotor, x g). 14. Fjern supernatant og lufttør RNA et eller tør under vakuum (ikke speedvac) 15. Opløs i 100 μl RNA se frit vand. Opbevar ved -80 o C. 144

145 Revers transkription REVERS TRANSSKRIPTION TIL GENEKSPRESSION Ved kvantitativ analyse af mrna er første trin en reverse transkriptionsreaktion, hvor der syntetiseres en DNA kopi af mrna. Målinger af genekspression ved RT-PCR kan kun sammenlignes, hvis RT reaktionen forløber under identiske omstændigheder m.h.t. primer strategi (random hexamers, oligo(dt), eller gene-specifikke reverse transcription primere) og betingelser for reaktionen. Reverse Transcriptionen udføres her med Oligo dt s og enzymet Superscript (Invitrogen), der udfører førstestrengssyntese af cdna. Kort forløber proceduren således: Bestemt mængde total RNA (f.kes 2µg) og OligodT denatures ved 65 C i 5min efterfulgt af 5 min inkubation på is og quick-spin. Der tilsættes en blanding af DTT, buffer og dntps og derefter Superscript og prøverne inkuberer ved 42 i 50 min, hvor Superscript en vil kopiere mrna et til cdna. Processen inaktiveres til slut ved 15 min inkubation ved 70 C. Efter et quick-spin er prøven klar til brug i PCR. 145

146 TaqMan Prober TAQMAN-PROBER TaqMan analyser og primere Under annealing-trinnet i TaqMan PCR reaktionen hybridiserer TaqMan proben og de to primere med DNA template. DNA polymerasen vil dissociere 5'enden af TaqMan proben, som derefter bliver spaltet af DNA polymerasens 5' nucleaseaktivitet. Herved adskilles fluorophoren i 5' enden af TaqMan proben fra quencher, og fluorescensen stiger proportionalt med antallet af spaltede TaqMan prober. Design af prober og primere til TaqMan analyser Vælg position af TagMan proben først og design primers, der ligger så tæt som muligt ved proben uden at overlappe den. Det anbefales at længden af amplicons holdes indenfor basepar, idet korte produkter giver høj effektivitet. Tm for TaqMan proben skal være C og Tm for proben skal være 8 10 C højere end Tm for primerne (58-60 C) for at sikre at proben er fuldt hybridiseret når DNA polymerase reaktionen starter. I øvrigt overholdes reglerne for G/C indhold som beskrevet for SYBR Green primere Ved mrna bestemmelser kan primere eller Taqman probe med fordel designes så en af dem spænder over intron-exon splejsninger. Herved bliver reaktionen specifik for mrna. I TaqMan analyser, hvor man sammenligner isoformer af samme familie af gener, er det vigtigt at TaqMan proben er specifik for den ønskede isoform. Typiske koncentration af primere er nm og for TaqMan prober nM. 146

147 SYBRgreen primere SYBR-GREEN PRIMERE PCR reaktioner med SYBRGreen som fluorescensprobe er relativt ukomplicerede, men proben binder også til uspecifikke produkter. Det er derfor vigtigt at vælge primere og andre betingelser for reaktionen med stor omhu. Det er vigtigt at holde Mg 2+ koncentrationen (2.5 mm) så lav som muligt. Der bruges en hot start Taq DNA Polymerase uden nuclease-aktivitet. Design af primere til SYBR-Green analyser Korte amplicons ( bp for SYBR) er bedst da de tillader højere effektivitet, idet DNA polymerasen kan afvikle syntesen indenfor kort tid. I et større forsøg kan det være vigtigt at vælge primere med Tm indenfor et bestemt område (55-60 o C), da det tillader brugen af universelle parametre for temperatur-cyklus i PCR reaktionerne. Hold G/C indholdet indenfor området 35 65% og undgå serier af samme nukleotid, især G. G/C-rige sekvenser er særligt tilbøjelige til at danne primer- må ikke have mere end to G og/eller C baser. dimer. Der må ikke være G på 5 enden og de sidste fem nukleotider i 3 enden Primerkoncentrationen holdes i området nm ( begynd med 150 nm) og Mg 2+ omkring 2.5 mm ved SYBR Green analyse 147