Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-1 ØVELSE 8. NYREFUNKTIONEN Øvelsen udføres som en video-demonstration af nyrefunktion på bedøvet rotte Formål Øvelsens formål er at demonstrere visse fundamentale træk af nyres fysiologi ved måling af renale clearance-værdier for 51 Cr-EDTA og lithium (Li + ) i en kontrolsituation og under indvirkning af to principielt forskelligt virkende diuretika (Avanddrivende@ stoffer), Amilorid og Acetazolamid (=Diamox R ). Baggrund 1. Clearancebegrebet: den renale plasma clearance af et stof (x) er defineret som det antal ml plasma, der indeholder den mængde af stoffet, som udskilles pr. minut: C x = U x @ V u @ P-,x 1. 2. Hvad clearance af stoffet (x) er et mål for, afhænger således af stoffets behandling i nefronet. F.eks. for et stof (som inulin og Cr-EDTA), der kun udskilles ved glomerulær filtration og som hverken reabsorberes eller secerneres tubulært, vil dets renale clearance være et mål for filtrationshastigheden (GFR). For et andet stof (som PAH), der udskilles ved filtration + tubulær sekretion således, at extractionsfraktionen er meget høj (ca. 90%), vil dets renale clearance være et mål for det effektive renale plasmaflow. For et stof (som Li + ), der udskilles ved filtration, og som reabsorberes i proksimale tubuli sammen med vand og Na + i samme forhold, som det findes i ultrafiltratet, men som normalt ikke reabsorberes distalt for pars recta af proksimale tubulus, vil dets renale clearance være et mål for flow af tubu-lusvæske ud af proksimale tubulus (V prox ) (se nedenfor). Supplement til lærebog Den glomerulære filtrationshastighed (GFR) er bestemt af: 1. det hydrostatiske tryk i glomeruluskapillærerne, P gc = ca. 50 mm Hg 2. det gennemsnitlige kolloid-osmotiske tryk, π = ca. 25 mm Hg (P gc - π) = P UF, ultrafiltrationstrykket = ca. 25 mm Hg 3. trykket i Bowmann=s kapsel, P BOW = P prox = ca. 15 mm Hg (Da der ikke er måleligt trykfald gennem proksimale tubulus, kan P BOW sættes lig med P prox, det hydrostatiske tryk i proksimale tubulus). 4. filtrationskoefficienten, K f, som er den hydrauliske permeabilitet (L p ) ganget med arealet af glomeruluskapillærerne, (A), altså L p @ A. GFR = K f @ [(P gc - π) - P BOW ] P UF - P prox = netto P UF = ca. 10 mm Hg, er trykfaldet over glomerulusmembranen. Dette bestemmer GFR=s størrelse under fysiologiske forhold, da K f her kan regnes for konstant. P prox er således en betydelig størrelse i forhold til netto P UF. For at forstå hvad der er bestemmende for GFR=s størrelse er der 3 forhold (a, b, og c i det efterfølgende), man må have klargjort. a) Det er væsentlig at forstå, at P prox bestemmes af: 1) P UF (d.v.s. P gc - π) 2) Indløbsmodstanden = strømningsmodstanden over glomerulusmembranen K-,f 1 = R ind
Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-2 3) Den samlede strømningsmodstand efter proksimale tubulus = summen af modstande i Henles slynge, distale tubulus og samlerør = R udl, som sammen med trykfaldet fra proksimale tubulus til pelvis renis (ca. 15 mm Hg) bestemmer udløbsflow. 4) absolutte proksimale reabsorptionshastighed (APR). Den proksimale compliance spiller en rolle for, hvor hurtigt en ændring i filtrationstryk afspejles i P prox, men spiller ingen rolle for steady state trykket. P prox er altså variabel, men da trykket er stabilt i steady states, må det være reguleret. Reguleringsmekanismen er en negativ tilbagekoblings-sløjfe, der kaldes den Atubuloglomerulære feedback mekanisme@ (TGF), anatomisk lokaliseret til det juxtaglomerulære apparat (JGA), som vil blive gennemgået nedenfor. b) R ind er langt mindre (40-50 gange mindre) end R udl, og c) APR er helt overvejende en Atilbuds-uafhængig@ isosmotisk væskereabsorption, d.v.s. den er stort set uafhængig af tryk og flow gennem proksimale tubulus, men er styret hormonalt og af den sympatiske nerveaktivitet. 75-80% af ultrafiltratet reabsorberes proksimalt. Udfra en hydrodynamisk betragtning over nefronets modstandsforhold (pkt. b) og APR=s tilbuds-uafhængighed (pkt. c), gælder det, at en ændring (f.eks. en stigning) i P gc eller fald i π umiddelbart vil medføre en stort set parallel ændring (stigning) i P prox, og derfor ingen ændring i trykfaldet over glomerulusmembranen (net P UF ), d.v.s. ingen målelig ændring i GFR. GFR vil naturligvis ændres lidt svarende til det øgede udløbsflow fra proksimale tubulus som følger af stigningen i P prox. Denne stigning i flow gennem Henle=s slynge vil øge Na + -koncentrationen for enden af tykke ascenderende ben af Henle (TAL) udfor macula densa (M.D.). Her er [NaCl] lav (ca. 40 mm) på grund af den aktive NaCl transport i TAL, som ikke følges af vandtransport, da dette nefronafsnit er vand-impermeabelt. NaCl-nettotransporten er derfor på dette sted (M.D.) koncentrations-limiteret og vil stige (tilbuds-afhængigt), når [NaCl] stiger. Dette er stimulus til TGF mekanismen. TGF responderer på en stigning i [NaCl] med 2 ændringer: 1. Afferent arteriolekontraktion. 2. Nedsat reninsekretion som bevirker, at angiotensin-ii koncentrationen lokalt i cortex nedsættes (da der er converterende enzym tilstede lokalt). Og vice versa, hvis [NaCl] falder (variationsområde 20-80 mm). TGF-mekanismen En ændring (f.eks. stigning på 5 mm Hg) i filtrationstrykket (P UF ) medfører en parallel stigning i P prox (i dette eksempel på ca. 5 mm Hg). Følgelig øges Henle flow og NaClkoncentrationen ved M.D. stiger. TGF responset 1. Øjeblikkelig afferent arteriole kontraktion, som vil nedsætte P gc, og dermed tilsvarende P prox. 2) Fald i reninsekretion, som lidt forsinket giver fald i lokale angiotensin-ii-koncentration i cortex-interstitset og i plasmaet i efferente arteriole. Angiotensin-II har 2 effekter i cortex, som spiller en rolle for TGF (og har desuden talrige andre effekter både i nyren (marven, hvor effekten bliver nedsat Na-ekskretion) og uden for
Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-3 nyren (på binyre, hjerte, perifere kar og hjerne), for at anføre nogle eksempler). De 2 virkninger af angiotensin i cortex, der har betydning for TGF, er: 1) Vasokonstriktion overvejende på efferente arteriole. (øger også afferente arterioles følsomhed for TGF-stimulus). Faldet i [ANG-II] giver derfor dilatation af vas efferens, (og nedsætter til en vis grad afferente TGF betingede kontraktion), og giver dermed yderligere fald i P gc og P prox. Disse to vaskulære responser er altså additive i tilbagereguleringen af trykket, som dog ikke reguleres helt tilbage, måske i eksemplet kun de 4 mm Hg. Da P prox ændres parallelt med P UF (P gc ), giver det vasculære respons i sig selv ingen ændring i GFR. 2) Hæmning af absolutte, proksimale reabsorptionshastighed. Et fald i [ANG-II] vil derfor øge APR, hvilket vil give yderligere fald i P prox, i dette eksempel yderligere 1 mm Hg, d.v.s. helt tilbage præcist til udgangsniveauet. Tubulustrykket falder således mere end P UF. Derfor ændres trykfaldet over glomerulusmembranen (net P UF ) og dermed GFR. I eksemplet her ændres trykfaldet fra 10 til 11 mm Hg, og GFR vil stige ca. 10%. Det bemærkes her, at TGF har bevirket at P prox er reguleret tilbage, og at denne regulering har medført en ændring i APR, og dermed i GFR, samt en ændret karmodstand, der giver ændring i renale blood flow (RBF) i samme retning (oftest parallelt). Konklusion Tubulustrykket er en variabel, der er præcist reguleret til konstant steady state niveau via en negativ feedback (TGF), således at flow til nedenforliggende afsnit (Henle=s slynge og samlerør) holdes stabilt, hvilket er forudsætningen for en præcist reguleret salt- og vandudskillelse. Ændringer og absolutte størrelse af GFR er bestemt af den totale tubulære reabsorptions hastighed under fysiologiske forhold. Da APR udgør 75-80%af GFR, bliver APR afgørende. Hermed er der en forklaring på fænomenet den Aglomerulo-tubulære balance@, som blot udtrykker, at GFR og den tubulære reabsorptionshastighed under normale fysiologiske forhold varierer parallelt. GFR kan kun ændres måleligt, hvis 1) reabsorptionshastigheden ændres og/eller 2) hvis strømningsmodstanden distalt for proksimale tubulus (R udl ) ændres. Ved fysiologiske ændringer regner man med, at R udl er ret konstant. APR bliver derfor normalt afgørende for GFR=s størrelse. Det er i denne forbindelse vigtigt at gøre sig klart, at man med en clearance bestemmelse af GFR, f.eks. C 51-EDTA eller C inulin, hvor C in = U in @ V u @ P-,i1,n, måler det integrerede produkt af 2 partial-processer, filtrationsprocessen og reabsorptionsprocessen, som forløber samtidigt un-der clearancemålingen. Man kan derfor udfra en clearancemåling af GFR ikke afgøre, om en evt. ændring skyldes ændring i glomerulusfunktionen eller i tubulusfunktionen. En patofysio-logisk ændring kan skyldes enten en ændring i glomerulusfunktionen eller i tubulusepithelets reabsorptionskapacitet, eller et fald i antal af fungerende nefroner. Li + -clearance Li + filtreres frit over glomerulusmembranen og koncentrationen i ultrafiltratet vil være lig med koncentrationen i plasma-vand (i praksis = P Li ). Li + reabsorberes proksimalt parallelt med Na + og H 2 O (isosmotisk reabsorption). Ved udløbet fra proksimale pars recta vil Li + -
Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-4 koncentrationen i tubulusvæsken (TF) ligesom for Na + være den samme som i ultrafiltratet, hvorfor ratio (TF @ P!1 ) Li = 1,0). Mængden af Li +, der forlader proksimale pars recta pr. tidsenhed vil være TF Li @ V prox (hastigheden = konc. @ flow). Normalt sker der ingen (målelig) Li + - reabsorption distalt for proksimale tubulus. Mængden af Li +, der forlader proksimale pars recta, vil derfor være lig med udskillelseshastigheden (TF Li @ V prox ) = (U Li @ V Li ). Ved division med P Li på begge sider af lighedstegnet får man: (TF @ P!1 ) Li @ V prox = (U Li @ V li ) @ P-,L1,i = C Li. Da (TF @ P!1 ) Li = 1, har man at C li = V prox. Clearance for 51 Cr-EDTA benyttes som mål for den glomerulære filtrationshastighed, GFR, og lithium-clearance tages som mål for den volumenhastighed, hvormed tubulusvæsken forlader det samlede proksimale tubulære system, V prox eller Aproximal delivery of water@. C Li @ (C 51-Cr EDTA )!1 er således et mål for passagefraktionen (F pass ) for enden af den proksimale pars recta. Det er en absolut forudsætning for et godt udbytte af øvelsen, at deltagerne forbereder sig grundigt i forvejen og sætter sig ind i såvel forsøgsgangen som i det teoretiske grundlag for forsøget og de dertil knyttede målinger og analyser. Praktisk udførelse (video demonstration) Præparation af rotten. En rotte på ca. 250-300 g anæsteseres med halotan-ilt gasblanding i en glasklokke. Herefter vedligeholdes anæsthesien på åben maske, mens den bedøvede rotte præpareres med katetre: 1) et i hø. a. carotis comm. (til blodprøvetagning og arteriel blodtryksmåling), 2) to i v. jugularis (til infusioner) og 3) et i trachea. Når præparationen er tilendebragt, indgives indikatorstofferne 51 Cr-EDTA og LiCl som en i.v. Apriming@ dosis, der efterfølges af en passende vedligeholdelses- (Asustaining@) dosis, og rotten overføres til opvarmet operationsbord. Nyren og ureter frilægges gennem abdominalsnit, og der indlægges et kateter i ve. ureter (til kvantitativ urinopsamling). Ve. nyrearterie fridissekeres, og en flowprobe anbringes omkring arterien til elektromagnetisk bloodflowmåling. Filmen demonstrerer måling af nyrens blodgennemstrømning, mikropunkturteknik og måling af tubulusvæskens passagetid gennem nefronet og ureterkatetret ved hjælp af farvestoffet Lissamingrønt (LG), der gives som en bolus intravenøst. LG behandles i nefronet ligesom inulin. Tiden fra LG=s ankomst til glomeruli til farvefronten når til enden af ureterkatetret benævnes Adelay time@. Delay time fra ultrafiltratets dannelse til den færdige urin når ned i opsamlingsglasset kan, når man kender den, anvendes til mere præcis korrektion af den plasmakoncentrationsværdi, der svarer til den gennemsnitlige urinopsamlingsperiode, d.v.s. til den plasmakoncentration, der forelå, da urinen i midten af opsamlingen blev dannet som ultra-filtrat. Ved normale diureser på en rotte (5-10 µl @ min!1 ) kan man regne med et delay på 5 min ved høje diureser (over 20 µl @ min!1 ) vil forsinkelsen være ca. 2 min. Efter en ækvilibreringsperiode på mindst 30 min efter Apriming@ påbegyndes kvantitativ urinopsamling i 10 min=s perioder, som nummereres fortløbende: U1, U2, U3.. o.s.v. Der tages 4 arterielle blodprøver i forsøgets løb (efter U1, U4, U7 og U10), nummereret I, II, III, IV, til bestemmelse af 51 Cr-EDTA-aktivitet og Li + -koncentration i plasma. Disse plasmaværdier benyttes ved beregning af renale clearance i hver af 10 min=s perioderne, idet den enkelte clearanceberegning baseres på udskillelseshastighederne for indikatorstof i perioderne og den svarende til periodens midtpunkt beregnede (interpolation) plasmakoncentration (evt. korrigeret for Adelay time@, se senere). Efter to kontrolperioder (C 1 og C 2 =20 min) gives en i.v. enkeltdosis af amilorid (25 µg) efterfulgt af fire 10 min=s perioder (A 1 til og med A 4 ). Derpå gives en i.v. enkeltdosis af acet-
Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-5 azolamid (Diamox R ). 1,25 mg) efterfulgt af yderligere fire 10 min=s clearanceperioder (D 1 til og med D 4 ). Skematisk fremstillet er forsøgsgangen følgende: i.v. infusion, isotonisk saltvand (0,9% NaCl) 20 µl @ min!1 ------------------------------------------------------------------------------ Asustaning@ 51 Cr-EDTA + LiCl i 0,9% NaCl Apriming@, 1,75 ml i.v. clear.periode C 1 C 2 A 1 A 2 A 3 A 4 D 1 D 2 D 3 D 4 urin nr. U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U10 tid,min 0 30 50 70 90 110 130 blodprøve I II III IV start stopur * amilorid Diamox 25 µg i.v. 1,25 mg i.v. Urinprøver Urinen opsamles fra ureterkatetret i 10 min=s perioder i klare plastikglas, nummereret U1, U2, U3...o.s.v., som i forvejen er udvejede (inklusive prop). Uringlassene tilproppes straks ved afslutning af opsamlingsperioden og vejes, hvorefter de anbringes til 51 Cr-EDTA-tælling direkte i γ-tællerens Abrønd@. Urinprøverne tælles successivt, efterhånden som de foreligger, med en fikseret tælletid på f.eks. 150 s. Li + -, Na + - og K + -koncentrationerne bestemmes ved atomabsorptionsspektrofotometri. Blodprøver Efter forudgående udtømning af det volumen blod/saltvand, som står i katetrets Adead space@, tappes ved hver blodprøvetagning ca. 0,5 ml blod i heparinglas. Hver blodprøve centrifugeres hurtigst muligt, hvorpå plasma tages fra. Af hver plasmaportion afpipetteres 2 @ 100 µl (dobbeltbestemmelse) i samme type plastikglas, som benyttes til urinopsamling. Der tælles, som for urinprøvernes vedkommende, i 150 s på hver afpipettering. Efter forsøgets gennemførelse aflives rotten ved i.v. injektion af overdosis af sovemidlet (barbiturat) mebumal. Forsøgsdyrets ve. nyre udtages, renses for bindevæv- og fedt, drænes og vejes med 0,01 g=s nøjagtighed. Behandling af måleresultater og udarbejdelse af rapport Rapporten skal indledes med en kort og præcis beskrivelse af øvelsens hovedideer. Herunder skal der redegøres for det teoretiske grundlag for anvendelsen af clearance-begrebet til vurdering af funktionsparametre i nyre. Der skal nøje redegøres for de forudsætninger, der fører til antagelserne at: 1) 51 Cr-EDTA clearance kan tages som mål for filtrationshastigheden (GFR).
Øvelse 8. NYREFUNKTIONEN Side 6-6 2) Li + -clearance kan tages som mål for udløbet af tubulusvæske fra proksimale tubuli (V prox ). Desuden skal der redegøres for, hvorledes man udfra disse forudsætninger og med kendskab til nefronets behandling af soluter og vand i proksimale og distale afsnit kan vurdere de absolutte og fraktionelle transporthastigheder i proksimale tubuli og i tubulusafsnit beliggende distalt herfor. Herefter fremlægges beregningerne. 51 Cr-aktivitet i urin- og plasmaprøver Resultater af tællingerne i gamma-tællerens 51 Cr-kanal foreligger i det udleverede skema A, hvor der tillige er indført vejetal for uringlassene. For samtlige prøver er tælletallene korrigeret for baggrundsaktiviteten, som er målt med brønden tom. For plasmaprøvernes vedkommende er der opgivet gennemsnit for hver dobbeltbestemmelse. 51 Cr-aktiviteterne og Li + -koncentrationerne i plasma indtegnes på mm-papir med tiden som x-akse, således at plasma-koncentrationen svarende til midten af urinopsamlingsperioden kan findes ved interpolation. Eventuelt korrigeres for Adelay time@. Herefter beregnes for hver urinopsamlingsperiode clearanceværdier og udskillelseshastigheder som opføres i de resterende felter i skemaerne A og B. Endelig fremstilles resultaterne grafisk som søjlediagrammer på mm-papir (A4) med tiden som x-akse (abscisse) (1 min = 2 mm) begyndende med urinopsamlingsperiode 1. Ordinatværdier afbildes med forskellige signaturer (evt. farver) og med passende skalering. Der fremstilles to (2) grafer på hver sit stykke mm-papir: A) på det ene afbildes: værdier fra hver 10 min=s urinopsamlingsperioder af: vandudskillelseshastigheden i µl @ min!1 @ g!1 (d.v.s. pr. g nyrevægt) Na + -udskillelseshastigheden i µmol @ min!1 @ g!1 K + -udskillelseshastigheden i µmol @ min!1 @ g!1 B) på det andet afbildes værdierne for hver 10 min=s clearanceperiode af: 51 Cr-EDTA clearance i µl @ min!1 @ g!1 Absolutte proksimale reabsorptionshastighed (APR) i µl @ min!1 @ g!1 Fraktionelle proksimale reabsorption (FPR = 1 - Li-Clear @ ( 51 Cr-EDTA-clear)!1 ) Effekten af de indgivne enkeltdoser af amilorid og acetazolamid på udskillelseshastighederne for vand, natirum og kalium beskrives, og der redegøres for virkningsmekanismerne. Effekten af amilorid og acetazolamid på den renale clearance for 51 Cr-EDTA og lithium forsøget igennem beskrives, og der skal redegøres for mekanismerne ved eventuelle ændringer i beregnet GFR (glomerulære filtrationshastighed). Hvilke konklusioner kan der ud fra forsøgsresultaterne drages med hensyn til det tubulære angrebspunkt for henholdsvis amilorid og acetazolamid? Angiv præmisserne for disse konklusioner. Revideret 1997 Paul Peter Leyssac