Undersøgelse af contrast MRSA bouillon til hurtigere identifikation af MRSA

Undersøgelse af contrast MRSA bouillon til hurtigere identifikation af MRSA 29-05-2013 Forfatter: Sabrina L. L. Christensen (122027) Klinisk vejleder: Bioanalytikeruderviser Erica Bracher Jørgensen Intern vejleder: Lektor, cand. scient., ph.d. Henning Ilsø Antal tegn: 46.490 VIA University College, Bioanalytikeruddannelsen, Aarhus Den praktiske del af projektet er udarbejdet i samarbejde med Alma Palic Side 1 af 52

Forord Der skal lyde en stor tak til alle bioanalytikere på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Aalborg Universitetshospital (KMA). Alle har været søde til at hjælpe, hvis der har været spørgsmål eller med det praktiske arbejde i weekenderne. Specielt tak til Hanne Rebsdorf som har hjulpet os med at analysere PCR prøver fra contrast, og Freddy Iversen som har hjulpet os med at finde statistik over overvågningsprøver i 2012 for KMA. Der skal også lyde en tak til hygiejnesygeplejerskerne Tinna Urth og Pernille Luther, som har podet alle patienter, og været behjælpelig med spørgsmål om anvendeligheden af contrast MRSA bouillon. Heidi fra Oxoid skal også have tak for hjælpen med anskaffelsen af contrast MRSA bouillon, og efterfølgende opklarende spørgsmål om contrast MRSA bouillon. Resumé Formål: Vi vil undersøge, om Contrast MRSA bouillon (contrast) fra OXOID kan erstatte den nuværende oksebouillon med 6,5 % NaCl (oksebouillon) fra SSI, for at gøre proceduren omkring dyrkning af methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA) hurtigere og gøre håndteringen af overvågningsprøver i laboratoriet lettere. Desuden vil vi undersøge priser for contrast og oksebouillon. Metode: Vi anvendte 124 patientprøver, som blev inokuleret i både contrast og oksebouillon. Oksebouillonen blev håndteret i rutinen på KMA, og blev betragtet som den gyldne standard, hvor vi selv håndterede contrast. Contrast blev inkuberet ved 35 C i 24 timer. Både contrast og oksebouillon blev udsået på MRSA ID agar, og ved grønne kolonier på pladen efter inkubation, blev der udført flere konfirmatoriske tests. Resultater: Sensitiviteten for contrast ved indikatoromslag er 25,0 %, hvor specificiteten er 92,0 %. Sensitiviteten, efter at de konfirmatoriske tests er udført, er 75,0 %, mens specificiteten er 99,1 %. Prisen for contrast er 14,83 kr./stk., mens prisen for oksebouillonen er 37 kr./stk. Konklusion: Contrast kan ikke implementeres på KMA, da sensitiviteten er for lav, hvilket vil sige, at der er for mange falsk negative resultater. Økonomisk vil KMA kunne spare mange penge ved at indføre contrast som opformeringsmedie. Side 2 af 52

Indholdsfortegnelse Forord... 2 Resumé... 2 1.0 Introduktion... 4 1.1 Baggrund... 4 1.2 Formål... 6 1.3 Problemformulering... 6 1.4 Målformulering... 6 2.0 Teori... 7 2.1 Staphylococcus aureus... 7 2.2 Methicillin resistente Staphylococcus aureus... 7 2.3 MRSA CC398... 8 2.4 Analyseprincip... 9 3.0 Materiale og metoder... 10 3.1 Materialer... 10 3.1.1 Substrater... 10 3.1.2 Apparatur og utensilier... 10 3.2 Forsøgsdesign... 11 3.3 Sensitivitet og specificitet... 15 3.4 Litteratursøgning... 15 4.0 Resultater... 16 4.1 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon... 16 4.1.1 Sensitivitet og specificitet for indikatoromslag af contrast MRSA bouillon... 16 4.1.2 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon efter de konfirmatoriske tests er udført.... 16 4.2 Semikvantitativ vurdering af mængden på MRSA ID agar for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl... 16 4.3 Priser for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl... 17 5.0 Diskussion... 17 5.1 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon... 17 5.2 Semikvantitativ vurdering af mængden på MRSA ID agar for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl... 21 5.3 Priser for Contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl... 22 Side 3 af 52

5.4 Diskussion af metoden og contrast... 23 6.0 Konklusion... 24 7.0 Perspektivering... 25 8.0 Referenceliste... 25 Bilag... 28 1.0 Introduktion 1.1 Baggrund Methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA) infektioner har været kendt siden 1961 i England (1), og har også været kendt i Danmark i 1960 erne (2). Siden 2002 har man set en stigning af MRSA infektioner i Danmark, som kan skyldes ændring af smittespredningen af MRSA. Den største stigning ses i samfundserhvervede MRSA infektioner, hvor hospitalserhvervede MRSA infekti- Side 4 af 52

oner har været på lavt stabilt niveau siden 2007. Antallet af MRSA infektioner er steget med 66 % fra 2007 til 2010, hvilket svarer til 1.097 nye tilfælde (3). MRSA af typen CC398, som man har kendt til siden 2004, er en af årsagerne til stigningen af MRSA infektioner. Det er en MRSA type, som primært findes hos svin, og typisk smitter gennem inficerede svinebesætninger, og kan smitte mennesker (4). I Danmark var der i 2012 1568 MRSA infektioner, hvoraf 233 var MRSA CC398 dvs. 14,9 %. I Nordjylland var der 141 MRSA infektioner, hvoraf 65 var MRSA CC398 dvs. 46,1 % (5). Det betyder, at der i Danmark årligt er 0,0042 % af befolkningen, som bliver smittet med MRSA CC398, hvor 0,011 % af befolkningen i Nordjylland bliver smittet med MRSA CC398 (6). Derudover ses infektioner med MRSA CC398 i over 30 % af alle MRSA infektioner i Sønderjylland og Vestjylland (5). Den høje forekomst af MRSA CC398 infektioner skyldes den høje svineproduktion i Jylland. Sundhedsstyrelsen har lavet en vejledning i 2006 Vejledning om forebyggelse af spredning af MRSA, som er blevet revideret november 2012. Ændringen er sket på baggrund af, at antallet af infektioner med MRSA CC398 er steget, samt at MRSA infektioner kan medføre øget sygelighed og dødelighed. Denne vejledning beskriver, at personer som arbejder med svin, samt personer i hustanden er i en risikogruppe for at blive smittet med MRSA CC398. Det betyder, at disse personer ved indlæggelse samt ved infektioner med stafylokokker skal undersøges for MRSA. Denne vejledning skal følges af personalet indenfor sundheds- og plejeområdet (7,8). I Region Nordjylland er det hygiejnesygeplejerskerne, som har kontakten med MRSA smittede personer, hvilket indebærer bl.a. overvågning, udredning samt iværksættelse af infektionsprofylakse (9). Desuden foretager hygiejnesygeplejerskerne overvågningspodninger og kontrolpodninger af MRSA smittede patienter. På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Aalborg Universitetshospital (KMA) anvendes i dag oksebouillon med 6,5 % NaCl fra Statens Serum Institut (SSI) som opformeringsmedie til identifikation af MRSA. Svartiden for negative prøver er ca. 2 døgn, og 3-4 dage ved positive prøver (10). Oxoid har fremstillet et medie, Contrast MRSA bouillon, til detektion af MRSA. Ved anvendelse af Contrast MRSA bouillon vil svar på negative prøver forelægge allerede efter 1 døgn. Indikatoromslag efter 1 døgn indikerer et positivt resultatet, hvorefter der udføres flere konfirmatoriske tests. Cont- Side 5 af 52

rast MRSA bouillon med indikatoromslag kan slutsvares efter 2-3 døgn. De konfirmatoriske test er de samme tests, som udføres for oksebouillon med 6,5 % NaCl (11). Med dette projekt vil vi belyse om Contrast MRSA bouillon fra Oxoid kan erstatte den nuværende oksebouillon med 6,5 % NaCl fra SSI. Det nye screeningstiltag gør, at der kommer mange prøver til Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Aalborg Universitetshospital (KMA). Hvis Contrast MRSA bouillon kan erstatte oksebouillonen 6,5 % NaCl, vil det betyde, at negative prøver allerede efter 1 døgn slutsvares uden yderligere håndtering af afdelingen, hvilket gør, at afdelingen har færre prøver at håndtere. Desuden vil en hurtigere detektering af MRSA betyde en hurtigere behandling af patienter ved positive prøver og hurtigere svar ved negative prøver. 1.2 Formål Vi vil undersøge, om Contrast MRSA bouillon fra Oxoid kan erstatte den nuværende oksebouillon med 6,5 % NaCl fra SSI, for at gøre proceduren omkring dyrkning af MRSA hurtigere og lette håndteringen i laboratoriet. Dyrkningen af MRSA vil blive hurtigere ved, at man vil kunne forkorte svartiden med et døgn for både positive og negative prøver. I det de negative prøver ikke skal udsås, og allerede kan sorteres fra efter et døgn, vil laboratoriet have færre prøver at håndtere. 1.3 Problemformulering Hvilken konsekvens vil det have for Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Aalborg Universitetshospital at udskifte den nu anvendte oksebouillon med 6,5 % NaCl fra SSI til detektion af MRSA med Contrast MRSA bouillon fra Oxoid? 1.4 Målformulering - Vi vil lave en metodesammenligning af Contrast MRSA bouillon med oksebouillon med 6,5 % NaCl, hvor oksebouillon med 6,5 % NaCl anvendes som den gyldne standard. Dette gøres ved at anvende patientprøver fra overvågningspatienter, hvor hygiejnesygeplejerskerne dobbeltpoder patienterne. Efterfølgende arbejde med oksebouillonen med 6,5 % NaCl udføres af medarbejderne på KMA, hvor vi udfører arbejdet med contrast MRSA bouillon, herefter beregnes sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon. - Vi vil undersøge, om Contrast MRSA bouillon er et bedre opformeringsmedie end oksebouillon med 6,5 % NaCl ved at vurdere mængden af vækst på MRSA ID agar semikvantitativt. Side 6 af 52

- Vi vil undersøge prisen for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl samt besparelsen af MRSA ID agar ved anvendelse af contrast MRSA bouillon. 2.0 Teori 2.1 Staphylococcus aureus Staphylococcus er grampositive kokker i hobe, og er en del af menneskets normalflora på huden og slimhinder. Slægten blev beskrevet første gang i 1878, og er en af de almindeligste infektioner. Særlig Staphylococcus aureus (S. aureus), som kaldes den gule staphylokok, er patogen, og giver anledning til hudinfektioner. Forskellen mellem S. aureus og andre staphylokokker er, at S. aureus er koagulasepositiv, dvs. at S. aureus kan producere et enzym, man kalder koagulase. Koagulase danner fibrin, som beskytter S. aureus fra leukocytter, som angriber bakterien. De andre staphylokokker, som forekommer hos mennesket, kalder man koagulasenegative staphylokokker (KNS). Staphylokokker vokser bedst under aerobe forhold, men er fakultativ anaerobe bakterier, og kan desuden vokse ved højt saltindhold. De fleste S. aureus, som stammer fra mennesker, har protein A i peptidoglykanlaget i cellevæggen (1). Ca. 50 % af befolkningen er bærer af S. aureus. Hvor raske bærere kun har en lille risiko for at blive syge, har personer som i forvejen er svækket eller syg en øget risiko for at få en alvorlig infektion (8). Beta-laktamantibiotika er en fællesbetegnelse for antibiotika, som indeholder en kemisk struktur kaldet beta-laktamring. Det første og mest kendte beta-laktamantibiotika er penicillin. Penicillinase produceres af 70-80 % af staphylokokstammerne, og spalter beta-laktamringen i penicillin, hvorved penicillin inaktiveres, det betyder, at de fleste staphylokokker er resistente overfor penicillin. Derfor udviklede man et nyt antibiotikum, methicillin, i 1960 til behandling af staphylokokker (1). 2.2 Methicillin resistente Staphylococcus aureus Den første methicillin resistente S. aureus fandt man i 1961, kun et år efter at methicillin blev taget i brug. Methicillinresistens skyldes meca genet, som er en del af et DNA-segment, der hedder staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). meca genet koder for PBP-2, et penicillinbindende membranprotein, der erstatter funktionen af de tre normale penicillinbindende membranproteiner, PBP1, PBP2 og PBP3. Normalt binder beta-laktamantibiotika sig med kovalente bindinger til PBP, derved hæmmes enzymer, som er med i dannelsen af peptidoglykan i S. aureus cellemembran, hvilket svækker cellevæggen. PBP-2 gør, at beta-laktamantibiotika har lav affinitet til S. aureus, hvilket betyder, at MRSA er resistent overfor alle beta-laktamantibiotika. Methicillin an- Side 7 af 52

vendes ikke længere klinisk, men betegnelsen methicillin resistens anvendes stadig (1). Alle S. aureus stammer screenes for MRSA med cefoxitin. Hvis S. aureus er resistent for cefoxitin, tyder det på MRSA, hvor følsomme S. aureus stammer ikke er methicillin resistente (12). Personer på hospitaler og plejehjem, som i forvejen er syge eller svækket, har en øget risiko for at få en alvorlig infektion med MRSA, derfor er der fokus på MRSA i disse institutioner. Smitte med staphylokokker sker primært mellem mennesker, og sker ofte ved tæt kontakt med især pårørende. Desuden kan bakterien overleve i flere måneder i miljøet som fx støv. Især god håndhygiejne er en vigtig faktor for at undgå smittespredning med MRSA (8). Ved patienter som screenes for MRSA tages der en podning fra næsen, svælget og perineum med kulpodepind eller vatpind. Der podes yderligere, hvis der forekommer sår, kateter, intra venøs dræn- eller indstikssted, trakealsekret og hudaffektioner (13). Personer der bliver testet MRSA-positiv, kan erklæres MRSA-negativ, hvis en kontrolpodning er negativ efter tidligst 6 måneder efter behandlingen. Behandling af MRSA smittede personer sker med mupirocin nasal næsesalve 2 %, som anvendes 2-3 gange dagligt i 5 dage, og klorhexidinsæbe 4 % som anvendes til daglig helkropsvask og hårvask i 5 dage. Alle medlemmer i husstanden behandles, så man undgår krydssmitte. En del af behandlingen er også rengøring af hjemmet og kontrol efter 6 måneder. Ydermere skal MRSA smittede personer være opmærksom på at mindske risikoen for at smitte andre personer. Dette gøres ved at dække sår og have en god håndhygiejne, desuden modtager den MRSA smittede et personligt MRSA-kort, som skal fremvises, når personen er i kontakt med sundhedsvæsenet (8). Infektioner med MRSA er forbundet med øget morbiditet og mortalitet, derfor er det vigtigt at holde antallet af MRSA infektioner på et lavt niveau, hvilket også er grunden til, at MRSA infektioner er anmeldelsespligtig (4). 2.3 MRSA CC398 MRSA CC398 har været kendt siden 2004 (4), og har reservoir i specielt svin. MRSA CC398 kan smitte fra svin til menneske, hvor smitte af MRSA CC398 mellem mennesker sjældent ses i forhold til andre MRSA-typer. Dvs. at MRSA CC398 primært ses hos personer, der arbejder med levende svin og i mindre grad hos andre personer. Hvis svinene er MRSA-positive, findes MRSA CC398 også i støv i stalden, og derfor vil personer, der arbejder i stalden, have en højere risiko for at være bærere af MRSA CC398. Mellem 30-80 % af personer som arbejder med positive svinebesætninger, vil være bærere af MRSA CC398. Dvs. at det ikke vil have nogen betydning at behandle disse Side 8 af 52

personer for MRSA CC398, da de vil blive bærer igen i løbet af kort tid. Desuden er risikoen for smitte af andre personer lav. Derfor er der heller ingen begrænsninger for raske bærere ved sociale aktiviteter samt skole og daginstitutioner (8). I 2010 er der set 15 tilfælde af MRSA CC398 smittede personer, som ikke har haft kontakt til svin, dette kan tyde på, at MRSA CC398 ændrer sig, til nemmere at kunne smitte fra person til person, hvilket man gerne vil undgå, da Danmark har en stor svineproduktion (14). Staphylococcus aureus protein A (spa) anvendes til typning af MRSA. Spa-typning udføres ved sekventering af en del af det gen, som koder for protein A. Denne del af genet kaldes X regionen og er meget polymorf (15). CC i MRSA CC398 står for klonal kompleks. Der findes 193 forskellige spa-typer, som kan grupperes i 17 klonale komplekser. De to største CC-grupper er CC8 og CC5, som har hver 27 og 30 spa-typer (7). CC398 er den tredjestørste CC-gruppe, og var i 2011 den CCgruppe, som hyppigst var årsag til samfundserhvervede MRSA infektioner (16). I 2011 er der fundet en ny variant af MRSA, hvis resistens skyldes mecc genet, som er en variant af meca genet. mecc MRSA menes at have reservoir i køer og får, og har givet diagnostiske problemer, da de nuværende metoder detekterer meca genet (17). En ny undersøgelse fra Danmark viser, at små drøvtyggere kan være reservoir for mecc. De undersøgte får og geder, og fandt to tilfælde med mecc MRSA i får. Denne stamme havde spa typen t843, hvilket er den mest almindelige mecc MRSA, som er fundet hos mennesker i Danmark. Denne type er også senere fundet hos en ko og flere får i Danmark (18). 2.4 Analyseprincip Oksebouillon med 6,5 % NaCl (oksebouillon): anvendes til selektiv dyrkning af Staphylococcus samt slægten Enterococcus. Oksebouillonen hæmmer væksten af de fleste bakterier pga. det høje natriumklorid indhold, hvor kun Staphylococcus og Enterococcus kan vokse (19). Oksebouillonen inkuberes ved 35 C til den efterfølgende dag. Svar for negative prøver forelægger efter 2 døgn, hvor der er svar efter 3-4 døgn ved positive prøver. Contrast MRSA bouillon (contrast): er et screeningsmedie, som anvendes til detektion af MRSA. Contrast er hurtigt og nemt, og op til fire podepinde fra samme patient kan inokuleres i en contrast. Contrast indeholder nalidixinsyre, som hæmmer væksten af både grampositive og gramnegative bakterier. Koncentrationen af nalidixinsyre er justreret til, at væksten af MRSA ikke hæmmes, mens andre ikke-relevante bakterier hæmmes. I contrast er der også tilsat et antibiotikum, som selekterer MRSA stammer i forhold til andre bakterier. Desuden indeholder contrast andet antibiotika og inhi- Side 9 af 52

bitorer, som hæmmer gramnegative bakterier og andre grampositive bakterier end MRSA. Contrast indeholder ph-indikator farvestoffet, phenol rød, samt mannitol og trehalose, to kulhydrater, som fermenteres af MRSA stammer. Derved falder ph i contrast, og der sker et indikatoromslag fra rød til gul/orange, hvilket indikerer tilstedeværelsen af MRSA i prøven. Contrast skal inkuberes ved 37 C i 18-24 timer. De contrast hvor der er sket et indikatoromslag, skal kontrolleres med en konfirmatorisk test, hvilket betyder, at der forelægger svar for positive prøver efter 3 døgn. Contrast uden indikatoromslag efter 24 timer betragtes som negative, og svar kan herefter afgives (11). MRSA ID agar: anvendes som konfirmatorisk test, og er et kromogent medie til selektiv dyrkning af MRSA. MRSA ID agar hæmmer væksten af gærsvampe, samt de fleste bakterier som ikke tilhører Staphylococcus. Desuden er der tilsat cefoxitin til pladen, hvilket hæmmer væksten af methicillin følsomme Staphylococcus. Grundet dannelsen af α-glucosidase bliver S. aureus kolonier farvet grønne på MRSA ID agar. Inkubation skal ske ved 35 C i 24 timer (10). 3.0 Materiale og metoder Vi har haft kontakt til Den Videnskabsetiske Komité, og de har vurderet, at projektet ikke skal anmeldes og godkendes af komitéen, selvom vi anvender patientprøver. Hygiejnesygeplejerskerne har fået informeret samtykke fra alle deltagende patienter. Se bilag 1 for mailkorrespondance med Videnskabsetisk komité. 3.1 Materialer 3.1.1 Substrater o Oksebouillon med 6,5 % NaCl fra SSI o Contrast MRSA bouillon fra Oxoid o MRSA ID agar fra Biomerieux o 5 % blodplader fra SSI o Hestecitratplasma fra SSI o Müller Hinton II agarplade med 2 % NaCl o Slidex MRSA detection kit fra biomérieux 3.1.2 Apparatur og utensilier o 35 C varmeskab o Mixer Side 10 af 52

o Varmeblok o Centrifuge o Mikroskop o Sterile kulpodepinde fra SSI o Øser o Hestesko o Engangspipetter 1 ml o Sterile glas o Vatpinde o Eppendorfrør o Hårrør o Objektglas fra Hounisens Laboratorieudstyr o Dækglas o Immersion liquid fra Leica o Oxacillin fra biomérieux o NaCl B. Braun 9 mg/ml o McFarland 0,5 fra Remel 3.2 Forsøgsdesign Den praktiske del af projektet forløb fra den 19. marts til den 3. maj. I vores forsøg har vi anvendt patientprøver, 124 podninger blev taget, som blev inokuleret i både oksebouillon og contrast. De patienter der primær blev podet, var patienter før og efter behandling. Patienter som skulle kontrolpodes, blev ekskluderet, da man forventede, at resultatet var negativt. Hygiejnesygeplejerskerne dobbeltpodede patienterne med to kulpodepinde på en gang, hvorved man forventede, at der ville komme lige mange bakterier på begge kulpodepinde. Når hygiejnesygeplejerskerne dobbeltpodede patienterne, inokulerede de en kulpodepind fra hvert område i hver sin oksebouillon og contrast. Derefter afleverede de prøverne til KMA. Side 11 af 52

På figur 1 ser man et flowdiagram over metoden i laboratoriet. Når prøverne blev modtaget på KMA, blev oksebouillonen og contrasten registreret med samme nummer, og inkuberet ved 35 C. Personalet på KMA varetog rutinearbejdet med oksebouillonen (12), hvor Alma og jeg varetog arbejdet med contrast. Derved kendte vi ikke resultatet af den gyldne standard i forvejen, mens vi aflæste prøverne for contrast. Contrasten blev inkuberet ved 35 C i 24 timer, hvorefter de blev aflæst til at have indikatoromslag eller ej. På billede 1 og 2 ses contrast med og uden indikatoromslag. Alle contrast blev sået ud på MRSA ID agar, som også blev inkuberet i 24 timer ved 35 C. Ved grøn vækst blev der lavet yderligere konfirmatoriske tests for at påvise MRSA. De resterende tests var mikroskopering, koagulase-test, oxacillin Etest og MRSA slidex (10,12,20-22). Side 12 af 52

Figur 1: Flowdiagram af håndtering af podninger til diagnostik af MRSA Side 13 af 52

Billede 2: positiv indikatoromslag af contrast Billede 1: ingen indikatoromslag af contrast Håndteringen af contrast modtaget efter den 19. april blev foretaget af Erica Bracher Jørgensen med hjælp fra bioanalytikere på afdelingen. De har aflæst indikatoromslag af contrast efter 24 timer og 48 timer, hvorefter de blev udsået på MRSA ID agar efter 24 timer. MRSA ID agar blev aflæst og noteret efter inkubation i 24 timer. Efterfølgende konfirmatoriske tests blev ikke udført, men resultater fra de konfirmatoriske test for oksebouillonen blev noteret. Ved semikvantitativ vurdering af mængde på MRSA ID agar anvendte vi trekantsudstrygning på MRSA ID agar. Herefter vurderede vi mængden af vækst alt efter, om der var vækst i A, B eller C feltet. Ved vækst i A feltet vurderede vi mængden til få kolonier, ved vækst i B feltet var der en del kolonier og ved vækst i C feltet vurderede vi mængden til mange kolonier. Se bilag 2 for billeder af den semikvantitative vurdering. Side 14 af 52

Retningslinjer fra Oxoid foreskriver, at contrast skal opbevares ved 3-5 C i mørke, og efter at contrast har opnået stuetemperatur, skal de anvendes indenfor 12 timer. Desuden skal contrast have opnået stuetemperatur inden inokulation, og derefter inkuberes straks i 18-24 timer i varmeskab ved 37 C (11). Praktisk har dette ikke kunne lade sig gøre. Hygiejnesygeplejerskerne opbevarede contrast i en kasse i et køleskab. De podede patienterne i løbet af dagen, og medtog kun de contrast, som de skulle bruge. Derefter opbevarede de contrast ved stuetemperatur, indtil de blev afleveret på KMA enten sent på eftermiddagen eller dagen efter. Inkubation har været ved 35 C. 3.3 Sensitivitet og specificitet Sensitivitet er en metodes evne til at stille en korrekt diagnose på syge personer, i dette tilfælde metodernes evne til at detektere MRSA positive personer. Til beregning anvendes denne formel: sensitivitet antal sand positive sand positiv falsk negativ Specificitet er metodens evne til at stille en korrekt diagnose af raske personer, i dette tilfælde metodernes evne til at detektere MRSA negative personer. Til beregning anvendes denne formel (23): specificit et antal sand negative sand negativ falsk positiv Oksebouillonen betragtes som den gyldne standard, dvs. at antal syge (sand positiv og falsk negativ) og antal raske (sand negativ og falsk positiv) defineres ud fra resultatet af oksebouillonen. 3.4 Litteratursøgning Litteratur til dette projekt er fundet på PubMed, Ugeskrift for Læger og Statens Serums Instituts hjemmeside. Der er søgt efter peer reviewed artikler, omhandlende contrast MRSA bouillon, baggrundsmateriale om MRSA, S. aureus samt MRSA CC 398. Det har ikke været muligt, at finde peer reviewed artikler omhandlende contrast MRSA bouillon. Søgninger på contrast MRSA broth og Oxoid gav ingen relevante artikler. Lignende søgninger på bibliotek.dk, Den Danske Forskningsdatabase, Web of Science og Google Scholar gav heller ingen relevante resultater. Der er søgt efter andre metoder til detektion af MRSA, og jeg har fundet en artikel på PubMed omkring PCR. Denne artikel er fundet ved at søge på: MeSH: MRSA AND MeSH: PCR AND rapid Side 15 af 52

detection. Der var visse begrænsninger til artikler mindre end fem år gammel og artikler omhandlende mennesker. Derved var der 51 hits, hvoraf jeg har valgt en artikel. Flere kilder er fundet ud fra tidligere bachelorprojekter fra Skejby og Rigshospitalet Se detaljeret søgeprotocol på bilag 3. 4.0 Resultater Se rådata til resultater på bilag 4. 4.1 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon 4.1.1 Sensitivitet og specificitet for indikatoromslag af contrast MRSA bouillon Tabel 1 viser sensitivitet for de contrast, hvor der er sket et indikatoromslag, og specificitet for de contrast, hvor der ikke er sket et indikatoromslag sammenlignet med den gyldne standard. Contrast MRSA bouillon Sensitivitet 25,0 % Specificitet 92,0 % Tabel 1: viser sensitivitet og specificitet for indikatoromslag af contrast MRSA bouillon 4.1.2 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon efter de konfirmatoriske tests er udført. Tabel 2 viser sensitivitet og specificitet for contrast efter det endelig resultat af de konfirmatoriske tests. Contrast MRSA bouillon Sensitivitet 75,0 % Specificitet 99,1 % Tabel 2: viser sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon efter de konfirmatoriske tests Se bilag 5 for eksempler på beregning af sensitivitet og specificitet samt tilhørende tabeller. 4.2 Semikvantitativ vurdering af mængden på MRSA ID agar for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl På tabel 3 ser man mængden af vækst på MRSA ID agar for både contrast og oksebouillon for de forskellige MRSA positive prøver. Side 16 af 52

Semikvantitativ vurdering af mængden på MRSA ID agar SPAtype Contrast MRSA bouillon Oksebouillon med 6,5 % NaCl Prøve 1 t657 mange mange Prøve 2 t223 mange mange Prøve 3 t657 en del MRSA ID agar smidt ud Prøve 4 t657 få mange Prøve 5 t657 en del mange Prøve 6 t657 ingen vækst mange Prøve 7 t034 mange en del Prøve 8 t442 en del en del Prøve 9 t011 en del en del Prøve 10 t127 en del ingen vækst Prøve 11 t011 ingen vækst mange Prøve 12 t002 mange mange Prøve 13 t223 mange en del Tabel 3: viser semikvantitativ vurdering af MRSA ID agar for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl 4.3 Priser for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl Tabel 4 viser prisen for contrast og oksebouillon. Priser for contrast og oksebouillon Kr./stk. Contrast MRSA bouillon 14,83 Oksebouillon med 6,5 % NaCl 37 Tabel 4: viser priserne for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl På bilag 6 ses mails med information om priser på contrast og oksebouillon, samt prisen på MRSA ID agar som anvendes senere. 5.0 Diskussion 5.1 Sensitivitet og specificitet for contrast MRSA bouillon Oxoid påstår, at contrast der er røde efter 24 timer, ikke indeholder MRSA i prøven (24). Hvis man ser på indikatoromslag efter 24 timer, bliver sensitiviteten og specificiteten for contrast henholdsvis 25,0 % og 92,0 %. Dvs. at hele 9 ud af 12 blev falsk negativ med contrast, og 9 prøver blev falsk positive. De 9 prøver, hvor der ikke var et indikatoromslag efter 24 timer, skulle ifølge Oxoid være negative. Derved skulle der ikke gøres mere ved de prøver ifølge Oxoid. Det betyder, at man ikke ville detektere 75,0 % af de positive podninger. Side 17 af 52

Efter at vi har fået de endelige resultater af contrast med de konfirmatoriske tests, blev sensitiviteten og specificiteten højere, nemlig 75 % og 99,1 %. Her var kun tre prøver falsk negative for contrasten, hvor der var en prøve, som blev falsk positiv i contrasten i forhold til oksebouillonen. Denne ene prøve har vi lavet en resistensplade på, og sammenlignet med en resistensplade, der er blevet lavet på patienten tidligere. Det viste sig, at resultaterne for resistenspladerne stemte overens, dermed konkluderede vi, at oksebouillonen ikke havde detekteret denne MRSA stamme. Derved er specificiteten i princippet 100 % for contrast, efter at de konfirmatoriske tests er udført. Efterfølgende konklusioner på sensitivitet beror sig på kun 12 positive prøver af i alt 124 prøver. Dette er meget få prøver, men da vi desværre ikke har fået flere positive prøver, må jeg gå ud fra de resultater jeg har. Det betyder, at sensitiviteten muligvis ikke vil give et reelt billede af contrastens ydeevne. Statens Institut for Folkesundhed anbefaler, at sensitiviteten er mellem 80-90 % eller mere ved screeningstests, mens specificiteten skal ligge på 95 % eller mere (25). Sammenligner man den anbefalede sensitivitet med vores resultater, ser man, at vores sensitiviteter er meget lave. Især mangelen på indikatoromslag ser ud til at påvirke contrastens virkningsevne. Det betyder, at contrast ikke vil kunne anvendes udelukkende ud fra indikatoromslag. Der skal minimum være en konfirmatorisk test, som bekræfter resultatet, også for prøver uden indikatoromslag. Det betyder, at svartiden på et døgn for negative prøver ikke kan lade sig gøre. Efter at de konfirmatoriske tests er udført, stiger sensitiviteten fra 25,0 % til 75,0 %, hvilket er meget, men ikke nok til at contrast kommer indenfor det anbefalede på 80-90 %. Desuden kan man også argumentere for, at sensitiviteten skal være højere end det anbefalede, da man gerne vil finde alle patienter med MRSA, så de kan komme i behandling og ikke smitte andre. Derved vil det være bedre med en lavere specificitet, for at sikre at sensitiviteten blev højere. Derved kan man sige, at de falsk positive prøver vi har fået, er okay, dog skal det bemærkes, at det er en meget stor andel af prøverne med indikatoromslag, som viste sig at være falsk positiv, nemlig 9 ud af 12 prøver. Vores specificitet på 92,0 % ved indikatoromslag kunne ikke være meget bedre, og ligger lige under det anbefalede på 95,0 %. At specificiteten ikke er bedre ved indikatoromslag af contrast, skyldes de 9 falsk positive prøver, men efter at der er udført konfirmatoriske tests bliver specificiteten 99,1 %, hvilket ligger pænt indenfor det anbefalede. Selve idéen med at implementere contrast på KMA i stedet for oksebouillon er, at kunne reducere svartiden for overvågningsprøver, især på negative prøver som kan slutsvares allerede efter et døgn. Ud fra de resultater vi har fået, vil implementering af contrast ikke være muligt. Det ses ved, at con- Side 18 af 52

trast ikke slår om i farven ved alle prøver med MRSA, samt at selv efter de konfirmatoriske tests er udført bliver 3 ud af 12 prøver med MRSA stadig negativ. Det betyder, at alle prøver skulle sås ud på MRSA ID agar for at højne sensitiviteten, samt at det stadig ville betyde, at ikke alle patienter med MRSA vil blive opdaget. Oxoid har lavet flere forsøg, som undersøger sensitivitet og specificitet. I det ene forsøg har de anvendt frysestammer, hvor de medtog 196 stammer, som var fordelt på 99 MRSA stammer og 97 non-mrsa stammer. Deres sensitiviteter efter 24 timers inkubation var 99,0 % og 95,0 %, alt efter koncentration af inokulum, hvor specificiteten var 78,4 %. Et andet forsøg fra Oxoid undersøgte 119 rutineprøver, hvoraf 20 prøver var MRSA positive, og 99 prøver var MRSA negative. Undersøgelsen viste en sensitivitet på 100 % og specificitet på 94,9 % efter 24 timers inkubation (24,26). Sammenlignet med vores sensitivitet på 75,0 % efter de konfirmatoriske tests, ligger Oxoids sensitiviteter højere. Særligt i forsøget med deres rutineprøver som direkte kan sammenlignes med vores forsøg ses en forskel fra 75,0 % til 100 %. Denne forskel kan skyldes, at det ikke har været muligt at inkubere direkte efter inokulation. Prøverne er først blevet afleveret på KMA om eftermiddagen eller dagen efter inokulation, derved kan det være, at MRSA stammerne ikke har haft de samme muligheder for at blive opformeret som ved Oxoids forsøg. Det er selvfølgelig svært at sige, om den sene inkubering har haft betydning for opformering af MRSA i både contrast og oksebouillonen. Desuden har Oxoid opslæmmet rutineprøverne i 1 ml saltvand før inokulation, og anvendt 250 μl til inokulering i contrast, som måske har gjort forsøget mere sensitiv. På modul 12 har vi også lavet projekt med contrast. Se projektet på bilag 7. Dette forsøg blev lavet på kendte frysestammer, hvorved vi også kunne beregne sensitivitet og specificitet for oksebouillonen. De efterfølgende resultater har en koncentration på 150 coluny forming units (CFU)/ ml. Sensitivitet og specificitet for indikatoromslag i contrast ved inkubation i minimum 18 timer var henholdsvis 93,3 % og 100 %. Efter udsåning på MRSA ID agar fra contrast var sensitiviteten 100 % og specificiteten 100 %. Sammenlignet med vores nuværende forsøg med en sensitivitet på 25,0 % og 75 % var sensitiviteten væsentlig højere i forsøget på modul 12. Det kan skyldes, at der er anvendt frysestammer, hvilket betyder, at der i contrasten er renkultur af MRSA stammer. Vi undersøgte også flere MRSA stammer med mecc genet, hvor der ikke sås nogle problemer med detekteringen af denne. Sensitiviteten for oksebouillonen var også 100 %, mens specificiteten var 80 %, da vi undersøgte en enterokok, som giver grønne kolonier på MRSA ID agar. Side 19 af 52

Der er lavet to andre professionsbachelorprojekter (PBP) på bioanalytikeruddannelsen om contrast. Der er lavet en PBP på KMA Skejby og en på KMA Rigshospitalet (27,28). Begge projekter er lavet ud fra frysestammer. Projektet fra Skejby (27) undersøger indikatoromslag af contrast uden senere at kontrollere negative prøver med en konfirmatorisk test. De har undersøgt 8 MRSA stammer samt methicillin følsømme Staphylococcus aureus (MSSA) og borderline oxacillin resistent Staphylococcus aureus (BORSA). BORSA stammer har nedsat følsomhed overfor oxacillin, men mangler meca genet (29). Projektet I Skejby har fået en sensitivitet for contrast på 95-100 % og en specificitet på 76-96 %, hvor de har undersøgt contrast efter 17, 20 og 30 timers inkubation uden stressfaktorer (renkultur). Deres sensitivitet blev 100 %, mens specificiteten blev mellem 12-16 % ved inkubation i 17, 20 og 30 timer med stressfaktorer (blandingskultur). De stressfaktorer projektet fra Skejby har anvendt er en methicillin resistent Staphylococcus epidermidis (MRSE), Enterococcus og Escherichia coli (E.coli), hvilket er bakterier, man finder i menneskets normalflora i henholdsvis tarmen, slimhinden og på huden (1). Sammenlignet med vores resultater har de fået en væsentlig bedre sensitivitet, det kan igen skyldes, at de har anvendt frysestammer, hvor vi har anvendt patientprøver. Dog burde sensitivteten med stressfaktorer kunne sammenlignes med vores resultater, da de har forsøgt at simulere en podning fra en patient. Til gengæld viser deres sensitivitet med stressfaktorer, at renkultur ikke er en nødvendighed ved opformering i contrast. Dette er en fordel ved patientprøver, hvor der må forventes, at være mange forskellige bakterier, som er en del af normalfloraen. At vi har en dårligere sensitivitet, kan også skyldes, at vi ikke har den samme store koncentration af MRSA i prøverne. Projektet fra Skejby har fået nogle dårlige specificiteter, når de har undersøgt contrast med stressfaktorer. Det kan skyldes, at især Enterococcus har givet anledning til indikatoromslag i contrasten. Det kan tyde på, at vi i vores forsøg også har haft disse bakterier til stede i contrasten, hvilket måske kan være årsag til, nogle af de falsk positiv resultater vi har haft på indikatoromslag af contrast. Projektet fra Rigshospitalet (28) har undersøgt 96 prøver med enten MRSA, MSSA og BORSA samt prøver fra rutinen på Rigshospitalet og flere non-s. aureus prøver. Der er udført konfirmatorisk test for prøver med indikatoromslag i contrasten. Projektet fra Rigshospitalet fik en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 20 % ved kun at se på indikatoromslag af contrast. Efter den konfirmatoriske test var sensitiviteten 100 % og specificiteten 68,2 %. Ved sammenligning med vores sensitivitet på 25,0 % ved indikatoromslag og 75,0 % efter de konfirmatoriske tests er deres forsøg mere vellykket. Det kan igen skyldes, at de anvender større koncentrationer og renkultur af MRSA. Deres specificitet er til gengæld dårligere end i vores forsøg, da vi har en specificitet på 92,0 % ved Side 20 af 52

indikatoromslag og 99,1 % efter konfirmatoriske tests. Denne forskel kan være forårsaget af, at høj koncentration af non-mrsa påvirker contrasten til indikatoromslag, heraf de 20 %, hvoraf en del afkræftes ved den konfirmatoriske test. Projektet fra Rigshospitalet har undersøgt og fundet frem til, at for stor koncentration af flere non-mrsa stammer kan fremkalde indikatoromslag i contrast, hvilket passer meget godt med vores falsk positive resultater. I de to bachelorprojekter er der ingen af dem, som har undersøgt, om der har været vækst af MRSA i contrast, selvom der ikke har været indikatoromslag. Derved ved de ikke, om de har fået nogle falsk negative prøver. Dog er deres sensitiviteter gode, så det vil være få prøver, det er gældende for. Desuden anvender de kendte stammer, og ved derfor, hvad resultater skulle ende ud med. De undersøger begge, om non-mrsa kan være skyld i indikatoromslag, hvilket det har vist sig at være, især Enterococcus, MSSA og BORSA prøver er skyld i mange falsk positive resultater, dog blev de konfirmatoriske tests negative I Tyskland har man også undersøgt contrast (30). Her anvendte man 100 patientprøver, som blev inokuleret i contrast og aflæst efter 18 timer. Her fandt man en sensitivitet på 100 %, mens specificiteten var 87 %. Igen er vores sensitivitet noget dårligere end ved dette forsøg, hvilket giver et billede af, at vi i vores forsøg har gjort noget, som mindsker contrasts ydeevne fx at contrast ikke er blevet inkuberet straks. Det er bemærkelsesværdigt, at alle andre undersøgelser har en meget bedre sensitivitet end vores. Det kan være svært at sige, hvad det kan skyldes. Måske har den sene inkubering en betydning, samt at koncentrationen af materiale på podepindene ikke har været særlig høj, og har derfor ikke kunne opformere nok MRSA til indikatoromslag af contrast. 5.2 Semikvantitativ vurdering af mængden på MRSA ID agar for contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl For de ni prøver vi har kunnet sammenligne i tabel 3, ses der ikke noget entydig. Ved fem prøver er væksten på MRSA ID agar ens, hvor der ses vækst med en del og mange kolonier. Ved de fire prøver som ikke stemmer overens, er fordelingen 2-2 til opformering af MRSA. Der var få kolonier ved prøve 4 i contrasten, hvor der var mange kolonier ved oksebouillonen. Prøve 5 viste også færre kolonier på MRSA ID agar for contrasten, nemlig en del kolonier, hvor der var mange kolonier ved oksebouillonen. Omvendt er det for prøve 7 og 12, hvor der er mange kolonier på MRSA ID agar for contrast, men kun en del kolonier ved oksebouillonen. Hvis man tæller det sammen, er der ved contrast én MRSA ID agar med få kolonier, tre med en del kolonier og fem plader med mange ko- Side 21 af 52

lonier. Ved oksebouillonen er der fire plader med en del kolonier og fem plader med mange kolonier. Når man sætter det op på denne måde, er oksebouillonen en smule bedre til at opformere MRSA. Ved de tre restende positive prøver var der ved to prøver ingen vækst på MRSA ID agar for contrast, dog var der heller ingen indikatoromslag. Dette kan enten tyde på, at oksebouillonen er et bedre opformeringsmedie, eller at der ikke har været nogle MRSA bakterier på podepinden, som blev inokuleret i contrast, og derved ikke har opformeret bakterien. MRSA ID agar er ved en enkel prøve blevet smidt ud for oksebouillonen, før vi nåede at aflæse den. Ved prøve 10 ser man, at oksebouillonen ikke har formået at opformere MRSA, mens contrast blev positiv for MRSA. Hvis man ser på de spa-typer, vi har fundet flere af, t657, t223 og t011, ses der heller ikke noget entydigt, om den ene metode er bedre end den anden metode til opformering af MRSA. Projektet fra Skejby har også vurderet opformeringsevnen af contrast. De har fundet en god opformeringsevne, ved alle de forskellige koncentrationer de har anvendt, især ved renkultur. Koncentrationen ved blandingskulturer blev noget lavere, men det påvirkede ikke indikatoromslag af contrast. 5.3 Priser for Contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl Som man kan se i tabel 4, er prisen for contrast 14,83 kr./stk., hvor oksebouillonen koster 37 kr./stk. Hvis man indfører contrast, vil det betyde en besparelse på 22,17 kr./bouillon. I tabel 5 ses, hvor mange overvågningsprøver KMA har modtaget i 2012 samt antallet af prøver med MRSA. Hvis man antager at contrast virker efter hensigten, ville alle contrast uden indikatoromslag kunne slutsvares uden yderligere tests. Derved skal disse prøver ikke udsås på MRSA ID agar, hvilket betyder, at man ville kunne have sparet op til 3561 plader i 2012 alt efter, hvor mange falsk positive prøver der ville have været med contrast. Med en pris på 8,35 kr./plade svarer det alt i alt til en besparelse på 118.746,90 kr./år. Overvågningsprøver modtaget på KMA i 2012 Antal MRSA 447 Non-MRSA 3561 Intet resultat 7 I alt 4015 Tabel 5: viser antallet af overvågningsprøver på KMA fordelt på MRSA, non-mrsa og ingen resultat i 2012 Ydermere kan contrast inokuleres med op til fire podepinde af gange (24). Hvis man antager, at hver patient bliver podet tre gange, var der i 2012 1339 patienter, der blev podet. Derved vil KMA kunne spare 2676 bouilloner/år, hvis der kun anvendes 1 bouillon/patient. Dette vil både lette hver- Side 22 af 52

dagen i laboratoriet og være økonomisk bedre for KMA. Dvs. at contrast i forhold til oksebouillonen er væsentlig billigere til diagnostik af overvågningsprøver. 5.4 Diskussion af metoden og contrast I forsøget har vi anvendt 124 prøver, hvor kun 12 var positive. Dette er et meget lille antal, hvor vi havde forventet flere positive prøver. Dette har været en ulempe ved at anvende patientprøver. Hygiejnesygeplejerskerne forsøgte, at pode de patienter de forventede, var positive, men dette var desværre ikke tilfældet. Fordelen ved at anvende patientprøver er at se, hvordan contrast håndterer den blandingskultur, man forventer, når patienter podes. Der vil også være forskellige koncentrationer af MRSA i prøverne fra start, da alle patienter ikke har lige meget MRSA på sig. Dette giver et billede af, om contrast er et godt opformeringsmedie. Ved prøver modtaget den 3. april har vi desværre anvendt for gamle contrast. Det kan være svært at sige, om det er grundet til, at der ikke ses indikatoromslag for de tre contrast, som efterfølgende blev positive, jævnfør bilag 4. Dog var det også i en prøve fra den 3. april, hvor vi fandt en MRSA, som ikke blev fundet på KMA. To af de modtagede prøver er blevet inokuleret med flere podepinde på en gang, da hygiejnesygeplejersken havde glemt, at podepindene skulle i hver sin contrast. Det ser dog ikke ud til at have påvirket resultaterne. Contrast blev ikke inkuberet straks efter inokulation, det blev valgt på baggrund af, den rutine hygiejnesygeplejerskerne anvender på nuværende tidspunkt. De poder patienterne, og inokulerer i oksebouillon, hvor de først afleverer prøverne om eftermiddagen eller den efterfølgende morgen. Denne praksis vil ikke kunne blive lave om, så derfor var de interessant at se, hvordan contrast håndterede den sene inkubation. Der er desuden inkuberet ved 35 C i stedet for de 37 C, som der anbefales fra Oxoid, dette gøres, da al inkubering på KMA foregår ved 35 C. Hygiejnesygeplejerskerne har ingen præferencer, hvad angår brugen af contrast og oksebouillon. De mener, at den metode der er bedst til at detektere MRSA, også er den metode, de vil bruge. Der er selvfølgelig fordele og ulemper ved at anvende contrast i stedet for oksebouillon. Nogle fordele er, at flere podepinde kan anvendes i samme contrast, hvilket kan lade sig gøre, da det ikke er nødvendig at vide præcis, hvor på patienten MRSA er fundet, da behandlingen er af hele kroppen. Endnu en fordel er indikatoromslag, som allerede efter et døgn giver en ide om, om patienten har MRSA eller ej. En anden fordel er prisen på contrast, som er meget billigere end oksebouillonen. Side 23 af 52

En ulempe ved contrast er inkubationstiden på 24 timer. Dette vil især påvirke KMA, hvis prøverne først modtages sent om eftermiddagen, hvor det meste af personalet er taget hjem. Dette vil påvirke afdelingen i to dage, da prøverne efterfølgende skal sås ud på MRSA ID agar, som også skal inkuberes i 24 timer. Aflæsning af indikatoromslag har ved nogle contrast været vanskelig. Flere af prøverne er vurderet til at have skiftet farve, men efter de konfirmatoriske tests viste det sig, at contrast ikke indeholdt MRSA. De fleste contrast ændrede kun farve til orange, hvor kun få contrast blev gul. Den ene positive prøve, som var blevet inokuleret med 3-4 podepinde, blev gul, derved tyder det på, at der har været en større koncentration af MRSA til start i den prøve. En anden ulempe ved contrast er, at det er et forholdsvis nyt medie fra oktober 2011. Der er endnu ingen klinisk mikrobiologiske afdelinger i Danmark, der anvender contrast. Desuden har det ikke været muligt at finde artikler om contrast på PubMed, derved tyder det på, at contrast endnu ikke er velafprøvet af andre end Oxoid selv, hvilket er en ulempe for mediet. Oxoid har endnu ikke undersøgt, om der er procedurer i retningslinjerne for contrast, som er særlig kritiske overfor resultatet, fx som at vi ikke har inkuberet contrast straks efter inokulering. 6.0 Konklusion Formålet med forsøget var, at finde ud af om contrast kunne erstatte oksebouillonen til detektion af MRSA. Ud fra den opnåede sensitivitet på 25,0 % ved indikatoromslag vurderes det at implementering af contrast ikke vil være muligt. Sensitiviteten blev simpelthen for lav. Hvis man anvender konfirmatoriske tests, blev sensitiviteten 75,0 %, hvilket er bedre men stadigvæk lav, da man gerne vil detektere alle med MRSA. Men der skal dog tages hensyn til, at sensitiviteterne er beregnet ud fra meget få positive prøver. Specificiteten var 92,0 % ved indikatoromslag og 99,1 % efter de konfirmatoriske tests, hvilket er pæne specificiteter for en screeningstest. Det er uvist ud fra vores resultater, om contrast er et bedre opformeringsmedie end oksebouillonen. Ud af de 12 positive prøver er fem prøver opformeret lige meget, to prøver blev opformeret mest ved contrast og to prøver opformeret mest ved oksebouillon. Desuden blev to af prøverne slet ikke opformeret ved contrast, og ved en prøve er pladen for oksebouillon smidt ud. Derved kunne det tyde på at oksebouillonen er en smule bedre til opformering af MRSA, men der skal flere positive resultater til, for at man sige noget mere præcis. Side 24 af 52

Der er stor forskel i prisen på contrast og oksebouillon. Contrast kan fås for 14,83 kr./stk., hvor oksebouillonen koster 37 kr./stk. KMA vil ved implementering af contrast kunne spare rigtig mange penge om året, op til 119.000 kr., da contrast er et billigere medie, samt at antallet af MRSA ID agar vil kunne mindskes. Alt i alt vil contrast MRSA bouillonen ikke kunne implementeres på KMA, selvom der ville være store økonomiske fordele ved det. 7.0 Perspektivering Projektet belyser anvendeligheden af contrast, og har været relevant for KMA, der har ønsket at finde en metode, som hurtigere kunne detektere MRSA. Vi har desværre fået dårlige resultater, som tyder på, at contrast ikke kan anvendes som screeningsmedie. Hvis forsøget skulle laves en anden gang, skulle der anvendes flere positive prøver, evt. over længere tid så der var en større sandsynlighed for positive prøver. Hvis contrast havde virket efter hensigten, ville projektet have været relevant for alle klinisk mikrobiologiske afdelinger i Danmark, da contrast både er mere økonomisk og tidsbesparende end oksebouillonen, samt at patienter med mistanke om MRSA skal vente kortere tid på svar, og derved hurtigere kan komme i behandling. Mistanke om MRSA kræver desuden isolation ved indlæggelse på hospitalet, derfor vil samfundet også kunne spare mange penge ved hurtigere at kunne detektere MRSA. Der findes andre metoder til hurtigere at detektere MRSA. En hollandsk undersøgelse viser, at relative quantification polymerase chain reaction (RQ-PCR) kan anvendes til detektion af MRSA. RQ- PCR opformerer meca genet og S. aureus 442 genet (SA442), hvis antallet af meca og SA442 efter opformering er det samme, skyldes det, at der er MRSA i prøven. Prøvematerialet har været fra patienter, og har været inokuleret i bouillon og inkuberet i 16-24 timer, hvorefter prøven er analyseret vha. RQ-PCR i et par timer. Derved kan en prøve slutsvares efter lidt over et døgn for både positive og negative prøver. Metoden har vist sig at have en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 94,5 % (31). Dette kunne være en alternativ metode til detektion af MRSA, som har en god sensitivitet og specificitet. 8.0 Referenceliste (1) Degré M, Hovig B, Rollag H. Medisinsk mikrobiologi. 3. utg. ed. Oslo: Gyldendal; 2008. Side 25 af 52

(2) Skov R, Westh H. Epidemisk stigning i antallet af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) i Danmark-indgriben er nødvendig nu. Ugeskr Laeger 2005;167:12-13. (3) Skov R, Schrøder Hansen D. MRSA og ESBL er fortsat stigende i samfundet og ved hospitalsassocierede udbrud. Ugeskrift for læger 2011;173(45):2869-2872. (4) Statens Serum Institut. Methicilin resistente Staphyloccus aureus. dec 2012; Fundet på: http://www.ssi.dk/service/sygdomsleksikon/m/methicillin%20resistente%20staphylococcus%20a ureus.aspx. Lokaliseret d. 19/3, 2013. (5) Statens Serum Institut. Overvågning i tal, grafer og kort. MRSA, laboratorieanmeldelsespligtige sygdomme. 1/2 2013; Fundet på: http://www.ssi.dk/data. Lokaliseret d. 20/3, 2013. (6) Region Nordjylland. Fakta og tal 2012. april 2012; Fundet på: http://www.rn.dk/nr/rdonlyres/e2eb6443-566d-4052-bdca- 815AB5CABB7C/0/Tal_og_fakta_2012_ok_web.pdf. Lokaliseret d. 16/4, 2013. (7) Statens Serum Institut. EPI-NYT. Overvågning og forebyggelse af smitsomme sygdomme. MRSA 2011. 21. nov. 2012; Fundet på: http://www.ssi.dk/service/sygdomsleksikon/m/~/link.aspx?_id=b3e31772044347d59c11b46d05 E4EE8E&_z=z. Lokaliseret d. 19/3, 2013. (8) Sundhedsstyrelsen. Vejledning om forebyggelse af spredning af MRSA. Version: 2.0; Versionsdato: 14. november 2012 ed. København: Sundhedsstyrelsen; 2012. (9) Infektionshygiejnen RN. Hvad laver hygiejnesygeplejersken? januar 2013; Fundet på: http://www.infektionshygiejne.rn.dk/for+fagfolk/hygiejnesygeplejer-skefuktionen/. Lokaliseret d. 8/4, 2013. (10) Højbjerg T. MRSA ID agar. januar 2012; Fundet på: www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 20/12, 2012. (11) Oxoid. Contrast MRSA Broth. 2013; Fundet på: http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=eb1225&org=155&c=uk&lang= EN. Lokaliseret d. 25/1, 2013. (12) Paulsen KI. Påvisning af meticillin resistente Staphylococcus aureus. juni 2011; Fundet på: www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 28/1, 2013. (13) Infektionshygiejnen. Screening af patienter for Methicillin Resistent Staphylococcus aureus (MRSA). december 2012; Fundet på: www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 3/4, 2013. (14) Statens Serum Institut. Pressemeddelelse: Stigende forekomst af MRSA-bakterier. august 2011; Fundet på: http://www.ssi.dk/aktuelt/nyheder/2011/2011_08_stigende%20forekomst%20af%20mrsabakterier_240811.aspx. Lokaliseret d. 14/5, 2013. Side 26 af 52

(15) Narukawa M, Yasuoka A, Note R, Funada H. Sequence-based spa typing as a rapid screening method for the areal and nosocomial outbreaks of MRSA. Tohoku J Exp Med 2009 Jul;218(3):207-213. (16) Stafylokoklaboratoriet SSI. Årsrapport. MRSA i Danmark 2011. 2012; Fundet på: http://edit.ssi.dk/sitecore/shell/controls/rich%20text%20editor/~/media/indhold/dk%20- %20dansk/Smitteberedskab/Referencelaboratorier/MRSA%202011%20KMA%20årsrapport.ashx. Lokaliseret d. 5/4, 2013. (17) Statens Serum Institut. Forskning. april 2013; Fundet på: http://www.ssi.dk/forskning/forskningsafdelinger/mikrobiologioginfektionskontrol/stafylokoklab oratoriet/forskning.aspx. Lokaliseret d. 30/4, 2013. (18) Eriksson J, Espinosa-Gongora C, Stamphoj I, Larsen AR, Guardabassi L. Carriage frequency, diversity and methicillin resistance of Staphylococcus aureus in Danish small ruminants. Vet Microbiol 2013 Apr 12;163(1-2):110-115. (19) Røder BL. Substrathåndbogen. 1. udgave ed. Kbh.: Statens Seruminstitut, Substratafdelingen; 1993. (20) Paulsen KI. Etest oxacillin for stafylokokker. februar 2013; Fundet på: http://www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 26/3, 2013. (21) Paulsen KI. Etest til MIC bestemmelse. oktober 2011; Fundet på: http://www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 26/3, 2013. (22) Paulsen KI. MRSA slidex kit. november 2012; Fundet på: http://www.pri.rn.dk. Lokaliseret d. 10/4, 2013. (23) Bendsen T. Noter i statistik. 2012; Fundet på: http://statnoter.biolyt.dk/. Lokaliseret d. 25/1, 2013. (24) Oxoid. Contrast MRSA. 2011; Fundet på: http://www.oxoid.com/pdf/mrsa/folio-1352-26418- MRSA-Contrast-Lit-August-2011.pdf. Lokaliseret d. 27/1, 2013. (25) Statens Institut for Folkesundhed. Folkesundhedsrapporten. Kapitel 27: Screening. 2007; Fundet på: http://www.si-folkesundhed.dk/upload/kap_27_screening.pdf. Lokaliseret d. 16/5, 2013. (26) Crabtree D. Evaluation of Oxoid Contrast MRSA Broth. 2010; Fundet på: http://www.oxoid.com/literature. Lokaliseret d. 8/5, 2013. (27) Jørgensen CB. Afprøvning af opformeringsmedier til identifikation af MRSA. december 2011; Fundet på: https://www.ucviden.dk/student-portal/files/10619373/pbp_en.pdf. Lokaliseret d. 19/1, 2013. (28) Frost SS. Opformeringsmedie til identifikation af MRSA. januar 2013; Fundet på: https://www.ucviden.dk/student-portal/files/10619373/pbp_en.pdf. Lokaliseret d. 15/4, 2013. Side 27 af 52

(29) Thomsen MK, Rasmussen M, Fuursted K, Westh H, Pedersen LN, Deleuran M, et al. Clonal spread of Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to oxacillin in a dermatological hospital unit. Acta Derm Venereol 2006;86(3):230-234. (30) Schäfter P BC. <br />Contrast MRSA broth (Oxoid) as a screening tool for MRSA colonization. Annual Meeting of the German Society for Hygiene and Microbiology. 2012 oktober;poster session. Se bilag 7 for reference (31) Bode LG, van Wunnik P, Vaessen N, Savelkoul PH, Smeets LC. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in screening samples by relative quantification between the meca gene and the SA442 gene. J Microbiol Methods 2012 May;89(2):129-132. Bilag Bilag 1 mailkorrespondance med Videnskabsetisk Komité Fra: Alma Palic (122001 BIOLYT) [mailto:122001@viauc.dk] Sendt: 15. januar 2013 11:37 Til: Videnskabsetisk Komité Emne: Godkendelse af prøveindsamling til bachelorprojekt Hej videnskabsetiske komité Da vi skal begynde på vores bachelorprojekt i uge 12., ønsker vi at høre, om vi skal have tilladelse til at indsamle ekstra podninger fra patienterne. Det er en infektionshygiejne sygeplejerske, som poder patienterne. Hver patient podes ca. 3 steder, hvor vi ønsker en ekstra podning fra alle steder. Den ene podning skal bruges til inokulation i oksebouillon med 6,5 % NaCl, mens den ekstra podning skal inokuleres i Contrast MRSA bouillon. Er det i orden, at vi kun indhenter tilladelse fra patienten, eller skal vi have videnskabsetiske komitéts godkendelse til den ekstra prøveindsamling? Vi vedhæfter vores foreløbige projektbeskrivelse. Hvis I har spørgsmål, er I velkomne til at skrive til os. På forhånd tak Hilsen Sabrina og Alma Bioanalytikerstuderende ved VIA University College Århus Nord Side 28 af 52

Fra: Videnskabsetisk Komité [vek@rn.dk] Sendt: 21. januar 2013 09:49 Til: Alma Palic (122001 BIOLYT) Emne: SV: Godkendelse af prøveindsamling til bachelorprojekt Kære Sabrina og Alma På baggrund af de fremsendte oplysninger sammenligning af Contrast MRSA bouillon med oksebouillon for at se, om Contrast MRSA kan erstatte oksebouillon og gøre svartiden på prøver kortere er det komitéens vurdering, at der er tale om et kvalitetsprojekt, der ikke skal anmeldes til og godkendes af komitésystemet, jf. 14, stk. 1, jf. 2 i komitéloven (lov nr. 593 af 14. juni 2011 om videnskabsetisk behandling af sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter). Projektet kan derfor iværksættes uden yderligere tilbagemelding fra Den Videnskabsetiske Komité for Region Nordjylland. Klagevejledning: afgørelsen kan, jf. komitélovens 26, stk. 1, indbringes for Den Nationale Videnskabsetiske Komité senest 30 dage efter, afgørelsen er modtaget. Den Nationale Videnskabsetiske Komité kan, af hensyn til sikring af forsøgspersoners rettigheder, behandle elementer af projektet, som ikke er omfattet af selve klagen. Klagen samt alle sagens dokumenter sendes til: Den Nationale Videnskabsetiske Komité DKetik@DKetik.dk<mailto:DKetik@DKetik.dk> Med venlig hilsen Karina Østergaard Schøler Tlf. 9764 8441 E-mail: k.oestergaard@rn.dk<mailto:k.oestergaard@rn.dk> REGION NORDJYLLAND Patientdialog og Sekretariatet for Den Videnskabsetiske Komité for Region Nordjylland Side 29 af 52

Niels Bohrs Vej 30 9220 Aalborg Ø www.rn.dk<http://www.rn.dk/> Bilag 2 Semikvantitativ vurdering af MRSA ID agar Figur 2: semikvantitativ vurdering til få kolonier Figur 3: semikvantitativ vurdering til en del kolonier Side 30 af 52

Figur 4: semikvantitativ vurdering til mange kolonier Bilag 3 Søgeprotocol Statens Serums Institut Findes på: http://www.ssi.dk/ Kilde (4) er fundet under sygdomsleksikon, Methicillin resistente Staphylococcus aureus d. 19.03.2013. Kilde (7) er fundet vha. kilde (4) d. 19.03.2013. Ud fra kilde (4) er kilde (8) fundet d. 05.04.2013. I søgefeltet er der søgt på mrsa typning derved er kilde (16) fundet d.05.04.2013. Kilde (17) er fundet d. 30.04.2013 ved at søge på mecc. Ugeskrift for læger Findes http://www.ugeskriftet.dk/portal/page/portal/laegerdk/ugeskrift_for_laeger på Kilde (2-3) er fundet ved at søge på MRSA i avanceret søgning (84 hits, 2 valgt). Søgning foretaget den 10.01.2013 Pri.rn.dk Kilde (10, 12-13, 20-22) er fundet på https://pri.rn.dk/overview/sider/dokumenter.aspx?sf=all fra den 20.12.2012 til den 10.04.2013. Region Nordjyllands dokumentsamling. Oxoid Side 31 af 52

Kilde (11, 24, 26) er fundet via oxoids hjemmeside: http://www.oxoid.com/dk/blue/index.asp, fra den 25.01.2013 til 08.05.2013 PubMed Søgning omhandlende contrast MRSA bouillon. Ingen hits. Søgning foretaget den 06.05.2013. Søgning om PCR hvor jeg fik 51 hits og valgte 1 artikel, kilde (31). Søgning foretaget den 16.05.2013. Søgning omhandlende BORSA. Jeg fik 21 hits, og valgte en artikel, kilde (29). Søgning foretaget den 18.05.2013. Søgning omhandlende mecc. Jeg fik 12 hits og valgte en dansk artikel, kilde (18). Søgning foretaget den 23.05.2013. Side 32 af 52

Søgning omhandlende spa-typning. Jeg fik 39 hits, hvor jeg har udvalgt en artikel, kilde (15). Søgning foretaget den 23.05.2013. Kilder fundet ud fra bachelorprojekterne fra Skejby (27) og Rigshospitalet (28) Projekterne er fundet via søgning på google på contrast MRSA bouillon. Kilde (14) er fundet ud fra bachelorprojektet fra Skejby. Kilde (30) er fundet ud fra bachelorprojektet fra Rigshospital. Side 33 af 52

Bilag 4 Rådata Ved rubrikker uden tekst er resultatet negativt. Indikatoromslag efter 48 timer er først aflæst efter den 12. april. prøve nr 19- mar 51045 farve 24 timer farve 48 timer contrast 51042 grøn vækst mange mange positiv 51035 50993 gul/orang 50990 e grøn vækst mange mange positiv 50981 51047 gul/orang 51049 Side 34 af 52 oxacillin Etest koagulase mikroskopi slidex mg/l oksebouillon MRSA plade MRSA plade MRSAplade mængde mængde SPAtype kokker i hobe positiv 16 t657 kokker i hobe positiv 24 t223 e hvid vækst en del smidt ud negativ t657 kokker i 51051 hvid+grøn få mange positiv hobe positiv 12 t657 kokker i 51054 grøn vækst en del mange positiv hobe positiv 16 t657 51057 51061 51071 gul/orang e hvid vækst en del negativ

51069 51068 51067 51065 51063 51072 51073 51075 51077 51078 51080 negativ mange t657 51093 51092 51088 51087 51085 51082 51354 51353 51352 kokker i 03-apr 59112 gul grøn vækst mange en del positiv hobe positiv 8 t034 59122 59260 59269 59276 59258 59267 59275 gul/orang e hvid vækst en del negativ negativ Side 35 af 52 kokker i hobe positiv 256

59255 59266 59274 grøn vækst en del en del positiv 59254 59265 59272 59253 59264 grøn vækt en del en del positiv 59271 59250 59262 59270 grøn vækst en del negativ positiv 08-apr 62348 gul/orang 62333 e hvid vækst en del negativ 62321 62304 62335 62323 62308 62340 62326 62309 62341 62327 62313 62343 kokker i hobe positiv 3 t442 kokker i hobe positiv 128 t011 kokker i hobe positiv >256 t127 Side 36 af 52

gul/orang 62329 e negativ negativ 62314 62346 62331 62315 11-apr 64650 64655 64654 15-apr 67110 67111 67114 67118 67122 67126 18-apr 69269 69271 69273 25-apr 72949 orange orange 72956 orange orange 72960 rød orange 72962 orange orange 72963 mange positiv positiv >256 t011 72964 72965 75370 75371 rød gul grøn mange mange positiv positiv >256 t002 75372 75373 75375 orange hvid vækst Side 37 af 52

75376 orange hvid vækst 75380 75382 75383 orange orange hvid vækst 75384 75385 75387 76174 rød gul hvid vækst 76178 76181 rød orange 76182 76183 76184 76185 76186 76188 76199 76202 76204 76206 76207 76208 76209 76210 hvidvækst 76211 orange orange hvidvækst 76212 76215 76216 rød gul grøn mange en del positiv t223 Side 38 af 52

Bilag 5 Eksempel på beregning af sensitivitet og specificitet samt tilhørende tabeller Skema for resultaterne ved indikatoromslag af Contrast MRSA bouillon contrast MRSA non-mrsa oksebouillon MRSA 3 9 non- MRSA 9 103 Eksempel på udregning af sensitivitet og specificitet: Sensitivit et Specificit et antal sand positive sand positiv falsk negativ antal sand negative sand negativ falsk positiv 3 100% 25,0% 3 9 103 100% 87,5% 103 9 Skema for resultaterne ved de endelige resultaterne efter de konfirmatoriske test. contrast MRSA non-mrsa oksebouillon MRSA 9 3 non- MRSA 1 111 Bilag 6 Information om priser på contrast, oksebouillon og MRSA ID agar Mail fra Oxoid ang. pris på contrast Hej Sabrina og Alma, Listeprisen på bouillonen er 14,83, men vi prissætter efter volumen/forbrug så alt mellem 10,00 og 14,83 kr per stk. Med venlig hilsen / Best Regards Heidi Herup Mail fra SSI ang. pris på oksebouillon Hej Alma Side 39 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Tak for din mail. Hvis du bestiller Oksebouillon m. 6,5% NaCl ; 5 ml gennem Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital er prisen DKK 37/stk. Bemærk at minimumsmængden er 20 stk. for denne vare. Med venlig hilsen Majbrit Miladinovic Sales and marketing co-ordinator SSI Diagnostica Pris for MRSA ID agar Prisen for MRSA ID agar er fået ved at ringen til KMA Aalborg, hvor Bente har opgivet prisen til 8,35 kr./stk. Bilag 7 Modul 12 projekt Introduktion Baggrund Antallet af methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA) infektioner er steget kraftig i de seneste 10 år. MRSA var tidligere associeret med indlæggelse på et udenlandsk hospital. Dog er der i de seneste år opdaget mange nye tilfælde af MRSA i Danmark, her udgør hospitalserhvervede MRSA infektioner kun 9 % af tilfældene. Dvs. at det er ude i samfundet folk smittes. 50 % af nye MRSA infektioner skyldes samfundserhvervede tilfælde. Der findes flere årsager til dette, nogle af årsagerne er kontakt med MRSA inficeret familiemedlemmer eller arbejde med svin (2). På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital (KMA) anvendes oksebouillon tilsat 6,5 % NaCl (oksebouillon) som opformeringsmedie efterfulgt af udsåning på MRSA agar plade til at påvise MRSA. Oxoid har nu produceret et nyt produkt, Contrast MRSA bouillon (contrast), som kan detektere MRSA hurtigere, end den metode der bliver brugt i dag. Derfor ønsker KMA at indføre contrast i stedet for oksebouillon. Før at dette bliver aktuelt, ønsker KMA en sammenligning af oksebouillon og contrast. Her skal blandt andet belyses anvendeligheden af contrast, og hvordan procedureren ved weekend og helligdage kan være, da KMA gemmer de screeningsprøver for MRSA de modtager om fredagen til om mandagen. Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Formål Vi vil undersøge om Contrast MRSA bouillon kan indføres på KMA til detektion af MRSA. På nuværende tidspunkt benyttes oksebouillon med 6,5 % NaCl efterfulgt af udsåning på MRSA plader. Desuden ønsker vi at undersøge KMAs procedure af MRSA påvisning omkring weekend og helligdage. Problemstilling Hvad vil det betyde at implementere Contrast MRSA bouillon i stedet for oksebouillon med 6,5 % NaCl på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital, og hvordan kan arbejdsgangen ved weekend og helligdage optimeres? Målformulering Metodesammenligning af Contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl. o Metodernes sensitivitet og specificitet beregnes. Vi vil undersøge proceduren af MRSA podninger omkring weekend og helligdage med Contrast MRSA bouillon og oksebouillon. o Metodernes sensitivitet og specificitet beregnes. Teori MRSA står for methicilinresistent Staphylococcus aureus, det vil sige at Staphylococcus aureus (S. aureus) er resistent for antibiotikaet methicillin. S. aureus er grampositive kokker i hobe, og er en del af menneskets normalflora. Desuden kan S. aureus producere koagulase, hvilket adskiller bakterien fra andre stafylokokker, som er koagulase negative stafylokokker (KNS). S. aureus blev opdaget i 1878, og er skyld i mange hverdagsinfektioner (3). De fleste stafylokokker er resistent overfor penicillin, derfor udviklede man et andet antibiotikum, methicillin, til behandling af stafylokokker. Methicillin blev første gang anvendt i 1960, og den første methicillin resistente S. aureus blev opdaget i 1961. Methicillin resistens skyldes meca-genet, som koder for et penicillinbindende membranprotein (PBP-2), og gør at MRSA er resistent overfor alle betalaktamantibiotika (3). I 2004 fandt man en ny type MRSA, som kaldes CC398, og stammer fra svin. I alt 12 % nye tilfælde af MRSA i 2011 var svine-mrsa, hvilket har medført, at kontakt med levende svin nu betragtes som en risikosituation. I Danmark og andre nordiske lande er der stadig en forholdsvis lav fore- Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 komst af MRSA infektioner sammenlignet med andre lande. Desuden er en MRSA infektion anmeldelses pligtig. MRSA infektioner kan give forlænget indlæggelsestid og øget sygelighed, og det er derfor vigtigt at MRSA ikke spredes yderligere (4). En amerikansk undersøgelse viser, at der er mange forskellige typer samfundserhvervede MRSA i Europa, inklusiv Danmark, som vi kan risikere at få med ind på hospitalerne. Derfor er det vigtig at have en kontinuerlig overvågning for at påvise og bekæmpe MRSA (5). På nuværende tidspunkt anvendes oksebouillon 6,5 % NaCl på KMA som opformeringsmedie. Oksebouillon anvendes til selektiv dyrkning af stafylokokker og slægten Enterococcus. På grund af det høje saltindhold kan andre bakterie ikke vokse i dette medie (6). Oxoids nye produkt Contrast MRSA bouillon er en hurtigtest, hvor prøver kan inokuleres direkte, og der kan inokuleres op til fire podepinde på en gang, hvilket øger sensitiviteten. Inkubationstiden er på 18-24 timer, hvor positive resultater indikeres med farveskift. Ifølge Oxoid kan negative prøve (ingen farveskift) allerede slutsvares efter et døgn. Positive resultater skal kontrolleres ved at lave en konfirmatorisk test. Oxoid har ved et forsøg på 119 rutine screeningsprøver fundet en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 94,9 % (7). Contrast er tilsat inhibitor og antibiotika for at hæmme ikke-mrsa og gram negative bakterier. Desuden indeholder contrast indikatorfarvestof, phenol rødt, samt to sukkerarte, mannitol og trehalose, som fermenteres af MRSA stammer. Dette betyder, at ph falder, og det medfører et farveskrift fra rød til gul/orange, hvilket er et positivt resultat (8). I dette forsøg anvendes MRSA ID agar som konfirmatorisk test. MRSA ID agar er et selektiv substrat, som hæmmer væksten af de fleste andre bakterier end Staphylococcus. Desuden er der tilsat cefoxitin, som forhindrer methicillin følsomme Staphylococcus i at vokse på pladen. Derudover er MRSA ID agar et kromogent substrat med grønfarvning af S. aureus kolonier, som skyldes dannelsen af α-glucosidase (9). Sensitivitet er en metodes evne til at stille en korrekt diagnose på syge personer, i dette tilfælde metodernes evne til at detektere MRSA stammer. Til beregning anvendes denne formel: sensitivit et antal sand positive antal syge Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Specificitet er metodens evne til at stille en korrekt diagnose af raske personer, i dette tilfælde metodernes evne til at detektere MRSA negative stammer. Til beregning anvendes denne formel: specificit et antal sand negativ antal raske Dvs. at ved en høj specificitet er metoden god til at detektere MRSA negative stammer, og ved en høj sensitivitet er metoden god til at detektere MRSA stammer (10). Materiale og metode Bouilloner: contrast MRSA bouillon fik vi fra Oxoid, mens oksebouillon 6,5 & NaCl sendes fra SSI. Ved begge bouilloner følges producentens vejledning, dog med den undtagelse at der inkuberes ved 35 C i stedet for 37 C. For en udførlig materialeliste se bilag 1. Bakteriestammer: Der vælges 15 kendte MRSA stammer, 5 MRSA negative bakteriestammer, som findes i sår, samt en positiv og negativ kontrol. Se bilag 2 for mere specifik information om stammerne. Alle MRSA stammer er forskellige, og der er valgt flere stammer med MecAlga, da det er en ny type MRSA og, KMA har haft problemer med detektering af disse bakterier. De MRSA negative bakteriestammer er valgt ud fra at de er bakterie som ofte findes i sår, desuden er enterokokken valgt, da den har en evne til at blive opformeret i oksebouillon, og ydermere bliver positiv på MRSA pladen. Den positive og negative kontrol er valgt for at teste nogle andre ATCC stammer, end dem Oxoid allerede har testet. Identifikation af MRSA: Der laves fortyndingsrække, hvor de to laveste fortyndinger anvendes til inokulation i contrast og oksebouillon. Fortyndingerne er på 150 colony forming units/ml (CFU/ml) og 15 CFU/ml, og er valgt på baggrund af et tidligere bachelorprojekt om contrast MRSA bouillon (11). Den mindste farveændring ved contrast betragtes som et positivt resultat. Både contrast og oksebouillon sås ud på MRSA plade, vækst med grønne kolonier eller kolonier med grøn skær betragtes som positiv. Når KMA Aalborg modtager overvågningsprøver om fredagen, gemmer de prøver til mandag, og begynder først der at inokulere i oksebouillon. Derfor undersøger vi, hvordan sensitiviteten og specificiteten er for contrast og oksebouillon, hvis man inokulerer om fredagen. Derved laves to forsøg, det ene hvor contrast og oksebouillon står et døgn i inkubation dernæst på køl de Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 næste to dage. Det andet hvor contrast og oksebouillon står på køl to døgn og derefter et døgns inkubation. Litteratursøgning Der er søgt i pudmed med MeSH ordene MRSA og PCR. Jeg stillede visse krav til artiklerne, de skulle ikke være ældre end 5 år, og der skulle være mulighed for free full text, derved fik jeg 154 hits, hvor jeg valgte to artikler. Der er også søgt i Ugeskrift for læger på MRSA, her fandt jeg 78 hits og valgte en artikel. Desuden er hjemmesider fra Statens Serum Institut (SSI), Oxoid og pri (Region Nordjyllands dokumentsamling) anvendt. Det er forsøgt at søge artikler om Oxoids contrast MRSA bouillon men det har ikke været muligt at finde noget. Resultater For rådata se bilag 3 Metodesammenligning af Contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl Tabel 1 viser sensitivitet og specificiteten, når vi følger producentens vejledning. Sensitiviteten for farveændring af contrast er 73,3 % og 93,3 % for henholdsvis 15 og 150 CFU/ml. MRSA plader giver grønne kolonier ved 73,3 % af tilfældene ved 15 CFU/ml og 100 % ved 150 CFU/ml. For oksebouillon er sensitiviteten 86,7 % og 100 % ved 15 og 150 CFU/ml. Ved Når contrast anvendes får vi en specificitet på 100 % ved alle fortyndinger, dvs. at der ingen farveændring er af contrast, og ingen vækst på MRSA pladen. Specificiteten ved brug af oksebouillon er 80 %. Producentens vejledning Contrast farveændring MRSA plade fra contrast MRSA plade fra oksebouillon 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml Sensitivitet 73,3% 93,3% 73,3% 100% 86,7% 100% Specificitet 100% 100% 100% 100% 80% 80% Tabel 1: Sensitivitet og specificitet for contrast og oksebouillon når producenternes vejledning følges. Proceduren omkring weekend og helligdage Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Tabel 2 viser, hvordan sensitiviteten og specificiteten er, når bouillonerne har været i inkubation i et døgn, og dernæst har været på køl i to døgn. Ved farveændring af contrast er sensitiviteten 73,3 % ved 15 CFU/ml, og 93,3 % ved 150 CFU/ml. For grøn vækst på MRSA pladen ved contrast er sensitiviteten 73,3 % og 100 % for henholdsvis 15 og 150 CFU/ml. For oksebouillon er sensitiviteten 93,3 % for både 15 og 150 CFU/ml. Specificiteten er 100 % for både 15 og 150 CFU/ml ved farveændring af contrast, MRSA plade fra contrast og MRSA plade fra oksebouillon. 1 dags inkubation og 2 dage på køl Contrast farveændring MRSA plade fra contrast MRSA plade fra oksebouillon 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml Sensitivitet 73,3% 93,3% 73,3% 100% 93,3% 93,3% Specificitet 100% 100% 100% 100% 100% 100% Tabel 2: Sensitivitet og specificitet for contrast og oksebouillon når disse har været i inkubation i 1 dag og derefter på køl i 2 dage. Tabel 3 viser sensitivitet og specificitet, når bouillonerne har været to dage på køl, og derefter en dag i inkubtion. Sensitiviteten for farveændring af contrast er 33,3 % ved 15 CFU/ml og 73,3 % ved 150 CFU/ml. På MRSA plade for contrast fandt vi en sensitivitet på 73,3 % og 100 % ved 15 og 150 CFU/ml. Sensitiviteten for MRSA plade fra oksebouillon var 33,3 % for 15 CFU/ml og 73,3 % med 150 CFU/ml. Specificiteten er 100 % ved det hele, dvs. at der ikke er nogen farveændring af contrast, og ingen vækst af grønne kolonier på MRSA pladen for både contrast og oksebouillon. 2 dage på køl og 1 dag med inkubation Contrast farveændring MRSA plade fra contrast MRSA plade fra oksebouillon 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml 15 CFU/ml 150 CFU/ml Sensitivitet 33,3% 73,3% 73,3% 100% 33,3% 73,3% Specificitet 100% 100% 100% 100% 100% 100% Tabel 3: Sensitivitet og specificitet for contrast og oksebouillon når disse har været på køl 2 dage og i inkubation 1 dag. Diskussion Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Metodesammenligning af Contrast MRSA bouillon og oksebouillon med 6,5 % NaCl Oxoid påstår, at hvis contrast stadig er rød efter 24 timer, er der ikke MRSA i prøven (7). Den beregnede sensitivitet ved farveændring af contrast er på 73,3 % og 93,3 %, dvs. at der var henholdsvis 4 og 1 falsk negative svar ved 15 og 150 CFU/ml. Ved udsåning på MRSA plade var sensitiviteten stadig 73, % ved 15 CFU/ml, men 100 % ved 150 CFU/ml. Derved kan man se, at selvom der ingen farveændring er i en contrast, kan der stadig vokse grønne kolonier frem på MRSA pladen, derfor må man gå ud fra, at der er bakterievækst i contrasten. Sammenlignet med MRSA pladen med udsåning fra oksebouillon er sensitiviteten 86,6 % og 100 % ved 15 og 150 CFU/ml. Dvs. at sensitiviteten er en smule bedre for oksebouillonen. Man kan se ud fra resultaterne at en større koncentration giver en bedre sensitivitet, hvilket vil sige en farveændring af contrast, og grønne kolonier på MRSA pladen både fra contrast og oksebouillon. Problemet ved dette er, at vi gerne vil kunne detektere MRSA, hvis der bare er det mindste til stede. Ved en enkelt bakterie er der ingen farveændring, vækst på MRSA pladen fra både contrast og oksebouillon ved 15 CFU/ml, det kan måske skyldes, at der slet ikke er nogle bakterier tilstede. Ved tre bakterier ser man, at der hverken er farveændring eller vækst på MRSA pladen for contrast ved 15 CFU/ml, men vækst ved udsåning fra oksebouillon. Det kan tyde på, at oksebouillonen er et bedre opformeringsmedie. Specificiteten er 100 % ved både farveændring og på MRSA pladen for contrast, hvilket vil sige at de bakterier vi har testet alle for et korrekt negativt svar, og vi ser ingen falsk positive resultater. Specificiteten for oksebouillon er 80 %, hvilket vi havde forventet, da enterokokken kan opformeres i oksebouillon, og giver grønne kolonier på MRSA pladen. Hvilket desuden er grunden til, at man i rutinen altid mikroskoperer grønne kolonier på MRSA pladen, for at se om det er kokker i hobe (12). Derved er det en fordel at contrast ikke ændre farve ved enterokokken. Oxoids påstand holder ikke helt, da vi fandt flere falsk negative svar. Deres fundne sensitivitet på 100 % samt specificiteten på 94,9 % (7) stemmer ikke helt overens med vores forsøg. Det kan skyldes, at de i deres forsøg har anvendt en større koncentration. Ulempen ved contrast er, at sensitiviteten er lavere end ved oksebouillonen. Fordelen ved contrast er den bedre specificitet. For at højne sensitiviteten af contrast foreslås det derfor altid at så alt ud på MRSA plader ligesom man gør med oksebouillonen. Derved kan man ved ukend- Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 te MRSA positive personer spare en dag i forhold til oksebouillonen, da man allerede ved farveændring kan lave en subkultur, som skal bruges, hvis det skulle vise sig, at der er vækst af grønne kolonier på MRSA pladen dagen efter. Den sparede dag er godt for patienter med mistanke om MRSA, da de skal bekymre sig i kortere tid om de mulige udfald af resultatet. Oksebouillonens fordel er den bedre sensitivitet end contrast, samtidig har oksebouillonen den ulempe, at enterokokker giver grønne kolonier på MRSA pladen, hvilket gør at personale bruger unødig tid på mikroskopering. Proceduren omkring weekend og helligdage KMA ønsker at finde ud af, hvordan proceduren kan være omkring weekend og helligdage. Sensitiviteten af farveændring af contrast, hvis bouillonerne har været inkuberet først, er 73,3 % 93,3 %, mens sensitiviteten er 73,3 % for 15 CFU/ml og 100 % for 150 CFU/ml med contrast på MRSA pladen. Dette er præcis det samme som ovenstående, dvs. at det ikke har påvirket resultaterne, at bouillonerne har stået på køl i to dage efterfølgende. For oksebouillonen er sensitiviteten 93,3 % for både 15 og 150 CFU/ml, og skyldes at to forskellige MRSA typer ikke detekteres. Sensitiviteten er derved højere for 15 CFU/ml, men lavere for 150 CFU/ml end før. Specificiteten er 100 % ved både farveændring af contrast og MRSA plade for contrast og oksebouillon. Det er samme resultat som ovenstående forsøg, bortset fra at enterokokken ikke bliver falsk positiv, når oksebouillonen kommer på køl efter inkubation. Det er en fordel, da man må forvente færre plader med vækst, og derved bruger bioanalytikeren mindre tid på mikroskopering. Alt i alt er resultaterne næsten det samme, som hvis bouillonerne kun havde været inkuberet et døgn, og derefter blevet sået ud på MRSA plader. Hvis bouillonerne først har været på køl i to dage, og derefter inkuberes en dag ser det helt anderledes ud. Sensitiviteten for farveændring af contrast er kun på 33,3 % for 15 CFU/ml, her er det kun er 5 ud af 15 stammer, hvor der sker en farveændring. For 150 CFU/ml er sensitiviteten 73,3 %. MRSA pladernes sensitivitet for contrast er 73,3 % og 100 %, hvilket er det samme som de to ovenstående forsøg. For oksebouillonen er MRSA pladernes sensitivitet også 33,3 % og 73,3 % for henholdsvis 15 og 150 CFU/ml, hvilket er meget lavere end de to andre forsøg. Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Igen ses ved samme bakterie hverken farveændring, eller vækst på MRSA pladerne for contrast og oksebouillon ved både ved inkubation og køl først. Dette kan enten skyldes, at bouillonerne ikke er gode nok til at opformere bakterierne, eller at vi har lavet en fejl i vores forsøg, hvor vi ikke har fået lavet den sidste fortynding godt nok, eller ikke har kommet noget materiale i fra forrige fortynding. Hvis vi antager, at vi har lavet en fejl i forsøget, vil de nye sensitiviteter se således ud. Ny sensitivitet uden bakterie 7 for 15 CFU/ml Contrast farveændrinrast lon MRSA plade fra cont- MRSA plade fra oksebou Sensitivitet Producentens vejledning 78,5% 78,5% 92,9 1 dags inkubation, 2 dages køl 78,5% 78,5% 100 2 dages køl, 1 dag inkubation 35,7% 78,5% 35,7 Tabel 4: Ny sensitivitet hvor bakterie 7 er set bort fra i udregningerne. Man kan herved se, at de nye sensitiviteter bliver bedre end de forrige. Specificiteten er stadig 100 % for farveændring og MRSA plader for contrast og oksebouillon, så det har ikke ændret sig, selvom bouillonerne har været på køl først. Ved problemstillingen omkring weekenden kan det anbefales at inkubere et døgn om fredag, og derefter tage bouillonerne på køl. Man så næsten de samme resultater som ved inkubation en dag og udsåning derefter. Sensitiviteten for oksebouillon som anvendes på nuværende tidspunkt blev højere, 100 %, ved 15 CFU/ml, men lidt lavere ved 150 CFU/ml. Specificiteten blev bedre ved at komme på køl, og ramte 100 %. Det kan ikke anbefales at sætte bouillonerne på køl i to dage, og udså dem derefter. Anvendeligheden af contrast MRSA bouillon Contrast MRSA bouillon er en glas beholder med skruelåg. Skuelåg kan ved mange gentagelse være dårligt for håndledet. Efter inokulation og inkubation var næste alle lågene meget stamme at skrue af. Desuden tager skruelåg mere tid end de propper/hætter der findes på oksebouillonen. Ved nogen af prøverne var det svært at vurdere, om der var sket en farveændring eller ej, fere gange måtte man holde en ubrugt contrast op mod en prøve for at Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 vurdere en evt. farveændring. Hvis der er mange tvivlsomme prøver, kan man komme til at bruge lang tid på vurderingen af farveændring. Diskussion af metoden Det kan anbefales at lave et forsøg med flere prøver, da få forkerte svar påvirker sensitiviteten og specificiteten relativt meget. Desuden ville et forsøg med overvågningsprøver være mere velegnet til forsøget, da man her ville kunne sammenligne oksebouillon og contrast til det rette behov. Det er muligt, at resultaterne ville have været anderledes, hvis vi havde valgt en højere koncentration, men for os spillede det en rolle, at contrast og oksebouillon kunne detektere lavest mulig. Den positive og negative kontrol har jeg set bort fra i denne opgave, da de overhovedet ikke blev som forventet. Desuden kan de 15 kendte MRSA stammer og 5 MRSA negative stammer, vi har testet, betragtes om positive og negative kontroller, da vi i forvejen kender bakteriestammerne. Til en anden gang kunne det også være en idé, at kontrollere om der evt. er sket en fejl i forsøget, som der muligvis er sket med bakterie syv, og derved lave forsøget om med denne bakterie. Perspektivering Denne opgave kan bruges til at belyse anvendeligheden af contrast MRSA bouillon. På baggrund af vores forsøg har vi fundet ud af, at contrast ikke kan anvendes, som Oxoid påstår, da sensitiviteten for farveændring bliver for lav i forhold til oksebouillonen. Hvis man udsår alt, som inokuleres forhøjes sensitiviteten. Om KMA vil anvende contrast i stedet for oksebouillon, skal vurderes ud fra de fordele og ulemper, som er beskrevet i diskussionsafsnittet. Det vil på KMA være muligt at inokulere oksebouillon om fredagen, og derved spare en dag i sidste ende. Der findes også andre metoder til detektion af MRSA. Et systematisk review fra Canada viser, at polymerase kæde reaktion (PCR) er væsentlig hurtigere til detektering af MRSA end kromogent agar. Xpert MRSA, en hurtig metode til detektion af MRSA, bruger kun 72 min eller mindre til detektering af MRSA (13). En så hurtig metode vil kunne mindske isolationsdage for patienter med mistanke om MRSA, og derved spare samfundet for mange penge. Konklusion Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Man kan til dels anvende contrast i stedet for oksebouillon. Farveændring eller ej skal alt, som inokuleres, sås ud på MRSA plader for at få en sensitivitet på højde med oksebouillonen. Her kan man med fordel lave en subkultur, hvis der er en farveændring af contrast. Implementering af contrast vil derved betyde en sparet dag, hvis personen ikke allerede er kendt med MRSA. Ved MRSA negative personer vil man ikke kunne spare tid ved at anvende contrast, da man stadig skal så ud på MRSA plade, for at højne sensitiviteten. Specificiteten var bedst for contrast. For at optimere arbejdsgangen omkring weekenden har forsøget vist, at man kan inokulere oksebouillonen og contrast om fredagen og inkubere dette i et døgn, herefter skal det stilles på køl i to døgn til mandag. Sensitiviteten og specificiteten for contrast var det samme, som hvis det kun havde været inkuberet et døgn. Sensitiviteten blev højere ved 15 CFU/ml, men lavere ved 150 CFU/ml. Specificiteten blev bedre for oksebouillonen, hvis bouillonerne kom på køl i to døgn. Referenceliste (1) Frost SS. Opformeringsmedie til identifikation af MRSA. januar 2013; Available at: https://www.ucviden.dk/student-portal/files/10619373/pbp_en.pdf. Accessed 15/4, 2013. (2) Skov R, Schrøder Hansen D. MRSA og ESBL er fortsat stigende i samfundet og ved hospitalsassocierede udbrud. Ugeskrift for læger 2011;173(45):2869-2872. (3) Degré M, Hovig B, Rollag H. Medisinsk mikrobiologi. 3. utg. ed. Oslo: Gyldendal; 2008. (4) Statens Serum Institut. Methicilin resistente Staphyloccus aureus. dec 2012; Available at: http://www.ssi.dk/service/sygdomsleksikon/m/methicillin%20resistente%20staphylococcus%20a ureus.aspx. Accessed 19/3, 2013. (5) Rolo J, Miragaia M, Turlej-Rogacka A, Empel J, Bouchami O, Faria NA, et al. High genetic diversity among community-associated Staphylococcus aureus in Europe: results from a multicenter study. PLoS One 2012;7(4):e34768. (6) Røder BL. Substrathåndbogen. 1. udgave ed. Kbh.: Statens Seruminstitut, Substratafdelingen; 1993. (7) Oxoid. Contrast MRSA. 2011; Available at: http://www.oxoid.com/pdf/mrsa/folio-1352-26418-mrsa-contrast-lit-august-2011.pdf. Accessed januar 27, 2013. (8) Oxoid. Contrast MRSA Broth. 2013; Available at: http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=eb1225&org=155&c=uk&lang= EN. Accessed Januar 25, 2013. Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 (9) Højbjerg T. MRSA ID agar. januar 2012; Available at: www.pri.rn.dk. Accessed 20 december, 2012. (10) Bendsen T. Noter i statistik. 2012; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/. Accessed 01/25, 2013. (11) Jørgensen CB. Afprøvning af opformeringsmedier til identifikation af MRSA. 2011; Available at: https://www.ucviden.dk/student-portal/files/10619373/pbp_en.pdf. Accessed januar 28, 2013. (12) Paulsen KI. Påvisning af meticillin resistente Staphylococcus aureus. juni 2011; Available at: www.pri.rn.dk. Accessed 2 januar, 2013. (13) Polisena J, Chen S, Cimon K, McGill S, Forward K, Gardam M. Clinical effectiveness of rapid tests for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in hospitalized patients: a systematic review. BMC Infect Dis 2011 Dec 12;11:336-2334-11-336. Bilag 8 - Contrast MRSA broth (Oxoid) as a screening tool for MRSA colonization Contrast MRSA Broth (Oxoid) as a Screening Tool for MRSA Colonization *Peter Schäfer & Claudia Bonk, MVZ Labor Ludwigsburg, Ludwigsburg, Deutschland Abstract-Text : Rationale Screening for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) colonization is a standard procedure to prevent nosocomial spreading. As patient isolation is cumbersome and expensive, it is crucial to confirm or rule out MRSA carriership in good time. However, conventional plating culture may require up to 72 h for definitive results, and more rapid methods based on PCR are logistically demanding. Thus, smart and simple culture procedures are of great interest. In this respect we have studied the utility of Contrast MRSA Broth (Oxoid), which promises to provide results within 18 h. Methods One-hundred nasal or pharyngeal swabs from patients screened for MRSA colonization were investigated in parallel by Contrast MRSA Broth (Oxoid) and standard culture. Contrast MRSA Broth was evaluated after 18 h. Standard cultures (Columbia CNA agar, chromogenic MRSA agar, BHI enrichment broth) were monitored for up to 72 h. Growth suggesting MRSA in Contrast MRSA Broth (change in color from red to yellow or orange as defined by the manufacturer) or in standard culture was confirmed with additional MRSA-specific tests. Results By standard culture, 14 samples were classified as MRSA positive and 86 as negative. Six specimens which appeared negative at 24 h turned out to be MRSA positive after 48 h or 72 h. In contrast, all 75 of the Contrast MRSA Broth samples which remained unchanged (red) after 18 h proved MRSA negative (p = 0.033). The other 25 broth results were rated as presumptively positive (yellow or orange). Of these, 14 were confirmed as MRSA positive, while 11 proved negative. Accordingly, Contrast MRSA Broth showed optimal sensitivity (100%), but only moderate specificity (87%). However, it was striking that 13 (93%) of the 14 MRSA-positive samples, but only one (9%) of the 11 remaining negative specimens displayed a complete color change to yellow (p < 0.001). Side 40 af 52

Sabrina L. L. Christensen 29.05.2013 Conclusions According to the test instructions, Contrast MRSA Broth samples which are unchanged after 18 h can be discarded, while any change in color indicates a presumptive positive and must be confirmed. Indeed, in our setting unchanged broths completely ruled out the presence of MRSA within 18 h, while the standard plating method showed significant false negative rates at 24 h. Strikingly, if only the complete color change to yellow (but not to orange) had been interpreted as a presumably positive result, the low overall specificity of the broth test would have increased from 87% to 99% (p = 0.002). However, one broth then would have been falsely rated as MRSA negative (not significant). Altogether the Contrast MRSA Broth (Oxoid) appears to be a promising tool for timely and reliable screening for MRSA colonization. A reappraisal of the criteria to define presumptive positives might prove advantageous in further studies. Side 40 af 52