Studiepraktik Vejledninger til Laboratoriearbejdet i mikrobiologi E 2013/BIS

Studiepraktik Vejledninger til Laboratoriearbejdet i mikrobiologi E 2013/BIS

1 Makroskopisk og mikroskopisk undersøgelse af bakterier Formål: At udføre makroskopiske og mikroskopiske bakterieundersøgelser. Mål: At kunne udføre makroskopiske og mikroskopiske bakterieundersøgelser under vejledning. At kunne arbejde aseptisk i det mikrobiologiske laboratorium. At kunne begå sig sikkerhedsmæssigt forsvarligt i det mikrobiologiske laboratorium. Teori: Ved bakterieidentifikation anvendes makroskopiske, mikroskopiske og biokemiske undersøgelser. Makroskopiske undersøgelser foretages på fremvoksede kolonier hvor bl.a. kolonifarve, -størrelse og lugt observeres. Ved vækst på blodplader kan evt. forekomst af hæmolyse iagttages. Der kan også anvendes substratplader, f.eks. den blå plade der skifter farve ved bakterievækst som følge af bakteriernes biokemi (eksempelvis kulhydratomsætning). Mikroskopi af gramfarvede bakterier anvendes til at vurdere bakteriens form og lejring samt dens gramreaktion, Gram-positiv (blå) eller Gram-negativ (rød). Apparatur: Mikroskop Utensiler: Podenåle Materialer og reagenser: Materialer: 4 stk. 5% blodplader 4 stk. blå plader (bromthymolblåt-laktose agar plader) 4 Staphytect/2 personer

2 Reagenser: Kemikalie CAS-nr. Mærkning Virkon 1% - - - H 2 O 2, 3% 7722-84-1 - - - Oxidase Reagens 637-01-4 Xi 36/37/38 26-36 Prøver: Bakterie A Bakterie B Bakterie C bakterie D Fremgangsmåde: Der arbejdes individuelt, undtaget er Staphytect-undersøgelsen, der udføres 2 og 2. Oversigt over laboratoriedagene Første laboratoriedag Onsdag d. 23. okt. 13:15-15:00 Anden laboratoriedag Fredag d. 25. okt. 12:15-14:00 Aktivitet Intro til mikrobiologiske laboratorium Demonstration af udsåning Udsåning på 5% blodplader Udsåning på blå plader Staphytect Demonstration af Gramfarvning Gramfarvning Aflæse 5% blodplader Aflæse blå plader Katalase og oxidasetest Mikroskopi af gramfarvede præparater Fremstilling af fugtigt præparat og mikroskopi af fugtigt præparat (hvis der er tid)

3 Første laboratoriedag a) Udsåning til makroskopiske undersøgelser af Bakterie A, Bakterie B, Bakterie C og bakterie D Udsåning til undersøgelse af kolonimorfologi og hæmolyseforekomst på 5% blodplader. 1. 5% blodplader (4 stk) mærkes i bunden rundt langs siden med initialer, dato samt bakteriea/b/c eller D. 2. 1 L podenålen udtages aseptisk af hylsteret. 3. Der udtages med podenål lidt kolonimasse. 4. Med podenålen udstryges på blodpladen, som vist på nedenstående tegning. (Udsåningen vil også blive demonstreret i laboratoriet). 5. Inkubér pladerne ved 37 ºC i 1 døgn. 1 2 3 4 lidt af en koloni udtages med øjepodenål og udstryges med øjepodenålen udføres med ren side af den runde ende udføres med ny ren side af den runde ende udføres med ny ren side af den runde ende NB: Skift podenål mellem 1 og 2. Mellem 2 og 3 samt 3 og 4 drejes podenålen en kvart omgang.

4 b) Udsåning til undersøgelse af laktoseforgæring på blå plade. Samme procedure som udsåning på 5% blodplade se ovenfor. c) Staphytect Plus (NB: dette forsøg udføres i grupper på 2 personer) Begynd med kontrolreaktionen: 1. Dryp en dråbe kontrolreagens (Control Reagent) i det ene felt. 2. Med en 1 L podenål udtages lidt kolonimasse fra den udsåede 5% blodplade, dette udrøres i kontroldråben. 3. Fordel materialet på hele cirklen og tag derefter kortet op i hånden og vip det, til der i alt er gået 20 sekunder. 4. Aflæs reaktionen Kontrolreaktionen skal altid være negativ (uden agglutination). Testreaktionen: 1. Dryp en dråbe testreagens (Test Reagent) i det andet felt. 2. Med en 1 L podenål udtages igen lidt kolonimasse fra den udsåede 5% blodplade, dette udrøres i test dråben. 3. Fordel materialet på hele cirklen og tag derefter kortet op i hånden og vip det, til der i alt er gået 20 sekunder. 4. Aflæs reaktionen Testreaktionen er positiv, hvis blandingen agglutinerer og negativ, hvis den ikke agglutinerer. Agglutination efter de 20 sekunder tæller ikke. Skriv reaktionen ind på figurerne på s. 11

5 d) Gramfarvning og mikroskopi af Bakterie A, B, C og D Fordel arbejdet, således at 2 studiepraktikanter arbejder sammen. Studiepraktikant 1 farver bakterie A og C Studiepraktikant 2 farver bakterie B og D Gramfarvning - fremgangsmåde. Fremstilling og flammefiksering af mikroskopipræparat: 5. På et objektglas anbringes en lille dråbe vand med et hårrør eller en 10 µl øjepodenål (blå). 6. Med en 1µL øjepodenål udtages lidt kolonimasse til objektglasset. Kolonimassen udrøres forsigtigt i vandet. 7. Blandingen fordeles i et tyndt lag jævnt fordelt midt på objektglasset. 8. Præparatet lufttørres. 9. Flammefikseres ved at føre objektglasset gennem flammen i en bunsenbrænder 2-3 gange med bakterierne opad. Farvning: 10. Tildryp med 1% methylviolet og lad farven virke 1 minut. Skyl med H 2 O. 11. Grundig afskylning med iod-iodkalium. 12. Præparatet dækkes med iod-iodkalium. Henstand 1 minut. Afskylning med vand. 13. Affarvning med absolut alkohol. OBS: Det er af største vigtighed at undgå påvirkning med fortyndet ethanol, derfor hældes ethanolen ned over det skråtholdte (45 ) præparat, således at vandet skubbes væk foran ethanolen, uden at få lejlighed til at blande sig med denne. Fortsæt skylningen med en tynd stråle ethanol i 20-40 sek. Affarvningstiden afhænger af præparatets tykkelse, og skylningen med ethanol skal fortsætte, indtil der ikke mere trækkes blå farve ud. 14. Afskylning med vand. Hurtigt uden nogen blanding. 15. Farvning 1 minut med 1% safranin. 16. Afskylning med vand. 17. Afdrypning og tørring. 18. Mikroskopering.

6 Anden laboratoriedag. a) Aflæsning af 5% blodplader. Indtegn (tag evt. et foto med ipad en) bakterievæksten på 5% blodpladerne i aflæsningsskemaet og udfyld skemaet vedrørende bakteriernes kolonimorfologi s.8 b) Aflæsning af blå plader Udfyld skemaet s. 9 c) Biokemiske test (katalase- og oxidase-test) Oxidasetest. 1. Overfør 1 dråbe oxidasereagens på et stykke filtrerpapir anbragt i en petriskål. 2. Med en øjepodenål udtages lidt kolonimasse fra blodpladen og overføres til det fugtede område på filtrerpapiret. 3. Positiv reaktion: blåfarvning inden for de første 10 sekunder. 4. Negativ reaktion: ingen blåfarvning (undertiden ses en beige/brunlig farve). Evt. sen blåfarvning. 5. Skriv reaktionerne ind i skemaet s. 9 Katalasetest. 1. På et objektglas anbringes med en dråbepipette én dråbe 3% brintperoxid (H 2 O 2 ). 2. Fra den udsåede 5% blodplade udtages med 1 L øjepodenål lidt kolonimasse, som udrøres i brintperoxiddråben. 3. Positiv reaktion viser sig straks ved brusen i dråben. 4. Ved negativ reaktion ses derimod ingen brusen. 5. Reaktionen iagttages bedst på mørk baggrund. 6. NB: Det er vigtigt ikke at medtage substrat til katalasetesten, da blod kan give falsk positiv reaktion. 7. Skriv reaktionerne ind i skemaet s. 9

7 d) Mikroskopi af gramfarvede præparater af Bakterie A, B, C og D Begynd med at indstille mikroskopet efter Köhlers princip. Find bakterierne ved 10 x forstørrelse. Skift til 40 x forstørrelse og fokuser. Bring de bakterier, som skal forstørres, ind i midten af synsfeltet ved 40 x forstørrelse. Drej objektivet væk og læg en dråbe olie på præparatet. Drej objektiv 100 x i lysvejen og justér finskruen, så præparatet ses skarpt. OBS.OBS. Kun objektiv 100 x må berøre olien! Efter brug af olie er det meget vigtigt at rengøre linsen bagefter. Dette gøres med kleenex påført optikrensevæske. Tør grundigt af og tør efter med en tør kleenex. Udfyld skemaet s. 10 e) Undersøgelse for bevægelighed i fugtigt præparat, Bakterie A, B, C og D Fremstilling af fugtigt præparat Princip: Våde præparater anvendes især til iagttagelse af bevægelighed hos bakterier. Bevægeligheden ses bedst i et fasekontrastmikroskop. Fremgangsmåde: Et vådt præparat kan fremstilles ud fra en bakteriekoloni. 1. På et objektglas anbringes en dråbe vand enten med 10 μl øjepodenål eller med et hårrør. 2. Med 1 μl øjepodenål udtages lidt kolonimasse, som overføres til vanddråben. 3. Læg dækglas på og mikroskoper ved 40x (fasekontrast) Resultat: Der kan skelnes mellem forskellige former for bevægelighed: Polært bevægelige (monotrich/lophotrich), bakterierne bevæger sig retningsbestemt. Peritrich bevægelige, bakterierne tumler. Udfyld skemaet s. 10

8 AFLÆSNINGSSKEMAER/-FIGURER a) Tegn bakterievæksten på 5% blodpladerne (tag evt. foto med Ipad en). Bakterie A Bakterie B Bakterie C Bakterie D

9 Udfyld skemaet Vækst på 5% blodplade kolonimorfologi Bakterie Bakterie A Bakterie B Bakterie C Bakterie C -, - eller non- Hæmolyse Kolonistørrelse Kolonifarve Evt. lugt b) Udfyld skemaet Vækst på den blå plade Bakterie Bakterie A Bakterie B Bakterie C Bakterie D Farve på substratet Forgærer bakterien laktose? Biokemiske test Katalase +/- Oxidase +/-

10 c) Mikroskopi af gramfarvede præparater og bevægelighedstest. Udfyld skemaet Bakterie Bakterie A Bakterie B Bakterie C Bakterie D Tegn det gramfarvede præparat, hvor farve, form og lejring vises Gramfarvning Angiv resultatet af gramfarvningen: G+/G- Bev. +/- Bevægelighedstest

11 d) Staphytect Tegn, hvad du ser (tag evt. foto med Ipad en) Kontrol Bakterie A Bakterie B Bakterie C Bakterie D Hvilken bakterie forårsagede en agglutination? ------------------------------------------------------------------------------------------- Samlet resultat Bakterie A er: Bakterie B er: Bakterie C er: Bakterie C er: Se bilag 1 for identifikation

Bilag 1 Bakterier i laboratoriet Substrater Mikroskopi Enzymatiske reaktioner Gram negative bakterier Koloni farve Blodplade Hæmolyse Mannitol salt agarplade Mannitol forgæring Blå plade Laktose forgæring CPS Koloni farve Form Bevægelighed Koagulase Katalase Oxidase Pseudomonas aeruginosa Grålig evt. metalagtigt skær Obs. lugt Ja/Nej Vores stamme er non Ingen vækst, men er man+ Vækst lak - Brunlige, oftest udflydende kolonier eller klare kolonier Stav Ja (Negativ) Ikke relevant Positiv Positiv Escherichia coli Proteus mirabilis Mathvid/ Grålig Grålig Sværmer Ja/Nej Vores stamme er non Nej Evt. svag Ingen vækst, men er man+ Ingen vækst, men er man- Vækst lak+ Vækst lak- Store lyserøde til bourgognefarvede kolonier Store lysebrune til mørkebrune kolonier. Evt. brunfarvning af pladen. Stav Ja (Negativ) Ikke relevant Stav Ja (Negativ) Ikke relevant Positiv Positiv Negativ Negativ Klebsiella pneumoniae Grålig Meget fede kolonier Nej Ingen vækst, men er man+ Vækst lak+ Store (blå-)grønne Stav Nej (Negativ) ikke relevant Positiv Negativ

Substrater Mikroskopi Enzymatiske reaktioner Blodplade Mannitol salt agarplade Blå plade CPS Gram positive bakterier Koloni farve Hæmolyse Mannitol forgæring Laktose forgæring Koloni farve Form Bevægelighed Koagulase Katalase Oxidase Staphylococcus aureus Svag gul Ja/Nej Vores stamme er non Vækst man+ Ingen vækst, men er lak+ Små klare kolonier Kok Nej Positiv Positiv Negativ Streptococcus pyogenes Clostridium difficile Grå Ja Ingen vækst, men M-type 6 og 55 er man +. De øvrige er man - Ingen vækst, men er lak+ Grå Ja Ingen vækst Ingen vækst, men er lak-? Kok Nej (Negativ)? Ikke relevant Stav Ja (Negativ) Ikke relevant Negativ Negativ Negativ Negativ

Bilag 2 Lokale regler for arbejde i det mikrobiologiske laboratorium Generelle regler: Langt hår skal være samlet. Smykker på hænder og håndled samt lange negle skal undgås. Der må ikke ligge bøger/mapper på bordene. Øvelsesvejledningen opbevares i de fremlagte plastlommer. Egne blyanter må ikke benyttes. Der bæres mærkede kitler. Kitlerne stilles til rådighed. Der bæres normalt ikke handsker ved almindelige mikrobiologiske undersøgelser, med mindre der er sår/rifter på hænderne. Farvninger foregår så vidt muligt i stinkskab. Det flammefikserede præparat fremstilles på egen arbejdsplads, evt. kan farvningen fortsætte på egen arbejdsplads, hvis flg. procedure overholdes: Farvningen skal foregå efter at alle udpodninger og aflæsninger er foretaget, bordet aftørres i 1 % Virkon og afdækkes med vandtæt papir (NB: den glatte side skal vende nedad). Desinfektionsprocedurer: Hænder vaskes i desinficerende sæbe før og efter arbejdet med mikroorganismer. Borde aftørres i 1,0 % Virkon før og efter arbejdet med mikroorganismer. Ved spild optørres straks med 1,0 % Virkon. Køkkenrulle anvendt til dette formål anbringes i alm. affald.