Stamceller DeL 2 - Led- og senebehandling nu og i fremtiden [ Lise C. Berg 1 og Thomas G. Koch 2 ] 1 Cand. med. vet., ph.d., adjunkt, Institut for Basal Husdyr- og Veterinærvidenskab, KU LIFE 2 Cand. med. vet., ph.d.-studerende, Department of Biomedical Sciences, University of Guelph, Canada Led- og seneskader er nogle af de primære årsager til, at sportsheste enten er sygemeldt eller bliver pensioneret før tid. Tilsvarende skader ses hos sportsudøvere og hos arbejdshunde. Bruskvæv er meget dårligt til at hele, og reparationsvævet opnår sjældent fuld funktion. Det samme gør sig gældende i mindre grad for seneskader, hvor den reparerede sene er mere udsat for nye skader. I de senere år er der sket meget inden for dette felt både veterinært og humant - og i det følgende vil vi beskrive nogle af de nye behandlingsmuligheder. Nogle af dem er allerede tilgængelige i klinisk praksis, mens andre endnu kun er eksperimentelle. Det gælder generelt for de fleste af metoderne beskrevet i denne oversigt, at der er ingen eller få kontrollerede studier, og at det derfor ikke er videnskabeligt bevist, om behandlingerne virker. Der er mange positive case-rapporter, men det er svært at vide, om der er tale om en egentlig effekt, eller om det er en placeboeffekt som følge af andre tiltag implementeret sammen med behandlingen fx ændrede træningsforhold og fodring eller andre sideløbende behandlinger. Et andet problem er, at der i mange tilfælde stadig er tale om symptombehandling mere end egentlig kurative tiltag. Det er vigtigt at pointere betydningen af at være kildekritisk overfor tilgængeligt materiale. Mange studier har kun været publiceret i kongresmateriale, universitetspublikationer og mindre tidsskrifter, og disse artikler kan virke (og er også ofte) seriøse og veldokumenterede, men hvis de ikke har været igennem en peer-review proces, hvor kollegaer har haft mulighed for at stille spørgsmål til de anvendte metoder og opnåede resultater, kan de ikke regnes som videnskabeligt bevis. Der vil også ofte være forudindtagethed især i case-rapporter, så positive resultater får mere plads end negative resultater. Formålet med denne oversigt er ikke at tage stilling til effektiviteten af de enkelte behandlinger, men artiklen er i stedet ment som en kilde til information om de muligheder, der findes nu eller er på vej. Anatomiske og fysiologiske forhold Det bevægelige led består af en række strukturer: Ledbrusk, synovialmembran, synovialvæske og det subchondrale knoglelag. Knogleendernes normalanatomiske stilling opretholdes af sener og ligamenter, der både kan være placeret indenfor og udenfor leddet. Ledbrusk er et på mange måder unikt væv. Der er ingen blod- og nerveforsyning, hvilket gør, at vævet er afhængigt af ledvæsken både for passiv diffusion af næringsstoffer, men også for transport af signalstoffer mellem cellerne og mellem bruskvævet og de omkringliggende strukturer. Selve vævet indeholder kun én celletype - chondrocytter - som er placeret enkeltvis i lacunae adskilt af en omfattende ekstracellulær matrix (ECM). ECM består primært af collagener (især collagen type 2) og proteoglycaner. De collagene fibre giver vævet stivhed, mens proteoglycanerne binder væske og derved giver vævet fleksibilitet. Kombinationen resulterer i et væv, der kan absorbere stød og kompression, men som har nok stivhed til ikke at kollapse under dyrets vægt. Når leddet er vægtbærende, presses brusken sammen og væsken indeholdende signalstoffer og affaldsstoffer presses ud i ledhulen, og når vægten tages af leddet udvider brusken sig igen, og ledvæske suges ind i vævet sammen med næringsstoffer og signalstoffer. Ledbrusken er derfor afhængig af bevægelser i leddet. Synovialmembranen beklæder den indvendige side af ledhulen. Synoviocytterne producerer hyaluronsyre og lubricin, som er med til at gøre ledvæsken viskøs, mens selve væskefasen er et ultrafiltrat fra blodet. Mellem ledbrusken og den underliggende knogle er det såkaldte subkondrale knoglelag. Nyere studier har vist, at det ikke kun er brusklaget, der har betydning for udvikling af ledskader, men at synovialmembranen og det subkondrale lag også spiller vigtige roller. Sener og ligamenter består ligeledes af én celletype - tenocytter - som er langstrakte celler organiseret i forhold til de belastninger, de udsættes for. Senevæv består primært af collagen type 1, men det indeholder også bl.a. proteoglycaner. I modsætning til brusk er senevæv forsynet både med blod og nerver. Terapiformer Den perfekte behandling til led- og seneskader vil føre til fuld reparation i form af regeneration af det beskadigede væv både strukturmæssigt og funktionelt. Derudover vil præparatet»ligge på hylden«klar til brug, kunne anvendes allogent (mellem individer) eller xenogent (mellem arter), være let at bruge, og være til at betale for klienten. På nuværende tidspunkt er der ingen behandlingsform, der opfylder alle kriterier, men forskningen er rettet mod alle aspekterne og ikke kun den egentlige vævsreparation. De nye og eksperimentelle behandlingsformer kan opdeles i tre hovedgrup- 10 Dansk Veterinærtidsskrift 2008 15. august Nummer 15/16 Årgang 91
Figur 1. Forenklet oversigt over procedure for isolering af stamceller fra fedtvæv og knoglemarv. Cellerne kan isoleres fra fedtvæv udtaget ved fx haleroden - eller knoglemarv udtaget fra fx sternum, femur eller ilium. Prøven forberedes til centrifugering og separeres ved hjælp af et separationsmedie. De kerneholdige celler bestående af leukocytter, makrofager og en meget lille mængde stamceller anvendes enten direkte til behandling (1) eller stamcellerne separeres fra de øvrige celler og dyrkes i laboratoriet til det ønskede celletal er opnået, hvorefter de anvendes til behandling (2). per: Cellebaserede terapier, vævs- og membranbaserede terapier og vækstfaktor- og farmakabaserede terapier. Ofte vil flere af grupperne blive anvendt samtidig, men for overskuelighedens skyld vil de her blive gennemgået enkeltvis. Cellebaserede behandlingsformer I cellebaserede behandlinger anvendes enten stamceller eller vævsspecifikke celler. I veterinær praksis er stamcellebehandling allerede kommercielt tilgængelig, mens vævsspecifikke celler primært bruges til mennesker. Stamceller Stamcelleområdet er genstand for mange diskussioner, da vi på nuværende tidspunkt ikke ved, hvor mange celler der skal til for at opnå en effekt, og om en eventuel effekt skyldes, at de injicerede celler bliver inkorporeret i vævet og selv danner det nye væv, eller om cellerne i stedet har en mere trofisk effekt, hvor de tiltrækker og stimulerer lokale celler til at udføre reparationen. Desuden kan det diskuteres, om der selv efter dyrkningstrin i laboratoriet er tale om stamceller, da cellerne ikke bliver testet for stamcelleegenskaber før brug (se artikel:»stamceller DEL 1«i DVT nr. 14/2008). Der findes flere»stamcellebaserede«løsninger på markedet. Stamcellerne bliver isoleret enten fra knoglemarv eller fedtvæv, hvor de udgør en meget lille del af den samlede cellepopulation. Første trin i separationsprocessen er at isolere de kerneholdige celler fra de kerneløse røde blodceller. Fraktionen af kerneholdige celler består hovedsageligt af leukocytter og makrofager og kun af få stamceller (figur 1). Nogle firmaer bruger denne heterogene celleopløsning direkte til behandling (primært ved fedtvævsprøver), hvilket muliggør returnering af prøven inden for få dage. Det er diskutabelt om denne terapiform kan kaldes stamcellebehandling, da der hovedsageligt injiceres pro-inflammatoriske celler (figur 1.1). For at øge antallet af stamceller kan der foretages yderligere separationsog proliferationstrin (se tidligere artikel i DVT), hvor stamcellerne adskilles fra de øvrige celler og dyrkes i laboratoriet, indtil den ønskede mængde celler er opnået (figur 1.2). Det tager ca. 2-3 uger at opnå >10 millioner stamceller. Denne metode er ligeledes anvendt kommercielt (primært ved knoglemarvsprøver). Cellerne fra knoglemarven bliver oftest returneret i en væskefase fra det oprindelige knoglemarvsaspirat, så selve behandlingen består af et blandingsprodukt af opdyrkede celler og faktorer fra væskefasen. Fælles for de to beskrevne metoder er, at de på nuværende tidspunkt især anvendes til behandling af fokale, velafgrænsede seneskader hos heste. Et vigtigt spørgsmål at få besvaret i kommende studier er, om en evt. effekt skyldes»stamcellerne«eller de faktorer og pro-inflammatoriske celler, der som beskrevet også indgår i behandlingen. Behandling af ledbruskdefekter med celler besværliggøres af problemer med at fastholde de injicerede celler i læsionen uden at cellerne knuses, afskrabes eller på anden måde»tabes«ud i synovialvæsken.»mikrofraktur«eller»marvstimulering«er en in situ terapiform baseret på patientens egne celler og vævsfaktorer, som bliver brugt i behandling af fokale bruskdefekter. Ved at lave huller i bunden af defekten skabes der kontakt mellem den beskadigede ledbrusk og den subkondrale knoglemarv, hvor der teoretisk set findes»stamceller«og forskellige vævsfaktorer (figur 2). Denne metode anvendes allerede humant og i begrænset omfang veterinært - især i USA - hvor det anses for at være en nem og Figur 2. Skematisk præsentation af mikrofraktur/marvstimulering. Metoden anvendes til fokale bruskdefekter. Defekten oprenses og der laves fuld-dybde huller i bunden af defekten ned til den underliggende subkondrale knoglemarv. Celler og vævsfaktorer fra knoglemarven trænger op og menes at understøtte reparation af bruskvævet. > Dansk Veterinærtidsskrift 2008 15. august Nummer 15/16 Årgang 91 11
Stamceller DEL 2 forholdsvis billig behandlingsform, der er værd at afprøve inden man går i gang med mere omfattende metoder. I USA er der udført en række kontrollerede studier i humane patienter med varierende resultater, og et studie på heste har vist, at den kalcificerede brusk i bunden af defekten skal være helt fjernet, for at opnå positive resultater. Vævsspecifikke celler De vævsspecifikke celler kan enten være voksne bruskceller (chondrocytter) udtaget ved biopsi, eller det kan være stamceller, der er blevet stimuleret i retning af brusk i laboratoriet (differentieret) inden behandling. Et eksempel på behandling med bruskceller er autolog bruskimplantation (ACI = autologous chondrocyte implantation), der på nuværende tidspunkt anvendes i human praksis til fokale bruskdefekter, og derudover har været afprøvet i enkelte forsøg på heste i USA. Metoden er udviklet i Sverige og anvendes især i Sverige og England. ACI består af to indgreb: Først udtages en bruskbiopsi fra et ikke-vægtbærende område af brusken, og cellerne isoleres og dyrkes i laboratoriet. Når der er opnået tilstrækkeligt mange celler udføres indgreb nummer to, hvor defekten renses og dækkes med en membran (syntetisk materiale eller periostflap fra patienten), der bliver syet fast. Cellerne sprøjtes ind under membranen ned i defekten (figur 3). En variation af denne metode er at høste stamceller fra patienten og så enten bruge dem i udifferentieret eller differentieret form. Denne version er endnu kun beskrevet anvendt i eksperimentelle behandlinger, men en fordel ved at bruge stamceller er, at det kun kræver ét indgreb i selve leddet. Behandlinger med membraner og vævskonstruktioner Bruskvæv udgøres primært af en omfattende ekstracellulær matrix (ECM), der indeholder et netværk af fibre og strukturelle komponenter. Den ekstracellulære matrix stabiliserer vævet og forsyner cellerne med strukturelle informationer, som er essentielle for vævets funktion. Senevæv er tilsvarende afhængigt af en intakt strukturel opbygning. Mange især eksperimentelle behandlingsformer indeholder konstruktioner, der skal afspejle dette ECM netværk og derved understøtte dannelsen af nyt væv. Enkelte præparater anvendes alene, men de fleste produkter anvendes i kombination med celler og/ eller forskellige faktorer fx vækstfaktorer. Præparaterne kan klassificeres som enten biologiske (autologe, allogene eller xenogene) eller syntetiske. Figur 3. Skematisk præsentation af autolog chondrocytimplantation (ACI). Metoden anvendes til fokale bruskdefekter og består af to indgreb. I første indgreb udtages en bruskbiopsi fra et ikke-vægtbærende område af ledbrusken (1), og bruskcellerne isoleres og dyrkes i laboratoriet til det ønskede celletal er opnået (2). I andet indgreb oprenses den fokale bruskdefekt (3). Der udtages en periost-flap fra patienten (4), (der kan også anvendes en syntetisk membran), og flappen bliver syet fast over defekten (5). Der kan evt. tætnes yderligere med vævslim. Til sidst sprøjtes cellerne ned i defekten evt. sammen med forskellige vævsfaktorer (6). Alternativt til bruskbiopsien kan der anvendes stamceller (7), hvilket vil gøre det muligt at nøjes med ét indgreb i selve leddet. Biologiske præparater Der er flere kommercielt tilgængelige biologiske præparater, som allerede anvendes i veterinær og human praksis. To eksempler er SIS (small intestinal submucosa) og UBM (urinary bladder matrix), som begge består af vævsmembran fra gris, hvor cellerne er fjernet, og der derfor kun er de strukturelle komponenter tilbage. Det bedst kendte produkt i Danmark er ACell, der består af blærevæg. Det er beskrevet anvendt i behandling af sener og led, men der foreligger ikke kontrollerede studier om effekten af disse behandlinger i veterinær praksis. Anvendelsen er xenogen, hvilket kan medføre en risiko for reaktioner mod produktet, da det stadig kan indeholde grisespecifikke molekyler, selvom cellerne er fjernet. En fordel ved dette præparat er, at det er 12 Dansk Veterinærtidsskrift 2008 15. august Nummer 15/16 Årgang 91
Figur 4. Oversigt over nogle af de vigtigste faktorer i nedbrydningen af ledbrusk. Når ledbrusk bliver udsat for påvirkninger som fx traume eller slid, kan det medføre en inflammationsreaktion. Der udskilles cytokiner bl.a. IL-1 (interleukin 1) og TNF (tumor necrosis factor), som fører til en opregulering af MMP er (matrix metalloproteinaser), aggrecanaser og andre stoffer, der nedbryder den ekstracellulære matrix og dermed ledbrusken. biologisk baseret og alligevel opfylder ønsket om at være umiddelbart klar til brug og have lang holdbarhed. Der er flere andre eksempler på biologisk materiale, der anvendes i behandling af lidelser i bevægeapparatet. Såkaldte osteokondrale plugs anvendes autologt til behandling af fokale bruskdefekter og består af fulddybde-biopsier, der udtages fra et ikke-vægtbærende område af ledoverfladen og implanteres i det beskadigede område. De er afprøvet i en række forsøg både veterinært og humant. I denne gruppe af præparater findes også den ovenfor nævnte autologe periost-flap (figur 3.4), som kan bruges til at dække bruskdefekter i forbindelse med bl.a. cellebaseret terapi, og endnu et eksempel er demineraliserede knoglevævsplugs, som anvendes allogent til behandling af knoglecyster hos mennesker. Syntetiske præparater For at undgå nogle af de problemer, der kan opstå ved anvendelse af især allogent og xenogent biologisk materiale, fx afstødelse, overførsel af sygdomme, biologisk variation og begrænset holdbarhed, er der mange samarbejdsprojekter i gang, hvor ingeniører og biologer/ medicinere forsøger at udvikle syntetiske konstruktioner med de samme karakteristika som de biologiske produkter. Nanoteknologi indgår som en vigtig del af dette arbejde. Kombinationer af syntetisk og biologisk materiale bliver også anvendt, hvor levende celler dyrkes på syntetisk materiale, fx ved syntetiske osteokondrale plugs, hvor knogle- og bruskceller bliver dyrket direkte på en kunstig, porøs kalciumkonstruktion før implantation. Disse produkter er stadig under udvikling. Behandlinger med vækstfaktorer og andre farmaka Mange af forandringerne i led- og seneskader skyldes op- og nedregulering af forskellige stoffer, hvilket fører til øget nedbrydning og/eller nedsat syntese (figur 4). Der findes en række præparater, som har til formål at hæmme disse processer og stimulere vævet til øget reparation og regeneration. Præparater der hæmmer nedbrydning Nedbrydning af brusk- og senevæv er et resultat af mange processer, men cytokinerne spiller en vigtig rolle, især IL- 1β (interleukin-1β) og TNFα (tumor necrosis factor α). Cytokinerne udskilles som følge af inflammation, og derfor har præparater, der hæmmer inflammation, også en sekundær virkning på de nedbrydende processer. Dette udnyttes bl.a. ved behandling med steroider og non-steroide antiinflammatoriske præparater. Der findes også mere målrettede behandlinger rettet specifikt mod IL-1. Formålet er hæmme nedbrydningsprocesserne ved at blokkere IL-1 receptorerne med det såkaldte IL-1 receptor antagonist protein (IL-1ra) (figur 5). Patientens blod bliver behandlet, så der produceres en række antiinflammatoriske proteiner bl.a. IL-1ra, og resultatet er et såkaldt»autologous conditioned serum«(acs). Et studie fra 2007 har vist, at behandling med ACS resulterede i nedsat halthed hos behandlede heste (N=8) sammenlignet med kontrolheste (N=8), men der er endnu ikke publiceret større kliniske afprøvninger. Metoden er tilgængelig i veterinær praksis i form af præparatet IRAP (forkortelsen står for interleukin receptor antagonist protein). Inflammation og den medfølgende udskillelse af cytokiner resulterer i øget udskillelse af en række matrixnedbrydende stoffer som fx matrix metalloproteinaser (MMP) og aggracanaser (figur 4). Studier har vist, at det kun er nogle bestemte MMP er og aggracanaser, der er ansvarlige for nedbrydning af bruskog/eller senevæv, og derfor er forskere i gang med at udvikle terapier rettet specifikt mod disse stoffer. Hvis det lykkes, vil det medføre endnu mere præcise og målrettede behandlinger. En anden følge af inflammationen og den begyndende nedbrydning er, at synovialvæsken mister sin viskositet. Der har længe været tradition for at behandle dette med hyaluronsyre (HA) og polysulferede glycosaminoglycaner (PS-GAG). Begge stoffer binder vand og menes desuden at have antiinflammatoriske egenskaber. Præparater der støtter opbygning De fleste stoffer, der hæmmer nedbrydning af vævet, støtter også sekundært opbygning af nyt væv, da de fjerner ska- > Dansk Veterinærtidsskrift 2008 15. august Nummer 15/16 Årgang 91 13
Stamceller DEL 2 delige stoffer og giver vævet bedre mulighed for at gennemgå en naturlig helingsproces. Problemet er, at især brusk er meget dårligt til at hele, og derfor arbejdes der på at udvikle produkter, der kan støtte helingsprocessen direkte. Disse produkter er ofte baseret på forskellige vækstfaktorer, som menes at have en gunstig effekt på opbygning af brusk- eller senevæv. Et eksempel er»platelet rich plasma«(prp), der ligesom ACS er et autologt præparat baseret på patientens eget blod. Blodet behandles, så man får isoleret en fraktion af blodet med stort indhold af forskellige vækstfaktorer bl.a. TGF-β (transforming growth factor-β) og IGF-1 (insulin-like growth factor-1), der begge har vist positiv effekt på bruskudvikling i laboratorieforsøg. PRP bliver allerede anvendt både veterinært og humant til en række lidelser, og der er kliniske studier i gang, hvor man undersøger PRPs effekt i ledlidelser hos mennesker. Genterapi Et problem ved flere af de beskrevne præparater er, at de kræver gentagne behandlinger, hvilket bl.a. medfører øgede omkostninger og risiko for bivirkninger. Et andet problem er, at nogle af de vækstfaktorer, som vi ved, er vigtige for regeneration af brusk, ikke har den ønskede virkning, når de sprøjtes direkte ind i leddet, og i nogle eksperimentelle studier endda har medført en forværring af tilstanden. En mulig løsning er genterapi, hvor kroppens egne celler manipuleres til at producere det ønskede molekyle. Meget forenklet er teorien bag genterapi, at man identificerer et protein, der enten mangler eller findes i for lille mængde i det syge væv. Derefter placerer man den gensekvens, der er ansvarlig for produktion af proteinet, inde i patientens cellers DNA ved hjælp af en vektor. Dette kan enten ske direkte i patienten, eller cellerne kan tages ud af patienten, behandles med genet, og derefter placeres tilbage i patienten. Efterfølgende producerer cellerne (forhåbentlig) det ønskede protein. Der arbejdes i mange laboratorier med udvikling af genterapier til behandling af led- og seneskader. Forsøg i heste har vist lovende resultater med celler kodet til at producere TGF-β, og der er også studier i gang, hvor man bruger genterapi til at producere IL-1ra. Nutraceuticals Nutraceuticals dækker over fodertilskud mv., som ikke er registrerede som lægemidler, og som derfor heller ikke er underlagt de samme krav. Analytiske studier af kommercielle produkter til heste har vist meget store variationer i indholdet af de deklarerede indholdsstoffer, hvor nogle produkter indeholdt ingen eller meget små koncentrationer. De fleste nutraceuticals er rettet mod bevægeapparatet, og der er tale om alt fra hvidløg og biotin til avocadoekstrakt, glucosamin og chondroitin. Teorien er, at man tildeler kroppen byggestene til at opbygge nyt væv eller øge viskositeten af ledvæsken, men der er mange uafklarede spørgsmål - bl.a. om kroppens evne til at optage og udnytte stofferne. Kun enkelte præparater er testet i kontrollerede, kliniske studier, men mange af indholdsstofferne er testet i laboratorieforsøg med svingende resultater. Der er også her mange positive case-rapporter, men markedet er blandet og uigennemskueligt. Figur 5. Skematisk oversigt over funktionen af IL-1ra (interleukin-1 receptor antagonist). Der udtages en blodprøve fra patienten, som behandles så der produceres en række antiinflammatoriske proteiner bl.a. IL-1ra, og resultatet er et såkaldt»autologous conditioned serum«(acs). IL-1ra (rød) binder til de samme receptorer som IL-1 (blå), men uden at aktivere processer inde i cellen. Når ACS injiceres i leddet, konkurrerer IL-1ra derfor med IL-1 om IL-1 receptorerne på bl.a. chondrocytter og lymfocytter, hvorved en mængde af receptorerne bliver blokkerede. IL-1s effekt hæmmes, og udskillelsen af de matrixnedbrydende MMP er, aggrecanaser m.fl. mindskes. Konklusion Led- og seneskader er et meget aktivt forskningsområde, og der er i de senere år kommet en del nye præparater på markedet, men det er endnu ikke muligt at opnå fuld regeneration af vævet. Derudover er mange af de nye produkter både dyre, tidskrævende og svære at anvende. De bedste resultater er set i behandling af velafgrænsede seneskader - og selvom resultaterne er lovende, er det endnu ikke præcist afklaret, hvad der sker inde i vævet, og om det er en direkte følge af behandlingen, en sekundær effekt af den anvendte metode eller en placebo effekt. Det veterinære område er langt fremme i udvikling og afprøvning af nye behandlinger til disse lidelser, og der sker en løbende udveksling af erfaringer mellem det humane og veterinære felt både mellem forskere og klinikere. 14 Dansk Veterinærtidsskrift 2008 15. august Nummer 15/16 Årgang 91