Blåmuslinger som biomarkører

BSc Speciale Blåmuslinger som biomarkører En undersøgelse af blåmuslingens (Mytilus edulis) egenskaber som biomarkør i det marine, kystnære miljø Hugin K Mortensen NVDRit 2007:04

Heiti / Title Blåmuslinger som biomarkører En undersøgelse af blåmuslingens (Mytilus edulis) egenskaber som biomarkør i det marine, kystnære miljø Kræklingar sum biomarkørar Ein kanning av kræklingi (Mytilus edulis) sum biomarkørur í marina umhvørvinum nær undir landi. Høvundur / Author Hugin K. Mortensen Vegleiðarar / Supervisors Ábyrgdarvegleiðari / Responsible Supervisor Maria Dam, Heilsufrøðiliga Starvsstovan Eyðfinn Magnussen, Fróðskaparsetur Føroya Ritslag / Report Type BSc speciale, biologi BSc Thesis, Biology Latið inn / Submitted 26. juni 2007 NVDRit 2007:04 Náttúruvísindadeildin og høvundarnir 2004 ISSN 1601-9741 Útgevari / Publisher Bústaður / Address Postrúm / P.O. box @ Náttúruvísindadeildin, Fróðskaparsetur Føroya Nóatún 3, FO 100 Tórshavn, Føroyar (Faroe Islands) 2109, FO 165 Argir, Føroyar (Faroe Islands) +298 352550 +298 352551 nvd@setur.fo

1. Abstract: Der er ingen tvivl om, at forurening i det marine, kystnære miljø er et voksende problem. Derfor er det af stor betydning at besidde redskaber til monitorering af dette miljø. Undersøgelser med muslinger (Mytillus edulis) i Thorshavns havn viser, at disse er yderst velegnede som biomarkører for TBT og PAH. Muslinger blev sat ud i perioden 30/6 2006 til 4/9 2006 ved forskellige lokaliteter i Thorshavns havn. Der blev foretaget analyser af disse muslinger for PAH, PAH-metabolitter og TBT. Ud over disse analyser blev der også lavet forsøg med muslingenes overlevelsesevne, samt at der blev foretaget en lysosomal stabilitets analyse og en in situ optælling af døde muslinger efter eksponeringsperioden i det forurenede miljø. Nærværende undersøgelser viser, at analyser for PAH-metabolitter ikke er relevante, da man arbejder med muslinger, da muslingerne ikke metaboliserer PAH. Derimod viste forsøgerne med stor overensstemmelse, at jo højere TBT og PAH koncentrationerne er, jo højere er tallet på døde muslinger in situ, og jo mindre er overlevelsesevnen. På trods af, at forsøget med lysosomal stabilitet ikke gav noget resultat ses der ingen grund til at betragte metoden for uegnet i denne sammenhæng. Nøgleord: Mytilus edulis, biomarkører, køleskabsforsøg, TBT, PAH, PAH-metabolitter, forurening, monitering.

2. Samandráttur Eingin ivi er um, at umhvørvisdálking í havumhvørvinum tætt undir landi er ein vaksandi trupulleiki. Tí er tað av størsta týdningi at hava kunnleika til ymsar mátar at fylgja hesi gongd. Kanningar í Tórshavnar havn vísa, at kræklingur (Mytilus edulis) er sera vælegnaður sum biomarkørur fyri TBT og PAH. Í tíðarskeiðinum 30/6 2006 til 4/9 2006 vóru kræklingar settir út á ymisum støðum í Tórshavnar havn. Hesir kræklingar vóru seinni kannaðir fyri PAH, PAHmetabolittar og TBT. Afturat hesum vóru yvirlivilsisevni hjá kræklingi kannað og talt var, hvussu nógvir kræklingar vóru deyðir, eftir at teir høvdu ligið í dálkaða umhvørvinum. Ein roynd við lysosomalum stabiliteti var eisini gjørd. Úrslit frá hesum arbeiði vísa, at óneyðugt er at kanna fyri PAH-metabolittar, tá talan er um krækling, tí kræklingar metabolisera ikki PAH. Harafturímóti vísti tað seg, at jú hægri TBT og PAH nøgdirnar eru, jú hægri er talið á deyðum kræklingum in situ, og jú verri eru yvirlivilsisevnini. Sjálvt um royndin við lysosomal stabiliteti ikki gav nakað úrslit, er eingin grund til at halda hesa mannagongd vera óegnaða, tá talan er um umhvørviseftiransing. Lyklaorð: Mytilus edulis, biomarkører, køleskabsforsøg, TBT, PAH, PAH-metabolitter, forurening, monitering.

3. Indledning Formålet med undersøgelsen er at belyse blåmuslingens (Mytillus edulis) egenskaber som biomarkør for PAH (polycycliske aromatiske hydrocarboner), PAH-metabolitter og tin-forbindelser i det marine kystnære miljø, nærmere angivet udvalgte steder på Havnarvág. Denne lokalitet ved Thorshavns havn er særligt velegnet, da der er forurenende virksomheder i området, samtidig med, at der er god vandudskiftning, hvilket gør, at der er stor forskel på forureningsgrad forskellige steder på området. Området er gennem en årrække blevet grundigt undersøgt af Heilsufrøðiliga Starvsstovan og nærværende undersøgelse kan ses om en aflægger af disse undersøgelser med særlig henblik på at vurdere blåmuslinger som indikatororganisme for udvalgte miljøgifte 1. Færøernes hovederhverv er fiskeri og fiskeopdræt i kystnære områder. Det er derfor af vital betydning at holde havet og fjordene så rene som muligt. Det er også af afgørende betydning at have god dokumentation for vandkvaliteten i alle de områder, som bliver brugt til produktion af fisk til menneskeføde. Vandkvalitet bliver traditionelt vurderet ud fra en række fysiske og kemiske kriterier. Miljøgifte er ofte meget skadelige selv i yderst små koncentrationer. Kemiske metoder til at monitere og måle disse miljøgifte viser sig at være yderst besværlige og omkostningskrævende. Et godt alternativ med en helt anden indgangsvinkel er at bruge biologiske indikatorer på forurening. Eksempel på en velegnet indikatororganisme er blåmusling, som en stor del af sit liv vokser på samme sted og gennem sin vækst akkumulerer forskellige miljøgifte, som er i området. I undersøgelsen er blåmuslinger dyrket i et bestemt tidsrum forskellige steder på Havnarvág med henblik på at teste forskellige metoders egnethed som mål for forureningsgrad. Disse metoder er: Overlevelsesgrad på vækstlokaliteten og overlevelsestid gennem en depurationsperiode i køleskab. Lysosomal stabilitet. Måling af PAH-metabolitter. Måling af PAH og måling af tinforbindelser. 1 Dam, M.; Danielsen, J: Havnarvág 2002 ein kanning av dálkingarstøðuni á Havnarvág og Yviri við Strond á sumri 2002. 5

4. Teoretisk baggrund for de anvendte metoder En grund til, at blåmuslinger er velegnet som indikatororganismer for forurening er som sagt, at de er sessile den største del af livet og at de har en god evne til at opkoncentrere persistente organiske stoffer som for eksempel PAH og TBT. Når man efter en residensperiode skal analysere blåmuslingerne for forurening har man en række metoder til rådighed, som spænder fra specifikke kemiske analyser over relativt specifikke biokemiske metoder til mere eller mindre uspecifikke biologiske metoder. Det hænger som regel sådan sammen, at jo mere specifikke metoderne er, jo besværligere og dyrere er de at udføre, og jo mindre specifikke de er, jo nemmere og billigere er de at udføre. Det er derfor en god mening i at undersøge, hvordan disse metoder stemmer overens i forskellige forureningsituationer. Hvis der er klar sammenhæng, er det jo godt nok at bruge de nemme metoder i moniteringsøjemed. Som nævnt ovenfor er der i denne undersøgelse sat fokus på tre nemme og uspecifikke metoder, nemlig overlevelse på lokaliteten og i køleskab og lysosomal stabilitet og tre mere specifikke metoder, nemlig gaskromatografisk måling af Sn-forbindelser og PAH og en flourescensmåling af PAH-metabolitter. 4.1 Overlevelsesgrad på vækstlokaliteten og overlevelsestid gennem en depurationsperiode i køleskab Ved at tælle op på hver lokalitet, hvor stor en del af blåmuslingerne er døde, kan det tænkes, at man får et groft mål for lokalitetens forureningsgrad. Overlevelsestid for de forurenede blåmuslinger i køleskab kan ligeledes tænkes at være et empirisk mål for hvor meget giftstof muslingerne indeholder. Metoden er velkendt i kontrollerede omgivelser, hvor man f. eks kan teste et givet stofs giftighed ved at måle en LD50 værdi for en given organisme. 4.2 Lysosomal stabilitet Cytotoksiske effekter i muslinger kan anvendes som følsomme markører for stress, forårsaget af miljøfarlige stoffer. Denne kendsgerning anvendes i metoden lysosomal stabilitet. 6

Lysosomer er subcellulære organeller, der indeholder mange enzymer, som er involveret i et bredt spektrum af væsentlige cellulært styrede funktioner, så som proteinkatabolisme, imunrespons, programmeret celledød og regenerering af beskadiget væv. Lysosomerne er omgivet af en speciel membran. Denne membran beskytter cellens eget organiske materiale mod påvirkning fra lysosomernes enzymer. Membranens stabilitet er derfor af største betydning for muslingens sundhedstilstand. Miljøgifte kan påvirke membranens stabilitet, eller holdbarhed, på forskellige måder. Tungmetaller kan for eksempel forstyrre membranen ved direkte interaktion, hvorimod nedbrydelige organiske miljøgifte inde i lysosomerne påvirker membranens stabilitet gennem ændring af lipidsammensætning eller dannelse af frie radikaler. 2 Eksempler på organiske miljøgifte er PAH. PAH er upolære stoffer, hvilket gør dem i stand til at opløses i lysosomernes membraner. Dette gør, at membranerne bliver mindre stabile og mindre funktionsdyktige. Organiske tinforbindelser kan tænkes at have en lignende effekt. Tin i TBT har kovalente bindinger til tre butylkæder. Ud over disse, har tin også en positiv ladning. Denne positive ion kan danne komplekser med negative ioner (Cl -, OH - osv.). Disse komplekser kan gøre, at TBT i høj grad bliver lipofilt (n-oktanol:vand-fordelingsforhold er ca. 5.600:1 3 ). Derfor kan det tænkes, at TBT i praksis har nogle af de samme virkninger som PAH. Selv om metoden lysosomal stabilitet er ret fintfølende er de observerede effekter dog ikke særlig stofspecifikke, og må derfor betragtes som et udtryk for en samlet forurening. 4 4.3 PAH Betegnelsen PAH dækker over alle forbindelser med op til 7 kondenserede cykliske ringe. Ringene kan være benzenringe med 6 kulstofatomer eller ringe med 4 eller 5 kulstofatomer. Der kan være substituenter på en eller flere ringe. Teoretisk set er der derfor tusindvis af forbindelser, der hører under betegnelsen PAH. I praksis undersøger man dog kun et lille udvalg af PAH forbindelser. 2 Strand, J.: NOVANA, Teknisk anvisning for marin overvågning, s 4.5-3 3 Bjerregaard, P.: Økotoksikologi, s 223 4 Strand, J.: NOVANA, Teknisk anvisning for marin overvågning, s 4.5-3 4.5-4 7

PAH-forbindelser forventes især at være til stede i forurening fra punktkilder som asfalt- og tjærevirksomhed, gasværker, skibsværfter og træimprægnerings-virksomhed 5. Desuden dannes der PAH ved al ufuldstændig forbrænding af organiske stoffer. PAH er som regel mere eller mindre giftige for levende organismer. Flere PAH-forbindelser og deres biologiske nedbrydningsprodukter vides at være kræftfremkaldende 6. 4.3.1 Måling af PAH-metabolitter De fleste organismer besidder afgiftningssystemer beregnet til at nedbryde naturligt forekommende giftstoffer. I økotoksikologisk sammenhæng er cytochrom-p450-systemet, som går mere end 2 milliarder år tilbage i udviklingshistorien og derfor kan forventes at være til stede i de fleste nulevende organismer, særlig interessant. Cytochrom-P450-systemet er et membranbundet enzymsystem, som er i stand til blandt andet at oxidere lipofile organiske forbindelser til hydrofile forbindelser, der så kan udskilles fra organismen. 7 En veldokumenteret reaktion af denne type er omdannelsen af benzo[a]pyren til et dihydroxid: Figur 1: Benzo[a]pyren findes bl.a. i olieprodukter, og da det desuden kan dannes ved ufuldstændig forbrænding af organisk stof, findes det også i sod. Benzo[a]pyren kan omsættes på flere forskellige måder, og en af omsættningsvejene er vist her. Først oxiderer et cytochrom-p- 450-enzym molekylet til epoxid. En hydrolase adderer vand til epoxidet under dannelse af en dihydrol, hvorefter cytochrom- P-450-enzymet oxiderer igen til et epoxid. Benzo[a]pyren- 7,8-dihydrodiol-9,10-oxid kan danne covalente bindinger til DNA, og det er stærkt cancerogent. 8 5 http://www2.mst.dk/common/udgivramme/frame.asp?pg=http://www2.mst.dk/udgiv/publikationer/2001/87-7944- 734-1/html/kap03.htm, afsnit 3.1 6 Bjerregaard, P.: Økotoksikologi, s 14 7 Bjerregaard, P.: Økotoksikologi, s 19-21 8 Bjerregaard, P.: Økotoksikologi, s 20 8

Ved lignende reaktioner omdannes PAH til oxidationsforbindelser, der går under betegnelsen PAHmetabolitter. Det vides, at PAH-metabolitter dannes i fisks galdeblære, og man har udviklet en relativt simpel metode at måle mængden af disse metabolitter. 9 Det må forventes, at blåmuslinger også besidder denne evne at danne PAH- metabolitter. Da blåmuslinger som nævnt er velegnede indikatororganismer, vil det være af stor interesse at undersøge om denne metode også kan anvendes til blåmuslinger. I en rapport fra Danmarks Miljø Undersøgelser fra marts 2007, et halvt år efter afslutningen af forsøgene i denne undersøgelse, konkluderes der dog, at Muslinger har ikke et effektivt enzymsystem til nedbrydning af miljøfremmede stoffer, og akkumulerer derfor mange miljøfremmede stoffer; de er derfor velegnede som indikator organismer i moniteringsundersøgelser af miljøbelastningen med forskellige miljøfremmede stoffer 10 Metoden anvendt på blåmuslinger er i grove træk denne: Fra blåmuslingen udtrækkes en hæmolymfeprøve. Denne opløses i metanol/vand-blanding og måles med et fluorescensmeter. Der tilsættes en intern standard af en given PAH-metabolit og måles igen. Herudfra beregnes mængden af PAH-metabolitten i blåmuslingen. 4.3.2 Måling af PAH Da der som nævnt ovenfor er indicier for, at blåmusling ikke er i stand til at danne PAHmetabolitter i samme omfang som f. eks. fisk, er en direkte metode til måling af PAH nødvendig. Metoden, som bliver brugt er en ekstraktion af fedtopløselige stoffer fra prøven efterfulgt af en kombination af gaskromatografi og massespektrometri. Metoden er velkendt og kan påvise de enkelte PAH, som man har i ren form og kan tilsætte prøverne som intern standard. Da der findes så mange forskellige PAH, har man valgt at bruge et udvalg af 16 af de mest forekommende (sum PAH16) som udtryk for det samlede indhold. 4.4 Tin forbindelser Tinforbindelserne omfatter stofferne tributyltin (TBT) og dets nedbrydelsesprodukter dibutyltin (DBT) og monobutyltin (MBT) samt triphenyltin (TPhT). Disse tinforbindelser er udelukkende 9 Personlig korrespondance med DMU, oprindeligt efter ICES (2005) og Richardson et al. (2004) 10 Faglig rapport fra DMU nr. 613, 2007 PAH i muslinger fra indre danske farvande 9

antropogene 11. TBT har været anvendt som antibegroningsmiddel i skibsmalinger siden 1950erne. I 1991 blev TBT forbudt i bundmaling på skibe under 25 m i bl.a. EU. I oktober 2001 blev et internationalt forbud mod anvendelse af TBT for alle skibe vedtaget den såkaldte Antifoulingkonvention (IMO 2002). Når konventionen træder i kraft, vil det fra 2003 være forbudt at påsmøre TBT-holdige bundmalinger, og fra 2008 må der ikke mere være TBT som aktivt stof på skibe. 12 På Færøerne er der p.t. intet forbud mod brug af TBT i skibsmaling, og derfor kan man forvente fortsat at finde TBT i havne og fjorde. TBT er blandt de få hormonforstyrrende stoffer, som der kendes en hel del til, hvad biokemiske virkninger og effekter på populationer ude i naturen angår. Som nævnt ovenover (side 7) er TBT i organismen i høj grad lipofilt og kan derfor associere til membransystemer. TBT har en generel virkningsmåde på alle organismer, idet forbindelsen dels transporterer ioner gennem membraner og dels binder sig til visse typer af proteiner, hvorved proteinernes funktion bliver forstyrret 13. TBT er ekstremt giftigt for mange organismer, f.eks. for mollusker. Det fremgår af EC50 for bivalvia i larvefasen, at TBT er 1000 gange så giftigt som nogen anden miljøgift. 14 Organotin forbindelsen der anvendes i skibsmaling er tributyltin (TBT), som ved nedbrydning i vand/sediment fasen omdannes først til dibutyltin (DBT), derefter til monobutyltin (MBT) og til sidst til uorganisk tin, som er stort set uskadeligt. Effekten af nedbrydningsprodukterne er også væsentligt mindre end af TBT, aftagende med fjernelsen af butyl-grupperne. 4.4.1 Måling af tinforbindelser. Normalt anvendes en derivatiseringsteknik, hvorved man gør organotin forbindelser mere vandskyende ved ethylering eller en Grignard-reaktion, og ekstraherer til et organisk medie, som så typisk analyseres ved kombineret gaskromatografi / massespektrometri overfor interne standarder. Ved denne metode bestemmes foruden TBT også DBT, MBT og TPhT. 15 11 Dahl, K. et al: Redskaber til vurdering af miljø- og naturkvalitet i de danske farvande, s. 10 12 Arbejdsrapport fra Miljøstyrelsen, 31/2005 13 Screening for effekter af miljøfarlige stoffer på algesamfund omkring havneanlæg Faglig rapport fra DMU, nr. 463 14 http://en.wikipedia.org/wiki/tributyltin 15 http://en.wikipedia.org/wiki/tributyltin 10

4.5 Variansanalyse Til de statistiske udregninger blev den såkaldte ANOVA-test anvendt. Denne test bruges til at undersøge, om der er forskel på middelværdier af parametre fra flere populationer. 16 Hovedresultatet fra en ANOVA-test er en P-værdi. På 5 % signifikansniveau betyder en P-værdi <0,05, at H 0 (middelværdier af rn parameter fra alle populationerne er ens) må forkastes. Dette betyder, at mindst to af middelværdierne er forskellige. Er P-værdien>0,05, må man derimod konkludere, at der ikke er signifikant forskel mellem nogen af parameterens middelværdier. 5. Forsøg og forsøgsdata 5.1 Udvælgelse af stationer Formålet var, som nævnt, at undersøge muslingers egenskaber som biomarkører for PAH, PAHmetabolitter og Sn-forbindelser i det kystnære miljø på udvalgte stationer ved Havnarvág. Disse stationer blev udvalgt efter den forventede forurening, se også fig. 2. Hvis der er en forskel i forureningen på de 4 stationer, forventes den være sådan, at station 1 var den mest forurenede, derefter stationerne 2, 3 og 4, i nævnte rækkefølge. Denne antagelse begrundes med, at station 1 ligger inderst i havnen, lige uden for skibsværftet. Ikke alene kan skibsværftet forventes at forurene en del, men vandudskiftningen er også ret lille. Station 2 er placeret ved en af broerne til marinaen. Der forventes ikke at være så megen forurening ved denne station, som ved station 1. Dette bl.a. fordi vandudskiftningen er meget bedre. Station 3 er placeret et stykke fra de to første, uden for Tinganes. Vandudskiftningen ved Tinganes er bedre end ved de andre stationer, så derfor forventes ikke særlig megen forurening der. Station 4 ligger ude på fjorden. På fjorden er strømmen stærk på grund af tidevandet, så derfor er vanduskiftningen rigtig god. Denne station var tænkt som reference. Desuden er der brugt muslinger fra to andre lokaliteter. Ved Saksun blev der taget muslinger, da det der pludselig blev nødvendigt med en alternativ reference. Af samme årsag blev muslinger fra Funningsfjord også brugt. 16 Townend, J: Practical Statistics for Environmental and Biological Scientists, kapittel 8 på side 107 11

Figur 2: Stationerne 1 til 4 ved Havnarvág og ude på åbent vand. Stationerne er disse: Station 1: Ved skibsværftet, pos. N 62 00.427 W 006 46.483. Station 2: Ved marinaen, pos. N 62 00.509 W 006 46.312. Station 3: Ved den røde bøje uden for Tinganes. Station 4: Ude på åbent vand, pos. N 61 59.989 W 006 46.384. Station 5: Saksun på nord Streymoy Station 6: Funningsfjord Muslinger fra Funningsfjord blev hentet den 29/6 2006. De blev så sat ud igen på 4 forskellige lokaliteter om aftenen den 30/6 2006. Til forsøget anvendtes 4 hummerruser, en på hver af stationerne 1 til 4. Ruserne blev delt op i tre afsnit. Dette blev gjort på den måde, at reb blev viklet ind i rusens mæsker, så et net blev formet. Oven på rebet blev et fluenet brugt som gulv. Denne rumlige indretning sikrer, at muslingerne har plads nok til at lægge sig optimalt i forhold til føden, der føres med vandstrømmen. De fire ruser blev lagt ud på de fire stationerne 1 til 4. Muslingerne fra stationerne 5 og 6 blev taget fra bestande, der i forvejen fandtes på lokaliteterne. På de første tre stationer var der mulighed for at hæfte ruserne i faste holdepunkter. Disse ruser blev alle hængt ca. 3 meter under vandoverfladen. Under rusen blev der bundet et jernlod. Dette skulle hjælpe som kontravægt, så at reb og ruser ikke blev suget op af 12

forbipasserende både. Dette gav også den fordel, at ruserne hang mere i fred, så muslingerne ikke blev så stressede af andre fysiske faktorer, som de ellers ville have været. Den fjerde ruse blev klargjort på en lidt anden måde. En tom plastikdunk blev brugt som bøje. Ned fra den hang rusen. Mellem rusen og bøjen blev der bundet en 1,5 liters flaske indeholdende luft, som skulle virke som flydeanker. Tanken med dette var, at rusen skulle hænge så stille som muligt. Og hvis den hang i bøjen, ville den være påvirket både af vind og strøm. Flasken, derimod, blev trukket under vandoverfladen af rusens og bundloddets vægt. Rusen hang således ca. 6 m fra bunden, udstrakt mellem bundloddet og flasken, der kun blev påvirket af strøm. Figur 3: En ruse med tre afsnit og nærbillede af muslinger, der er lagt i et afsnit. Tabellen nedenfor viser, hvor mange muslinger der blev lagt i de 4 ruser og hvordan de blev fordelt i afsnittene. Ruse nr 1 Ruse nr 2 Ruse nr 3 Ruse nr 4 Nederste afsnit 30 30 30 30 Mellem afsnit 42 38 41 35 Øverste afsnit 30 30 30 30 I alt 102 98 101 95 Tabel 1: Fordelingen af muslinger i de fire ruser. Station 4 ude på åbent vand var tænkt som en reference, idet den var på et område med så gode strømforhold, at den i praksis kunne regnes som repræsenterende rent havvand. Der blev den 11/8 2006 taget nogle muslinger fra hver station til lysosomal stabilitet forsøg. Desværre skete der det uheld i perioden efter denne dato og før muslingerne endelig skulle tages op først i september, at rusen fra station 4, med alt indhold gik tabt. 13

Da der nu ikke var nogen egentlig referencestation, blev det nødvendigt med muslinger fra steder, som kunne tænkes at være så afsides fra antropogen forurening, at de kunne fungere som referencestation. Saksun på nord Streymoy blev derfor valgt som ny referencestation (station 5). Denne reference er dog næppe helt repræsentativ, da der var blevet lavet noget vejarbejde i nærheden kort forinden. Til TBT- og PAH- analyser er der derfor taget nogle muslinger fra Funningsfjord (station 6), som også kan bruges som bud på en referencestation, da området er forholdsvis rent. Disse blev taget, fordi det jo også er relevant at vide, hvordan muslingerne så ud inden de blev sat ud. Muslingerne fra de tre resterende stationer blev endeligt taget op i perioden fra 30/8 2006 til 4/9 2006. 5.2 Indsamling og bearbejdning af data 5.2.1 In situ optælling af døde muslinger Da ruserne blev samlet ind igen blev der talt op, hvor mange, der var døde i perioden på godt ni uger, som forsøget havde varet. Som død regnedes en musling, hvis indmad var væk og derfor kun bestod af en tom skal. Resultatet af denne optælling er vist i tabel 2. Station Tal af muslinger sat ud på stationen Tal af døde muslinger i dyrkningsperioden Tal af døde muslinger i dyrkningsperioden i procent Tal af overlevende muslinger i dyrkningsperioden i procent 1 102 25 25 75 2 98 9 9 91 3 101 11 11 89 Tabel 2: Tal af udsatte muslinger og tal af døde muslinger ved optagelse på 3 af stationerne 5.2.2 Køleskabsforsøg Dette forsøg blev udført således, at 10-12 muslinger blev lagt i en bakke i et køleskab. I bakken blev der også lagt vådt køkkenpapir, så at fugtigheden ikke skulle være for lav. Inde i køleskabet lå muslingerne i mørke og ved en temperatur på cirka 5 grader. En gang om dagen blev muslingernes tilstand checket. Det antal døgn, de levede, blev noteret. 14

Stationer Antal muslinger fra stationen Antal overlevelsesdøgn pr musling Gennemsnitlig levetid i døgn 1 12 6, 6, 6, 8, 10, 10, 10, 10, 10 11 12 13 9,3 2 10 14, 12, 12, 15, 12, 15, 12, 18, 21, 13 14,4 3 10 13, 21, 20, 18, 23, 23, 24, 28, 27, 27 20,3 5 10 10, 10, 23, 23, 23, 23, 24, 24, 24, 26 21,0 Tabel 3: Levetid i døgn for muslinger fra 4 stationer. For at teste, om den gennemsnitlige levetid i døgn er ens på de forskellige stationer, benyttes en ANOVA- test (se afsnit 4.5). Testen blev udført med statistikprogrammet Systat 11 17. Fig. 4 viser middelværdier med indtegnede variansintervaller. Testen giver p=0,0, som viser, at der er klar forskel på middelværdierne. Fig. 2 viser også, at værdierne fra stationerne 3 og 5 ligger meget tæt på hinanden. ANOVA-testen, udført kun på disse to dataset, giver p=0,6, som betyder, at der med foreliggende data ikke er grundlag for at antage, at levetiden er forskellig på de to stationer. På den anden side er der signifikant indbyrdes forskel på middelværdierne fra stationerne 1, 2 og 3. Least Squares Means 26 19 DOEGN 12 5 1 2 3 5 STATION Figur 4: ANOVA-test på gennemsnitlig levetid i døgn fra tabel 3. 17 For more information about SYSTAT software products, please visit our WWW site at http://www.systat.com 15

5.2.3 Lysosomal stabilitet Metode til dette forsøg var denne: Hæmolymfen trækkes ud af muslingens bagerste lukkemuskel, tilsættes neutral red farvestoffet og bringes på et mikroskopglas. Neutral red er et farvestof, som tilbageholdes i lysosomerne så længe, som membranen er hel. Efter en tid går membranen i stykker og cellen dør, også i friske muslinger. Denne proces følges i mikroskop, og tiden, når 50 % af cellerne er døde, anvendes som mål for, hvor påvirket muslingen er. Cellerne efterses efter 15 minutter, 30 minutter og derefter hver halve time. I sunde muslinger er den tid 150-180 minutter. Derfor bør undersøgelser af belastede områder bør sammenholdes med velegnede referenceområder. Der laves duplikater af hver musling 18. Figur 5 Den bagerste lukkemuskel, posterior adductor muscle (PAM) hos musling Figur 6: Strukturformel for neutral red a b c Figur 7: a: Friske celler, b: Døde celler, c: 50% døde celler. Mikroskopbilleder af hæmolymfeceller fra musling. Friske celler er svagt rødfarvede sammenlignet med døde celler, som også bliver rundere, når lysosomerne er gået i stykker. Resultaterne fra dette forsøg er givet i tabel 4 nedenfor. 18 Strand, J., Dallöf, I.: NOVANA, Teknisk anvisning for marin overvågning 16

Station Halveringstid i minutter for musling nr. Halveringstid i minutter i middel 1 2 3 4 5 1 120 120 90 150 150 115 2 90 150 180 180 90 138 3 120 150 120 210 210 140 4 180 120 120 180 180 156 Tabel 4: Tiden i minutter til halvdelen af cellerne fra hæmolymfen er døde. For at teste, om halveringstiderne er ens, bruges ANOVA testen igen. Resultatet p=0,571, viser at der ikke er grundlag for at antage andet, end at halveringstiderne i gennemsnit er lige. L e a s t S q u a r e s M e a n s 1 9 2 1 6 4 MIN 1 3 6 1 0 8 8 0 1 2 3 6 S T A T I O N Figur 8: Halveringstiden for hæmolymfeceller fra muslinger. Stationer er ud efter x-aksen, mens antal minutter er op efter y-aksen. 5.2.4 PAH-metabolitter PAH-metabolitter blev analyseret på DMU s laboratorium i Roskilde. Hæmolymfeprøver opløses i en metanol/vand-blanding og måles med et fluorescensmeter. Der tilsættes en intern standard af en given PAH-metabolit og måles igen. Herudfra beregnes mængden af PAH-metabolitten i blåmuslingen. 19 Nedenfor viser fig. 9 resultatet fra et forsøg på at påvise metabolitten 1-OH-pyren: 19 Forskrift: Analyse af PAH-metabolitter, oprindeligt efter ICES (2005) og Richardson et al (2004). 17

Figur 9: Data fra forsøget på at finde 1-OH-pyren i en af prøverne. I fald, at denne metabolit var til stede, ville der vise sig en top, hvor pilen viser. Det samme resultat viste sig ved samtlige prøver. Koncentrationen var under detektionsgrænsen. 5.2.5 PAH Disse analyser blev lavet på det norske institut for vandforskning, NIVA s laboratorium. Generelt kan siges, at de udtagne delprøver af homogeniseret muslingevæv først er tilsat interne standarder (isotopmærkede), hvorefter prøven er ekstraheret ved Soxhlet ekstraktion. Ekstraktet er efterfølgende oprenset; dels for at fjerne fedt, som kan forstyrre analysen og dels for at isolere aromat fraktionen, hvor PAHerne er indeholdt. Herefter er ekstraktet blevet analyseret ved GC/MS i SIM (single ion monitering) mode, som specifikt kan detektere de ønskede PAHer. Den efterfølgende kvantificering er foretaget ud fra de tilsatte interne standarder. Station Sum PAH Sum PAH16 Sum KPAH µg/kg tørstof 2 419 330 83,3 3 275,3 212,15 52,55 1 1736,35 1528,4 361,2 6 44,95 42,25 0 Tabel 5: Indhold af PAH, PAH16 og KPAH i gennemsnit af to prøver fra hver station. SUM PAH16 omfatter følgende forbindelser: naftalen, acenaftylen, acenaften, fluoren, fenantren, antracen, fluoranten, pyren, benz(a)antracen, chrysen, benzo(b+j)fluoranten, benzo(k)fluoranten, benzo(a)pyren, indeno(1,2,3-cd)pyren, dibenz(a,c+a,h)antracen, benzo(ghi)perylen. SUM KPAH er summen av benz(a)antracen, benzo(b+j+k)fluoranten, benzo(a)pyren, indeno(1,2,3- cd)pyren og dibenz(a,c+a,h)antracen. Disse har potentielt kræftfremkaldende egenskaber overfor 18

mennesker etter IARC (1987), dvs. tilhørende IARC's kategorier 2A + 2B (sandsynlige og kendte carcinogene). SUM PAH er summen af alle PAH-forbindelser som indgår i denne rapport. 5.2.6 TBT-analyser Muslingerne depureredes natten over, inden de blev dissekeret. Der blev målt vådvægt og tørvægt af kødet samt vægt og længde af skallerne. Muslingekødet blev udtaget af alle muslinger, findelt, blandet og ca. 2 g våd kødvægt udtaget til videre analyse. TBT, DBT, MBT og TPhT blev ekstraheret fra prøvematerialet ved at tilsætte syre under ultralydsbehandling. Intern kvantificeringsstandard (tripropyltin, TPT) blev tilsat prøverne samtidigt med syren. Efter ultralydsbehandling blev ph justeret (ca. 5), TBT blev etyleret med tetraboretyl og overført i en pentanfase. Detektionen og kvantificering skete ved analyse på GC med pulserende flammefotometrisk detektion. 20 Ng Sn/g tørvægt Stationer TBT DBT MBT TPhT DPhT MPhT 1 2291,5 762,4 244,5 39,9-1,8-2,2 2 350,3 62,4 37,2 7-0,4-1 3 152,5 41,4 20,9 0,3-0,6-1,5 5-0,4-0,4-0,4-0,5-0,4-0,4 6 4,1 3,4 3,7 7-2,2-1,6 Tabel 6: Sn indhold i muslinger fra 5 stationer. 20 Dahl, K; Dahllöf, I: Screening for effekter af miljøfarlige stoffer på algesamfund omkring havneanlæg, Faglig rapport fra DMU, nr. 463 2003: s. 16-17 19

6. Præsentation af resultater Med udgangspunkt i tabeller fra forrige afsnit om forsøg og forsøgsdata vil data her blive præsenteret som grafer og medfølgende uddybning og kommentering af resultaterne. Data fra tabel 2 på side 14, som viser tal af døde muslinger i eksponeringstiden er sat op i figur 10. Figur 10: % af muslingerne, der døde under eksponeringen Figuren viser helt klart, at dødeligheden er størst på station 1, mens der ikke er stor forskel i dødelighed på station 2 og 3. Station 4, som var den planlagte referencestation er ikke med, fordi den som nævnt ovenfor gik tabt under eksponeringsforløbet. Resultatet er delvis som forventet, idet station 1 må formodes at være mest forurenet. At man ikke kan se tydelig forskel på station 2 og 3 behøver ikke at betyde, at forureningsgraden på de to stationer er ens. Det vil kræve et større talgrundlag for at påvise en eventuel forskel. 20