Bodil Stilling Inger Dahl Krabbe Margit Mølgård Hvilsom Molekylærbiologi og biokemi Teori og metode
Molekylærbiologi og biokemi Teori og metode 3. udgave, 1. oplag 2014 Nyt Teknisk Forlag 2014 Forlagsredaktør: Heidi Kølle Andersen, hka@ef.dk Omslag, grafisk tilrettelæggelse og dtp: Dorthe Møller Tegninger: Dorthe Møller Fotos: Forfatterne, Novozymes, lektor, ph.d. Ditlev E. Brodersen samt Colourbox Tryk: PNB Print ISBN: 978-87-571-2812-3 ISBN: 978-87-571-3336-3 (e-bog) Varenummer: 44049-1 Bogens hjemmeside: nyttf.dk/biokemi Bogen er sat med Minion Pro Bogen er trykt på 115 g Arctic silk Alle rettigheder ifølge gældende lov om ophavsret forbeholdes. Kopiering fra denne bog må kun finde sted på institutioner, der har en aftale om kopiering med Copydan Tekst & Node, og kun inden for aftalens rammer. Hovedreglen er: højst 20 sider af en bog til samme hold/klasse pr. studerende pr. undervisningsår. Og kopier må ikke genbruges. Kopier skal tilføjes kildeangivelse: Forfatter, titel og forlag. Se mere på www.copydan.dk Nyt Teknisk Forlag Ny Vestergade 17 1471 København K info@nyttf.dk www.nyttf.dk Ekspedition: Erhvervsskolernes Forlag, +45 63 15 17 00
Forord Den foreliggende bog, Molekylærbiologi og Biokemi Teori og metode, er primært udarbejdet med henblik på undervisning af laborantstuderende og efteruddannelse af laboranter. Det er imidlertid vores håb, at bogen også kan finde anvendelse på andre uddannelser, hvor molekylærbiologi og biokemi indgår i pensum. Bogen er en gennemgribende revision af Bodil Stillings Biokemi og Bioteknologi fra 2008. De fleste kapitler i den nye bog er i princippet bygget op som i den tidligere, idet hvert kapitel består af et teoriafsnit efterfulgt af et afsnit om metoder. Alle kapitler slutter nu med en række repetitionsopgaver, som vil gøre bogen mere velegnet til selvstudium. Løsningsforslagene kan man finde på bogens hjemmeside: nyttf.dk/biokemi Bogen er nylayoutet med over 450 illustrationer. Bogens egenart findes i metodeafsnittene. Laboranternes arbejde er jo praktisk arbejde i laboratoriet. Derfor har vi valgt at kalde afsnittene som handler om laboratorieteknikker og metoder for Praktisk arbejde. Her gennemgås principperne for langt de fleste gængse analysemetoder i det biokemiske og molekylærbiologiske laboratorium. Kapitlerne 8-10 beskriver nucleinsyrerne. Her har vi valgt at anbringe metoderne i et særskilt kapitel, da mange genteknologiske metoder kræver kenskab til hele paletten af teori. Kapitel 11, "Genteknologiske metoder", er således gennemgribende fornyet i forhold til den gamle bog. Der er ikke beskrevet metoder i de sidste tre kapitler, der beskriver metabolisme, nitrogenstofskiftet og fotosyntesen. Analysemetoder for disse emner er mindre vigtige i laborantuddannelsen, men vi planlægger, at der senere kommer supplerende materiale på hjemmesiden.
Vi har anvendt IUPAC-nomenklatur som fortolket af Kemisk Ordbog (Nyt Teknisk Forlag, 2008). Vi tre forfattere har forskellige talenter, viden og kompetencer, som vi har udnyttet: Inger Dahl Krabbe har haft ansvaret for de genteknologiske kapitler 8-11, og kapitlerne er skrevet med inspiration fra de øvrige forfattere. Inger har desuden sammen med Bodil Stilling fornyet og opdateret de fleste metodeafsnit. Margit har fungeret som uundværlig inspirator, idemager til formler, skemaer og indhold. Bodil har med assistance fra begge medforfattere revideret de øvrige afsnit og været tovholder på bogen. Men vi har fået hjælp fra mange, og vi takker hermed Mette Nielsen og Anne Wolf på Erhvervsakademi Sjælland, Campus Roskilde og Bo Greve, Torben Skou og Jan S. Knudsen på Professionshøjskolen Metropol for diskussioner, gennemlæsning og uundværlige rettelser. Også tak til studerende Anders Westermann Møller og Nicklas Sepstrup Sørensen på laborantuddannelsen på Erhvervsakademi Sjælland, Campus Roskilde for gelfotos til kapitel 11. Desuden en særlig tak til lektor Niels Grunnet, Biomedicinsk Institut, Afd. for Celle- og Metabolismeforskning KU, for gennemgang af kapitlerne 12 og 13, til Christina Lunde, Novozymes, for gennemgang af kapitel 14 og til Sten Aastrup, Novozymes, for gode diskussioner og udarbejdelse af boks 6.1. Den særlige tak gælder også Ebbe Tørring, som har læst korrektur og i øvrigt fungeret som en yderst kompetent sproglig konsulent. Bogen har fået sit smukke og særlige udtryk, fordi vi har haft en meget dygtig og engageret tegner og layouter, Dorthe Møller fra Nyt Teknisk Forlag. Dorthe har fanget ideen bag de mange illustrationer med et enestående talent for naturvidenskab, så stor tak til Dorthe. Endelig vil vi gerne takke vores forlagsredaktør Heidi Kølle Andersen. Heidi har bevaret overblikket og guidet os sikkert gennem processen. Januar 2014 Forfatterne
Indhold 1. Introduktion til biomolekyler og celler... 8 Biomolekyler...8 Celler...9 Bakterier...13 Eukaryoter...15 Multicellulære organismer...21 Resumé...23 Praktisk arbejde...25 Opgaver...28 2. Grundlæggende kemiske begreber. 30 Kemiske bindinger, vand, kemisk energi...30 Kort om atomer og grundstoffer...30 Boks 2.1: Kemiske symboler og modeller...32 Kemiske bindinger...34 Vands øvrige egenskaber...46 Boks 2.2. Beregning af ph...48 Isomeri...50 Boks 2.3 Pasteur...54 Boks 2.4 RS-systemet...55 Kemisk energi...56 Energi...61 Praktisk arbejde...62 ph...62 Fremstilling af en buffer...62 Elektroforese...63 Spektrofotometri...66 Opgaver...69 3. Proteiner... 72 Aminosyrerne, proteinernes byggesten...73 Aminosyrernes individuelle egenskaber...77 Essentielle aminosyrer...79 Resumé af aminosyrernes egenskaber...80 Peptider...81 Boks 3.1 Peptidhormoner...84 Proteinstruktur...85 Boks 3.2 Strukturproteiner...91 Kvaternær struktur...94 Boks 3.3 Prioner...96 Strukturforudsigelser...97 Glycosylering...97 Proteiner og ligander...97 Resumé...100 Praktisk arbejde...102 Denaturering...103 Proteiners opløselighed...105 Saltfældning...107 Afsaltning...109 Spektrofotometriske metoder...110 Kromatografi...112 SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE)... 118 Aminosyreanalyse...121 Sekvens- og strukturanalyser...121 Opgaver...123 4. Immunologi og immunkemi...128 Det uspecifikke immunforsvar...129 Det specifikke immunforsvar...131 Immunoglobuliner...134 Immunisering...135 Boks 4.1 Fem klasser...137 Resumé...138 Praktisk arbejde...140 Boks 4.2 At måle...145 Boks 4.3 Immunologiske hurtigmetoder:...159 Opgaver...162 5. Enzymer...164 Katalysatorer...164 Enzym og substrat...166 Boks 5.1 Industrielle enzymer...169 Reaktionshastighed...171 Boks 5.2 Unit...173 Behandling af eksperimentelle data...179 Enzymhæmning...180 Navngivning og klassificering af enzymer..183 Cofaktorer...184 Metalioner...184 Coenzymer...186 Resumé...191 Praktisk arbejde...192 Enzym Assays...192 Opgaver...199 6. Carbohydrater...202 Opbygning af carbonhydrater...202 Monosaccharider...204 Mutarotation...214 Tautomeri...216 Monosaccharidernes derivater...216 Glycosidbindingen...221 Oligosaccharider...222 5
6 Polysaccharider...224 Boks 6.1 Bløde kostfibre...228 Glycoproteiner...232 Praktisk arbejde...234 Oligosaccharider og polysaccharider...236 Opgaver...239 7. Lipider...242 Fedtsyrebaserede lipider....243 Boks 7.1 Hvad hedder det?...244 Triacylglyceroler...248 Boks 7.2 Sæbe og andre detergenter...251 Phosphoglycerider...252 Sphingolipider og ceramider...253 Boks 7.3 Blodtyper...254 Cellemembraner...255 Isoprenoider...257 Fedtopløselige vitaminer...261 Resumé...264 Praktisk arbejde...266 Opgaver...268 8. Nucleinsyrer...270 Nucleotider...272 DNA s organisering i cellerne...282 Resumé...286 Opgaver...287 9. Replikation...290 DNA-polymeraser...291 Template-DNA...292 Primere...293 Nucleotider...293 Boks 9.1 Energi...293 Forløb af replikation....294 Prokaryot replikation...295 Eukaryot replikation...296 Oversigt: Replikation...297 DNA repair...297 DNA mismatch repair...298 Skader som følge af UV-lys....298 Resumé...300 Opgaver...302 10. Proteinsyntese...304 Proteinsyntese i prokaryote celler...305 Transskription...306 Translation...315 Trin i translation...322 Proteinsyntese i eukaryote celler...328 Resumé...335 Opgaver...337 11. Genteknologiske metoder...340 Denaturering og renaturering af DNA...341 Oprensning af DNA fra celler...343 Agarosegelelektroforese...348 Skæring af DNA med restriktionsenzymer. 351 Restriktionsanalyse...353 Boks 11.1 DNA-profilanalyse...365 Kloningsteknik...370 Trin i DNA-kloning...372 Boks 11.2 Ekspressionskloning...381 DNA-sekventering...383 DNA-hybridiseringsteknik...386 Microarrays...390 Resumé...392 Opgaver...393 12. Metabolisme Carbohydrater og triacylglyceroler..396 Carbohydraters metabolisme...396 Boks 12.1 Sødhed og sødestoffer...408 Opbygning af carbohydrat...426 Resumé af carbohydratmetabolisme...429 Triacylglycerolernes metabolisme...430 Resumé...439 Opgaver...441 13. Nitrogen...446 Fordøjelse af proteiner...447 Aminosyremetabolisme...449 Resumé...455 Opgaver...456 14. Fotosyntese...458 Kloroplaster...459 Lysprocessen...461 Lysprocessens reaktioner...462 Mørkeprocessen...465 Resumé...468 Opgaver...468 Ordliste...469 Stikord...482
1 Introduktion til biomolekyler og celler
8 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Introduktion til biomolekyler og celler De levende organismer er opbygget af tusindvis af mere eller mindre komplekse molekyler, som vi her kalder biomolekyler. Biokemien er den videnskab som beskriver, hvordan de levende organismers fantastiske egenskaber opstår med udgangspunkt i biomolekylerne. Det er livets kemi. Helt overordnet beskriver biokemien: Biomolekyler Levende organismers mikrostruktur Livets processer Molekylærbiologi er den del af biologien, som omfatter struktur og funktion af levende organismers molekyler, især proteiner og nucleinsyrer, og deres rolle i forbindelse med celledeling og overførsel af genetisk information. Molekylærbiologien beskæftiger sig også med manipulation og analyse af DNA i forskellige sammenhænge, fx ved konstruktion af genetisk modificerede organismer, kortlægning og analyser af gener og diagnostik af sygdomme. Biomolekyler Selv om der er utallige forskellige levende organismer, er de molekyler, som de er opbygget af, de samme. Der findes organismer hos alle fire store klasser af biomolekyler: Proteiner Carbohydrater Lipider Nucleinsyrer og en række mindre meget forskellige molekyler, der tilsammen danner grundlaget for livet.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 9 Proteiner, carbohydrater og nucleinsyrer har det tilfælles, at de er polymere stoffer (biopolymerer). Det betyder, at de består af relativt små og ensartede molekyler, der er bundet sammen af kemiske bindinger, der er ens, og som er karakteristiske for hver af klasserne. De små molekyler, som danner grundlaget for de polymere stoffer, kaldes monomerer. Det er karakteristisk for alle biopolymererne, at de har en veldefineret struktur, så længe de optræder i levende organismer. Når en organisme dør, ødelægges stoffernes struktur. Vi skal i de følgende kapitler se på opbygning, struktur og funktion af de forskellige stofklasser. Celler Den mindste enhed i enhver levende organisme er cellen. Planter og dyr er sat sammen af mange celler, de kaldes derfor multicellulære organismer. En isoleret plante- eller dyrecelle har ikke nogen selvstændig eksistens. Cellerne i de multicellulære organismer er forskellige, man bruger udtrykket, at de er differentierede, de arbejder sammen og er afhængige af hinanden. Mikroorganismer derimod består af en eneste celle, som er fritlevende. På trods af forskellene er cellerne opbygget af de samme elementer. Alle celler har en membran, der udgør deres overflade. Deres indre består af en tyktflydende væske, cytoplasma. Cytoplasmaet består af en vandig opløsning, som kaldes cytosol, og forskellige partikler med specifikke funktioner, som er opslæmmet i cytosolen. Cytosolen er en koncentreret opløsning, der indeholder enzymer og RNA, coenzymer og forskellige ioner. Det bemærkelsesværdige er den store lighed i indholdet af alle celler, selv om der er mange forskelle i størrelse og former. Celler kan klassificeres som enten prokaryote (pro = før, karyon = cellekerne, dvs. celler uden cellekerne) eller eukaryote (eu = ægte, karyon = cellekerne, dvs. celler med cellekerne). Biologisk (taksonomisk) hører cellerne til i tre store grupper, som kaldes domæner: Bacteria Archaea Eukarya
10 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Bacteria og Archaea kaldes henholdsvis bakterier og archebakterier, og begge grupper har den prokaryote celletype. De er alle encellede organismer. De lever overalt: i jord, i vand, i vævet på andre levende eller døde organismer. Archebakterier lever fortrinsvis i ekstreme miljøer, hvor andre organismer ikke kan leve, fx i kogende kilder, på oceanernes bund, i stærkt sure eller salte søer. Deres plasmamembraner adskiller sig fra plasmamembranen hos bakterier og eukaryote organismer. Eukarya kaldes eukaryoter, og alle flercellede organismer er eukaryote, men der findes også encellede eukaryoter, fx protister, encellede gærsvampe og alger. Eukaryote celler adskiller sig fra de prokaryote ved deres størrelse og deres indhold af organeller. Organeller er relativt store partikler i cellerne, der hver for sig er omgivet af egne membraner. Eukaryoter kan atter underinddeles, som det fremgår af figur 1.1 Domænerne underinddeles i riger. Alle levende organismer Bacteria Archaea Eukarya eubakterier archebakterier dyreriget planteriget svampe protister Figur 1.1 De levende organismer klassificeret efter deres opbygning i tre domæner: Bakterier, archebakterier og eukaryoter. Eubakterier omfatter de egentlige bakterier. Alle domæner underinddeles yderligere i riger.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 11 De levende organismer kan også inddeles efter, hvor de får deres energi fra (fig. 1.2). Der er fototrofe organismer, som får deres energi fra lys, og der er kemotrofe organismer, der får deres energi fra oxidation af kemiske forbindelser. Denne inddeling går helt på tværs af den systematiske inddeling, som er vist i figur 1.1. Alle levende organismer fototrofe kemotrofe planter bakterier dyr svampe bakterier Figur 1.2 Organismerne kan klassificeres i henhold til deres energikilde. Denne klassificering går på tværs af domænerne. Det ses fx, at der både er fototrofe og kemotrofe bakterier. Opbygning af celler Det er fælles for alle celler, at de er omgivet af en membran, kaldet plasmamembranen. Denne afgrænser cellen fra omverdenen. Uden på plasmamembranen har en del celler en cellevæg, som vi ser på, når vi behandler disse celletyper. Alle biologiske membraner består af et dobbelt lag af phospholipider (se kap. 7). Phospholipider er amfifile molekyler, der har en lang hydrofob (vandskyende) hale og et hydrofilt (vandelskende) hoved. Denne særlige opbygning gør, at phospholipider i vandige opløsninger vil danne vesikler (fig. 1.3). I en vesikel er en lille dråbe vand isoleret fra det vand, der omgiver vesiklen. Når det handler om celler, er cellens indre, cytoplasmaet, isoleret fra omverdenen. Det dobbelte lag af phospholipider udgør en sej, smidig og tæt hud. Det dobbelte lag af phospholipider kaldes også for en enhedsmembran. Ved cellens normale temperatur er plasmamembranen halvt flydende. Den er uigennemtrængelig for ioner og store polære molekyler. Vand kan godt trænge gennem membranen; man mener, det er fordi, vandmolekylerne er så små, at de smutter forbi de hydrofobe haler. Upolære molekyler kan passere membranen. Det gælder både små molekyler som CO 2 og O 2 og større molekyler som steroidhormoner (kap. 7). Figur 1.3 En celle Vandholdig hulhed En celle er principielt en vesikel. En lille væskedråbe, cytoplasma, er omgivet af en membran, som er opbygget af et dobbelt lag af phospholipider. Membranen isolerer cytoplasmaet fra omgivelserne.
12 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE En celle skal kommunikere med omverdenen. Derfor skal der være molekyler indlejret i plasmamembranen, som kan udføre sådanne opgaver. Proteiner (kap. 3) har de egenskaber, der skal til. En plasmamembran består altså af et dobbelt lipidlag, hvori der er indlejret en række proteinmolekyler (fig. 1.4). I figuren ses bl.a. en proteinkanal (3); sådanne kanaler er ofte selektive, idet de kun lader bestemte stoffer passere, og mange er i stand til at åbne og lukke sig. Man kalder denne konstruktion af en cellemembran for en flydende mosaik. Plasmamembranen er forskellig på indersiden og ydersiden. NH 2 6 P P Dobbelt lipidlag 1 2 3 4 5 COOH Figur 1.4 Et udsnit af en plasmamembran med indlejrede proteiner 1), 2) og 3) viser, hvordan tre forskellige proteiner indlejres hen over membranen. Protein nr. 3 danner en kanal, hvor cellen kan udveksle stoffer med omgivelserne. 4) er et protein, som er indlejret i den ene halvdel af dobbeltmembranen. 5) og 6) viser proteiner, der er bundet til fedtsyrer, som udgør deres anker i membranen. Plasmamembranen er således forskellig på indersiden og ydersiden. Cytoplasma består af hele celleindholdet på nær cellekernen hos eukaryote celler. Det består af cytosolen, næringsdepoter og forskellige partiker. Cytosolen er væskedelen med opløste stoffer. Alle celler indeholder et eller flere kromosomer.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 13 Kromosomer er opbygget af DNA og indeholder bl.a. cellens opskrifter på de proteiner, som cellen kan fremstille. Kromosomerne udgør cellens arvemasse. Det vil sige, at når en celle deler sig, får hver af de to nye celler en komplet kopi af kromosomerne. Ribosomer er store komplekser, der er opbygget af proteiner og RNA. De er molekylære maskiner, der bygger proteiner. Opskrifterne på proteinerne ankommer til ribosomet som mrna fra cellekernen, og energien leveres af byggestenene nuclosid-5 -triphosphater (kap. 2 og 10). Bakterier Bakterier er små encellede organismer. Deres udstrækning er almindeligvis 1-10 µm, og de kan have mange forskellige former (fig. 1.5). Her ser vi generelt på bakterier (fig. 1.6). Bakteriesystematik er et omfattende emne, så hvis man vil vide mere om dette, henvises til litteratur om mikrobiologi. Figur 1.5 Forskellige bakterier har forskellige former Kugleformede bakterier kaldes "kokker". De kan lejres som enkelte bakterier, som perlekæder eller som klumper. Cylinderformede bakterier kaldes stave. De kan lejre sig enkeltvis eller som kæder. De kan desuden have udvækster af flageller og pili. Spiralsnoede bakterier kaldes skrueformede. Selv om bakterierne morfologisk (dvs. efter deres ydre form) er forskellige, gælder for alle, at de har et indre som vist i figur 1. 6.
14 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Figur 1.6 Opbygning og indhold af en stavformet bakteriecelle med pili og flagel. Overfladerne varierer mellem de forskellige klasser, men indholdet er nogenlunde det samme. Bakterierne har en cellevæg, der er placeret udenfor cellemembranen. Cellevæggen er en stiv struktur opbygget af et mere eller mindre tykt netværk af carbohydrater og peptider (fig. 6.35 og 6.36). Cellevæggen giver bakterien dens form og beskytter den mod påvirkninger fra omverdenen. Nogle bakterier har desuden en slimkapsel udenpå cellevæggen. Denne kapsel består af glycoproteiner (kap. 6). I løbet af evolutionen har nogle bakterier mistet deres cellevæg, sådanne bakterier kaldes mycoplasma. Mycoplasma er meget små, kun omkring 0,1µm. Bakterier kan have en eller flere flageller. En flagel er en proteinfiber, som kan rotere, så cellen med dens hjælp kan bevæge sig. Pili (flertal af pilus) er stive udvækster, som visse bakterier er i besiddelse af. Pili bruges til at hæfte bakterier til overflader. En særlig slags pili er sexpili, som bruges til at udveksle arvemateriale mellem to bakterieceller. Bakteriers kromosom er en supercoiled ringformet struktur (fig. 8.16 og 8.18). Det område i bakteriecellen, hvor kromosomet er placeret, kaldes nucleoid. Kromosomet ligger i cytoplasmaet i tæt forbindelse med cellemembranen, ofte i forbindelse med et område af plasmamembranen, som er krænget ind i cellen. Sådan en struktur kaldes et mesosom.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 15 Mange bakterier indeholder desuden plasmider, der ligesom kromosomet består af nucleinsyrer og ligesom kromosomet indeholder arveanlæg (ganske få i forhold til antallet af arveanlæg i kromosomet). Cytoplasmaet indeholder desuden ribosomer, der er små legemer, opbygget af nukleinsyrer og proteiner; ribosomer fremstiller proteiner (kap. 10). Store molekyler som enzymer kan ikke passere cellemembranen. Men ved hjælp af forskellige mekanismer kan enzymer frigives til omgivelserne, hvor de nedbryder næringsstoffer udenfor cellen til mindre molekyler, der så er i stand til at passere membranen. Den videre fordøjelse sker derefter ved hjælp af enzymer, der befinder sig i cytoplasmaet. Eukaryoter Opbygningen af de eukaryote celler er kompliceret sammenlignet med opbygningen af de prokaryote celler. Eukaryote celler er først og fremmest meget større, 10-100 µm i diameter. Visse celler kan dog være meget større, fx er nerveceller i hvaler og giraffer mange meter lange. Den store størrelse kræver en langt højere grad af organisering af cellen. Eukaryote organismer kan både være encellede og multicellulære. Eksempelvis er amøber, visse alger og gærceller eukaryote encellede organismer, og de er ikke differentierede. Højere planter og dyr er multicellulære med differentierede celler. Cytoplasma I dyrecellerne opretholdes cellens struktur af et system af proteinfibre og rør, som kaldes cellens cytoskelet. En del eukaryoter er selvbevægelige, fx sædceller, makrofager og amøber. Sædceller har en flagel, som ligner bakterieflageller. Makrofager og amøber bevæger sig vha. bevægelser i cytoskelettet. Mange dyreceller er indlejret i en proteinmatrix, som de selv har produceret. Plantecellerne opretholder deres struktur vha. en stiv cellevæg, som er opbygget af carbohydrater (kap. 6).
16 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Figur 1.7 a) Typisk dyrecelle b) Typisk plantecelle Organeller Eukaryote celler indeholder en række organeller, som er afgrænsede legemer med specialiserede funktioner. Organeller afgrænses mod resten af cellen med cellemembraner, på samme måde som cellen selv afgrænses mod omverdenen af plasmamembranen. De stoffer, der er indlejret i organellernes membraner, er forskellige fra de stoffer, der er indlejret i plasmamembranen. Både planter og dyr er eukaryote, men de adskiller sig fra hinanden på forskellige områder. De grønne planteceller indeholder fx kloroplaster (grønkorn), som er de organeller, hvor sollys, CO 2 og vand omsættes til sukker. Plantecellerne er desuden omgivet af en stiv cellevæg, det er dyreceller ikke. I figur 1.7 ses tegningerne af en plantecelle og en dyrecelle. Organellerne, som beskrives i det følgende, ses på figuren.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 17 Cellekernen Kernen er et kugleformet legeme, som afgrænses fra det omgivende cytoplasma af en dobbelt membran kernemembranen. Cellekernen indeholder cellens kromosomer. Eukaryote kromosomer er lineære i modsætning til bakteriernes ringformede kromosom. Cellekernen indeholder mange andre elementer, bl.a. alle de enzymer og monomerer, der benyttes ved translation (aflæsning af kromosomets opskrifter) og replikation (deling af kromosomet). Se i øvrigt kapitel 8, 9 og 10. I cellekernen findes der desuden et område, som set i et mikroskop har en særlig karakter. Området kaldes kernelegemet eller nukleolus. Her er transskriptionsaktiviteten (DNA oversættes til RNA) ekstra høj; her fremstilles RNA til opbygning af ribosomer og trna. De to dele af kernemembranen er forskellige. Den indre membran er beklædt med et netværk af proteiner (laminer), som er med til at opretholde cellekernens form og holde styr på kromosomerne. Den ydre membran er forbundet med et netværk af membraner det endoplasmatiske reticulum, ER, som er et membransystem, der strækker sig igennem cellen. Kernemembranen indeholder porer, hvorigennem cellekernen udveksler stof med den øvrige del af cellen. Eksempelvis sendes mrna (messenger-rna) ud gennem porerne, så der kan fremstilles proteiner i cytoplasma. Ribosomer Ribosomer er proteinfabrikker. De kan være opløst i cytoplasmaet eller sidde på det endoplasmatiske reticulum. Placeringen af ribosomerne er afhængig af, hvor proteinet senere skal bruges. Proteiner, der skal indlejres i plasmamembranen, produceres på ER ligesom de proteiner, der skal eksporteres ud af cellen. Proteiner, der skal forblive i cytoplasmaet, produceres på fritliggende ribosomer.
18 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Når ribosomer ikke arbejder, findes de opløst i cytoplasmaet som to forskellige legemer, der kaldes henholdsvis store subunit og lille subunit. Endoplasmatisk reticulum Det endoplasmatiske reticulum (ER) kan sammenlignes med en labyrint af sammenhængende hulheder og rør. Det er et system af membraner, der har forbindelse med den ydre kernemembran. Ca. to tredjedele af alle proteiner syntetiseres på overfladen af ER, idet ribosomerne sætter sig på ydersiden af ER og syntetiserer proteinerne ind i ER-hulrummet, hvor de yderligere forarbejdes. Dette finder sted på den del af ER, som kaldes det ru ER, fordi overfladen forekommer ru i mikroskopet. Det ru ER er hovedsageligt udformet som flade sække. En anden del af ER har en glat overflade og kaldes derfor det glatte ER. I denne del foregår der bl.a. syntese af fedtstoffer. Det glatte ER er især udformet som rørstrukturer. Golgi-apparatet Golgi-apparatet eller Golgi-komplekset er en serie af isolerede membraner, der danner flade hulrum. Efter at proteinerne er syntetiseret i ER, transporteres de i vesikler til Golgiapparatet, hvor de bearbejdes (kap. 10). Mitokondrier Mitokondrierne er cellernes kraftcentraler. Det er her, den endelige oxidering af cellernes næring finder sted. Mitokondrier er forholdsvis store med en udstrækning på den længste led på ca. 1 µm, altså på størrelse med en bakterie. Mitokondrierne er afgrænset fra resten af cellen med en dobbelt membran. Figur 1.8 Mitokondrie Mitokondrierne er organeller, som findes i alle eukaryote celler. Det er i mitokondrierne, at den endelige oxidering af næringsstoffer i cellen finder sted. granula ribosomer ydre membran indre membran christae Mitokondrierne er på størrelse med små bakterier, ca. 1µm på den lange led. De består af to membraner, hvor den ydre er en glat membran, der omgiver den indre membran, som er stærkt foldet. intermembrant rum DNA matrix
1. Introduktion til biomolekyler og celler 19 Et mitokondrie består af fire veldefinerede områder (fig. 1.8): Ydre membran, der er opbygget af det normale dobbelte lipidlag. Membranen er forholdsvis gennemtrængelig for forskellige stoffer. Nogle af processerne i opbygningen af fedtstoffer foregår ved hjælp af enzymer, der er indlejret i membranen. Intermembrane rum udgøres af rummet mellem membranerne. En del af nucleotidstofskiftet foregår her (nucleotiderne er byggesten i DNA og desuden vigtige for energiomsætningen). Indre membran er stærkt foldet, folderne kaldes christae. I den indre membran er indlejret mange forskellige proteiner. Bl.a. enzymer og andre proteiner, der oxiderer hydrogen til vand under dannelse af energi i den proces, der kaldes respirationskæden. Matrix er det indre hulrum, hvor der foregår mange forskellige processer i forbindelse med nedbrydning af næringsstofferne. Skønt det meste af en celles DNA findes i cellekernen, har mitokondrierne tillige deres eget DNA. Det er opløst i matrix på samme måde, som kromosomet er opløst i cytoplasmaet i prokaryote celler. Der er flere kopier af kromosomet i mitokondrierne. Mitokondrierne har desuden deres egne ribosomer, som opbygger de proteiner, mitokondrie-dna koder for. Det er dog langtfra alle de proteiner, der bruges i mitokondrierne, som også er fremstillet her. De fleste proteiner fremstilles i cellens cytoplasma og sendes herfra ind i mitokondrierne. Mitokondrier deler sig på samme måde som celler. Både antallet af mitokondrier og deres opbygning varierer fra celle til celle. Celler med et stort energiforbrug, fx hjertemuskelceller, indeholder flere tusinde mitokondrier, og disse indeholder mange christae. Celler med lavt energiforbrug kan have ganske få mitokondrier med færre christae. Lysosomer, peroxisomer og andre vesikler Man kan sammenligne lysosomer og peroxisomer med dyrenes mavesæk, der kan fordøje store molekyler. Lysosomer og peroxisomer er små vesikler, der er afgrænset af en membran, og de indeholder forskellige enzymer, som bruges til at nedbryde organisk stof. Mens peroxisomerne er udbredt blandt alle eukaryote celler, findes lysosomerne kun i dyreceller.
20 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Nogle dyreceller fagocyterende celler kan optage partikler ved at krænge cellemembranen rundt om partiklen, hvorved den optages i cytoplasmaet. Der dannes således en vesikel, hvor partiklen er indesluttet. Membranerne omkring lysosomer og peroxisomer smelter derefter sammen med vesikelmembranen og frigør nedbrydende enzymer og andre nedbrydende stoffer til vesiklen, hvorved partiklen fordøjes. Som eksempel på fagocyterende celler kan nævnes visse encellede organismer som amøber, desuden er nogle af de hvide blodlegemer fagocyterende (se fx fig. 4.2). Forskellige vesikler bruges i cellernes interne transport, fx transporteres nogle proteiner igennem cellen indpakket i vesikler. Kloroplaster (grønkorn) Kloroplaster er organeller, der kun findes i de grønne planteceller. De kaldes også grønkorn. Kloroplaster er solfangerne, der i fotosyntesen (kap. 14) fanger energien i sollyset og anvender den til opbygning af carbohydrater (kap. 6). Ligesom mitokondrierne er kloroplasterne opbygget af et dobbelt membransystem. Den ydre membran afgrænser kloroplasten fra resten af cellen. Imellem den ydre og den indre membran er der et snævert intermembrant rum. Den indre membran omgiver et stort centralt rum, der kaldes stroma. I stroma findes endnu et membransystem thylakoider. Thylakoiderne består af et sammenhængende membransystem, hvor nogle membraner er stablet som lagkager, disse stabler kaldes grana. Fotosyntesen finder sted i kloroplasternes stroma og thylakoider. På figur 1.9 ses opbygningen af en kloroplast. Figur 1.9 Opbygning af en kloroplast
1. Introduktion til biomolekyler og celler 21 Kloroplaster har ligesom mitokondrierne eget arvemateriale og egne ribosomer og deler sig ligesom celler. Vakuoler og granula Mange planteceller indeholder vakuoler, som også kaldes saftrum. De indeholder opløste næringsstoffer i flydende form. Granula er tilsvarende lagre af næring, men her opbevares næringsstofferne næsten tørt, det gælder fx de carbohydrater, der oplagres i korn og frø. Multicellulære organismer Indtil nu har vi kun beskæftiget os med de enkelte celler, men verden består jo i høj grad af organismer, der er opbygget af mange celler multicellulære organismer. For at en multicellulær organisme overhovedet kan eksistere, må cellerne på en eller anden måde være bundet sammen, og eukaryoterne har fundet flere løsninger på det problem. I de højere planter er cellerne placeret indenfor en stiv cellevæg. Hver celle er forbundet med sine naboer gennem kanaler i cellevæggen cytoplasmabroer, hvorved cellerne i nogen grad får fælles cytoplasma. Dyreceller derimod har ikke stive cellevægge, og cytoplasmabroer er sjældne. Dyrecellerne er forbundet med naboceller via nogle af de proteiner, der er indlejret i plasmamembranerne. Mange dyreceller er desuden forankret i et netværk af proteiner (den ekstracellulære matrix), som de selv har dannet. Det er karakteristisk for de multicellulære organismer, at cellerne, som de er opbygget af, er forskellige. I hvirveldyrene er der ca. 200 forskellige celletyper. Arvematerialet er det samme i alle cellerne i en organisme, men det er forskellige områder (eller gener) i arvematerialet, der kommer til udtryk i de forskellige celler. Denne udvikling af cellernes forskellighed sker i fostertilstanden, den kaldes celledifferentiering. Plantecellernes differentiering sker under væksten, og en del planteceller kan, hvis de isoleres fra moderplanten, danne en ny plante. Man kan se det, når man tager et skud fra en plante. Skuddet kan under passende omstændigheder danne nye rødder. Noget tilsvarende sker sjældent for hvirveldyr.
22 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Det er helt afgørende, at cellerne i de multicellulære organismer arbejder tæt sammen. De har derfor mange måder, hvorpå de kan kommunikere indbyrdes. Men der er en fællesnævner for næsten al kommunikation mellem cellerne: Alle cellemembraner indeholder proteiner, der kan modtage signaler fra omgivelserne og videreføre dem til cellens indre. Denne form for signaloverførsel findes bl.a. i signaleringen mellem nervecellerne indbyrdes, og mellem nervecellerne og de celler der skal modtage eller afgive besked. Systemet er rigt varieret. Det omfatter fx immunsystemets skelnen mellem organismen selv og fremmede organismer (kap. 4). En hel del hormoner fungerer ved at sætte sig fast på overfladen af de celler, der skal modtage en besked. Der er andre former for kemisk signaloverførsel, hvor det ikke er proteiner i cellemembranen, der deltager. Kønshormonerne vandrer fx helt ind i cellekernen, hvorfra de kan sætte kønsudviklingen i gang. Virus Virus (flertal: Vira) falder uden for de klasser af levende celler, vi indtil nu har omtalt. Et virus har ikke noget selvstændigt liv. Det består af en proteinkapsel, der indeholder dets arveanlæg (DNA eller RNA) og nogle ganske få enzymer. Et virus liv består i, at det sprøjter sine arveanlæg ind i en værtscelle, hvorefter dets arveanlæg overtager kommandoen over cellen, som på den måde omstilles til at producere nye viruspartikler. Nogle vira dræber værten, mens andre omstiller en del af stofskiftet, så cellen har en løbende produktion af nye vira.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 23 Resumé Den grundlæggende enhed i enhver levende organisme er cellen. De levende celler har mange elementer tilfælles: En plasmamembran, som er opbygget af et dobbelt lipidlag. Cytosolen, som er en tykflydende væske, hvori mange af cellens bestanddele er opløst. Cytoplasma, som udgøres af cytosolen og de partikler, der er opløst/opslæmmet i denne. Kromosomer, som er opbygget af DNA. Kromosomernes funktion er dels at opbevare opskrifterne på alle de proteiner en celle kan fremstille, dels at deltage i styringen af, hvornår disse skal produceres. Ved reproduktion af enhver celle udstyres afkommet med en kopi af forældrecellens kromosom/ kromosomer. Ribosomer, som er proteinfabrikker. Resumé Men der er også forskel på opbygningen af celler. På baggrund af disse forskelle klassificeres tre domæner: Bacteria, Archaea og Eukarya. Domænerne underinddeles i riger. Eukarya underinddeles således i planteriget, dyreriget, svampe og protister. På tværs af domænerne opdeles organismerne i autotrofe og kemotrofe, alt efter hvorfra de får deres energi. Autotrofe organismer får deres energi fra solen, mens kemotrofe får energi ved at nedbryde stoffer med høj kemisk energi. Således er planter og nogle bakterie autrofe, og alle dyr, svampe og andre bakterier er kemotrofe. Her har vi set på opbygningen af bakterier og eukaryoter. Bakterier er små encellede organismer. De indeholder et ringformet kromosom, og nogle indeholder yderligere små ringformede DNAmolekyler, der kaldes plasmider. Alt, hvad de har brug for, er dels opløst i cytosolen, dels indlejret i cellemembranen. På ydersiden af cellemembranen har bakterierne en cellevæg, der er opbygget af et netværk af carbohydrater og peptider. Bakterierne har forskellige former, nogle kan bevæge sig ved hjælp af en flagel. Eukarya underinddeles i fire riger. Her har vi set på opbygning af cellerne i dyreriget og planteriget
24 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Eukaryote celler er mange gange større end bakterier. I cytosolen findes dels de samme elementer som i bakterier, dels findes yderligere en række organeller. Organeller er legemer i cytoplasmaet, der er adskilt fra det øvrige cytoplasma af membraner, der grundlæggende er opbygget på samme måde som plasmamembranen. Her er nævnt: Cellekernen, hvor de eukaryote kromosomer opbevares adskilt fra cellens øvrige elementer af en dobbelt membran. Mitokondrier, hvor den endelige oxidering af næringsstofferne sker. ER det endoplasmatiske reticulum, er et membransystem, der hænger sammen med den ydre kernemembran. Hertil fæstes en del ribosomer, således at proteinerne syntetiseres ind i ER s hulheder. Golgi-apparatet/komplekset, hvor proteiner, der er syntetiseret i ER, yderligere bearbejdes. Vesikler, som indeholder enzymer, der kan nedbryde organisk stof. Grønne planteceller indeholder desuden kloroplaster, som er et organel, der ligner mitokondrierne lidt. Her sker omdannelsen af CO 2 og vand til carbohydrater.
1. Introduktion til biomolekyler og celler 25 Praktisk arbejde Som vi skal se i det følgende, har man i studiet af biokemi og molekylærbiologi mange analysemetoder til rådighed. Man kan til en vis grad opdele metoderne i to forskellige grupper, nemlig i præparative metoder, hvor formålet er at få et produkt, fx et oprenset protein, fra en blanding af mange forskellige stoffer, og analytiske metoder, hvor formålet er at få oplysninger om et stof. I dette afsnit skal vi gennemgå to præparative metoder: Homogenisering og centrifugering. I de følgende kapitler vil der være mange eksempler både på præparative og analytiske metoder. Åbning af celler Celler eller vævsprøver består af mange organeller og tusindvis af forskellige stoffer. Det er derfor ofte nødvendigt at isolere de af cellens elementer (et stof eller et bestemt organel), som man ønsker at undersøge. Det første trin i en sådan isolering er tit en lysering (åbning af celler) med en samtidig eller efterfølgende homogenisering af det væv eller de celler, hvori det interessante stof/organel befinder sig. Der bruges både fysiske og kemiske metoder til at lysere og homogenisere celler og væv, og ofte bruges en blanding af de fysiske og de kemiske metoder. Praktisk arbejde Blandt fysiske metoder kan nævnes: Homogenisering i en blender med høj hastighed Behandling med ultralyd (sonikering) Behandling med en homogenisator (fig. 1.10) Frysning (is fylder mere end vand) En kemisk metode kan være behandling med detergenter (sæbelignede stoffer, se boks 7.2), som opløser cellemembranen. Til nedbrydning af cellevægge bruges ofte enzymer, som specifikt angriber cellevæggen på netop den organisme, man ønsker at undersøge. I alle tilfælde foregår homogeniseringen i en opløsning med en ionstyrke og en ph-værdi, der er tilpasset det stof eller de partikler, man ønsker at undersøge. Desuden bør homogeniseringen foregå ved lav temperatur (isbad) for at nedsætte de nedbrydende proces- Figur 1.10 Homogenisator Et stempel, der passer meget tæt i et glasrør. Stemplet drejes op og ned i glasset, hvorved cellemembranerne knuses. Bruges til homogenisering af væv
26 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE sers reaktionshastighed. Ved ødelæggelsen af celler og væv produceres en suspension (homogenat), hvorfra man i den videre procedure kan isolere det stof eller de organeller, man ønsker. Centrifugering Centrifugering bruges på mange forskellige steder i biokemiske analyser og oprensninger (fig. 1.11). Princippet ved centrifugering er, at forskellige partikler i en suspension bundfældes med forskellig hastighed. Partikler, der kan bundfældes ved centrifugering, kan være celler, organeller eller molekyler med forskellig masse og vægtfylde. Figur 1.11 Bordcentrifuge med køling En centrifuge er et instrument, der forøger den hastighed, hvormed en partikel bundfældes. Centrifugen består af en rotor, der roterer med høj hastighed. Derved påvirkes prøven, der centrifugeres, med en tyngdekraft, der i de stærkeste centrifuger når op på 600.000 gange jordens tyngdekraft. Det kaldes 600.000 G. Forholdet mellem omdrejningshastighed, rotordiameter og den kraft der påvirker en givet partikel beskrives af formlen: rpm 2 G = r 900 G = den kraft, der påvirker partiklen. rpm = antallet af omdrejninger pr. minut r = afstanden fra rotorens centrum til bunden af centrifugeglasset
1. Introduktion til biomolekyler og celler 27 En af de mest almindelige anvendelser af centrifugering er differentiel centrifugering, hvor man adskiller opløseligt materiale fra uopløseligt. En sådan centrifugering bruges ofte i den indledende fase af en oprensningsprocedure. De celler eller det væv, man bruger som udgangsmateriale, findeles og opslæmmes i en buffer og centrifugeres. Man kan herefter arbejde videre med bundfaldet (man bruger normalt i laboratoriet det engelske udtryk pellet) eller den øverstliggende væske, som kaldes supernatanten. Differentiel centrifugering kan også anvendes til at adskille to ikke blandbare væsker, fx kan fedt og vand i en emulsion adskilles ved centrifugering. Differentiel centrifugering kan desuden anvendes til adskillelse af cellernes forskellige organeller. Cellekerner bundfældes i området 6-800 G, mitokondrier og kloroplaster bundfældes i området 15.000 G, mens de frie ribosomer først bundfældes ved 150-300.000 G. De fleste laboratoriecentrifuger, der bruges i biokemi og molekylærbiologi, er termostaterede kølecentrifuger (fig. 1.12). Organeller, der er oprenset ved centrifugering, bevarer ofte en del af deres biologiske aktivitet, og de kan derved gøres til genstand for forskellige undersøgelser. Sådanne præparationer kaldes cellefri systemer. Gradientcentrifugering Der kan skabes en gradient i et centrifugeglas, så massefylden af opløsningen i glasset er større i bunden end i toppen (fig. 1.12). Hvis man før centrifugeringen lægger den blanding, man ønsker at adskille, på toppen af opløsningen i centrifugeglasset, vil blandingens forskellige elementer placere sig i opløsningen efter massefylde. En sådan gradient kan fx fremstilles af opløst sucrose. Både opløste stoffer, fx proteiner, og opslæmmede organeller, kan oprenses vha. en sådan gradientcentrifugering. Figur 1.12 Gradient centrifugering Fremstilling af en gradient til en gradient centrifugering.
28 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI TEORI OG METODE Opgaver Opgaver 1. Beskriv, hvad der er fælles for alle levende celler. 2. Beskriv forskellene mellem en eukaryot dyrecelle og en bakterie. 3. Beskriv forskellene mellem en eukaryot dyrecelle og plantecelle. 4. Beskriv opbygning og funktion af et mitokondrie. 5. Beskriv kromosomernes funktioner. 6. Beskriv ribosomernes funktioner. 7. Beskriv forskellene på analytiske og præperative metoder?