Chapter 11 Cell cycle regulation
Hvad er cellecyklus? Hvordan opnås viden om regulation? Hvordan fungerer og reguleres cyklin-afhængige kinaser? Hvad er et restriktionspunkt? Hvilken funktion har proteinkinaser under mitose? Hvordan monitorerer checkpoints DNA skade? Hvordan relaterer cellecyklus-regulation til cancer?
Celledeling En celle indeholder alle nødvendige informationer til gennem deling at lave en kopi af sig selv. Den eukaryote cellecyklus er en serie af ordnede begivenheder, der resulterer i generering af to kopier af den oprindelige celle. I éncellede organismer producerer hver deling en ny og uafhængig organisme, d.v.s. sikrer videreførsel. I flercellede organismer kræves mange celledelinger for at danne en organisme, og delinger derefter erstatter løbende celletab, d.v.s. sikrer turnover og fortsat opretholdelse af struktur og funktion.
Figure 11.01: Syntese (S fase) og mitose (M fase) er i de fleste celler adskilt af Gap faser, G1 og G2.
Cellecyklus i tidlige blastomerer Eks. frøæg bliver til 37000 celler på 43 timer Periodisk ophobning af cyklin B. Syntetiseres af oocyt mrna. slide6.mov
Figure 11.02: Celledelinger foregår ikke kontinuert, men reguleres af cellens mikromiljø. Mange overgange i cyklus reguleres af et kontrolsystem, som reagerer på information fra kritiske checkpoints.
Betinget loss-of-function mutanter af gær er klassiske cellecyklus-modeller Figure 11.04: Bagergær formerer sig ved knopskydning. Celler uden knop er i G1, celler med knop er i G2 eller M.
Figure 11.05: Permissive growth condition 25C, nonpermissive 37C. De temperaturfølsomme mutanter kaldes cell division cycle (cdc). Mutanter kan synkroniseres.
Figure 11.06: Spaltegær er cylindrisk og deles efter længdevækst medialt. cdc mutanter giver øget længdevækst, wee mutanter udviser begrænset vækst i forhold til vildtype.
Mammale celler som cellecyklus-model S-fase fremmende faktorer findes i cytoplasma. Mitotiske celler indeholder en dominant mitosefremmende substans.
Figure 11.08: Cell cyklus har mange checkpoints, og nøglefaktorerne i det centrale kontrolsystem er proteinkinaser, cyclin-dependent kinases (CDKs).
Cyclin-dependent kinases (CDKs). Aktiv CDK består af et kompleks af to polypeptider: CDK, som binder ATP og indeholder det aktive site og cyklin, hvis binding inducerer en konformationsændring i CDK, så det katalytiske center eksponeres for substrat. Aktiviteten af CDK-cyklin komplekser svinger gennem cyklus, og et givent kompleks er kun aktivt indenfor et begrænset tidsrum af cyklus. Forskellige proteinkinaser er aktive i forskellige tidsrum af cyklus. I det korte tidsrum en kinase er aktiv, fosforyleres et stort antal proteiner, som derved enten aktiveres eller hæmmes.
Figure 11.09: Cyclin A binding activates Cdk2. Cdk2.mov
Figure 11.10: Cykliner blev oprindeligt beskrevet i søpindsvin-embryoner. Man opdagede proteiner, hvis niveau faldt drastisk samtidig med celledeling.
Figure 11.12: I spaltegær er ét CDK-cyklin kompleks nok til at organisere cellecyklus. I mammale celler kræves forskellige komplekser.
Figure 11.13: Spaltegær: Lavt niveau af Cdk1-cyklin B aktivitet initierer replikation, og højt niveau fremmer mitose.
Der findes 3 cyklinklasser: G1 cykliner, som er ansvarlige for G1 passage mod S-fase. (Cyklin D og E). S-fase cykliner, som nødvendige for initiering af replikation. (Cyklin A). M-fase cykliner, som er nødvendige for at initiere mitose. (Cyklin B). Alle cykliner interagerer med samme katalytiske subunit i CDK komplekset (konserveret 150aa stretch, the cyclin box ). Diversiteten i funktion af komplekser opnås ved, at cyklinet er bestemmende for, hvilke target proteiner, der fosforyleres. Cykliner udviser redundancy (cyklin E KO uden fænotype).
Regulation af CDK-cyklin komplekser Fosforylering (aktiverende eller inaktiverende) Proteininhibitorer (cyclin kinase inhibitors, CKIs) Proteolyse Subcellulær lokalisation
Figure 11.14: Aktiverende fosforylering af Thr167 i T-loop af kinasen v.h.a. CDKactivating kinase, som bevirker konformationsændring. Inaktiverende fosforylering af Thr14 eller Tyr15, som fastholder Cdk1 komplekset inaktivt i G2. Dette kan reverteres i G2-M overgangen af Cdc25 aktivitet.
Figure 11.15: Der findes to typer CKIs: p16 og Cip/Kip familierne. Førstnævnte interagerer med kinase subunit, sidstnævnte, f. eks. p27, binder og hæmmer komplekset.
Figure 11.16.
Figure 11.17: Celler kan fra G1 gå i G0, og derefter tilbage i cyklus efter et givent stimulus. Efter et vist punkt sent i G1, hhv. START og restriction point er cellen irreversibelt committed til at løbe cyklus igennem uanset ydre forhold. Permanent G0 => differentiering eller apoptose.
Figure 11.19: Vækstfaktorer, såsom PDGF, inducerer proliferation. G1 cyklinet, cyklin D, er et delayed early response gene, hvis ekspression er en vigtig del af G1/S transition.
Figure 11.20: CDKs og associerede G1 cykliner bevirker gennemløb af restriktionspunkt ved at fosforylere retinoblastoma, Rb, som binder og hæmmer transkriptionsfaktoren, E2F. Når tilstrækkelig Cdk2-cyklin E akkumulerer, overskrider cellen restriktionspunktet og påbegynder S-fasen.
Mitose G2-M overgang er hoved-checkpoint i de fleste eukaryote celler. Cellen undergår dramatiske cytoskelet- og kerneændringer under mitosen, bl. a. dannelse af den mitotiske ten og nedbrydning af kernemembran. Korrekt gennemførsel af den mitotiske proces beror på aktiviteten af mitotiske kinaser: - Nedbrydning af kernemembran - Kromosomkondensering og adskillelse - Tendannelse - Cytokinese
Organisation under mitose I interfasen organiserer centrosomet MT i lange filamenter i cytoplasma, i mitosen nedbrydes disse, centrosomer separeres, og en bipolær ten af MT dannes imellem dem. Kromosomer hæftes (hæftningspunkt: kinetochoren) til MTender i tenen, og forbindes til centrosomet. Idet hvert søsterkromatid har egen kinetochor, og hæftes til MT, der udspringer af hvert sit centrosom, fordeles kromatider ligeligt ved mitosen. MT asters interagerer med cellecortex, og er med til at orientere tenen i cellen. Korrekt hæftning af MT til kintochorer er en forudsætning for korrekt kromosomfordeling.
Proteinkinaser er vigtige komponenter i mitosen Cdk1-cyklin, Plk, Aurora og NIMA lokaliserer til centrosomet. Cdk1 fosforylerer lamin A, så kernemembran opløses. Aurora A faciliterer MT nucleation og rekrutterer andre faktorer til centrosomet. Aurora B er et chromosome passenger protein, der flyttes fra kinetochor til ten-centrum i anafase, og findes i midbody regionen, når cellen deler sig. Tjekker for mangel på tension i tenen.
Figure 11.26: Cdk1-cyklin B fosforylerer lamin, så kernemembranen opløses.
Proteinkinaser er vigtige komponenter i mitosen Cdk1-cyklin, Plk, Aurora og NIMA lokaliserer til centrosomet. Cdk1 fosforylerer lamin A, så kernemembran opløses. Aurora A faciliterer MT nucleation og rekrutterer andre faktorer til centrosomet. Aurora B er et chromosome passenger protein, der flyttes fra kinetochor til ten-centrum i anafase, og findes i midbody regionen, når cellen deler sig. Tjekker for mangel på tension i tenen.
Aurora A Aurora lokaliserer til centrosomet i G2 og mitose. Aurora A er nødvendig for korrekt lokalisation og funktion af en række centrosomale komponenter. Depletion af Aurora A giver monopolær tendannelse. Aurora A-genet er ofte amplificeret og overudtrykt i cancer.
Aurora A kinase i celledeling og cancer (BBA 2008)
Proteinkinaser er vigtige komponenter i mitosen Cdk1-cyklin, Plk, Aurora og NIMA lokaliserer til centrosomet. Cdk1 fosforylerer lamin A, så kernemembran opløses. Aurora A faciliterer MT nucleation og rekrutterer andre faktorer til centrosomet. Aurora B er et chromosome passenger protein, der flyttes fra kinetochor til ten-centrum i anafase, og findes i midbody regionen, når cellen deler sig. Tjekker for mangel på tension i tenen.
Aurora B: A chromosomal passenger conducting cell division (Nature Rev. 2007)
Aurora B bidrager til kromosomkondensering og Condensin1 kompleksets kromosomale association. Aurora B styrer kromosomal cohæsion, idet Aurora B fjerner cohesin fra kromosomarme. Måske bidrager Aurora B også til ten assembly. Syntel kinetochor attachment, som foregår som en stokastisk begivenhed, bliver aktivt destabiliseret af Aurora B. Aurora B ophobes i centromerer af merotelt hæftede kinetochorer, og speeder turnover af kinetochor-mt op, og sørger derved for destabilisering. Spindle assembly checkpoint SAC hæmmer metafase-anafase overgang til fejlen er rettet.
Figure 11.38: Manglende hæftning til kinetochor eller ukorrekt tension over søsterkromatider aktiverer SAC, som hæmmer metafase-anafase overgang.
Figure 11.39. Når SAC er aktiveret, inaktiveres APC (anaphase-promoting complex) af binding af Mad2 og Cdc20, så securin ikke undergår proteolyse og frigiver separase. Ingen aktiv separase, ingen sepration af søsterkromatider.
Mitose exit Exit fra mitose kræver inaktivering af Cdk1. Mitotisk exit involverer reversion af Cdk1 fosforylering. Inaktivering af Cdk1 og reversion af Cdk1 fosforylering er koordineret med: disassembly af den mitotiske ten cytokinese
Checkpoint controls koordinerer forskellige cellecyklus-begivenheder Cellecyklus-begivenheder er koordinerede. Koordination af cellecyklus-begivenheder opnås via specifikke checkpoints. Checkpoints sinker cellecyklus, hvis en forudgående cellecyklus-begivenhed ikke er blevet fuldendt.
Checkpoints kan være af essentiel betydning kun når cellen er stresset eller beskadiget. De kan også være aktive i den normale cyklus for at sikre ordentlig koordination af begivenheder.
DNA replikation og DNA-skade checkpoints monitorerer defekt DNA metabolisme Ukomplet og/eller defekt DNA replikation aktiverer cellecyklus checkpoints. Beskadiget DNA aktiverer et checkpoint som relateres til replikationscheckpoint. DNA-skade checkpoints holder cellecyklus tilbage på forskellige stadier afhængig af i hvilket stadium, skaden opstod.
Figure 11.33. Checkpoint respons reguleres af evolutionært konserverede proteiner.
Ataxia telangiectasia mutated (ATM) Proteinkinase vigtig sensor af DSBs. Arvelig mutation i ATM genet giver genomisk instabilitetssyndrom, ataxia telangiectasia, AT, som bl. a. er karakteriseret ved predisponering for cancer.
Oculocutaneously telangiectasia
Ataxia telangiectasia mutated (ATM) Proteinkinase vigtig sensor af DSBs. Arvelig mutation i ATM genet giver genomisk instabilitetssyndrom, ataxia telangiectasia, AT, som bl. a. er karakteriseret ved predisponering for cancer. Næsten 40% af AT homozygoter udvikler malign cancer ( mest lymfomer og leukæmier). Årsag: Det muterede ATM protein kan ikke iværksætte reparation af DNA-skader under modning af immunsystem.
Figure 11.34: ssdna udløser ATR-afhængigt respons, DSB udløser ATMafhængigt respons.
Figure 11.35: Regulation of the intra-s checkpoint.
ATM er en nøglefaktor i DSBs respons Breast Cancer Res. Treat. 2007
Figure 11.36: Defekter i DNA replikation resulterer i stallede replikations-gafler, som aktiverer checkpoints, som bl. a. hindrer iværksættelse af mitose. Eksperimentelt kan celler stoppet i G2 efter aktivering af DNA damage checkpoint, blive stimuleret til at gå i mitose med koffein, som hæmmer ATM og ATR kinaser og slukker checkpoint.
Figure 11.33. Checkpoint respons reguleres af evolutionært konserverede proteiner.
BRCA1: Breast Cancer 1 Oprindeligt beskrevet som muteret i arvelig brystkræft 600 muterede former identificeret. Tumor suppressor, som opretholder genomisk integritet for at undgå ukontrolleret proliferation.
DSBs medfører fosforylering af BRCA1 og reallokering til beskadiget DNA. Central for regulation af komplekser, som er unikke i koordination af cellecyklus checkpoints og DNA repair. J. Clin. Oncol. 2008
BRCA1 i ovariecancer 90% af tilfælde af OC er sporadiske. Mutation af BRCA til grund for 95% af arvelig ovariecancer. Blandt patienter med fremskreden cancer, har de med BRCA1/2 mutationer bedre overlevelse end de med sporadisk sygdom. Årsag: BRCA-mutanter udviser øget sensitivitet overfor DNA-beskadigende behandling.
Figure 11.CO: Cell cycle regulation