Muskel 1 C. Juel 2006 MUSKEL-ØVELSE. Indledning. Øvelsens formål er: at studere muskelkontraktionen at give nogle typiske værdier til karakterisering af muskelkontraktionen at demonstrere brugen af en type registreringsudstyr. De studerende forventes i hold på 4-5 deltagere, at gennemføre de beskrevne procedurer på et frø-muskel præparat, der som regel vil være anbragt i opstillingen, når øvelsen begynder. Det er målet, at de studerende kan tegne og/eller beskrive de iagttagne fænomener og få nogle omtrentlige talværdier at forbinde dem med, og at de studerende kan redegøre for de grundliggende mekanismer ved hjælp af lærebogens begreber. Som forberedelse foreslås det at gennemgå øvelsesvejledningen så grundigt, at formål og princip i procedurerne står klart før hver øvelsesdel, samt at læse relevante dele af kapitel 9 (side 287-298) i Vander et al. s: Human Physiology, The Mechanisms of Body Function (10. udgave). Det planlagte øvelsesprogram forventes at udfylde den disponible tid (2,5 time), idet de studerende forventes at diskutere resultaterne for de enkelte afsnit under øvelsen, sådan at man her sikrer sig forståelsen af øvelsens resultater. Materialer og metoder. Som muskel-præparat anvendes sartorius musklen fra en frø. Til mekaniske forsøg på muskler foretrækkes sartorius-musklen ofte, dels fordi alle fibre forløber parallelt og er næsten lige lange, dels fordi der her findes få såkaldt langsomme fibre, og endelig fordi musklen er båndformet og så tynd, at diffusion af stoffer ind og ud af musklen foregår relativt hurtigt. Placeres musklen i en fysiologisk saltopløsning (Ringer opløsning, se bilag) vil (næsten) normale funktioner kunne iagttages flere timer efter dissektionen. Sikkerhed og Arbejdsmiljø. Ringeropløsningerne indeholder almindelige salte, der ikke udgør nogen sundhedsmæssig risiko. 1
Muskel 2 Musklens længde i kroppen med dyrets ben udstrakt (L K ) opgives: L K = mm Musklen er ophængt i myografen, idet den forsigtigt er strakt ud til L K, og et sæt stimuleringselektroder er anbragt i kontakt med muskelmembranerne (direkte stimulering). Der indgår altså ingen nervecelle. Muskelkontraktionerne registreres via et mekano-elektrisk transducer-system på oscilloskopet. Musklen er ophængt i en myograf, som kan måle muskelkontraktionerne under veldefinerede betingelser. I myografen indgår et muskelkar med to ophængningspunkter for musklen. Det ene ophængningspunkt er en klemme på en horisontalt forskydelig stang og det andet er en lille krog på metalpladen i den mekano-elektriske transducer. I denne transducer danner den bøjelige metalplade og en fast metalkerne tilsammen den variable kapacitet i en elektrisk svingningskreds. Trækkes i pladen vil denne afbøjes svarende til kraftens størrelse og derved formindske kondensatorens kapacitet, sådan at svingningsfrekvensen i kredsen ændres. Frekvensændringen omsættes i reactans converteren til en spændingsforskel, der registreres på oscilloskopet (Figur 1). Samtidig med at stimulatoren danner stimulerings-impulsen, afsendes en "trigger impuls", der bruges til at starte (trigge) oscilloskopet. 2
Muskel 3 Figur 1. Opstillingen skematisk. Opstillingen er kalibreret ved at belaste transduceren med lodder fra 1 til 100 g, svarende til en kraftpåvirkning fra ca. 0. 01 til 1 N, og målesystemet er korrigeret til linearitet. Udslaget på oscilloskopet er justeret med det indskudte potentiometer, sådan at der er et simpelt forhold mellem kraftpåvirkningen på transduceren og den spændingsforskel, der registreres på oscilloskopet. Omregningsfaktoren opgives: 1 V (udslag i volt på oscilloskopet) N. (kraft i Newton) Øvelsens udførelse. Den eksperimentelle del af øvelsen har følgende afsnit: 1. Relationen mellem stimulusstyrken og enkeltkontraktionens størrelse. 2. Effekt af stigende-stimulus frekvens, tidsforsinkelsen. 3. Muskeltræthed. 4. Længde-spændings-relationen (sammenhængen mellem kraft og længde). 3
Muskel 4 1. Relationen mellem stimulus-styrken og enkeltkontraktionens størrelse. Præparatet stimuleres med enkeltimpulser og stimulusstyrke (O/P på digitimer stimulator) forøges langsomt fra 0 V og opefter (med trin på 0,5 V). Mål sammenhængen mellem stimulusstyrken (aflæst på stimulator) og enkeltkontraktionens størrelse (twitchkraften, d.v.s. afbøjningen fra hvileniveauet til toppen af kraft/tidskurven på oscilloskopskærmen). Signalets størrelse måles (antal div = antal cm udslag i Y-aksens retning), dette omregnes til V og derefter til kraft (i Newton, N). Stop forsøget, når maksimal twitchkraft er opnået ved 3 forskellige stimulusstyrker. Relationen mellem stimulusintensitet og enkeltkontraktionens størrelse er sjældent helt reproducerbar. Forsøget gennemføres med så små intervaller som muligt, idet der lægges vægt på at konstatere at musklens twitchkraft kan antage både "alt" - og "intet"-værdier, samt værdier her imellem. Oscilloskop: time base, = tidsenhed (time/div.) 0,1 sec/div ( knap 10). Sensitivity, = følsomhed (volts/div.): 0. l V/div Stimulator: Enkeltimpulser ( "single" ) stimulus udløses med trykknap. (de foreslåede indstillinger af oscilloskopet og stimulatoren må forstås som vejledende: erfaringsmæssigt er disse indstillinger ofte hensigtsmæssige, men det kan være nødvendigt med lidt andre indstillinger, så signalet får et passende udslag på skærmen). Resultaterne indføres i Måleskema A. Måleskema A.: Stimulus Følsomhed styrke, Volt Volts/div. (indstilles på (På stimulator) oscilloskopet) Twitch i div (cm) (Yaksen) Twitch i Volt (beregnet) Twitch kraft i N. (beregnet) 4
Muskel 5 Tegn den maksimale enkeltkontraktions forløb som den fremtræder på oscilloskopskærmen. Oscilloskopets følsomhed : volts/div. Tidsenhed, time/div : sec/div. Kontraktionens kraft: N og varighed msec. Beregn kontraktionens varighed og kraft. Redegør kortfattet for de processer, der fører fra stimulering af en muskel til kontraktion. Afbild relationen mellem stimulus intensitet (x-aksen) og enkeltkontraktionens kraft (y-aksen) (data fra Måleskema A). Beskriv kurvens forløb og de forskellige afsnit, når det tages i betragtning, at den enkelte motoriske enhed følger "alt-eller-intet-loven". 5
Muskel 6 2. Effekt af stigende stimulus frekvens. Stimulatoren indstilles, så maksimal twitchkraft opnås. Musklen stimuleres med korte impulstog af stigende frekvens (1, 2,5, 5, 10 og 15 Hz, "rate" på stimulator). De enkelte forsøg bør ikke gentages for ofte, da musklen let udtrættes. Oscilloskop: tidsenhed 0. 2 sec/div følsomhed (volts/div) indstilles så twitch-kraften svarer til 1-2 divisioner på skærmen. Stimulator: Stimulusintensiteten skal være så stor, at enkeltkontraktionen bliver maksimal. Skift til train. Mode: gate Impulstogets varighed er stillet til at give en varighed på ca. 500 msek (ubenævnt knap længst til venstre på stimulatoren). Impulstoget udløses ved tryk på sort knap (måleskemaer næste side). Tegn serien af kontraktioner som de fremtræder på oscilloskopet (der er plads til fem billeder). Beregn forholdet mellem de maksimale aktive kræfter under tetanus og twitch (tetanus/twitch forholdet). Hvorfor er kraften større under tetanus end under twitch? 6
Muskel 7 Måleskema B. (effekt af stigende stimulus frekvens). Frekvens: Hz. Volts/div:. Antal div: Kraft: N Frekvens: Hz. Volts/div:. Antal div: Kraft: N Frekvens: Hz. Volts/div:. Antal div: Kraft: N Frekvens: Hz. Volts/div:. Antal div: Kraft: N Frekvens: Hz. Volts/div:. Antal div: Kraft: N 7
Muskel 8 Forsinkelsen fra stimulation til begyndende kraft. Mål tidsforsinkelsen fra der stimuleres til kraften begynder at vise sig. Det er nødvendigt at lade oscilloskopet løbe hurtigt for at kunne måle forsinkelsen. Tidsforsinkelsen blev målt til at være: ms. Hvad skyldes denne tidsforsinkelse? Oscilloskop: tidsenhed (time/div.): 5 msec/div. følsomhed (volts/div.) forøges til 20 eller 50 mv/div Stimulator: enkeltimpulser. "single". 3. Muskeltræthed Muskeltræthed i en isoleret muskel kan defineres som faldende kraft på trods af konstant stimulering. I dette forsøg stimuleres til musklen er blevet træt, derefter får musklen en hvileperiode og den stimuleres igen. Time base 0.5 sek/div. AT/norm knappen trykkes ud så strålen løber hele tiden. Der stimuleres med enkeltimpulser med en frekvens på 2 Hz. Kraften aflæses ved start og for hver 15 sek. Efter to minutters stimulation (eller til kraften er faldet til 10-15 % af begyndelseskraften) holdes en pause på 2 minutter. Derefter stimuleres musklen igen og kraften måles ved start og for hver 15 sek i de næste 1-2 minutter. Værdierne indføres i skemaet Beskriv forløbet. Giv nogle mulige forklaringer på forløbet. 8
Muskel 9 4. Længde-spændings-relationen (sammenhængen mellem kraft og længde). Det er vigtigt at deltagerne gør sig strategien klar inden de kaster sig ud i denne del af øvelsen. Stimuleringselektroderne anbringes ca. l cm fra den ende af musklen, der er forbundet til transduceren. Stimulator: Enkeltstimulationer. Oscilloskopet: Tidesenhed 0.1 sec/div. Sensitivity (volt/div) sættes så tetanuskraften svarer til kun ca. l - 2 cm på skærmen (dette sikrer at det ikke er nødvendigt at ændre sensitivity under det følgende forsøg). Definitioner: Passiv kraft: musklens modstand når den forlænges (skyldes ikke tværbroer). Aktiv kraft: den kraft der opstår når musklen stimuleres (skyldes dannelse af tværbroer). Musklens ligevægtslængde (L L ), er den største længde af musklen, hvor den ikke giver en passiv kraft. Musklens ligevægtslængde findes (fjern evt. stimuleringselektroden ): Musklen strammes ved at trækker stangen langsomt ud. Når strålen på oscilloskopet netop begynder at afbøjes fra 0-niveauet, har man nået musklens ligevægtslængde L L. Prøv det evt. et par gange. Stangen skrues fast, L L og den tilhørende stanglængde udenfor kammeret måles (med en skydelære) og noteres (måleskema D). Musklens aktive kraft måles: Stimuleringselektroden placeres igen. Løsn den forskydelige stang og skub den så langt ind, at musklen ved stimulering ikke yder en aktiv kraft (der kan dog stadig ses en bevægelse). Husk at skrue stangen fast igen. Stimulér musklen og mål tetanuskraften (den aktive kraft). Musklens længde øges nu trinvis med 2 mm intervaller (mål på stangen!) i området op til mindst 130% af L L ; de sammenhørende værdier for længde og kraft ("spænding") måles, idet den aktive kraft ved tetanisk stimulering måles som strålens maksimale afbøjning fra det øjeblikkelige hvileniveau. Hvor kort (i % af L L ) skal musklen være før en aktiv kraft ikke registreres? Samtidig måles musklens passive kraft: Ved muskellængder udover L L vil man iagttage, at strålen afbøjes fra det oprindelige 0-niveauet uden at musklen stimuleres, d. v. s. at musklen udøver en passiv kraft. Denne vil vise sig ikke at have nogen hel fast værdi, idet musklen udviser en vis grad af plasticitet. Musklens passive kraft noteres umiddelbart efter strækning (passiv I) og en fast tid senere, f eks. l/2 minut (passiv II). Værdier indføres i måleskema D. Måleskema D 9
Muskel 10 Længde-spændings relationen: Musklens ligevægtslængde, L L mm Stang længde Muskel længde Muskel længde mm mm % af L L Sensitivity Volts/ div mm svarer til en stanglængden udenfor kammeret på Passiv Kraft I antal div Kraft i N Passiv Kraft II antal div Kraft i N Aktiv + passiv kraft II antal div Kraft i N Aktiv kraft Kraft i N 10
Muskel 11 Tegn i samme diagram relationen mellem musklens længde (i % af ligevægtslængden L L ) og dens aktive og passive kræfter: Beskriv, hvorledes henholdsvis den passive og den aktive kraft varierer med musklens længde. Findes der en optimal længde for udviklingen af den aktive kraft? Sammenlign med længden i kroppen, L K Diskutér længde-spændingsrelationen på basis af forskydningsteorien (sliding-filament theory), d.v.s. gør rede for, hvorledes størrelsen af overlapzonen mellem de tykke og de tynde filamenter ændrer sig med musklens længde; og konkludér til slut, om forskydningsteorien kan forklare den fundne længde-spændingsrelation. Raportkrav: Måleresultaterne afleveres i skemaform, samt som grafiske afbildninger, hvor dette er ønsket. Princippet for den enkelte del-øvelse omtales kortfattet sammen med konklusionerne på grundlag af det eksperimentelle materiale. Besvarelserne af de til afsnittet hørende spørgsmål må gives, så de kan forstås uafhængigt af øvelsesvejledningen. 11
Muskel 12 BILAG 12
Muskel 13 BILAG l. Ringer-opløsninger (der er færdiglavet): Normal frø -Ringer: 115 mm NaCl, 3,5 mm KCl, 2,7 mm CaCl 2, l mm HPO - 4, 5 mm MOPS. ph 7.2. 2. Kortfattet instruktion i brugen af stimulatoren. Digitimer stimulator med ombygning, Når man ikke har apparatet foran sig under forberedelsen til øvelsen kan det være svært at forstå betjeningen, men har er i hvert fald nogle facts om apparaterne og deres brug, kan evt. bruges til opslag. Ved øvelsen bruges følgende funktioner: Enkeltimpuls: Impulstog: Mode: single, udløses med sort knap (manuelt) styrke (O/P) 0 - l 0 V (x l og x l 0) Mode: gate frekvens i toget: rate 3. Kortfattet instruktion i brugen af oscilloskopet. (numrene henviser til figuren næste side). 7 Trig: lampen blinker når oscilloskopet trigges udefra. 8 Bestemmer hvilken type signal der starter trigger impulsen 10 Time/div.: time base = Oscilloskopets hastighed. Time/div = antal sec/cm eller msec/cm 12 Ext.: extern trigning hvis ind. 13 At/norm: knap ind, oscilloskopet trigges kun udefra. 15 Trig. inp.: Input for trigger. En impuls udefra starter strålen. 30. Volts/div.: Sensitivity = Oscilloskopets følsomhed i Y-aksens retning. 33. Inv.: trykkes ind for at fa signalet til at vende rigtigt. 36. Stor.: (storage) billedet gemmes. 13
Muskel 14 38. Single: Et enkelt billede gemmes. 14