Mad og mikroorganismer

------------------------------------------------~ Mad og mikroorganismer Nr. 3 Indsamling af bakterier til antibiotikaresistensovervågning 1996

Indsamling af bakterier til antibiotikaresistensovervågning 1996 er udgivet som nr. 3 i serien Mad og mikroorganismer Veterinær- og Fødevaredirektoratet Ministeriet fol" Fødevarer, Landbrug og Fiskeri Janual' 1998 TSSN lll', 1397 5404 Veterinær- og Fødevaredirektoratet Mørkhøj Bygade 19 2860 Søborg

Samarbejdsprojekt om indsamling af bakterier til antibiotikaresistens overvågning 1996. Sammendrag Et samarbejdsprojekt om indsamling af indikatorbakterier til resistensovervågning af levnedsmidler blev iværksat i 1996 med deltagelse fra II kommunale levnedsmiddelkontrolenheder og Veterinær- og Fødevaredirektoratet. Samarbejdsprojektet skulle danne grundlag for indsamling af indikatorbakterier til den permanente overvågning af antibiotikaresistens hos bakterier i levnedsmidler. Denne rapport præsenterer resultaterne af det praktiske arbejde i forbindelse med fremskaffelse af bakterieisolater fra levnedsmidler. De resistensdata, som blev genereret på dette grundlag er tidligere blevet offentliggjort i rapporten "Antibiotikaforbrug og overvågning af resistens hos bakterier fra produktionsdyr, levnedsmidler og mennesker i Danmark". Samarbejdsprojektet fungerede tilfredsstillende og er i 1997 blevet efterfulgt af endnu et samarbejdsprojekt med deltagelse fra 21 LKE laboratorier. Introduktion I 1996 fik det daværende Levnedsmiddelstyrelsen, nu Veterinær- og Fødevaredirektoratet, til opgave at starte det nationale program til overvågning af antibiotikaresistens hos bakterier i levnedsmidler. Veterinær- og Fødevaredirektoratet udfører denne overvågning i samarbejde med Statens Serum Institut og Statens Veterinære Serumlaboratorium, der overvåger antibiotikaresistens i henholdsvis de humane og veterinære bakterier. Overvågningsprogrammet hedder DANMAP, (Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme) Veterinær- og Fødevaredirektoratet indbød på denne baggrund til et samarbejdsprojekt med de kommunale levnedsmiddelkontolenheder omkring indsamling af indikatorbakterierne, Escherichia eau og Enleracoccus faeciuml E. faecaus til overvågningsprogrammet. Eftersom der endnu ikke i andre lande foretages en systematisk overvågning af antibiotikaresistens hos bakterier fra levnedsmidler var der ikke noget erfaringsgrundlag, som man fra dansk side kunne trække på. Samarbejdsprojektet skulle derfor være med til at sikre, at den fremtidige indsamling af indikatorbakterier kom til at foregå på en hensigtsmæssig måde, samt at sikre at isolateme kom til at repræsentere et bredt udsnit af levnedsmidler. l

Efter invitation til samarbejde meldte der sig II interesserede levnedsmiddelkontrolenheder (se Appendix I). Et indledende møde mellem deltagerne blev aflloldt i august 1996, hvorunder den praktiske tilrettelægning af projektet blev drøftet. Der blev herefter opstillet en tidsplan for projektet (Se Appendix 2). Med hensyn til betaling blev det besluttet at prisen skulle være 100 kr pr. forsøgt isolation af indikatorbakrerier, uanset om dette resulterede i et isolat eller ej. Indsamlingen af isolater blev afsluttet den 30. november 1996 og resultaterne af resistensundersøgelserne blev offentliggjort i februar 1997 i rapporten: "Antibiotikaforbrug og overvågning af resistens hos bakterier fra produktionsdyr, levnedsmidler og mennesker i Danmark". Rapporten blev udsendt til alle levnedsmiddelkontrolenheder ved udgivelsen. Ekstra eksemplarer kan bestilles ved henvendelse til Dansk Zoonosecenter. Formål Før starten af samarbejdsprojektet blev der opstillet følgende formål for projektet: - at opnå erfaring med isolering og håndtering af et forholdsvist stort antal isolater. - at foretage en vægtning af de forskellige levnedsmiddeltyper hvorfra bakterierne isoleres. - at implementere arbejdsrutiner vedrørende resistensbestemmelser ved VFD, herunder modtagelse af prøver, identifikation, resistensbestenunelse, registrering af resultater og kontrolprocedtrrer. - at få arbejdsrutiner i isolering samt forsendelse af isolater til overvågningen indført som rutine hos LKE laboratorierne. - at bedømme ressotrrce- og tidsforbruget til de enkelte opgaver: isolering, identifikation, forsendelse og resistensbestemmelse. - at opnå samarbejdserfaring og finde den optimale fordeling af arbejde mellem VFD og LKE laboratorierne. - at finde frem til en opdeling af levnedsmidler i forskellige hovedgrupper. - at identificere kritiske plmkter i overvågningen. 2

Prøveudtagning Arbejdet for de deltagende LKE laboratorier bestod i at isolere indikatorbakterier fra forskellige levnedsmiddeltyper efter nænnere angivne isolationsprocedurer. Den efterfølgende resistensbestemmelse foregik ved Veter.inær- og Fødevaredirektoratet I løbet af projektperioden var målet at isolere 350 E. coli og 350 enterokokker fra udvalgte levnedsmidler, fordelt med 50 isolater af hver art på hver af 7 levnedsmiddelkategorier. På basis af nedenstående prøvetagningsplan blev hver af de deltagende laboratorier bedt om i gennemsnit at indsamle ca. 50 isolater. Plan for indsamling afisolater til samarbejdsprojektet 1996 LKE okse- svme- fjerkræ/ mælke fisk frugt! andet kød kød æg -prod. grønt Thisted 5/5*) 5/5 4/4 10/10 O O OD) Vejle 5/5 5/5 4/4 O O 2/2 2/2 Ringsted 5/5 5/5 4/4 O O 5/5 O Nykøbing 5/5 5/5 O O O 3/3 5/5 Odense 5/5 5/5 10/10 15/ 15 18/ 18 5/5 O Slagelse 5/5 5/5 5/5 4/4 IS/ IS 5/5 O Århus 5/5 5/5 10/10 IO/ IO 5/5 15115 O Bornhohn 5/5 5/5 O O O 4/4 2/2 Haderslev 5/5 5/5 5/5 O 6/6 6/6 O Hillerød 5/5 5/5 5/5 10/10 O 2/2 O København 5/5 5/5 IO/ IO 10/10 20/20 10110 O antal 55/55 55/55 57/57 59/59 64/64 57/57 9/9 isolater 356/356 *) skal tolkes som 5 E. coli isolater og 5 fækale enterokok isolater D) I kategorien "andet" modtages endvidere udover det i tabeuen nævnte yderligere højst 4/4 isolater fra hver LKE. 3

. Metoder I det følgende beskrives kort de metoder, som blev anvendt til isolering af Escherichia coli og Enrerococcus Jaecalis og Enlerococcus JaeciulIl fra levnedsmidler med henblik på resistensbestenmlelse. Hovedprincip: Et levnedsmiddel, et E. coli og/eller et enterokok isola!. Metode til isolering af Esc"eric"ia coli: 5 g levnedsmiddel + 45 ml MacConkey bouillon eller Laktose-ttypton-Iawylsulfatbuillon. Inkubation nalten over ved 44 C Udsæd med stor øjepodennål til RVG agar, inkubation 24 timer ved 44 C. Aflæsning samt subkultur af suspekte kolonier til blodagar eller anden non-selektiv agar. For LKE laboratorieme var det valgfrit om man ville foretage verifikation. Ved VFD blev foretaget følgende verifikation: Præsumptive E. coli er indol positive, E. coli giver ++ved IMVC reaktioner. Det var valgfrit om man benyttede MacConkey- eller Lallrylslllfat-bollillon. Metode til isolering af Enterokokker: 5 g levnedsmiddel + 45 ml Azide Dextrose Bouillon (tilsendt af VFD). Inkubation nalten over ved 44 C Udsæd med stor øjepodennål til Slanetz agar, inkubation 2 døgn ved 44 C. Aflæsning samt subkultur af suspekte kolonier til blodagar evt. tilsat aesculin. For LKE laboratorierne var det valgfrit om man ville foretage verifikation. Ved VFD blev foretaget verifikation efter NMKL. 4

Medier: MacConkey bouillon: Som fonnuleret i NMKL metoden nr. 125, 3. udgave 1996 eller tilsvarende: Difco 0020-0 I -05, Merck No. 5396, Oxoid CM5a. Laktose-trypton-Iaurylsulfat-buil\on (LTLSB eller LST): Som fonm~eret i NMKL metoden nr. 125,3. udgave 1996 eller tilsvarende: Difco 0241-01-8, Merck No. 10266, Oxoid CM45 I RYG: Slanetz-Bartleyagar: NMKL-metoder: Som formuleret i NMKL metode nr. 125, 3. udgave 1996 eller tilsvarende: Difco 0012-01-5, Merck No. 1406, Oxoid CMI07. Som formuleret i NMKL 68, 2. udgave 1992 ener tilsvarende: Difco 0746-01-8, Merck No. 5289, Oxoid CM377. Fækale enterokokker: NMKL 68, 1992,2. udgave Fækale coli: NMKL nr. 125, 1996,3. udgave med de i cirkulæret angivne modifikationer. Resultater I. Indsamling af isolater På baggrund af prøvetagningsplanen blev der indsamlet bakterieisolater til resistensbestemmelse. Tabellerne C og D er oversigter over indsamlingsresultateme for E. cali og enterokokker. N udtrykker antallet af undersøgte prøver, mens n udtrykker antallet af positive prøver, der resulterede i et isolat. Swnmen af holdne isolater ligger for begge arter ganske tæt på det oprindeligt pl~agte mål, som var 350 isolater af hver art. For E. cali har det været svært at opnå det ønskede antal isolater fra mælkeprodukter, fisk og grønt og frugt, hvorimod især isolater fra oksekød er overrepræsenteret. Der er tydeligvis variation i, hvor bogstaveligt man har fulgt indsarnlingsplanen på de forskellige LKE laboratorierer. Enkelte laboratorier har ændret i planen efter mundtlig aftale med YFD. Det blev ikke nødvendigt at anvende levnedsmiddelkategorien "andet", idet langt størstedelen af de indsamlede isolater kwme henføres direkte til en af de 6 øvrige levnedslniddelkategorier. linegative prøver" De undersøgte prøver resulterede ikke alle i et bakterieisolat. Det var i forvejen forventet at sådarme "negative prøver" ville forekomme, især indenfor fiske- og grøntprøverne. Overordnet set er der intet negativt i, at E. cali og fækale enterokokker ikke optræder i aue 5

levnedsmiddeltyper. For den konkrete resistensovervågning betyder det imidlertid, at et større antal prøver skal undersøges for at kmllle generere et datamateriale af en passende størrelse. I lagkagediagrammeme på figm A og B er andelen af de "negative prøver" angivet med hvid farve. Præsumptive og verificerede isolater De præsmuptive isolater af E. coli og enterokokker blev verificeret hos VFD inden resistensbestemmelsen. lait 38 af de præsmuptive E. coli isolater og IO af de præsmnptive enterokok isolater viste sig at tilhøre andre bakteriearter. l lagkagediagranuuerne på figm A og B er andelen af de indsamlede isolater, der ikke kunne verificeres angivet med sort farve. Succes rater Succesrater er beregnet som n : N x 100 % og er således et udtryk for, hvor stor en andel de positive prøver udgør af det samlede antal undersøgte prøver. Som det fremgår at tabel C og D var der betydelige forskelle på succesraterne for de forskellige levnedsmiddelkategorier. Specielt hos E. coli er variationen i succesrater stor: fra 85% i oksekødsprøver og ned til 14% i prøver af grønt og frugt. II.Isolationsprocedurer Isolationsprocedurerne til indsamling af præsmnptive E. coli og Enlerococcus jaecalis / E. jaeciulil blev udarbejdet med henblik på at skulle give stor sandsynligbed for at finde isolater med mindst mulig arbejdsbelastning i LKE laboratorierne. Med udgangspunkt i de føromtalte succesrater skønnes det, at isolationsprocedurerne fimgerer tilfredsstillende. Hovedprincippet, at der fra en levnedsmiddelprøve isoleres et bakterieisolat af hver type, sikrer at datamaterialet repræsenterer tilfældigt udvalgte isolater. Arbejdsrutiner, håndtering og forsendelse Samarbejdsprojektet har gjort det muligt for VFD at indkøre arbejdsrutiner med hensyn til prøveregistrering, verifikation, resistensbestemmelse og dataopsamling. Håodteringen af de godt 700 bakterieisolater fra LKE laboratorierne har i det store hele fimgeret fint. Enkelte svage punkter bør dog fremhæves. Fremsendelsen af isolater til VFD er i visse tilfælde sket i meget store portioner, hvilket har givet flaskehalsproblemer i laboratoriet på VFD. Endvidere bør skemaer med oplysninger om de fremsendte isolater følge forsendelsen. Opdeling af levnedsmidler på kategorier Opdelingen af levnedsmidleme på forskellige hovedkategorier giver mulighed for at simplificere overvågningen for at kunne følge hovedtræk i resistensudviklingen. Yderligere informationer om råvarerne kunne opnås ved at trække på den levnedsmiddelmikrobiologiske database. Som forventet kunne der isoleres fækale enterokokker og E. coli fra de fleste af de rå levnedsmidler af animalsk oprindelse. l modsætning til kategorierne "oksekød" og "svinekød" rmrunede kategorien "fjerkræ" prøver fra mange forskellige fjerkræarter. 6

Eftersom overvågningen i 1996 viste, at bakterieisolaterne fra fjerkrækød var hyppigst bærere af resistens er der behov for at lulderdele denne kategori for at kunne indkredse resistensproblemet. Derfor vil der i 1997 blive indsamlet prøver fra to fjerkrækategorier: "slagtekyllinger" og "andet fjerkræ". III. Samarbejdserfaring og kommunikation Kommunikationen mellem samarbejdsparteme har primært bestået i skriftbgt materiale udsendt fra VFD samt telefonsamtaler. På det ufonneiie plan har konununikationen været god. Der har været en vis forsinkelse, når det drejede sig om at fa regninger fra LKE laboratorierne i tide. Af hensyn til økonomien er det vigtigt at datoer for afregning overholdes. Samarbejdsprojektet har været baseret på en åben dialog mellem VFD og LKE laboratorierne. På de afholdte fællesmøder er der blevet diskuteret såvel praktiske som teoretiske problemer og deres mulige løsning. Der er blevet etableret et godt samarbejde, hvor LKE laboratorierne med deres erfaringsgrundlag har ydet en væsentlig indsats til projektets gennemførelse. Arbejdsdelingen mellem LKE laboratorier og VFD har i praksis vist sig at fungere efter hensigten. Ved indkald til samarbejde om resistensovervågning i 1997 har IO af de II deltagende LKE laboratorier meldt sig på ny som deltagere sanunen med yderligere II LKE laboratorier. Dette må tages som udtryk for engagement og interesse i projektet. Konklusion Resistensovervågning af levnedsmidler er en nyskabelse fra danske side, som bar international bevågenhed. Det har således været en ny og væsentlig opgave at fa etableret et netværk til indsaniling af indikatorbakterier, der repræsenterer tilfældigt udvalgte levnedsmidler i Danmark. Samarbejdsprojektet med LKE laboratorierne har udgjort et udmærket grundlag for indsamlingen af indikatorbakterierne. Denne rapport er udarbejdet af en redaktionsgruppe bestående af Sigrid Andersen, Jeppe Boel, Flennning Boisen og Morten østergaard. Alle deltagere i samarbejdsprojektet takkes hermed for deres arbejdsindsats. 7

Oksekød Fisk Svinekød Frugt og grønt Fjerkræ Mælkeprodukter Figur A. Indsamlede præsumptive E. coli-isolater. Hver lagkage repræsenterer det samlede antal af undersøgte prøver, N. Et gråt felt repræsenterer andelen af fundne E. CDU isolater., n. Et hvidt felt repræsenterer andelen af negative prøver, hvorfra der ikke kunne isoleres E. cali. Et sort felt repræsenterer andelen af indsamlede isolater, der ikke var E. coli. De eksakte talværdier kan aflæses i Tabel C. 8

Svinekød Fisk Oksekød Fjerkræ Frugt og grønt Figur B. Indsamlede præsumptive enterokok-isolater. Hver lagkage repræsenterer antallet af undersøgte prøver, N. Et gråt felt repræsenterer andelen affundne Enterokok isolater, n. Et hvidt felt repræsenterer andelen af negative prøver, hvorfra der ikke kunne isoleres enterokokker. Et sort felt repræsenterer andelen af indsamlede præsumptive isojater, der ikke var enterokokker. De eksakte talværdier fremgår af Tabel D. 9

Tabel C. Indsamlede præsumptive E.coli-isolater i resistens samarbejdsprojekt 1996. Tabellen angiver antallet af E. coli-isolater, som hvert laboratorium har fimdet ved analyse af levnedsmiddelprøver. Hvor kun et tal er nævnt svarede antallet af fundne isolater til antallet af undersøgte prøver. Angivelsen "4 ud af 5" indikerer, at 4 ud af 5 undersøgte prøver resulterede i et isolat. En streg ( - ) indikerer at der ikke er taget prøver. LKE Oksekød SVinekød Fjerkræ Mælkeprod Ask Grønt og frugt Sum af N Sumafn Sum af negative prøver Hillerød 5 5 5 IO 2udaf8 33 21 6 Ringsted 4udaf5 8udaf11 5 - Oudaf5 26 Il 9 Amus 26 16 9 udaf 15 IO udaf 18 5 4udaf54 134 10 64 Bomho1m 5 6.. - II II O Vejle 8 8udaf9 5 - ludaf6 28 22 6 Odense 3udaf4 2 10udafll 3 udaf 14 4udafl - 38 22 16 Thisted IIudafl2 II udafl2 3 udaf IO 4 udaf IO - 44 29 15 Nykøbing 35udaf40 16udaf21. - - 61 51 IO Haderslev 5udafl0 5udafl0 5udaf8-5udafl 5udaf6 41 25 16 København.. 16 4 udaf 18 IOaf33 4 udaf 11 84 34 50 Slagelse 6udafl 2udaf5 9 udaf IO 1 udafll 4 af26 2udafll 16 24 52 n 104 13 51 21 23 16 332 244 N 122 91 85 81 18 113 516 ikkee coli 4 6 IO II 5 2 succesrate 85% 15% 61% 26% 29% 14% ------ 10

LKE Oksekød Svinekød Fjerkræ Mælkeprrxf. Ask Grønt og frugt SumafN Sumafn Sum af negative prøver Hillerød 5 5 5 IO 2 29 21 O Ringsted 2udaf4 12udafl5 Oudaf 5 2udaf5 29 16 IJ Arhus 5udaflO 6udaf8 9 ud af 20 10udaf J2 5udafl2 15udaf 48 130 50 80 Bomho1m 5 4. 9 9 O Vejle IO 8 4 6 28 28 O Odense 5 2 /I 6 udafl I 5udafl 36 29 1 Thisled 12udaflJ 12udaflJ Judaf 6 IOudafl4 46 J1 9 NykøbingF. 2Oudaf26 9udafl2. 38 29 9 Haderslev 5 5udaflO 5udaf 8 6udafl 1 J1 28 9 København.. 16 14udafl8 25udaf33 IOudafl1 84 65 19 Slagelse 9 5udaf6 8udafll 5udaf8 21udaf J1 8udafl4 65 62 2J n 16 68 60 55 83 48 J10 169 Tabel D. Indsamlede præsumptive Enterokok-isolater i resistens samarbejdsprojekt 1996 N 92 83 86 9J 96 99 549 ikke enlerokok 2 O I O 5 2 succesrate 8J% 83% 10% 59% 66% 48% Tabellen angiver antallet af enterokok-isolater, som hvert laboratorium har fundet ved analyse af levnedsmiddel prøver. Hvor kun et tal er nævnt svarede antallet af fundne isolater ti l antallet af undersøgte prøver. Angivelsen "2 ud af 4" indikerer, at 2 ud af 4 undersøgte prøver resulterede i et isolat. En streg ( - ) indi kerer at der ikke er taget prøver. 11

Appendix I Deltagerlisle, Samarbejdsprojekt 1996 Tlf: Uffe S. Mikkelsen 74526540 74525386 Levnedsmiddelkontrollen i Søndeljylland VS Ole Rømersvej 30 6100 Haderslev Tlf: Anne Rahbek 4226 1600 4226 1667 Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen Huginsvej 2 B 3400 Hillerød TIL Peter AnneVUlla Møller 312240 11 31 23 32 28 Levnedsmiddelkontrollen i København Aæsketorvet 75 1711 København V Tlf. : Finn Madsen 54855333 54822540 Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen for Lolland, Falster og Møn Tværgade2 Postboks 293 4800 Nykøbing F Tlf. : Flemming Boisen 655656 12 65565699 MLK Fyn VS Lille Tombjerg Vej 24 5220 Odense Sø Tlf. : Ditlev Svane 53617778 576703 83 Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen Set. Knudsgade 3 4100 Ringsted 12

Tlf. : Turid Smith 56952630 56911630 Bornholms Levnedsmiddelkontrol Thorkildsvej 2 3700 Rønne Tlf. : Mogens Gammel 53529900 5850 1528 Miljø- og Levnedsmiddelcentret Rugvænget 28 4200 Slagelse TIL Henrik Sørensen I Marius Olesen 9792 05 66 97924941 Miljø- og Levnedsmiddelkontrolenheden Ringvejen 34 7700 Thisted TIL Kirsten Sørensen 75822 199 75821517 LevnedsmiddelCenter Vejle US Dianavej 3 7100 Vejle TIL Erik DahmI Morten Østergaard 8944 33 22 8944 33 23 MLK ØstjyUand US Gøteborg Alle 1 8200 Århus N Tlf. : Jeppe Boel / Sigrid Andersen 33956000 33956001 Veterinær- og Fødevaredirektoratet Mørkhøj Bygade 19 2860 Søborg 13

Appendix 2 TIDSPLAN for samarbejdsprojekt 1996 om indsamling afindikatorbakterier til overvågning af antibiotikaresistens uge 33 uge 36 uge 37 uge 38 indledende møde afholdt, anvisninger udsendt mødereferat udsendes forberedelse i laboratorierne indsamlingen afindikatorisolater starter, indsendelse afisolater til VFD uge 39 uge 40 indsamlingsperiode uge41 uge 42 uge 43 uge 44 uge 45 uge 46 uge 47 uge 48 de sidste isolater indsendes til VFD VFD afslutter identifikationer og resistens~bestemmelserne opsamling af resistenstaj, databehandling afsluttende møde for samarbejdsprojelctet afrapportering 14