Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: +.0.5.599 Fax: +.0.5.570 Email: reagents@sanquin.nl Website: www.sanquinreagents.com M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 ELISA kit til kvantitativ påvisning af human IgG subklasser i serum (da) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL da Antistoffer imod Sort Buffer Kalibrator Konjugat Kontrol DIL GREEN HRP HUM HO MOU da Fortynding Grøn HRP Human Hydrogenperoxid Mus RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS da Rød Pladeforseglinger Beholdning Stop Subklasser Substrat WASH WELL YELLOW da Vask Brønde Gul Område ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M805 50 ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M809 0.5 ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS
da I. INDLEDNING Human IgG omfatter fire subklasser: IgG, IgG, IgG og IgG. IgGsubklassernes biokemiske egenskaber er blevet beskrevet uddybende (5). Forskellene mellem lggsubklasserne afspejles i adskillige biologisk vigtige funktioner som f.eks. genkendelse af antigener, komplementaktivering eller binding til cellernes overfladereceptorer. Mange undersøgelser har vist, at abnormiteter i lggsubklassernes serumniveauer kan associeres med forskellige sygdomstilstande. Især associationen med mangel på selektiv lggsubklasse med forøget modtagelighed for virus eller bakterieinfektioner, er til overflod blevet dokumenteret (,5). Lave IgG eller IgGserumniveauer er blevet rapporteret om patienter med periodisk tilbagevendende infektioner af de øvre og nedre luftveje. Andre har fundet en sammenhæng mellem meget lave lggserumkoncentrationer og periodisk tilbagevendende bihule og lungeinfektioner (). Abnormiteter i lggsubklassernes serumniveauer er også konstateret i forbindelse med autoimmunsygdomme, neurologiske sygdomme og ved HIVinfektioner (). II. TEKNISK PRINCIP PeliClass human subklasse ELISAkittet er en ELISAtest baseret på et 'sandwich'princip. Kittet indeholder strips med mikrobrønde, der er coatet med meget aktive monoklonale antistoffer, der hver er specifikke for en af de humane IgGsubklasser. Testprøver, kalibreringsog kontrolsera inkuberes i de pågældende brønde. Den IgGsubklasse, der skal bestemmes, vil bindes til den faste tilstandsform, og ikke bundet IgG fjernes ved en vaskeprocedure. Dernæst tilsættes et peroxidasekonjugeret ikkehumant IgG antiserum i hver brønd og ikke bundet konjugat fjernes ved en vaskeprocedure. Efter inkubationen med substratopløsningen (ABTS) og HO, stoppes reaktionen med en syrebuffer. Absorbansen af det grønfarvede reaktionsprodukt måles og koncentrationen af IgGsubklasser i testprøven beregnes og sammenholdes med værdierne på en referencekurve. IgGsubklasse kontrolserummet analyseres til at kontrollere gyldigheden af kalibreringskurverne og nøjagtigheden af IgGsubklasse bestemmelserne. IgGsubklasse niveauerne i kalibratore(r)n(e) blev bestemt ved hjælp af en kalibrator, der er afledt af WHO 7/97 referencepræparationen. Der er anvendt de anbefalede målværdier på 5,0 g/l til IgG,, g/l til IgG, 0, g/l til IgG og 0,5 g/l til IgG (7). III. OPBEVARELSE OG HOLDBARHED PeliClass human subklasse ELISAkittet skal opbevares opretstående mellem 8 C. Det kan anvendes inden udløbsdatoen, der er angivet på etiketten. Holdbarheden af alle komponenter er uge efter åbning, såfremt disse opbevares mellem 8 C. Transportbetingelserne kan afvige fra betingelserne for opbevarelse. IV. KITTETS INDHOLD Se tabellen i begyndelse af denne indlægsseddel. PeliClass human subklasse ELISAkittet indeholder reagenter nok til 8 test for hver subklasse, inklusive kalibratorer, kontroller og tomme reagenter. De monoklonale antistoffer er renset for vævnæringssubstrat ved hjælp af søjlekromatografi (ionbytning og affinitetskromatografi). Kalibratoren og kontrollen er flydende humansera. V. YDERLIGERE PÅKRÆVEDE MATERIALER Destilleret vand til fortynding af vaske, fortyndings og substratbuffere. Afpipetteringsudstyr til nøjagtig mængdedosering. En inkubator (7 ± C). En standard ELISAvasker eller en 500 ml sprøjteflaske af plast til automatisk eller manuel vask af stripsene. Et standard ELISAfotometer til absorbansmåling ved nm eller 05 nm. Linjeret logpapir. VI. HÅNDTERING AF TESTPRØVEN Kun serumprøver skal testes. Prøverne skal være så friske som mulig eller skal opbevares nedfrosset. Prøverne skal fortyndes manuelt inden brug (se VII TESTPROTOKOL). VII. TESTPROTOKOL Sørg for, at alle reagenter har stuetemperatur (85 C) og bland omhyggeligt. Undgå bobler eller skum. Det anbefales at teste alle prøver, kontroller og kalibratorfortyndinger i dobbeltbestemmelse.. MIKROTITER PLADE PeliClass human IgG subklasse ELISAkittet giver muligheden for at anvende delplader ved særlige lejligheder. Bestem hvor mange strips der er nødvendige til at teste det ønskede antal prøver, samt brønde, der er nødvendige til at køre kalibratorer, kontroller og tomme reagenter i dobbeltbestemmelse, inden plastposen åbnes. Fjern strips, der ikke vil blive brugt, fra pladerammen og læg dem tilbage i plastposen med tørremidlet og opbevar disse mellem 8 C.. TILBEREDNING AF BUFFERE Vaskebuffer: Tilbered vaskebufferen ved at tilsætte hele flasken med vaskebufferkoncentrat til 950 ml destilleret vand. Den fortyndte vaskebuffer skal opbevares mellem 8 C og er holdbar i uge. Bemærk: Den koncentrerede buffer kan indeholde saltkrystaller. Opvarm den koncentrerede buffer KORT til 7 C til at opløse krystallerne, før De tilbereder arbejdsbufferen. Fortyndingsbuffer: Beregn den nødvendige mængde fortyndingsbuffer (ca. ml ufortyndet buffer pr. strip med mikrobrønde) og tilbered en arbejdsopløsning ved at fortynde bufferen 0 gange i destilleret vand.
. TILBEREDNING AF KALIBRATOR OG KONTROLSERA For oplysninger om koncentrationer se Tabel og på den vedlagte informationsbrochure. Kalibrator: (Se tabel på den vedlagte informationsbrochure) Mærk et 0 ml glas med ':500' og otte ml glas med 'Kal til Kal8'. Afpipetter,99 ml fortyndingsbuffer i 0 ml glasset og tilsæt 0 µl kalibratorserum (første fortynding :500). Afpipetter,9 ml fortyndingsbuffer i glasset mærket med 'Kal' og,0 ml i glassene mærket med 'Kal Kal8'. Afpipetter 00 µl :500 fortyndet kalibrator i glasset Kal. Lav syv dobbelte seriefortyndinger fra dette glas ved at tilsætte,0 ml fra den forrige fortynding til det næste 'Cal' glas. Vælg for hver IgGsubklasse en serie med kalibratorfortyndinger: IgG :80.000 :.80.000 IgG, IgG og IgG :0.000 :0.000. Kontrol: Mærk et glas med :500 og to ml glas med :0.000 (til IgG,, ) henholdsvis :0.000 (til IgG). Afpipetter i glasset mærket med :500,99 ml fortyndingsbuffer og 0 µl kontrolserum. Afpipetter i glasset mærket med :0.000 885 µl fortyndingsbuffer og 5 µl :500 fortynding. Afpipetter i glasset mærket med :0.000 875 µl fortyndingsbuffer og 5 µl :0.000 fortynding. Forbered et ml glas med ml fortyndingsbuffer som tom reagent.. FORBEREDELSE AF PRØVER Fortynd testprøverne med fortyndingsbufferen i henhold til samme protokol som for kontrolserummet. Ved resultater, der er uden for de angivne områder (se tabel i den vedlagte informationsbrochure), skal testen gentages med en anden prøvefortynding. 5. FØRSTE VASK Vask de nødvendige mikrobrønde i pladerammen fire gange med vaskebufferen. Ved manuel vask fyldes brøndene helt (> 00 µl) med vaskebuffer og kasseres; proceduren skal gentages tre gange. Til sidst skal brøndene være fuldstændig tomme. Den følgende reagent skal tilsættes øjeblikkeligt; lad ikke brøndene stå og tørre i lange perioder.. FØRSTE INKUBATION Tilsæt 00 µl af de fortyndede kalibratorer, kontroller og tomme reagenter i de relevante brønde. Dæk pladen med den selvklæbende forsegling, ryst forsigtigt ved at banke mod mikrotiterpladens kant i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkuber time ved 7 C. Forbered den næste reagent til inkubation som beskrevet i punkt 8, lige før vasken. 7. ANDEN VASK Aspirer supernatanter fra brøndene og vask pladen som beskrevet i punkt 5. 8. INKUBATION MED HRPKONJUGERET ANTISTOF MOD HUMAN IgG Fortynd konjugatet :500 ved at afpipettere 0 µl konjugat i,97 ml fortyndingsbuffer. Fortynd konjugatet yderligere til: :000 ved at afpipettere, ml af :500 fortyndingen i,0 ml fortyndingsbuffer. :000 ved at afpipettere,0 ml af :500 fortyndingen i,0 ml fortyndingsbuffer. :000 ved at afpipettere,5 ml af :500 fortyndingen i,5 ml fortyndingsbuffer. Tilsæt: 00 µl af :500 fortyndingen til antiigg strips med mikrobrønde; 00 µl af :000 fortyndingen til antiigg strips med mikrobrønde; 00 µl af :000 fortyndingen til antiigg strips med mikrobrønde; 00 µl af :000 fortyndingen til antiigg strips med mikrobrønde; Dæk pladen med den selvklæbende forsegling, ryst forsigtigt ved at banke mod mikrotiterpladens kant i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkuber i time ved 7 C. Forbered den næste reagent til inkubation som beskrevet i punkt 0, lige før vasken. 9. TREDJE VASK Aspirer supernatanter fra brøndene og vask pladen som beskrevet i punkt 5. 0. INKUBATION MED ABTSSUBSTRAT Beregn mængden af substratopløsningen (der kræves ca. 0,9 ml pr. strip med mikrobrønde). Tilsæt ækvivalenterne af 00 µl brintoverilte stamopløsning og 00 µl ABTS stamopløsning til 0 ml substratbuffer med arbejdskoncentration ( ml substrat stamopløsning + 8 ml destilleret vand). Tilsæt 00 µl substratopløsning til alle brønde. Ryst forsigtigt ved at banke mod mikrotiterpladens kant i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkuber i 0 minutter ved stuetemperatur (85 C).. STOP ENZYMREAKTIONEN Tilsæt 50 µl stopopløsning til alle brønde.. AFLÆSNING AF PLADEN Aflæs pladen i løbet af time ved (fortrinsvis) eller 05 nm i et ELISAfotometer. VIII. RESULTATER OG FORTOLKNING AF DATA Noter absorbansen ved (fortrinsvis) eller 05 nm for hver brønd og beregn gennemsnittet af dobbelværdierne. For hver prøve skal duplikaterne ikke afvige mere en 5% fra gennemsnitsværdien. Testen skal gentages, hvis duplikaterne afviger mere. Plot gennemsnitsabsorbansen af kalibratorerne (yakse) ind mod den relaterede subklassekoncentration i ng/ml på linjeret logpapir og tegn en kurve, der passer bedst. IgGsubklassekoncentrationerne i kontrolserummet skal være inden for de(t) område(r), der er angivet i tabel på den vedlagte informationsbrochure. Interpoler den gennemsnitlige absorbansværdi for hver prøve på referencekurven. Testprøver, der viser en gennemsnitlig absorbans, der er uden for området af fortyndingerne på referencekurven, skal fortyndes passende. For at få en evaluering af IgG subklassekoncentrationen i en testprøve kan man sammenligne de fundne koncentrationer med de normale værdier for IgG subklasser (se X REFERENCEOMRÅDER). IX. TESTOMRÅDER Se Tabel i den vedlagte informationsbrochure for testområder, der er specifikke for kittet.
X. REFERENCEOMRÅDER Referenceområder (g/l) for IgGsubklasser i serumprøver taget fra raske europide individer (8). For andre befolkningsgrupper skal der refereres til særskilte referenceområder. Alder IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a SPECIFIKKE YDELSESKARAKTERISTIKKER Reproducerbarhed IgGsubklassekoncentration IgG IgG IgG IgG variation (%) i testen variation (%) mellem tester 7 7 b Sammenligning af PeliClass human IgGsubklasse kit og Mancini. IgG, IgG, IgG og IgG koncentrationerne i sera blev bestemt ved hjælp af en ELISAtest og sammenlignet med de tilsvarende værdier, der er fundet i Mancini. Følgende korrelationer blev oprettet: IgGsubklasse lineær regressionslinie korrelation IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Bemærk: De citerede værdier for testens specifikke ydelseskarakteristikker repræsenterer typiske resultater og skal ikke betragtes som specifikationer for dette kit. XII. BEGRÆNSNINGER. Brugeren skal være faguddannet og fortrolig med ELISAtester og testproceduren.. Udtalt hæmolyserede eller lipæmiske prøver skal ikke anvendes. Der kan opnås uventede resultater for prøver indeholdende reumatoid faktor, høje bilirubinniveauer eller andre cirkulerende immunkomplekser. Disse prøver bør analyseres ved hjælp af en anden metode.. Prøver, der er uden for området, f.eks. i tilfælde af paraproteiner, skal gentages med andre fortyndinger.. Hvis der konstateres et nedsat niveau af en af lggsubklasserne, kan dette aldrig tjene som en definitiv diagnose, men det skal snarere betragtes som tegn på en forstyrrelse af immunsystemet, der kræver yderligere diagnostisk undersøgelse. 5. Brug altid kontrolserummet til at kontrollere gyldigheden af kalibreringskurverne. Hvis kontrolserummet er uden for området, er resultaterne af testprøverne ikke pålidelige. Testen skal gentages.. Reagenter fra forskellige batcher må ikke ombyttes. 7. Rester af reagenter (f.eks. dødrum) må ikke blandes med indholdet af nyåbnede flasker. 8. Låg og flasker må ikke ombyttes. Låg skal skrues igen på de tilsvarende flasker. 9. Selvom de humane kalibrator og kontrolsera er blevet testet for markører af specifikke sygdomsoverførende stoffer i overensstemmelse med de gældende EUdirektiver om GMP, og disse var nonreaktive, skal alle komponenter af human oprindelse betragtes som potentielt smittefarlige. 0. Konserveringsstof: Thiomersal 0,00%.. Brug nye pladeforseglinger til hver inkubation/hvert fiksationstrin i ELISAtesten for at undgå krydskontaminering. Brug ikke aluminiumsfolie.. Brug engangspipettespidser for alle overførsler for at undgå krydskontaminering.. Hver gang kittet anvendes, skal der tilberedes friske fortyndinger af kalibratorer, konjugat og buffere.. Brug ikke andre reagenter og mikrotiter strips end dem, der følger med kittet. 5. Natriumazid gør HRP uvirksom; brug ikke opløsninger, der indeholder natriumazid, og tilsæt ikke natriumazid til de leverede buffere.. Bortskaffelse af affald skal ske i henhold til laboratoriets regulativer.
XIII. REFERENCER. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5