MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Luftvejsprøver REF 080-045

Til in-vitro-diagnostisk brug. Applied Biosystems 7500 Luftvejsprøver MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Luftvejsprøver REF 080-045 Tilsigtet anvendelse MycAssay Aspergillus er indiceret til brug af kvalificerede laboratoriemedarbejdere til kvalitativ påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ekstraheret fra respirationsprøver fra de nedre luftveje (f.eks. bronkiale prøver) som en hjælp for diagnosticering hos voksne patienter, som mistænkes at have Aspergillus-infektion eller - allergi. MycAssay Aspergillus er blevet godkendt til brug med Applied Biosystems 7500 (ved anvendelse af SDS softwareversion 1.4). Resumé og forklaring Aspergillus spp. er ubikvitære opportunistiske skimmelsvampe, der forårsager både allergiske og invasive syndromer Genusen omfatter ca. 300 arter, hvoraf 41 er blevet sat i forbindelse med menneskelige sygdomme. Majoriteten af infektioner forårsages af A. fumigatus, A. flavus, A. terreus og A. niger; i mindre almindelige tilfælde har, A. nidulans og andre sjældne arter, som f.eks. A. sydowii, A. versicolor, A. lentulus og A. pseudofischeri været impliceret 1. De fleste infektioner og allergier forårsaget af Aspergillus spp. påvirker luftvejene. Allergiske syndromer inkluderer allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA) og allergisk Aspergillus bihulebetændelse og forårsages normalt af A. fumigatus. Kronisk pulmonal aspergillose omfatter aspergillom, kronisk kaverne pulmonal aspergillose og kronisk fibrøs aspergillose. Invasiv aspergillose (IA) forekommer hos risiko-patientgrupper inklusive dem, der er behandlet med kortikosteroider og dem med neutropeni eller fagocytisk dysfunktion (dvs. kronisk granulomatøs sygdom og HIV-infektion). Omkring 80% af tilfældene af invasiv aspergillose involverer lungerne 2. Rutinediagnose af invasiv pulmonal aspergillose omfatter CT-scanning (Computed Tomography scanning), bronkoskopi og bronkoalveolær lavage (mikroskopi og podning), Aspergillus antigentest af blod, eller histologisk undersøgelse af kirurgiske biopsiprøver. I dette scenarie er podninger ofte fejlagtigt negative 3. Bronkoalveolær lavage er faktisk kun positiv ved podning i ca. 40% af tilfældene, selv når diagnosen er eftervist med andre metoder 4,5,6,7, hvilket viser den manglende sensitivitet af podning med hensyn til påvisning af invasiv aspergillose og kronisk pulmonal aspergillose. Imidlertid er podninger vigtige, hvis de er positive, fordi mange diagnostiske test ikke indikerer enten den genus eller de arter af fungus, der forårsager sygdommen, eller dispositionsprofilen af den afsondring, der forårsager infektion. Allergisk bronkopulmonal aspergillose giver komplikationer ved astma og cystisk fibrose 8 og viser sig sjældent uden underliggende sygdomme. De fleste tilfælde er associerede med A. fumigatus, i visse tilfælde med andre implicerede fungi. Sygdommens karakteristika er episodisk obstruktiv lungesygdom med sejt opspyt fuldt af Aspergillus hyfe, total serumværdi IgE >1.000 IU/mL og påviselige A. fumigatus-specifikke IgE og IgG antistoffer eller en positiv Aspergillus priktest. Opspytpodninger kan være positive for A. fumigatus og bronkietasi ses eventuelt på en CT-scanning af brystkassen. Aktuelle metoder til diagnosticering af kronisk pulmonal aspergillose er en blanding af radiologi (som ikke er specifik) 9 og serologi (Aspergillus IgG antistoffer eller præcipitiner) som er positive ved de fleste former for aspergillose (og derfor ikke specifikke for nogen bestem manifestation af aspergillose) 1. Podninger er kun positive i 40-65% af de tilfælde, der er påvist ved radiologi og serologi 10,11. Da differentialdiagnosen er omfattende og inkluderer tuberkulose, atypisk mykobakteriose, sarkoidose, histoplasmose, coccidioidomykose, pneumokoniose, reumatoid lunge, Bechterew's sygdom og andre, er 1 Species Database i www.aspergillus.org.uk 2 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp. Medical Mycology: 43 (suppl. 1): S207-38. 3 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infectious Diseases: 9: 609-22. 4 Levy H, Horak DA, Tegtmeier BR, Yokota SB, Forman SJ. (1992). The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Respir Med: 86: 243-8. 5 Greub G and Bille J. (1998) Aspergillus species isolated from clinical specimens: suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance. Clin Microbiol Infect 4: 710-716. 6 Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L,Chapman SW, Morrison VA, Pappas P, Hiemenz JW, Stevens DA, and the Mycoses Study Group. (2001). The impact of culture isolation of Aspergillus species: A hospital-based survey of Aspergillosis. Clinical Infectious Diseases; 33:1824 33. 7 Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, Verbeken E, Verschakelen J, Boogaerts M. (2002). Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases. 186:1297 306. 8 Tillie-Leblond I, Tonnel AB. (2005). Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy: 60: 1004-13. 9 Greene R. (2005). The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis. Med Mycol: 43 (Suppl 1): S147-54. 10 Denning DW, Riniotis K, Dobrashian R, Sambatakou H. (2003). Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis: Case series, proposed nomenclature and review. Clin Infect Dis: 37 (Suppl 3): S265-80. 11 Camuset J, Lavolé A, Wislez M, Khalil A, Bellocq A, Bazelly B, Mayaud C, Cadranel J. (2007). Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non-immunocompromised patient. Rev Pneumol Clin. 63:155-166. Dansk 1

dokumentation af tilstedeværelsen af Aspergillus spp. i respirationsprøver vigtig for at forhindre forsinkelse af erkendelsen af pulmonal aspergillose og forkert behandling. MycAssay Aspergillus er et molekylært diagnosesæt til påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ved hjælp af Molecular Beacon 12 Real-Time PCR teknologi. Hele testprocedure, inklusive udtrækning af DNA fra den kliniske prøve, kan gennemføres i løbet af 4 timer, sammenlignet med svampepodning, hvor det kan tage flere dage at producere positive resultater. Denne analyse giver fordele i forhold til de aktuelt tilgængelige diagnosemetoder for akut invasiv og kronisk pulmonal aspergillose. Disse fordele omfatter hurtigere påvisning af Aspergillus spp. og muligheden for forøget sensitivitet overfor Aspergillus spp. hos kraftigt immunsvækkede patienter, som mistænkes at have invasiv pulmonal aspergillose. Procedurens principper Efter blanding af reagenserne i MycAssay Aspergillus-sættet med en prøve, der indeholder den ønskede Aspergillus DNA-sekvens (en del af Aspergillus ribosomal 18S genet), vil thermocycling resultere i DNA-amplifikation. Analysen indeholder også en Internal Amplification Control (IAC), et DNA-fragment der ikke findes i Aspergillus, andre fungale, bakterielle eller humane genomer, for at påvise PCR-hæmmende substancer og bekræfte funktionen af testreagenserne. De amplificerede DNA-mål påvises ved hjælp af Molecular Beacon teknologi. Molecular Beacons er enkeltstrengede oligonucleotid hybridiseringsprober, som danner en trin-og-spiral struktur. Spiralen indeholder en probesekvens, som er komplementær til en målsekvens, og trinnet dannes af adouceringen af komplementære armsekvenser, som er placeret på hver side af probesekvensen. En fluorofor, som fluorescerer når den exciteres med lys med den passende bølgelængde, er kovalent bundet til enden af én arm og en slukker, som undertrykker fluorescensen af fluoroforen ved tæt fysisk nærhed, er kovalent bundet til enden af den anden arm. Molecular beacons fluorescerer ikke, når de befinder sig frit i opløsningen. Imidlertid, når de hybridiserer til en nukleinsyrestreng, der indeholder en målsekvens, undergår de en konformationsændring, som fysisk adskiller flouroforen og slukkeren og gør dem i stand til at fluorescere ved excitation. Mængden af fluorescens ved en hvilken som helst given cyklus, eller efter gennemført cyklus, afhænger af mængden af tilstedeværende specifikke amplicons på det pågældende tidspunkt. Real-Time PCR systemet monitorerer samtidigt fluorescensen, der udsendes af hver beacon. Forholdsregler Sættet er udelukkende beregnet til at blive anvendt af professionelle laboratoriemedarbejdere. Der kræves procedurer til non-aerosol manipulation af prøver. Standardforholdsregler og institutionsretningslinjer skal følges ved enhver håndtering af alle prøver. Et materialesikkerhedsdatablad kan fås hos Myconostica Ltd. Denne test er udelukkende beregnet til in vitro diagnostisk anvendelse. Denne test er udelukkende beregnet til brug med Applied Biosystems 7500 med SDS softwareversion 1.4. Brug ikke reagenser eller ler, hvis de beskyttende poser er åbne eller gået i stykker ved modtagelsen. Reagenser og ler kan ikke ombyttes imellem sæt med forskellige partinumre. Hæld aldrig reagenser eller ler sammen fra forskellige glas, selvom de er fra samme parti. Anvend aldrig reagenser eller ler efter deres udløbsdato. Reagenser og ler må ikke genfryses eller genanvendes efter åbning. Bær beskyttelsesbeklædning og engangshandsker ved håndtering af sættets reagenser. Undgå mikrobiel- og deoxyribonuklease (DNase)-kontaminering af reagenser ved fjernelse af alikvoter fra glas. Det anbefales at bruge sterile, DNase-fri, lav-retentions engangs filter-spidser eller positive fortrængningspipettespidser. Brug en ny spids til hver prøve eller reagens. Bortskaf ubrugte reagenser og affald i overensstemmelse med gældende nationale og lokale love og forskrifter. For at undgå kontaminering med Aspergillus eller IAC-amplicons må reaktionsglassene ikke åbnes efter amplifikation. Der kan eventuelt testes yderligere ler i overensstemmelse med vejledninger fra nationale, lokale eller akkrediterende organisationer. Det er forbudt at spise, drikke eller ryge i områder, hvor prøver eller sættets reagenser håndteres. Lave koncentrationer af DNA kan være ustabile ved ukorrekt opbevaring. Det anbefales, at udtrækninger af DNA fra kliniske prøver opbevares ved -80 o C for at bevare deres integritet. Desuden skal gentagne optøninger og genfrysninger altid undgås, når det er muligt. Dette sæt blev godkendt ved brug af 0,2 ml 96-brønds semi-skørt PVR-plader med optisk selvklæbende film (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971). Anvendelse af andre kilder/typer af plastik kan ugyldiggøre 12 Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308. Dansk 2

grænseværdierne og derfor også de påstande, der er angivet i brugsanvisningen. Hvis der anvendes en alternativ kilde anbefales det at gennemføre en lokal validering med de positive og negative -reaktioner. Sættets indhold Beskrivelse Sættet består af fem forseglede 3-rums folieposer, som hver kan tages ud af boksen og anvendes separat. Hver pose indeholder tilstrækkelig reagens til 8 reaktioner. Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (grøn hætte) Glas 3 (klar kætte) Glas 4 (sort hætte) dntps MgCl 2 Bufferet opløsning af DNA polymerase complex <0,01% primere <0,01% Molecular Beacons <0,0001% Internal Amplification Control (IAC) Internal Amplification Control er et rekombinant DNA-plasmid, der indeholder en ikke-infektiøs sekvens uden relation til målsekvensen (Aspergillus) Tris-HCl buffer Negativ Vand Positiv <0,0001% positiv DNA Det positive molekyle er et rekombinant plasmid, der indeholder Aspergillusmålsekvensen Tris-HCl buffer Volumen 66 µl 66 µl 25 µl 25 µl Sættet indeholder desuden: - MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol CD-ROM - Brugsanvisning - Analysecertifikat Dansk 3

Opbevaring Sættet skal opbevares i frossen tilstand (-15 til -25 C) indtil udløbsdatoen, der er angivet på etiketten på sættets boks. Derefter skal det kasseres og bortskaffes ifølge lokale forskrifter. Når en pose er blevet åbnet, skal dens indhold anvendes straks og må ikke genfryses eller genanvendes på et senere tidspunkt. Nødvendigt udstyr/materiale (medfølger ikke) A. Nødvendigt udstyr Applied Biosystems Real-Time PCR System (inklusive brugervejledning, tilsluttet computer og SDS softwareversion 1.4) 96-brønds kantplader med skørt/hævet og forseglingsfilm i optisk kvalitet (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971). Stativ til 96-brøndsplade Centrifuge udstyret med holdere til 96-brøndsplader B. Nødvendigt almindeligt udstyr Mikrocentrifuge Vortex mixer Mikropipetter (nødvendigt volumen 7,5 µl 20 µl) Sterile lav-retentions filterspidser Engangshandsker, uden pudder Mønsterbeskyttet DNA-dekontamineringsopløsning Permanent markeringspen DNA-isolationssæt (se nedenfor) Prøve Prøven til MycAssay Aspergillus analyse er totalt genomisk DNA ekstraheret fra klinisk BAL og andre prøver fra de nedre luftveje. Det anbefales at anvende følgende isolationssæt og udstyr, der også blev anvendt ved valideringen, til dette formål: - MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt (REF: 080-005, kan fås hos Myconostica) - Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA) - Vortex Adaptor Plate (REF: 080-015, kan fås hos Myconostica) Dansk 4

Bemærkninger til proceduren Læs hele protokollen inden arbejdet påbegyndes. Hele MycAssay Aspergillus processen (eksklusive DNA-ekstraktion) tager ca. 2 timer, afhængigt af antallet af testede prøver. Opsætning af testen skal udføres i en PCR-arbejdsstation eller et pre-pcr laboratorium. Hvis en PCR-arbejdsstation ikke er tilgængelig, skal testen opsættes i et dertil beregnet område af laboratoriet 13, adskilt fra områder der bruges til DNA-ekstraktion, som regelmæssigt rengøres med DNA-dekontamineringsreagenser. Det skal imidlertid undgås at anvende DNA-dekontamineringsreagenser ved opsætning af Real-Time PCR, da de kan hæmme analysen. Brug mikropipetter til overføring af væsker. Mikropipetter, der kun er beregnet til dette formål, skal bruges til opsætning af disse reaktioner og de skal regelmæssigt dekontamineres. Det anbefales at anvende lav-retentions filterspidser for at sikre, at der ikke mistes noget DNA under opsætningsproceduren. Udvis forsigtighed ved håndtering af glas 4. Dette indeholder DNA-materiale til positiv og kontaminering kan medføre forkerte positive testresultater. Bær altid handsker. Alle reagensglas skal forsynes med hætte efter brug og inden bortskaffelse. Sørg for at notere prøvernes nøjagtige position i 96-brøndspladen på en plade-tegning. Anvendelsesprocedure: 1. Opsætning af Real-Time PCR 1.1 Tænd først for Real-Time PCR systemet (instrument og tilhørende computer) og start den relevante software. Indtast brugernavn og password. 1.2 Kontrollér at arbejdsområdet er blevet rengjort med DNA-dekontamineringsreagenser og at det er helt tørt; undgå brugen under analyse-opsætning, da resterende rengøringsopløsning kan hæmme PCR-reaktionerne. 1.3 En pose indeholder én af hver af Glas 1, Glas 2, Glas 3 og Glas 4. Der er tilstrækkelig mængde reagenser i én pose til gennemføre 8 reaktioner. Der skal udføres mindst én positiv - og én negativ -reaktion pr. kørsel, hvor reagenserne er fra et enkelt sæt. Derfor kan én pose analysere 6 patientprøver. Hvis der skal testes mere end 6 prøver, kan der bruges mere end én pose, hvis de anvendte poser er fra samme sæt-parti. Der kan testes maskisimalt 38 patientprøver med de 5 poser i sættet. 1.4 Beregn antallet af nødvendige reaktioner med reference til nedenstående tabel: Antal af poser Maksimalt antal af patientprøver 1 6 2 14 3 22 4 30 5 38 1.5 Tag det passende antal poser ud af fryseren. Brug aldrig en pose, der ikke længere er forseglet, Tag også patientprøverne ud af fryseren, hvis de blev frosset efter ekstraktionen. 1.6 Åbn det nødvendige antal poser og tag glassene ud. Hvis der anvendes mere end én pose, men der kun gennemføres ét sæt positive og negative ler, er det kun nødvendigt at tage glas 3 og 4 ud af den ene pose. Udvis forsigtighed ved håndtering af glas 4. Dette indeholder DNA-materiale til positiv og kontaminering kan medføre forkerte positive testresultater. 1.7 Lad glassenes indhold tø op ved at anbringe dem på laboratoriebænken i 5-10 minutter og sikre, at indholdet af hvert glas er helt optøet inden der fortsættes. Bland glassenes indhold og patientprøverne med Vortex mixer; centrifugér dem derefter kort i en mikrocentrifuge for at sikre samling af alt indholdet i glassenes bund inden anvendelse. 1.8 Anbring 96-brøndspladen i et stativ. Pas på, at du kun berører kanten på pladen med hænderne 13 Se f.eks. Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. (eds. Dieffenbach og Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. Dansk 5

1.9 Opsæt altid først den negative og derefter patientprøverne. Den positive skal altid opsættes til sidst. 1.10 Reagens- og DNA-voluminer vises i nedenstående tabel: Reagens Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (grøn hætte) Negativ Reaktion Patient prøve Positiv 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 3 (klar hætte) 10 µl - - Patientprøve - 10 µl - Glas 4 (sort hætte) - - 10 µl Totalt volumen 25 µl 25 µl 25 µl 1.11 Tilføj reagenser i den rækkefølge, der er vist i ovenstående tabel; glas 1, derefter glas 2, fulgt af skabelonen (negativ, patientprøve, eller positiv ). Vær forsigtig ved udtagning af alikvoter fra glas 1; væsken er en smule viskøs og kan klæbe til glasset indvendige rand. Hvis dette sker, skal det køre igen i centrifugen for at samle den endelige indhold i bunden af glasset, inden det forsøges at fjerne de endelige alikvoter. 1.12 Brug en ny pipettespids til hver væskeoverføring. Sæt hætten på hvert reagensglas igen efter brug og kassér det straks sammen det resterende indhold i en lukket beholder til klinisk affald. Ubrugte reagenser kan ikke gemmes til senere brug. 1.13 Vær især forsigtig ved udtagning af væsken med pipette fra glas 4 (DNA til positiv ) for at sikre, at den ikke kontaminerer andre reaktionsglas. Ved at lukke lågene på de andre reaktionsglas inden åbning af glas 4 reduceres risikoen for krydskontaminering. 1.14 Notér positionen af hver prøve i pladen på en plade-tegning. Forsegl forsigtigt og omhyggeligt pladen med forseglingsfilmen i optisk kvalitet, idet det sikres, at kanterne sidder fast nedad. Lad pladen centrifugere ned i en centrifuge ved 900 g i 1 minut. Kontrollér, at der ikke er nogen bobler i bunden af brøndene. Hvis der er, skal centrifugeringen gentages. 1.15 Gå straks videre til afsnit 2. reaktioner er stabile på bænken i op til 60 minutter. 1.16 Efter PCR-opsætningen skal det sikres, at arbejdsområdet rengøres omhyggeligt med DNAdekontamineringsreagenser. Dansk 6

2. Gennemførelse af kørslen (run) 2.1 Åbn AB 7500 SDS software version 1.4 og indtast brugernavn og password. 2.2 Indsæt MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol CD-ROM'en. 2.3 Vælg det første punkt; Create New Document... i Quick Startup menuen; 2.4 Vælg de nedenfor viste indstillinger. Vælg skabelonen MycAssay Aspergillus v1_2.sdt fra CD-ROM'en via Browse... 2.5 Giv kørslen et passende Plate Name (pladenavn). Et eksempel er vist nedenfor: 2.6 Klik på Finish. Et nyt dokument vil åbne, som indeholder PCR parametrene og de detektorer, der automatisk er indstillet til denne analyse. I Plate-visningen under fanen Setup, brug Well Inspector (vælg en brønd og tryk på Ctrl+1 eller højreklik med musen) for at navngive brøndene i overensstemmelse med positionerne for prøverne i 1.12. For eksempel: 2.7 Når alle brøndene er navngivet korrekt, gemmes kørslen idet Plate Name (pladens navn) bruges som filnavn. 2.8 Start kørslen under fanen Instrument ved at klikke på Start-knappen. 2.9 For at angive hvor lang tid kørslen vil tage, vises der en nedtælling ved siden af Start-knappen. Dansk 7

3. Dataanalyse og fortolkning 3.1 Klik på den grønne pil på den øverste menubjælke for at opdatere, når kørslen er afsluttet. 3.2 Åbn visningen Amplification Plot under fanen Result. Indstil i højre side grænseværdierne for hver kanal som følger: Asp MycAssay = 12000 IAC MycAssay = 4000 Manual Baseline skal forblive på 3-15 for begge detektorer. 3.3 Klik på knappen Analyze for at aktivere disse ændringer. For eksempel: 3.4 Gem ændringerne. 3.5 Vælg de brønde, der indeholder prøver, og eksportér rapportfilen File>Export>Results... som vist nedenfor: 3.6 For undgå forvirring skal du gemme filen med samme navn, som blev brugt til selve kørselsfilen Husk at gemme filen på et passende sted. 3.7 Aktivér Export only selected wells, når du bliver bedt om det, og klik på OK. 3.8 Åbn den gemte.csv-fil med Excel eller et lignende regnearksprogram. 3.9 Analysér hver prøve ved at starte med lerne, som vist i nedenstående diagram (detaljer findes også i tabellen under diagrammet): Dansk 8

NEJ Kontrollér den negative Er ASP MycAssay Ct 37,0 eller udetekteret? JA Kørsel er kontamineret HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den negative Er IAC MycAssay Ct 27,7-31,9? Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen JA Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den positive Er ASP MycAssay Ct 15,0-20,0? JA Positiv for Aspergillus DNA HANDLING: Rapportér resultat 2 JA Kontrollér patientprøven Er ASP MycAssay Ct 33,5? NEJ Negativ for Aspergillus DNA HANDLING: Rapportér resultat 1 JA Kontrollér patientprøven Er IAC MycAssay Ct 27,7-31,9? NEJ IAC-fejl HANDLING: Gentag prøve. Hvis samme resultat igen; Rapportér resultat 3 Prøve Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv ASP MycAssay Ct 37,0 eller upåvist 37,0 eller upåvist IAC MycAssay Ct Inden for 27,7-31,9 <37.0 Inden for 27,7-31,9 Inden for 15,0- N/A 20,0 <15,0 eller N/A >20,0 Patient >33.5 Inden for 27,7-31,9 Fortolkning Negativ acceptabel <27,7 eller >31,9 Fejl i negativ Kontaminering Positiv acceptabel Fejl i positiv Negativ for Aspergillus ved CCO* Patient 33.5 N/A Positiv for Aspergillus ved CCO* Patient 37,0 eller upåvist Yderligere handling Patientresultater er gyldige Gentag hele kørslen Gentag hele kørslen Patientresultater er gyldige Gentag hele kørslen Rapporter resultat: Resultat 1 Rapporter resultat: Resultat 2 <27,7 eller >31,9 IAC fejl i prøve Gentag prøve: Resultat 3 *CCO = clinical cut-off. Alle resultater på eller under dette niveau betragtes som klinisk positive. Andre prøver rapporterer eventuelt Ct-værdier >33,5, men disse afspejler normale eller baggrundsniveauer af Aspergillusindholdet i luftvejsprøven. Se klinisk rapport (resultat 1, 2 eller 3) Dansk 9

4. Fejlfinding 4.1 Den negative har genereret et positivt signal i FAM-kanalen: Der opstod kontaminering under opsætningen. Resultater fra hele kørslen er ikke pålidelige og kan ikke betragtes som nøjagtige. Gentag hele kørslen og vær meget omhyggelig ved tilføjelse af skabelonerne, især den positive (glas 4), for at sikre, at der ikke sker krydskontaminering. Kontrollér at arbejdsområdet og instrumenterne bliver korrekt dekontamineret før og efter brug. Den negative var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at brøndene forsynes korrekt med noter i programmet. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Grænseværdier er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede 0,2 ml 96-brønds semi-skørt PCR-plader med optisk selvklæbende film (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971). 4.2 Den negative IAC Ct-værdi ligger ikke inden for det acceptable område: PCR er blevet hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Reagens fra enten glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til PCR-reaktionen, eller der blev tilsat den dobbelte mængde fra glas 2. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis væskeniveauet er højere eller lavere i én brønd i forhold til andre. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Grænseværdier er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede 0,2 ml 96-brønds semi-skørt PCR-plader med optisk selvklæbende film (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971). 4.3 Den positive er negativ: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Der opstod en fejl under trin 1.12 og den positive skabelon (glas 4) blev anbragt i det forkerte reaktionsglas. Gentag kørslen idet der udvises stor forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis der er højere væskeniveau i et reaktionsglas og et lavere niveau i et andet, i forhold til normalt niveau. Reagensen fra enten glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til reaktionen. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis der er lavere væskeniveau i denne brønd sammenlignet med andre. Den positive var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at brøndene forsynes korrekt med noter i programmet. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Grænseværdier er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede 0,2 ml 96-brønds semi-skørt PCR-plader med optisk selvklæbende film (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971). 4.4 Patientprøve(r) giver Resultat 3 - Invalid (ugyldig): Det er sandsynligt, at den/de ekstraherede kliniske prøve(r) indeholder PCR-hæmmere. Vi anbefaler, at DNA fra kliniske prøver ekstraheres ved hjælp af MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt. Dansk 10

4.5 Der findes ingen resultater for nogen kanal med nogen prøver eller ler: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Det anvendte udstyr fungerer ikke optimalt. Kontrollér, at dit Real-Time PCR-instrument er blevet serviceret korrekt og er up-to-date, samt at det er blevet fuldt kalibreret som beskrevet i denne installations- og vedligeholdelsesvejledning. Der blev brugt en ukorrekt protokolfil under opsætning af softwaren. Referér venligst til afsnit 2 og vælg den korrekte protokolfil, som specificeret for hver softwaretype/-version, fra Myconostica Protocol CD-ROM'en. Det er kun muligt at finde den fil, der passer til softwaren. Gentag kørslen ved hjælp af den korrekte protokolfil. Hvis du har yderligere spørgsmål, eller hvis du erfarer problemer, bedes du kontakte vores Technical Support (productsupport@lab21.com) Dansk 11

Præstationskarakteristika og -begrænsninger AB7500 analysepræstationsdata Sættet blev først valideret ved anvendelse af Cepheid SmartCycler. Visse af analysepræstationskravene blev genvalideret på AB7500 platformen ved anvendelse af 0,2 ml 96-brønds semi-skørt PCR-plader med optisk selvklæbende film (Star Lab Cat # E1403-8200 og Applied Biosystems Cat # 4311971) og er angivet nedenfor. Hvor det ikke blev forventet, at forskellene mellem platformene ville påvirke præstationen af analysen, og derfor kravet, blev undersøgelsen ikke gentaget. Disse resultater, der er opnået ved brug af SmartCycler, forudsættes at kunne overføres til AB7500-platformen. Ananlytisk sensitivitet Ved hjælp af den ovenfor beskrevne AB7500 protokol og PCR-skabeloner genereret hos Myconostica, blev LoB for MycAssay Aspergillus bestemt til at være en Ct-værdi på 37,0, mens LoD blev bestemt til at være <25 kopier af mål- DNA ved hjælp af AF293-stammen af A. fumigatus. Analytisk selektivitet Genomisk DNA ekstraheret fra Penicillium spp. genererer også positive resultater. Dette skyldes det faktum, at sekvenserne af de molekylære mål i stor udstrækning bevares mellem Aspergillus og Penicillium. Det skal derfor bemærkes, at et positivt resultat med denne analyse kan være et resultat af infektion med Penicillium, i stedet for Aspergillus. Analytisk selektivitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra flere forskellige fungale og ikke-fungale arter. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiosperinu, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatu. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende bakteriearter; Bordetella pertussi, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumonia, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, S. pyogenes, S. salivarius. Humant genomisk DNA giver ikke et positive resultat med denne analyse. De følgende 3 fungale arter blev ikke testet på AB7500-systemet, men var blevet testet på SmartCycler : Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum og Alternaria alternata. Alle 3 gav negative resultater med analysen. Reproducerbarhed og repeterbarhed Repeterbarheden og reproducerbarheden blev bestemt af 4 forskellige operatører, der testede et panel af 7 forskellige skabeloner, i tre eksemplarer, ved i alt 168 analyser. Der blev gennemført eksperimenter ved hjælp af 1 fremstillet portion af sæt, på 2 forskellige instrumenter, der var placeret 2 steder i Storbritannien. Resultaterne blev analyseret i forhold til Limit of Blank (LoB) og clinical cut-off (CCO). Ved en koncentration på 3 gange Limit of Detection (LoD), var resultaterne fra 100% af alle testede prøver overensstemmende (positive) for LoB, og 83% af prøverne var positive ved CCO. Ved koncentrationer højere end 3 x LoD var resultaterne fra 100% af alle prøver positive ved både CCO og LoB. For negative skabeloner var alle testede prøver negative ved CCO. Overførsel af Clinical Cut-Off Clinical cut-off-værdien på 36,0 var blevet fastslået på SmartCycler. Denne cut-off-værdi blev overført analytisk til AB7500-platformen ved hjælp af en skabelon med en Aspergillus-koncentration, der var blevet påvist at give 95% positive resultater ved CCO på SmartCycler. Der blev konstatere en Ct-værdi på 33,5, som derefter blev bekræftet ved hjælp af skabeloner med 3 forskellige koncentrationer. Dansk 12

Følgende præstationskrav blev fastslået ved hjælp af Cepheid SmartCycler Påvirkende substanser (kontraindikationer for brug) Følgende forbindelser blev testet i klinisk relevante koncentrationer og det blev konstateret, at de ikke hæmmede analysen: acteylcysteine, amphotericin, beclometasondipropionat, budesonid, colistimethatnatrium, fluticasonpropionat, formoterolfumaratdihydrat, ipratropiumbromid, lidocain, mannitol, salbutamolsulfat, salmerterol, natriumklorid, natriumcromoglicat, terbutalin, tobramycin. Præstationsevaluering Respirationsprøver (BAL), der var blevet indsamlet fra 2 hospitaler, ekstraheret ved hjælp af MycXtra sættet og opbevaret, blev brugt til at evaluere præstationen af sættet med kliniske prøver. Der blev foretaget sammenligninger af både klinisk diagnose og podning. Cut-off-værdien med en Ct-værdi på 36,0 blev fastslået efter en gennemgang af et datasæt fra prøver, der var indhentet fra forskellige steder og forskellige patientpopulationer. Forskellige cut-off-værdier blev evalueret for sandsynligheden for differentiering mellem sygdomstilstand og ikke-sygdomstilstand. PCR v klinisk diagnose Klinisk positiv Klinisk negativ PCR positiv 31 1 0.97 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR negativ 2 10 0.83 NPV (negativ prædiktiv værdi ) 0.94 0.91 Følsomhed Specificitet PCR v Aspergillus podning Podning positiv Podning negativ PCR positiv 29 3 0.91 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR negativ 2 10 0.83 NPV (negativ prædiktiv værdi ) 0.94 0.77 Følsomhed Specificitet Af de testede prøver indeholdt 0,8% PCR-hæmmere som rappoteret af IAC, efter ekstraktion ved hjælp af MycXtra sættet. Klinisk rapportering MycAssay Aspergillus sættet er beregnet til at fungere som en hjælp for diagnosticering. Resultaterne skal vurderes i sammenhæng med patientens kliniske tilstand og andre diagnostiske testresultater. I det følgende er angivet anbefalede rapporter, hver afhængig af fortolkningen af analyseresultatet: Resultat nr. 1 Aspergillus spp. ikke påvist Resultat nr. 2 Aspergillus spp. påvist; positivt resultat. Denne analyse påviser også Penicillium spp. Resultat nr. 3 Test mislykket; hæmmere eller andre ukendte substanser tilstede Dansk 13

Procedurens begrænsninger Den grundlæggende begrænsning af denne procedure relaterer til kvaliteten af den primære prøve: - Hvis prøven er meget lille eller ikke er hentet fra det påvirkede område af lungen, vil testen være mindre følsom og kan være fejlagtigt negativ. - BAL-prøver skal centrifugeres inden DNA-ekstraktion tabletten. - Data har også vist, at en reduktion af voluminet af supernatant, der buges i ekstraktionsprocessen, opnået ved centrifugeringen, reducerer andelen af hæmmere, der trænger ind i systemet. Falske positive resultater er mulige, hvis det inficerende stof er Penicillium spp. som ikke kan differentieres fra Aspergillus spp. ved hjælp af dette sæt. Selvom MycXtra Fungal DNA ekstraktionsproceduren er beregnet til at fjerne PCR-hæmmere, er der ikke foretaget evaluering af alle lægemidler eller patientpopulationer. Proceduren er ikke blevet fuldt vurderet med spyt og er heller ikke blevet vurderet med inducerede saltvandsprøver eller på prøver fra børn. Falske positive resultater kan være forårsaget af ekstern kontaminering af den originale prøve eller test. En sådan kontaminering kan forårsages af Aspergillus-kontamineret luft, ringe eksperimentalteknik med hensyn til positiv eller ekstern (især via pipette) kontaminering med Aspergillus DNA. Da et sandt positivt resultat kan opnås fra patienter, som forbigående eller vedvarende er koloniseret af Aspergillus spp., kræves der klinisk vurdering ved fortolkning af testresultaterne, i sammenhæng med sygdom. LICENSER TopTaq TM Hot Start leveres af QIAGEN. QIAGEN er et registreret varemærke tilhørende Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland. Dette produkt sælges under licens fra Public Health Research Institute, Newark, New Jersey, USA og må kun bruges under PHRI-patentrettigheder til human in vitro-diagnose. SmartCycler er et registreret varemærke tilhørende Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. En del af dette produkt er dækket af en eksklusiv licens til en patentansøgning ejet af Fred Hutchinson Cancer Centre, Seattle, USA. Applied BioSystems er et registreret varemærke tilhørende Applera Corporation eller datterselskaber heraf i USA og/eller visse andre lande. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Dansk 14