HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kode GM333 2. udgave HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en analyse af direkte fluorescens in situ-hybridisering (FISH), som er designet til kvantitativ fastlæggelse af HER2-genamplifikation i prøver af formalinfikseret, paraffinindstøbt (FFPE) brystkræftvæv og FFPE-prøver fra patienter med metastatisk gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er indiceret sammen med HercepTest til vurdering af patienter, til hvem der overvejes behandling med Herceptin. Flasken indeholder reagenser til 20 analyser. Tilhørende reagenser skal anvendes sammen med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Kode Produktnavn GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 1/55

Indhold Side Tilsigtet anvendelse... 3 Procedureprincip - Bryst... 4 Reagenser - Bryst... 5 Forholdsregler - Bryst... 6 Opbevaring - Bryst... 6 Klargøring af prøver - Bryst... 7 BRUGSVEJLEDING - Bryst... 8 A. Klargøring af reagens - Bryst... 8 B. Farvningsprocedure - Bryst... 10 Kvalitetskontrol - Bryst... 11 Fortolkning af farvning - Bryst... 12 Begrænsninger - Bryst... 13 Præstationskarakteristika - Bryst... 13 Fejlfinding - Bryst... 22 Appendiks 1 - Bryst... 24 Appendiks 2 - Bryst... 26 Resumé og forklaring - Gastrisk... 27 Procedureprincip - Gastrisk... 27 Reagenser - Gastrisk... 28 Forholdsregler - Gastrisk... 29 Opbevaring - Gastrisk... 31 Klargøring af prøver - Gastrisk... 31 BRUGSVEJLEDNING - Gastrisk... 32 A. Klargøring af reagens - Gastrisk... 32 B. Farvningsprocedure - Gastrisk... 34 Kvalitetskontrol - Gastrisk... 36 Fortolkning af farvning - Gastrisk... 36 Begrænsninger - Gastrisk... 38 Præstationskarakteristika - Gastrisk... 38 Fejlfinding Gastrisk... 47 Appendiks 3 - Gastrisk... 49 Appendiks 4 - Gastrisk... 51 Appendiks 5 - Gastrisk... 52 Referencer... 53 Symbolforklaring... 55 (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 2/55

Tilsigtet anvendelse Til in vitro-diagnostisk brug. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben til den automatiserede analyse af direkte fluorescens in situ-hybridisering (FISH) i Dako Omnis-instrumenter og er sammen med de tilhørende reagensanordninger designet til kvantitativ fastlæggelse af HER2-genamplifikation i prøver af formalinfikseret, paraffinindstøbt (FFPE) brystkræftvæv og FFPE-prøver fra patienter med gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang. HER2 IQFISH pharmdx er indiceret sammen med HercepTest til vurdering af patienter, til hvilke der overvejes behandling med Herceptin (trastuzumab) (se indlægssedlen til Herceptin ). For patienter med brystkræft er resultater fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) beregnet som et supplement til de klinisk-patologiske oplysninger, der aktuelt anvendes til estimering af prognosen for patienter med stadie II, noduspositiv brystkræft. Gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang kaldes også for gastrisk kræft i dette dokument. Se side 4-26 for anvendelse til brystkræft. Se side 27-52 for anvendelse til gastrisk cancer. Vigtigt: Bemærk forskellene for væv af brystkræft og gastrisk kræft, især i afsnittene Fortolkning af farvning (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 3/55

Brystkræft Resumé og forklaring - Bryst Det humane HER2-gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er placeret på kromosom 17 og koder for HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet forekommer i to kopier i alle normale diploide celler. Hos en del patienter med brystkræft amplificeres HER2 -genet som et led i den maligne transformationsproces og tumorudvikling (3-8). HER2 -genamplifikation fører almindeligvis til overekspression af HER2-proteinet på overfladen af brystkræftceller (9). Amplifikation af HER2-genet og/eller overekspression af dettes protein er blevet påvist i 20-25% af alle tilfælde af brystkræft (10). Denne opregulering er associeret med dårlig prognose, øget risiko for tilbagefald og forkortet overlevelsestid. Adskillige forsøg har vist, at HER2-status korrelerer med sensitivitet eller resistens over for visse kemoterapeutiske behandlingsregimer (11). Påvisning af kraftig overekspression af HER2-protein eller HER2-genamplifikation er essentielt for indledning af behandling med Herceptin, et monoklonalt antistof mod HER2-protein. Kliniske forsøg har vist, at patienter med tumorer med kraftig overekspression af HER2-protein og/eller amplifikation af HER2-genet opnår størst gavnlig virkning af Herceptin (12). Dette produkt (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) er en IQISH-probeblanding til automatiseret direkte FISH-påvisning af HER2-genamplifikation. Produktet bør anvendes sammen med de angivne tilhørende reagenser i Dako Omnis, og det udledes fra den manuelt udførte analyse af HER2-genamplifikation, HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731. Procedureprincip - Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en IQISH probeblanding, der består af en blanding af Texas Red-mærkede DNA-prober, der dækker 218 kb-området, herunder HER2-genet på kromosom 17, og en blanding af fluorescein-mærkede PNA-prober (peptidnukleinsyre)(13), der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN-17). Specifik hybridisering til de to målområder resulterer i dannelse af et distinkt rødt fluorescenssignal i hvert HER2-genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17-centromer. Vurdering af HER2-genamplifikation ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en fuldt automatiseret metode på Dako Omnis-instrumentet. Det er muligt at vælge mellem tre forskellige validerede HER2 FISH-farvningsprotokoller i programmet på Dako Link Omnisarbejdsstationen. Protokollerne afviger kun i forhold til nedbrydningstid for pepsin, således at det er muligt at vælge pepsinnedbrydning i 10 min (protokollen Short), 15 min (protokollen Medium) og 20 min (protokollen Long) (se mere nedenfor). Protokollen Medium anbefales til den indledende analyse. Efter farvning i Dako Omnis monteres prøverne med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), og dækkes af dækglas. Ved brug af et fluorescensmikroskop, der er udstyret med passende filtre (se appendiks 2), lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signaler. Herefter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som en intern positiv farvningskontrol. For detaljer, se afsnittet Fortolkning af farvning. Se brugervejledningerne til Dako Omnis for detaljerede oplysninger om indsættelse og udtagning af objektglas, ISH-låg (Dako Omnis), reagenser, bulkvæsker og affald. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 4/55

Brystkræft Reagenser - Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser kan bestilles separat som enkeltstående reagenser. Medfølgende materialer HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, blanding af Texas Red-mærkede HER2 DNA-prober og fluorescein-mærkede CEN-17 PNA-prober, der er klar til brug og leveres i IQISH-hybridiseringsbuffer. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) forsendes i tøris. For at sikre, at reagenset ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Flasker med tøet reagens skal altid opbevares og håndteres i lodret stilling. Der er en guldbelagt metalkugle i alle flasker med reagens, således at reagenset kan blandes ved hjælp af Dako Omnis blandingsudstyr (se brugervejledningen til Dako Omnis blandingsudstyr). Det er vigtigt, at reagenset blandes grundigt, inden flasken indsættes i Dako Omnis. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Tilhørende reagenser Følgende reagenser er påkrævet i Dako Omnis-instrumentet for at udføre en analyse af HER2-genamplifikation med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, koncentreret 20x, skal fortyndes 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske (kode GC109). Produktet indeholder et bakteriehæmmende middel og et inert grønt farvestof for nem identifikation og brugervenlighed. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% ethanol (klar til brug). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepsin A-opløsning (klar til brug), ph 2,0, indeholder stabiliseringsmiddel og et bakteriehæmmende middel. Pepsin forsendes i tøris. For at sikre, at reagenset ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml natriumcitrat-saltvandsopløsning, koncentreret 20x, skal fortyndes 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske (kode GC109). Produktet indeholder et bakteriehæmmende middel, et rengøringsmiddel og et inert gult farvestof for nem identifikation og brugervenlighed. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescensmonteringsmedium (klar til brug) med DAPI. Ovenstående reagenser leveres ikke sammen med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), men beskrives alligevel kort nedenfor. Se brugsvejledningen til de enkelte anordninger for yderligere oplysninger. Tilhørende reagenser og anordninger Dako Omnis, kode GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kode GC807 Clearify, kode GC810 Dako Omnis blandingsudstyr, kode GC116 ISH-låg, kode GC102 ISH Cleaning Solution, kode GC207 Dækglas af glas til montering (24 mm x 50 mm) Se den grundlæggende og den avancerede brugervejledning til Dako Omnis angående brug af tilhørende reagenser og anordninger. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 5/55

Brystkræft Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red-dobbeltfilter eller FITC- og Texas Redmonofiltre - se appendiks 2 for detaljer. Brug af et DAPI-filter ved høj forstørrelse har en negativ indvirkning på signalets intensitet. Lange eksponeringstider bør undgås. Der bør anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære. Andre lyskilder anbefales ikke til disse filtre. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende). Forholdsregler - Bryst 1. Til in vitro-diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indeholder 10-<25% ethylenkarbonat og 3-<5% natriumchlorid. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær øjen- eller ansigtsbeskyttelse. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet. 4. Vævsprøver og alle materialer, der komme i berøring med disse, skal både før og efter fiksering håndteres som potentielt smittefarlige og skal bortskaffes under overholdelse af de korrekte forholdsregler (14). Pipetter aldrig reagenser med munden, og undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og prøver. Vask med rigelige mængder vand, hvis reagenser kommer i kontakt med overfølsomme områder. 5. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlbehæftede resultater. 6. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 7. Reagenset er fortyndet optimalt. Yderligere fortynding kan medføre manglende effektivitet. 8. Brug passende personlige værnemidler for at undgå kontakt med øjne og hud. Se materialesikkerhedsdataarket (SDS) for yderligere oplysninger. 9. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, national og EU-retlig lovgivning. Opbevaring - Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal opbevares mørkt ved < 18 C ( 18 C til 25 C anbefales). Flasker med optøet reagens skal altid opbevares i lodret stilling. Frysning og optøning af reagenset op til 10 gange påvirker ikke præstationen. Denne komponent må ikke opbevares i stuetemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser: ISH Pepsin (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan blive påvirket, hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse komponenter ved stuetemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og det tilhørende reagens, Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), kan blive påvirket, hvis de udsættes for meget og kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 6/55

Brystkræft De tilhørende reagenser, ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), skal opbevares mørkt ved 2-8 C. ISH Pepsin (Dako Omnis) skal opbevares ved -18-8 C. Flaskens låg, herunder flip låget, skal være lukket for alle reagenser under opbevaring. Fortyndede opløsninger (brugsopløsning af ISH Stringent Wash Buffer og ISH Pre-Treatment Solution) kan opbevares ved 2-8 C i 30 dage. Reagenser må ikke anvendes efter den udløbsdato, der er stemplet på reagensbeholderen. Under opbevaring skal reagenslåget, herunder fliplåget, være lukket. Hvis reagenser opbevares under andre betingelser end de angivne, skal brugeren validere reagensets præstation(15). Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt DAKOs tekniske service ved observation af et uventet fluorescensmønster, der ikke kan forklares, og hvor der er mistanke om et problem med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eller de tilhørende reagenser Holdbarhed i Dako Omnis-instrumentet Holdbarheden i instrumentet af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser, ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), er 80 timer. Holdbarheden af fortyndet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) og ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) er 7 dage i instrumentet. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren. Brug af udløbne reagenser vil medføre, at der vises en advarsel på Dako Omnis-instrumentet, at alle objektglas, der farves med det udløbne reagens får status "mistænkelig", og at objektglasloggen på arbejdsstationen viser, at der er anvendt et udløbet reagens. Klargøring af prøver - Bryst Prøver fra biopsier, excisioner og resektioner skal håndteres, så vævet bevares til FISH-analyse. Der bør anvendes standardmetoder til behandling af væv til immuncytokemisk farvning for alle prøver (16). Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Prøverne kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i 18-24 timer i neutral, bufferjusteret formalin. Vævet dehydreres derefter i en gradueret serie af ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur maks. må være 60 C. Korrekt fikseret og indstøbt væv kan holde sig uendeligt inden sektionering og montering på objektglas, hvis det opbevares køligt (15-25 C) (16-17). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævsprøver skal opskæres i snit med en tykkelse på 4-6 µm. De nødvendige objektglas til analyse af HER2-genamplifikation samt bekræftelse af forekomst af tumor bør klargøres samtidig. Det anbefales at anvende mindst to serielle snit: Et snit til bekræftelse af forekomst af tumor, der farves med hæmatoxylin og eosin (H&E stain), og et snit til analyse af HER2-genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kode K8020. Superfrost Plus-objektglas (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) er også velegnet. Det skal sikres, at objektglassene ikke har overskredet udløbsdatoen. Prøverne skal analyseres maks. 6 måneder efter sektionering ved opbevaring ved 2-25 C. BEMÆRK: Vævsprøverne skal placeres inden for det angivne farvningsområde på objektglasset. Se den grundlæggende brugervejleding til Dako Omnis for målene på objektglassets farvningsområde. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 7/55

BRUGSVEJLEDING - Bryst Brystkræft A. Klargøring af reagens - Bryst A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Flasken med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indeholder en guldbelagt metalkugle, der bruges til blanding. Inden flasken placeres i Dako Omnis, skal reagenset optøs og blandes grundigt, da dets fase skiller under nedfrysning. Brug Dako Omnis blandingsudstyret til probeblandingen. Følg nedenstående procedure for probeblanding i Dako Omnis blandingsudstyret, og se brugervejledningen til blandingsudstyret for yderligere oplysninger. 1. Tag flasken med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ud af fryseren. 2. Indsæt flasken i Dako Omnis blandingsudstyret. 3. Tilslut blandingsudstyret og sørg for, at den grønne lampe er tændt. Vælg programmet "Thaw + mix" (Optøning + blanding). Vigtigt: Flasker, der opbevares under 25 C, skal optøs (kun lige), inden flasken indsæt tes i Dako Omnis blandingsudstyret, og programmet Mix (Bland) bør benyttes. 4. Udtag flasken af blandingsudstyret 5. Åbn fliplåget, tryk det bagud og klik det i position (se den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger). 6. Indsæt omgående flasken i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis-instrumentet. Hvis funktionen til kontinuerlig tilførsel af reagens anvendes under farvningskørslen, skal det sikres, at tiden fra blanding til aspiration af flasken i Dako Omnis er mindst 10 min. Proben fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kan optøs og anvendes igen op til 10 gange. Proben fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal altid blandes inden indsættelse i instrumentet. Den må ikke rystes. Den samlede holdbarhed i instrumentet af ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Når HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har været i Dako Omnis, skal det omgående overføres til < 18 C ( 18 C til 25 C anbefales). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Klargør en brugsopløsning ved at fortynde koncentreret ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 som følger: 1. Fyld en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske mærket PTB (blå etiket) til påfyldningslinjen med deioniseret vand (3,325 L). Sørg for, at bulkflasken er placeret på en vandret flade, før den fyldes. 2. Tøm en flaske med 175 ml koncentreret ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) i bulkflasken. 3. Flyt den aftagelige mærkat fra koncentratflasken til bulkflasken. Sæt bulkflaskens låg på, og vend bulkflasken på hovedet 2-3 gange. 4. Brug den håndholdte Dako Omnis-stregkodescanner til at identificere reagenset (scan den aftagelige mærkat og bulkflasken). 5. Isæt straks bulkflasken på Dako Omnis-instrumentet. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 8/55

Brystkræft Den fortyndede opløsning kan anvendes inden for 7 timer, når den opbevares på Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2-8 C i 30 d age. Når den fortyndede opløsning har været opbevaret koldt, skal det sikres, at den afbalanceres til min. 18 C inden indsættelse i Dako Omnis. BEMÆRK: Smid fortyndet opløsning bort, hvis den er uklar. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Klargør en brugsopløsning ved at fortynde koncentreret ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 som følger: 1. Fyld en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske mærket PTB (blå etiket) til påfyldningslinjen med deioniseret vand (3,325 L). Sørg for, at bulkflasken er placeret på en vandret flade, før den fyldes. 2. Tøm en flaske med 175 ml koncentreret ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) i bulkflasken. 3. Flyt den aftagelige mærkat fra koncentratflasken til bulkflasken. Sæt bulkflaskens låg på, og vend bulkflasken på hovedet 2-3 gange. 4. Brug den håndholdte Dako Omnis-stregkodescanner til at identificere reagenset (scan den aftagelige mærkat og derefter bulkflasken). 5. Indsæt omgående bulkflasken i Dako Omnis-instrumentet. Den fortyndede opløsning kan anvendes inden for 7 timer, når den opbevares på Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Ubrugt, fortyndet opløsning kan opbevares ved 2-8 C i op til 30 dage. Når den fortyndede opløsning har været opbevaret koldt, skal det sikres, at den afbalanceres til min. 18 C inden indsættelse i Dako Omnis. BEMÆRK: Smid fortyndet opløsning bort, hvis den er uklar. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er et reagens, der er klar til brug. Åbn flaskens fliplåg, skub det tilbage og klik det i position inden indsættelse i Dako Omnis. Den samlede holdbarhed af ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Når kørslen er færdig, kan ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) overføres til stuetemperatur (2-8 C) for at forlænge holdbarhedstiden i instrumentet. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) er et reagens, der er klar til brug. Åbn flaskens fliplåg, skub det tilbage og klik det i position inden indsættelse i Dako Omnis, når det først er konstateret, at reagenset er optøet. Den samlede holdbarhed i instrumentet af ISH Pepsin (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Når kørslen er færdig, kan ISH Pepsin (Dako Omnis) overføres til stuetemperatur ved -18-8 C for at sp are på stabilitetstiden i instrumentet. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) er et monteringsmedium, der er klar til brug, og som bruges uden for Dako Omnis-instrumentet. Overfør Fluorescence Mounting Medium til opbevaringstemperatur (2-8 C) umiddelbart efter br ug.

Brystkræft A.7 Yderligere tilbehør Følgende tilbehør kan også indsættes i Dako Omnis: Deioniseret vand, fortyndet Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kode GC807, Clearify, kode GC810, ISH Cleaning Solution, kode GC207 og ISH-låg (Dako Omnis), kode GC102, som angivet i brugervejledningerne til Dako Omnis. B. Farvningsprocedure - Bryst B.1 Procedurebemærkninger HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben til den automatiserede analyse af direkte fluorescens in situ-hybridisering (FISH) i Dako Omnis-instrumentet og er sammen med de tilhørende reagenser, GM300, GM301, GM302, GM303 og GM304 (GM304 uden for instrumentet), designet til kvantitativ fastlæggelse af HER2-genamplifikation. Brugeren bør inden brug læse alle vejledninger grundigt og sætte sig ind i alle komponenter og de relaterede forholdsregler. Den automatiserede FISH-farvningsprocedure i Dako Omnis omfatter afparaffinering af vævssnit, target retrieval, pepsinnedbrydning, hybridisering og stringent vask. Objektglassene udtages i den tørre udtagningsstation. Alle protokoltrin er forprogrammeret i Dako Omnis-softwaren. Se brugervejledningerne til Dako Omnis for en vejledning til indsættelse af objektglas, ISH-låg, reagenser osv. Dako Omnis-softwaren er forprogrammeret med tre validerede HER2IQFISHprotokoller: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium og HER2 IQFISH Pepsin Long. Protokollerne adskiller sig kun fra hinanden i forhold til tiden for pepsinnedbrydning, og de kan vælges for hver af de fem objektglas i objektglasholderen. Det muliggør optimering af vævsfordøjelsen, som kan afhængige af præanalytiske forhold. Protokollen HER2 IQFISH Pepsin Medium anses for standardprotokollen. De forskellige farvningsprotokoller kan ses i Dako Link Omnis-arbejdsstationen. B.2. Forfarvningsprocedure 1. Vælg den HER2 IQFISH-protokol, der skal anvendes til de enkelte objektglas, i programmet på Dako Link Omnis-arbejdsstationen under IQFISH-protokoller. 2. Udskriv mærkater til objektglassene, og sæt dem på. 3. Sæt objektglassene i objektglasholderen. Læs den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger. Der kan være op til fem objektglas i en objektglasholder. Det anbefales, at mindst to objektglas farves i en HER2 IQFISH-farvningskørsel. 4. Indsæt objektglasholderen i Dako Omnis-instrumentet. 5. Indsæt ISH-låg (et ISH-låg pr. objektglas) i Dako Omnis-instrumentet. 6. Sørg for, at der er indsat bulkflasker med væsker i Dako Omnis-instrumentet, og at instrumentet har registreret dem. Bulkflaskevæsker: Clearify (rengøringsmiddel), fortyndet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), fortyndet ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) og fortyndet Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Indsæt ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), det friskblandede HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og ISH Cleaning Solution i reagensopbevaringsmodulet. Sørg for, at alle fliplågene på flaskerne er åbne. 8. Følg vejledningen på berøringsskærmen, og tryk på "Done" (Færdig) for at starte farvningsproceduren. B.3. Farvningsprocedure HER2 IQFISH-farvningsproceduren i Dako Omnis-instrumentet (sammendrag i tabel 1) kan overvåges på Dako Link Omnis-arbejdsstationen: (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 10/55

Brystkræft Tabel 1. Forenklet oversigt over trinnene i HER2 IQFISH-farvningsprotokollen. Trin Reagens Tid og temperatur Afparaffinering Clearify (rengøringsmiddel) 10 min. ved 38 C Target retrieval ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 15 min. ved 97 C Vask ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 min. ved 32 C (Dako Omnis) Fordøjelse* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 min., 15 min. eller 20 min. Tørring 15 min. ved 45 C Denaturering 10 min. ved 66 C Hybridisering HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 min. ved 45 C Stringent vask ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 min. ved 61 C * Det er muligt at vælge mellem tre validerede nedbrydningstider for pepsin ved hjælp af de ovenfor nævnte HER2 IQFISHprotokoller. Overfør alle reagenser til de anbefalede opbevaringstemperaturer, hvis der ikke umiddelbart skal udføres yderligere ISH-farvning. B.4. Efterfarvningsprocedure Udtag objektglassene og tilfør op til 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI i objektglassets målområde. Vævssnittet skal være helt dækket af Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Afdæk med et dækglas af glas. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglas opbevares mørkt ved -18-8 C. Kvalitetskontrol - Bryst 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Normale celler bør indeholde 1-2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN-17-PNA-proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler bør ligeledes indeholde 1-2 klart synlige røde signaler, der indikerer, at HER2 DNA-proben har hybridiseret godt til HER2-genet/-erne Vævssektionering kan medføre, at nogle af de normale celler indeholder færre end de forventede to signaler af hver farve. Fravær af signaler i normale celler indikerer en analysefejl, og resultatet skal betragtes som ugyldigt. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer overfordøjelse af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Der skal være mindst 20 tumorceller, der kan evalueres. 5. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet.

Brystkræft Fortolkning af farvning - Bryst Evaluerbart væv Kun prøver fra patienter med invasivt karcinom bør testes. I tilfælde med karcinoma in situ og invasivt karcinom i samme prøve skal kun den invasive komponent bedømmes. Undgå områder med nekrose samt områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund over. Signaltælling Find tumoren på det H&E-farvede objektglas, og evaluer det samme område på det FISH-farvede objektglas. Scan adskillige områder af tumorceller for at tage højde for mulig heterogenesitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kerneafgrænsningen af hver evaluerede kerne ifølge retningslinjerne nedenfor (se også appendiks 2). - Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. - To signaler, der har samme størrelse og er adskilt af en afstand, der er lig med eller mindre end signalets diameter, tælles som kun ét signal - I kerner med høje niveauer af HER2-genamplifikation kan HER2-signalerne ligge meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I sådanne tilfælde kan antallet af HER2-signaler ikke tælles, men skal i stedet estimeres. Vær særligt opmærksom på de grønne signaler, da klynger af HER2-signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC-filter. Tæl ikke kerner uden signaler, eller med signaler af kun en farve, med. Tæl kun kerner, der indeholder et eller flere FISH-signaler af hver farve. Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kernerne lapper over hinanden, ikke alle kernernes områder er synlige 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under- eller overfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donutformede kerner). 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 12/55

Brystkræft 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC-filter, eller tæl ikke Optegn tallene i en tabel som vist i appendiks 1. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, hvor muligt fra distinkte tumorområder (18). Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde HER2-signaler med det samlede antal grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold, der er større end eller lig med 2, skal betragtes som værende HER2-genamplificerede(3, 18-20). Resultater på eller i nærheden af cut-off (1,8-2,2) skal fortolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er på grænsen (1,8-2,2), tælles yderligere 20 kerner, hvorefter forholdet beregnes igen for de 40 kerner. Objektglasset med prøven skal tælles igen i tvivlstilfælde. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskeligt. Begrænsninger - Bryst 1. Kun til automatiseret brug i Dako Omnis-instrumenter. 2. Specialiseret træning er nødvendigt for valg af væv, fiksering og klargøring af objektglas samt fortolkning af IQFISH-farvning. Fortolkning af HER2 IQFISH pharmdx -farver (Dako Omnis) bør ikke udføres af farveblinde personer. 3. Resultater af FISH er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridiseringen. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 4. HER2 IQFISH pharmdx -analysens (Dako Omnis) præstation er ikke blevet vurderet for brystkræftprøver med mikrokalcificeringer. Præstationskarakteristika - Bryst Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten af HER2 IQFISH pharmdx blev undersøgt ved hjælp af 180 formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit, der blev undersøgt på tre forsøgscentre. Alle 180 vævssnit kunne tælles i henhold til produktets retningslinjer for tælning. Hybridiseringseffektiviteten var 100%. De HER2/CEN-17-forhold, der beregnes og anvendes i undersøgelserne af præsentationskarakteristika, er baseret på tælning af signaler i 20 kerner ved hjælp af de retningslinjer for scoring, der angives i afsnittet Fortolkning af farvning i denne brugervejledning. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev undersøgt ved hjælp af 20 forskellige vævsprøver af brystkarcinom (10 prøver med amplificeret HER2-genstatus og 10 ikke-amplificerede prøver). Forholdet mellem antallet af

Brystkræft HER2-signaler og CEN-17-signaler blev beregnet på baggrund af tælning af signaler i 20 kerner fra normale celler i vævsprøverne. Det påviste forhold mellem HER2og CEN-17 for normale celler i de 20 vævsprøver var mellem 0,97 og 1,11. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberne i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er blevet endesekvenseret og kortlagt for at bekræfte total dækning af 218 kb, herunder HER2 -genet. CEN-17 PNA-proberne i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er blevet undersøgt med FISH, både separat og i kombination, for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at udelukke krydshybridisering til andre kromosomer end kromosom 17 blev metafasespredninger undersøgt i henhold til standardprocedurer for Dako QC. Sammenlagt blev der evalueret 275 metafasespredninger med distinkte signaler for specifik hybridisering af HER2 DNA- og CEN-17 PNA-probeblandinger. Hybridiseringen var specifik for kromosom 17 i alle 275 tilfælde. I ingen af de 275 tilfælde blev der observeret krydshybridisering til loci på andre kromosomer. Probespecificiteten var dermed 100% (275 af 275). Til måling af IQFISH-analysens evne til udelukkende at identificere målstofferne HER2 og CEN-17 uden interferens fra andre stoffer blev vævsprøver af brystkarcinom undersøgt ved at udelade HER2- og CEN-17-proberne fra hybridiseringsblandingen og udelukkende anvende hybridiseringsbufferen. Der blev evalueret i alt 20 prøver for forekomst af signaler, der ikke var forbundet med probeblandingen. I ingen af de 20 prøver blev der observeret detektion af andre kromosommål eller interferens med nært forbundne stoffer. Robusthedsundersøgelser Robustheden af HER2 IQFISH pharmdx -analysen (Dako Omnis) blev undersøgt ved at anvende skiftende PNA-probekoncentration, tid til target retrieval, inkubationstid for pepsin, denatueringstid, hybridiseringstid samt tid og temperatur for stringent vask. De forskellige parametre blev undersøgt på fem FFPE-vævsprøver af brystkræft (både amplificerede og ikke-amplificerede vævsprøver). Alle parametre blev undersøgt både under og over standardindstillingen for de respektive protokoller, bortset fra PNA-probekoncentration og temperatur for stringent vask, hvor standardindstillingen for protokollen indgik i opsætningen. Testparametrene var: PNA-probekoncentration: Undersøgt ved 100% og +/-17%. Tid til target retrieval: Undersøgt ved 13 min. 45 sek. samt 16 min. og 15 sek. Inkubationstid for pepsin: Undersøgt ved 14 min. 45 sek. samt 16 min. og 15 sek. Denatureringstid: Undersøgt ved 9 min. 45 sek. samt 10 min. og 45 sek. Hybridiseringstid: Undersøgt ved 70 min. og 80min. Tid for stringent vask: Undersøgt ved 8 min. 45 sek. samt 11 min. og 15 sek. Temperatur for stringent vask: Undersøgt ved 59 C, 61 C og 63 C. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 14/55

Brystkræft De tre PNA-probekoncentrationer blev vurderet i et fraktioneret eksperimentdesign (JMP-værktøj, SAS), som blev udført med 12 forskelige farvningsprotokoller som angivet i tabel 2. Tabel 2. Tolv forskellige farvningsprotokoller, der blev anvendt i robusthedsundersøgelsen. Testparameter Robusthedsprotokol nr. Tid til target retrieval (min) Pepsintid (min) Denatueringstid (min) Hybridiseringstid (min) Tid for stringent vask (min) Temperatur for stringent vask ( 0 C) PNA-konc. i probeblanding 1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83% 2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100% 3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100% 4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83% 5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117% 6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83% 7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100% 8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83% 9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117% 10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117% 11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100% 12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117% Alle fem vævsprøver blev farvet ved hjælp af alle 12 protokoller. Resultatet af robusthedsundersøgelsen var signalintensitet og morfologiske kvalitet. Alle protokoller gav farvning af alle vævsprøver (60 i alt) med signaler, der var lyse, distinkte og lette at evaluere, dvs. egnet til signaltælling. Herudover blev effekten af vævstykkelsen på analyseresultatet fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersøgt ved at variere snittykkelsen af FFPE-vævsprøverne af brystkræft. Der blev undersøgt i alt fem på hinanden følgende prøver af humant brystkarcinom med forskellig tykkelse (3, 4, 5, 6 og 7 µm) med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den gennemsnitlige variationskoefficient for HER2/CEN-17-forholdet var 5,8% (svingende fra 4,3% til 7,1%). Reproducerbarhed Reproducerbarheden i laboratoriet, fra dag til dag samt fra lot til lot blev undersøgt ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Undersøgelsen var udformet som en intern, blindet, randomiseret undersøgelse af HER2/CEN-17-forholdene ved hjælp af snit fra otte forskellige formalinfikserede, paraffinindstøbte brystkræftprøver med forskellige grader af HER2- genamplifikation. De otte prøver var blevet undersøgt med HercepTest, og bestod af to prøver med HER2 IHC 0/1+, to prøver med HER2 IHC 2+, to prøver med HER2 IHC 3+ og to prøver med et foruddefineret HER2/CEN-17 FISH-forhold på mellem 1,5 og 2,5, som var opnået ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Samtlige prøver blev farvet med tre forskellige lot af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på fem dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden. Sammenlagt 240 vævsfarvninger blev behandlet for hele undersøgelsen, idet hver kombination blev farvet i to kopier. Figur 1 viser udsvingene i forholdene fra dag til dag og fra lot til lot. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box-Cox transformation via en Random Effect-model for at opnå homogen datavarians. Den samlede variationskoefficient blev anslået til 4,3%, og det observeredes, at udsvingene fra dag til dag og fra lot til lot bidrog med hhv. 1,5% og 0%. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 15/55

Brystkræft Figur 1. HER2/CEN-17-forhold fra en laboratorieundersøgelse af reproducerbarhed på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), herunder endepunkterne lot til lot og dag til dag for reproducerbarhed. Herudover blev reproducerbarheden fra dag til dag og fra center til center for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersøgt eksternt på tre forskellige centre (et center i USA og to centre i Europa) i en stratificeret og blindet undersøgelse med vævssnit fra 12 forskellige formalinfikserede, paraffinindstøbte brystkræftprøver. Af disse tolv prøver var tre HER2 IHC 0/1+, tre var HER2 IHC 2+, tre var HER2 IHC 3+ og tre havde et foruddefineret HER2/CEN-17 FISHforhold på mellem 1,5 og 2,5, hvilket var opnået ved hjælp af hhv. HercepTest og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Prøverne blev farvet og analyseret på undersøgelsescentrene. Samtlige prøver blev farvet mindst fem gange på fem dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden, og scoret af en observatør på de enkelte undersøgelsescentre. Der blev farvet 192 snit, som alle indgik i den statiske analyse. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box- Cox transformation, og varianskomponenterne blev beregnet. Den samlede variationskoefficient, baseret på den øvre 95% konfidensgrænse, var 15%. Udsvingene i HER2/CEN-17-forholdet for dag til dag og center til center er angivet i figur 2. Figur 2. Variabilitetsdiagram over HER2/CEN-17-forholdene i ikke-transformerede enheder fra reproducerbarhedsundersøgelsen af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vævsprøver af brystkræft for dag til dag samt center til center. Analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev undersøgt for reproducerbarhed fra observatør til observatør som led i den internt udførte undersøgelse af metodesammenligning, hvori indgik tre observatører, der scorede de farvede prøver uafhængigt af hinanden. Reproducerbarheden blev undersøgt på 140 forskellige prøver af humant brystkarcinom med enten ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box-Cox transformation. Den gennemsnitlige variationskoefficient for observatør til observatør var 9%. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 16/55

Brystkræft Reproducerbarhed Reproducerbarheden af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på laboratoriet blev undersøgt ved hjælp af fortløbende snit af otte prøver af humant brystkarcinom med enten ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Væv blev undersøgt i to kopier på fem dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden, med tre forskellige lot på i alt 240 objektglas (120 snit i kopi). Den Random Effects-model, der blev anvendt til dataanalysen, medførte en varians, der kan henføres til dage og lot (som angivet i den interne reproducerbarhedsundersøgelse). Den resterende varians svarer til variansen fra kopi til kopi og dermed reproducerbarhed. Den øvre 95% konfidensgrænse for variationskoefficienten for reproducerbarhed var 4,4%. Metodesammenligningsundersøgelser Sammenligning af resultater fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og resultater fra HER2 IQFISH pharmdx HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev sammenlignet med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) i en sammenlignende undersøgelse af 140 vævsprøver af humant brystkarcinom. Prøverne bestod af 77 ikke-her2-amplificerede tilfælde og 63 HER2-amplificerede tilfælde med kendt score fra HercepTest som vist i tabel 3. Tabel 3. Fordeling af prøver på baggrund af score fra HercepTest og HER2 FISH (HER2-genstatus), der er opnået med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Score for HercepTest farvning 0 1+ 2+ 3+ I alt n 27 11 53 49 140 HER2 FISH-status Amplificeret 2 0 13 48 63 Ikke-amplificeret 25 11 40 1 77 FISH-undersøgte prøver i alt 27 11 53 49 140 Resultatet af krydstabulering af HER2-genstatus, der er opnået ved hjælp af to analyser med beregning af overordnet procentoverensstemmelse (OPA), positiv procentoverensstemmelse (PPA) og negativ procentoverensstemmelse (NPA), er vist i tabel 4. Figur 3 viser korrelationen mellem HER2/CEN-17-forholdene ved hjælp af de to analyser. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 17/55

Brystkræft Tabel 4. Krydstabulering af HER2-genstatus, som er opnået ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikkeamplificeret HER2- genstatus (Dako Omnis) HER2-genstatus (K5731) Ikkeamplificeret Amplificeret I alt 77 0 77 Amplificeret 0 63 63 I alt 77 63 140 OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figur 3. Korrelation mellem HER2/CEN-17-forhold ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) på 140 brystkræftprøver (lineær regression: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. Vægtet med omvendt varians for at tage højde for lineær regression). HER2/CEN-17-forholdene blev logaritmisk transformeret med henblik på analyse. 95% konfidensintervallet for den gennemsnitlige forskel for de to farvningsmetoder var [0,002; 0,031] ved HER2/CEN-17-forhold = 2. Det betyder, at en forskel på over 3% ikke forventes med 95% konfidens. Standardafvigelsen (RMSE) var 9%, hvilket angiver størrelsen på den gennemsnitlige svingning omkring gennemsnitsværdien. Sammenligning af resultater fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og resultater fra PathVysion HER-2 DNA Probe Kit HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev sammenlignet med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit i en sammenlignende undersøgelse med 140 vævsprøver af humant brystkarcinom. Prøverne bestod af 80 ikke-her2-amplificerede tilfælde og 80 HER2-amplificerede tilfælde med kendt score fra HercepTest som vist i tabel 5.

Tabel 5. Fordeling af prøver på baggrund af score fra HercepTest og HER2 FISH score (HER2-genstatus), der er opnået med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Brystkræft Resultatet af krydstabulering af HER2-genstatus, der er opnået ved hjælp af to analyser med beregning af overordnet procentoverensstemmelse (OPA), positiv procentoverensstemmelse (PPA) og negativ procentoverensstemmelse (NPA), er vist i tabel 6. Figur 4 viser korrelationen mellem HER2/CEN-17-forholdene ved hjælp af de to analyser. Tabel 6. Krydstabulering af HER2-genstatus, som er opnået ved hjælp af PathVysion HER-2 DNA Probe Kit og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikkeamplificeret HER2- genstatus (Dako Omnis) HER2-genstatus (PathVysion) Ikkeamplificeret Amplificeret Score fra HercepTest farvning 0 1+ 2+ 3+ I alt n 28 10 54 48 140 HER2 FISH-status Amplificeret 1 0 12 47 60 Ikke-amplificeret 27 10 42 1 80 FISH-undersøgte prøver i alt 28 10 54 48 140 I alt 80 0 80 Amplificeret 0 60 60 I alt 80 60 140 OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figur 4. Korrelation mellem HER2/CEN-17-forhold ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og PathVysion på 140 brystkræftprøver (lineær regression: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. Vægtet med omvendt varians for at tage højde for lineær regression). HER2/CEN-17-forholdene blev logaritmisk transformeret med henblik på analyse. 95% konfidensintervallet for den gennemsnitlige forskel for de to farvningsmetoder var [0,001; 0,031] ved HER2/CEN-17-forhold = 2. Det betyder, at en forskel på over 3% ikke forventes med 95% konfidens.

Brystkræft Standardafvigelsen (RMSE) var 10%, hvilket angiver størrelsen på den gennemsnitlige svingning omkring gennemsnitsværdien. Klinisk anvendelighed ved valg af patienter til behandling med Herceptin (trastuzumab) HER2 FISH pharmdx Kit blev undersøgt i sammenlignende undersøgelser med både PathVysion HER-2 DNA Probe Kit og Dako HercepTest. Der foreligger resultater af HER2 FISH-undersøgelser for 940 brystkræftprøver i alt. Sammenligning af resultater fra HER2 FISH pharmdx Kit med testresultater fra PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Der er gennemført tre undersøgelser, der alle sammenligner resultaterne fra test med HER2 FISH pharmdx Kit og resultaterne fra test med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (se tabel 7). Undersøgelserne blev udført på forskellige geografiske lokationer, og der var ingen overlapning af prøver. Sammenlagt 328 prøver blev undersøgt. Tabel 7. Sammenfatning af sammenlignende undersøgelser af FISH-metode. Undersøgelsens navn Konkordans (95% konfidensinterval) Positiv procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval) Negativ procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval) Konkordansundersøgelse (danske prøver, N=190) 93,68% (90,22%-97,14%) 86% (77,34%-95,08%) 97% (94,05%-99,89%) Konkordansundersøgelse (japanske prøver, N=52) 96,15% * Artiklen indeholdt data til sammenligning, men HER2 FISH-analysen var ikke specificeret. 97% 96% Konkordansundersøgelse (franske prøver, N=86) (21)* Testen med HER2 FISH pharmdx Kit og testen med PathVysion HER-2 DNA Probe udmøntede sig i sammenlagt tolv afvigende resultater for de danske kliniske prøver (se tabel 8). Tabel 8. Sammenfatning af data for de tolv afvigende testresultater. HER2 FISH(positiv)/PathVysion(negativ) Idnrforhold HER2 FISH- 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) PathVysionforhold 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) HER2 FISH(negativ)/PathVysion(positiv) Score fra HercepTest Idnr. HER2 FISHforhold 2+ 234 1,68 (1,38-1,83) 2+ 284 1,44 (1,07-1,83) 1+ 423 1,7 (1,52-1,95) 2+ 474 1,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) PathVysionforhold 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) Score fra HercepTest 2+ * KI af de gennemsnitlige, logaritmisk transformerede forhold omfattede 2,0. Tallene i parentes er 95% KI Der blev anvendt logaritmisk transformerede forhold i denne diskrepansanalyse. 95% konfidensintervallet blev beregnet for de 60 logaritmisk transformerede forhold fra de kerner, der blev anvendt til beregning af PathVysion HER-2 DNA Probe-forholdet. For de fire tilfælde, hvor HER2 FISH pharmdx Kit var positiv og PathVysion HER-2 DNA Probe var negativ, omfattede 2+ 1+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 20/55

Brystkræft ingen intervaller den kritisk værdi 2. Af de otte tilfælde, hvor HER2 FISH pharmdx Kit var negativ og PathVysion HER-2 DNA Probe var positiv, omfattede 95% KI for tre (nr. 234, 284 og 735) den kritiske værdi 2. På samme måde blev 95% konfidensintervallet beregnet for logaritmisk transformerede forhold fra de kerner, der blev anvendt til beregning af HER2 FISH pharm Dx Kit-forholdet. For de fire tilfælde, hvor HER2 FISH pharmdx Kit var positiv og PathVysion HER- 2 DNA Probe var negativ, omfattede to den kritisk værdi 2 (nr. 160 og 306). Af de otte tilfælde, hvor HER2 FISH pharmdx Kit var negativ og PathVysion HER-2 DNA Probe var positiv, omfattede 95% KI for en (nr. 881) den kritiske værdi 2. Sammenligning af resultater fra HER2 FISH pharmdx Kit og resultater fra HercepTest Der er gennemført fire undersøgelser, der sammenligner resultater fra HER2 FISH pharmdx Kit og HercepTest. Der er sammenlignet i alt 940 prøver, hvor scoringsresultatet fra 3+farvningen blev anvendt som et positivt IHC-resultat i HercepTest -analysen (se tabel 9). Tabel 9. Sammendrag af sammenlignende undersøgelser af HER2 FISH pharmdx Kit og IHC (HercepTest ). Undersøgelsens navn Konkordans (95% konfidensinterval) Positiv procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval) Negativ procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval) Danske kliniske prøver (N=682) 93,11% (91,21%-95,01%) 91% (87,39%-94,57%) 94% (92,12%-96,46%) Japanske prøver (N=52) Fransk undersøgelse (N=86) (31) Dansk pilotundersøgelse (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% Fordelingsdata for testresultater for HercepTest og HER2 FISH for de danske kliniske prøver er vist i tabel 10. Tabel 10. Fordeling af HER2-status efter HercepTest og HER2 FISH pharmdx Kit. Score fra HercepTest farvning 0 1+ 2+ 3+ I alt n 221 267 84 248 820 % 27 33 10 30 100% HER2 FISH-status Amplificeret 0 8 17 222 247 Ikke-amplificeret 106 245 62 22 435 FISH-undersøgte prøver i alt 106 253 79 244 682 (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 21/55

Brystkræft Fejlfinding - Bryst Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler 1a. Reagenserne har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Sørg for, at der var tøris i pakken ved modtagelsen af IQISH-probeblandingen og pepsinet. Sørg for, at reagenserne er blevet opbevaret i henhold til specifikationen. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnet til brug sammen med probeblandingens fluorokromer samt at kviksølvslampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt udover den forventede levetid (se appendiks 2). I tvivlstilfælde kontaktes mikroskopleverandøren. 1c. Falmede signaler 1c. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimér eksponeringen for kraftigt lys. 2. Områder uden signal 1d. Forkert identificerede buffere 2. Der er opstået luftbobler under montering 1d. Udskift bulkbuffere og sørg for korrekte registrering (på arbejdsstationen) og identifikation (på berøringsskærmen) af bulkbuffere. Se den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger. Bemærk: ISH Pre- Treatment Solution er grønt, og ISH Stringent Wash Buffer er gult. 2. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. 3. Stor baggrundsfarvning 3a. Forkert vævsfiksering 3a. Sørg for, at der kun anvendes formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 3b. For lang tids eksponering af hybridiseret vævssnit 3b. Undgå lange undersøgelser under (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 22/55

Brystkræft Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning mod for kraftigt lys mikroskop og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 4. Dårlig vævsmorfologi 5. Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset, herunder i områder uden FFPE-væv 4a. Forkert behandling med pepsin 4b. Pepsinbehandling i for lang tid eller en meget tynd snittykkelse kan medføre, at der forekommer spøgelsesceller eller donutceller 5. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas 4a. Skift til en anden af de tre forskellige farvningsprotokoller. Sørg for, at ISH Pepsin (Dako Omnis) opbevares ved den korrekte temperatur. 4b. Prøv en farvningsprotokol med en kortere inkubationstid for pepsin. Sørg for, at snittykkelsen er 4-6 µm. 5. Vælg objektglas i henhold til specifikationen. Det skal sikres, at objektglassene ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Kontakt DAKOs tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp, hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 23/55

Brystkræft Appendiks 1 - Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Scoringsskema Dato for kørslen: Id for farvekørselslog: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Prøve-id: Kerne Antal. HER2-score (rød) Tæl signaler i 20 kerner CEN-17- score (grøn) Kerneantal 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 I alt (1-10) I alt (11-20) HER2- score (rød) CEN-17- score (grøn) Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN- 17-signaler i de samme 20 kerner, hvorefter det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er på grænsen (1,8-2,2), tælles yderligere 20 kerner, hvorefter forholdet beregnes igen for de 40 kerner. Resultater på eller tæt på cut-off (1,8-2,2) skal fortolkes med forsigtighed (se tællevejledningen). Samlet score (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- forhold (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 24/55

Brystkræft Kerneantal HER2-score (rød) Tæl signaler i yderligere 20 kerner CEN-17- score (grøn) Kerneantal 21 31 22 32 23 33 24 34 25 35 26 36 27 37 28 38 29 39 30 40 I alt (21-30) I alt (31-40) HER2- score (rød) CEN-17- score (grøn) Beregn HER2/CEN-17-forholdet baseret på de 40 talte kerner HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- forhold Samlet score (1-40) Forhold < 2: HER2-genamplifikation ikke observeret Forhold 2: HER2-genamplifikation observeret Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: Se Fortolkning af farvning for retningslinjer for tælling. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 25/55

Brystkræft Appendiks 2 - Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til brug sammen med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden) 3. Objektiver Olieimmersionsobjektiver af typen 16X eller 20X gælder for screening af væv Til højeffektsforstørrelse og tælling af signaler kan der kun anbefales olieimmersionsobjektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtre udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler brug af et specifikt DAPI-filter i kombination med et Texas Red-/FITC-dobbeltfilter af høj kvalitet. DAPI-filter, f.eks. Chroma filter # 31000 Texas Red-/FITC-dobbeltfilter, f.eks. Omega Optical filter # XF53 eller Chroma filter # 51006 Texas Red- og FITC-enkeltfiltre kan anvendes til bekræftelse og til tælling. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt Deres mikroskopleverandør eller Deres Dako repræsentant, hvis De ønsker detaljeret information. 5. Olie Ikke-fluorescerende olie Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke Rhodaminfiltre kan ikke anvendes Tripelfiltre anbefales ikke Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt justeret og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Det bør tilstræbes, at prøven eksponeres for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Det anbefales, at opsætningen af mikroskopet diskuteres med producenten eller at litteraturen læses inden opstart af flourescens in situ-hybridiseringen. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 26/55

Gastrisk kræft Resumé og forklaring - Gastrisk Det humane HER2-gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er placeret på kromosom 17 og koder for HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet forekommer i to kopier i alle normale diploide celler. HOverekspression af HER2-proteinet og amplifikation af HER2-genet ved gastrisk kræft er påvist i et stort antal undersøgelser (gennemgået i (23)). HER2-positivitet kan registreres hos ca. 20% af patienterne med enten IHC eller FISH(23). Prækliniske in vitro- og in vivo-undersøgelser har påvist, at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i forskellige modeller for gastrisk kræft, hvilket har ført til opstart af adskillige kliniske forsøg(23-27). Alle patienterne i fase III BO18255-forsøget (ToGA "Et open-label, randomiseret, multicenter-, fase III-forsøg med traustuzumab i kombination med fluoropyrimidin og cisplatin i forhold til kun kemoterapi som førstelinjebehandling til patienter med HER2-positiv, fremskreden gastrisk kræft"), som blev sponsoreret af Hoffmann-La Roche AG, blev udvalgt ved hjælp af Dako HercepTest (IHC) og Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) med HER2-positivitet, der var defineret som IHC 3+ eller FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). Forsøget påviste den kliniske anvendelighed af både HercepTest (IHC) og HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) til vurdering af HER2-status hos patienter med fremskredent gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang, til hvem der overvejes behandling med trastuzumab(28). Der blev ikke indskrevet patienter, hvis tumorer ikke udviste genamplifikation, men svag til kraftig overekspression af HER2-protein [FISH(-)/IHC 2+]. Det er derfor uklart, om patienter med tumorer uden genamplifikation, men med overekspression af HER2-protein (dvs. FISH(-), IHC 2+ eller 3+), opnår gavnlig virkning af behandling med Herceptin. Forsøget påviste også, at genamplifikation (FISH) og overekspression af protein (IHC) ikke er så korreleret som med brystkræft, hvor der ikke bør anvendes en enkelt metode til fastlæggelse af HER2-status. Dette produkt (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) er en IQISH-probeblanding til automatiseret direkte FISH-påvisning af HER2-genamplifikation. Produktet bør anvendes sammen med de angivne tilhørende reagenser i Dako Omnis, og det udledes fra den manuelt udførte analyse af HER2-genamplifikation, HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731. Procedureprincip - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en IQISH-probe, der består af en blanding af Texas Red-mærkede DNA-prober, der dækker 218 kb-området, herunder HER2-genet på kromosom 17, og en blanding af fluorescein-mærkede PNA-prober peptidnukleinsyre)(13), der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN-17). Specifik hybridisering til de to målområder resulterer i dannelse af et distinkt rødt fluorescenssignal i hvert HER2-genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17-centromer. Vurdering af HER2-genamplifikation ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en fuldt automatiseret metode på Dako Omnis-instrumentet. Det er muligt at vælge mellem tre forskellige validerede HER2 FISH-farvningsprotokoller i programmet på Dako Link Omnisarbejdsstationen. Protokollerne afviger kun i forhold til pepsinnedbrydningstid, og det er således muligt at vælge pepsinnedbrydning i 10 min (protokollen Short), 15 min (protokollen Medium) og 20 min (protokollen Long) (se mere nedenfor). Protokollen Medium anbefales til den indledende analyse. Efter farvning i Dako Omnis monteres prøverne med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), og dækkes af dækglas. Ved brug af et fluorescensmikroskop, der er udstyret med passende filtre (se appendiks 5), lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signaler. Herefter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som intern positiv kontrol af forbehandlingens og hybridiseringens effektivitet. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 27/55

For detaljer, se afsnittet Fortolkning af farvning. Gastrisk kræft Se brugervejledningerne til Dako Omnis for detaljerede oplysninger om indsættelse og udtagning af objektglas, ISH-låg (Dako Omnis), kode GC102, reagenser, bulkvæsker og affald. Reagenser - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser kan bestilles separat som enkeltstående reagenser. Medfølgende materialer HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, blanding af Texas Red-mærkede HER2 DNA-prober og fluorescein-mærkede CEN-17 PNA-prober, der er klar til brug og leveres i IQISH-hybridiseringsbuffer. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) forsendes i tøris. For at sikre, at reagenset ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Flasker med tøet reagens skal altid opbevares og håndteres i lodret stilling. Der er en guldbelagt metalkugle i alle flasker med reagens, således at reagenset kan blandes ved hjælp af Dako Omnis blandingsudstyr (se brugervejledningen til Dako Omnis blandingsudstyr). Det er vigtigt, at reagenset blandes grundigt, inden flasken indsættes i Dako Omnis. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Tilhørende reagenser Følgende reagenser er påkrævet i Dako Omnis-instrumentet for at udføre en analyse af HER2-genamplifikation med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, koncentreret 20x, skal fortyndes i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske (kode GC109). Produktet indeholder et bakteriehæmmende middel og et inert grønt farvestof for nem identifikation og brugervenlighed. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% ethanol (klar til brug). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepsin A-opløsning (klar til brug), ph 2,0, indeholder stabiliseringsmiddel og et bakteriehæmmende middel. Pepsin forsendes i tøris. For at sikre, at reagenset ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml natriumcitrat-saltvandsopløsning, koncentreret 20x, skal fortyndes 1:20 i en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske (kode GC109). Produktet indeholder et bakteriehæmmende middel, et rengøringsmiddel og et inert gult farvestof for nem identifikation og brugervenlighed. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescensmonteringsmedium (klar til brug) med DAPI. Ovenstående reagenser leveres ikke sammen med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), men beskrives alligevel kort nedenfor. Se brugsvejledningen til de enkelte anordninger for yderligere oplysninger. Tilhørende reagenser og anordninger Dako Omnis, kode Gl100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kode GC807 Clearify TM, kode GC810 Dako Omnis blandingsudstyr, kode GC116 ISH-låg, kode GC102 ISH Cleaning Solution, kode GC207 (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 28/55

Dækglas af glas til montering (24 mm x 50 mm) Gastrisk kræft Se den grundlæggende og den avancerede brugervejledning til Dako Omnis angående brug af tilhørende reagenser og anordninger. Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI- og FITC/Texas Red-dobbeltfilter eller FITC- og Texas Red-monofiltre - se appendiks 5 for flere oplysninger. Brug af et DAPI-filter ved høj forstørrelse har en negativ indvirkning på signalets intensitet. Lange eksponeringstider bør undgås. Der bør anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære. Andre lyskilder anbefales ikke til disse filtre. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende) Forholdsregler - Gastrisk 1. Til in vitro-diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indeholder 10-<25% ethylenkarbonat og 3-<5% natriumchlorid. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær øjen- eller ansigtsbeskyttelse. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet. 4. Vævsprøver og alle materialer, der komme i berøring med disse, skal både før og efter fiksering håndteres som potentielt smittefarlige og skal bortskaffes under overholdelse af de korrekte forholdsregler (14). Pipetter aldrig reagenser med munden, og undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og prøver. Vask med rigelige mængder vand, hvis reagenser kommer i kontakt med overfølsomme områder. 5. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlbehæftede resultater. 6. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 7. Reagenset er fortyndet optimalt. Yderligere fortynding kan medføre manglende effektivitet. 8. Brug passende personlige værnemidler for at undgå kontakt med øjne og hud. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 9. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, national og EU-retlig lovgivning. 10. De gastriske kræftprøvers heterogene natur betyder, at det er vigtigt at foretage en grundig scanning af hele prøven for at evaluere signalfordelingen, inden området for signaltælling vælges. 11. Evaluering af meget små præparater anbefales ikke (dvs. at præparaterne skal have intakt morfologi og tilstrækkelige kerner til tælling). 12. Hvis der udføres en HER2 FISH-analyse på en biopsiprøve, skal adskillige (7-8) evaluerbare biopsier fra forskellige områder af tumoren analyseres for at sikre korrekt fastlæggelse af HER2-status. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 29/55

Gastrisk kræft 13. Med henblik på identifikation af samtlige vævskerner i en biopsiprøve er det vigtigt at kontrollere det H&E-farvede objektglas. 14. HER2-genamplifikation og overekspression af HER2-protein er ikke så godt korreleret ved gastrisk kræft som ved brystkræft, hvorfor der ikke bør anvendes en enkelt metode til fastlæggelse af HER2-status. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 30/55

Gastrisk kræft Opbevaring - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal opbevares mørkt ved < 18 C ( 18 C til 25 C anbefales). Flasker med optøet reagens skal altid opbevares i lodret stilling. Frysning og optøning af reagenset op til 10 gange påvirker ikke præstationen. Denne komponent må ikke opbevares i stuetemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser, ISH Pepsin (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), kan blive påvirket, hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse komponenter ved stuetemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og det tilhørende reagens, Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), kan blive påvirket, hvis de udsættes for meget og kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. De tilhørende reagenser, ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), skal opbevares mørkt ved 2-8 C. ISH Pepsin (Dako Omnis) skal opbevares ved -18-8 C. Flaskens låg, herunder flip låget, skal være lukket for alle reagenser under opbevaring. Fortyndede opløsninger (brugsopløsning af ISH Stringent Wash Buffer og ISH Pre-Treatment Solution) kan opbevares ved 2-8 C i 30 dage. Reagenser må ikke anvendes efter den udløbsdato, der er stemplet på reagensbeholderen. Under opbevaring skal låget, herunder fliplåget, være lukket. Hvis reagenser opbevares under andre betingelser end de angivne, skal brugeren validere reagensets præstation(15). Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt DAKOs tekniske service ved observation af et uventet fluorescensmønster, der ikke kan forklares, og hvor der er mistanke om et problem med HER2 IQFISH pharmdx. Holdbarhed i Dako Omnis-instrumentet Holdbarheden af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og de tilhørende reagenser i instrumentet, ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), er 80 timer. Holdbarheden af fortyndet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) og ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) er 7 dage i instrumentet. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren. Brug af udløbne reagenser vil medføre, at der vises en advarsel på Dako Omnis-instrumentet, at alle objektglas, der farves med det udløbne reagens får status "mistænkelig", og at objektglasloggen på arbejdsstationen viser, at der er anvendt et udløbet reagens. Klargøring af prøver - Gastrisk Prøver af gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang fra biopsier, excisioner og resektioner skal håndteres, således at vævet bevares til FISH-analyse. Der bør anvendes standardmetoder til behandling af væv til immunhistokemisk farvning for alle prøver (16). Ved undersøgelse af små biopsiprøver fastslås intakt tumormorfologi og forekomsten af tilstrækkelige tumorceller til tælling. Hvis der udføres en HER2 FISH-analyse på en biopsiprøve, skal adskillige (7-8) evaluerbare biopsier fra forskellige områder af tumoren analyseres for at sikre korrekt fastlæggelse af HER2-status. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 31/55

Gastrisk kræft Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Prøverne kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i 18-24 timer i neutral, bufferjusteret formalin. Biopsiprøverne blev fikseret i 6-8 timer i ToGA-forsøget (se (28) for en reference til forsøget). Vævet dehydreres derefter i en gradueret serie af ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur maks. må være 60 C. Korrekt fikseret og indstøbt væv kan holde sig uendeligt inden sektionering og montering på objektglas, hvis det opbevares køligt (15-25 C) (16-17). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævsprøver skal opskæres i snit med en tykkelse på 3-6 µm. De nødvendige objektglas til analyse af HER2-genamplifikation samt bekræftelse af forekomst af tumor bør klargøres samtidig. Det anbefales at anvende mindst to serielle snit: Et snit til bekræftelse af forekomst af tumor, der farves med hæmatoxylin og eosin (H&E stain), og et snit til analyse af HER2-genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kode K8020. Superfrost Plus-objektglas (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) er også velegnet. Det skal sikres, at objektglassene ikke har overskredet udløbsdatoen. Prøverne skal analyseres maks. 6 måneder efter sektionering ved opbevaring ved 2-25 C. BEMÆRK: Vævsprøverne skal placeres inden for det angivne farvningsområde på objektglasset. Se den grundlæggende brugervejleding til Dako Omnis for målene på objektglassets farvningsområde. BRUGSVEJLEDNING - Gastrisk A. Klargøring af reagens - Gastrisk A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Flasken med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indeholder en guldbelagt metalkugle, der bruges til blanding. Inden flasken placeres i Dako Omnis, skal reagenset optøs og blandes grundigt, da dets fase skiller under nedfrysning. Brug Dako Omnis blandingsudstyret til probeblandingen. Følg nedenstående procedure for probeblanding i Dako Omnis blandingsudstyret, og se brugervejledningen til blandingsudstyret for yderligere oplysninger. 1. Tag flasken med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ud af fryseren 2. Isæt flasken i Dako Omnis blandingsudstyret 3. Tilslut blandingsudstyret og sørg for, at den grønne lampe er tændt. 4. Vælg programmet "Thaw + mix" (Optøning + blanding). Vigtigt: Flasker, der opbevares under 25 C, skal optøs (kun lige), inden flasken indsæt tes i Dako Omnis blandingsudstyret, og programmet Mix (Bland) bør benyttes. 5. Udtag flasken af blandingsudstyret 6. Åbn fliplåget, tryk det bagud og klik det i position (se den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger). 7. Indsæt omgående flasken i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis-instrumentet. Hvis funktionen til kontinuerlig tilførsel af reagens anvendes under farvningskørslen, skal det sikres, at tiden fra blanding til aspiration af flasken i Dako Omnis er mindst 10 min. Proben fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kan optøs og anvendes igen op til 10 gange. Proben fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal altid blandes inden indsættelse i instrumentet. Den må ikke rystes. Den samlede holdbarhed i instrumentet af ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 32/55

Gastrisk kræft Når HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har været i Dako Omnis, skal det omgående overføres til < 18 C ( 18 C til -25 C anbefales ). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Klargør en brugsopløsning ved at fortynde koncentreret ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 som følger: 1. Fyld en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske mærket PTB (blå etiket) til påfyldningslinjen med deioniseret vand (3,325 L). Sørg for, at bulkflasken er placeret på en vandret flade, før den fyldes. 2. Tøm en flaske med 175 ml koncentreret ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) i bulkflasken. 3. Flyt den aftagelige mærkat fra koncentratflasken til bulkflasken. Sæt bulkflaskens låg på, og vend bulkflasken på hovedet 2-3 gange. 4. Brug den håndholdte Dako Omnis-stregkodescanner til at identificere reagenset (scan den aftagelige mærkat og bulkflasken). 5. Isæt straks bulkflasken på Dako Omnis-instrumentet. Den fortyndede opløsning kan anvendes inden for 7 timer, når den opbevares på Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Ubrugt, fortyndet opløsning kan opbevares ved 2-8 C i 30 dage. Når den fortyndede opløsning har været opbevaret koldt, skal det sikres, at den afbalanceres til min. 18 C inden indsættelse i Dako Omnis. BEMÆRK: Smid fortyndet opløsning bort, hvis den er uklar. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Klargør en brugsopløsning ved at fortynde koncentreret ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 som følger: 1. Fyld en Dako Omnis 3,5 L bulkflaske mærket PTB (blå etiket) til påfyldningslinjen med deioniseret vand (3,325 L). Sørg for, at bulkflasken er placeret på en vandret flade, før den fyldes. 2. Tøm en flaske med 175 ml koncentreret ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) i bulkflasken. 3. Flyt den aftagelige mærkat fra koncentratflasken til bulkflasken. Sæt bulkflaskens låg på, og vend bulkflasken på hovedet 2-3 gange. 4. Brug den håndholdte Dako Omnis-stregkodescanner til at identificere reagenset (scan den aftagelige mærkat og derefter bulkflasken). 5. Indsæt omgående bulkflasken i Dako Omnis-instrumentet. Den fortyndede opløsning kan anvendes inden for 7 timer, når den opbevares på Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2-8 C i op til 30 dage. Når den fortyndede opløsning har været opbevaret koldt, skal det sikres, at den afbalanceres til min. 18 C inden indsættelse i Dako Omnis. BEMÆRK: Smid fortyndet opløsning bort, hvis den er uklar. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 33/55

Gastrisk kræft A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er et reagens, der er klar til brug. Åbn flaskens fliplåg, skub det tilbage og klik det i position inden indsættelse i Dako Omnis. Den samlede holdbarhed af ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Når kørslen er færdig, kan ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) overføres til stuetemperatur (2-8 C) for at forlænge holdbarhedstiden i instrumentet. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) er et reagens, der er klar til brug. Åbn flaskens fliplåg, skub det tilbage og klik det i position inden indsættelse i Dako Omnis, når det først er konstateret, at reagenset er optøet. Den samlede holdbarhed i instrumentet af ISH Pepsin (Dako Omnis) er 80 timer ved opbevaring i reagensopbevaringsmodulet i Dako Omnis. Den resterende holdbarhed i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren (se ovenfor). Når kørslen er færdig, kan ISH Pepsin (Dako Omnis) overføres til stuetemperatur ved -18-8 C for at sp are på stabilitetstiden i instrumentet. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) er et monteringsmedium, der er klar til brug, som bruges uden for Dako Omnis-instrumentet. Overfør Fluorescence Mounting Medium til opbevaringstemperatur (2-8 C) umiddelbart efter br ug. A.7 Yderligere tilbehør Følgende tilbehør bør også indsættes i Dako Omnis: Deioniseret vand, fortyndet Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kode GC807, Clearify (Dako Omnis), kode GC810, ISH Cleaning Solution, kode GC207 og ISH-låg (Dako Omnis), kode GC102, som angivet i brugervejledningerne til Dako Omnis. B. Farvningsprocedure - Gastrisk B.1 Procedurebemærkninger HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben til den automatiserede analyse af direkte fluorescens in situ-hybridisering (FISH) i Dako Omnis-instrumentet og er sammen med de tilhørende reagenser, GM300, GM301, GM302, GM303 og GM304 (GM304 uden for instrumentet), designet til kvantitativ fastlæggelse af HER2-genamplifikation. Brugeren bør inden brug læse alle vejledninger grundigt og sætte sig ind i alle komponenter og de relaterede forholdsregler. Den automatiserede procedure i Dako Omnis omfatter afparaffinering af vævssnit, target retrieval, pepsinnedbrydning, hybridisering og stringent vask. Objektglassene udtages i den tørre udtagningsstation. Alle protokoltrin er forprogrammeret i Dako Omnis-softwaren. Se brugervejledningerne til Dako Omnis for en vejledning til indsættelse af objektglas, ISH-låg, reagenser osv. Dako Omnis-softwaren er forprogrammeret med tre validerede HER2IQFISHprotokoller: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium og HER2 IQFISH Pepsin Long. Protokollerne adskiller sig kun fra hinanden i forhold til tiden for pepsinnedbrydning, og de kan vælges for hver af de fem objektglas i objektglasholderen. Det muliggør optimering af vævsfordøjelsen, som kan afhængige af præanalytiske forhold. Protokollen HER2 IQFISH Pepsin Medium anses for standardprotokollen. De forskellige farvningsprotokoller kan ses i Dako Link Omnis-arbejdsstationen. B.2. Forfarvningsprocedure 1. Vælg den HER2 IQFISH-protokol, der skal anvendes til de enkelte objektglas, i programmet på Dako Link Omnis-arbejdsstationen under IQFISH-protokoller. 2. Udskriv mærkater til objektglassene, og sæt dem på. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 34/55

Gastrisk kræft 3. Sæt objektglassene i objektglasholderen. Læs den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger. Der kan være op til fem objektglas i en objektglasholder. Det anbefales, at mindst to objektglas farves i en HER2 IQFISH-farvningskørsel. 4. Indsæt objektglasholderen i Dako Omnis-instrumentet. 5. Indsæt ISH-låg (et ISH-låg pr. objektglas) i Dako Omnis-instrumentet. 6. Sørg for, at der er indsat bulkflasker med væsker i Dako Omnis-instrumentet, og at instrumentet har registreret dem. Bulkflaskevæsker: Clearify (rengøringsmiddel), fortyndet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), fortyndet ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) og fortyndet Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Indsæt ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), det friskblandede HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og ISH Cleaning Solution i reagensopbevaringsmodulet. Sørg for, at alle fliplågene på flaskerne er åbne. 8. Følg vejledningen på berøringsskærmen, og tryk på "Done" (Færdig) for at starte farvningsproceduren. B.3. Farvningsprocedure HER2 IQFISH-farvningsproceduren i Dako Omnis-instrumentet (opsummeres i tabel 11) kan overvåges på Dako Link Omnis-arbejdsstationen: Tabel 11. Forenklet oversigt over trinnene i HER2 IQFISH-farvningsprotokollen. Trin Reagens Tid og temperatur Afparaffinering Clearify (rengøringsmiddel) 10 min. ved 38 C Target retrieval ISH Pre-Treatment Solution 15 min., 97 C (Dako Omnis) Vask ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 min. ved 32 C (Dako Omnis) Fordøjelse* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 min., 15 min. eller 20 min. Tørring 15 min. ved 45 C Denaturering 10 min. ved 66 C Hybridisering HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 min. ved 45 C Stringent vask ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 min. ved 61 C * Det er muligt at vælge mellem tre validerede nedbrydningstider for pepsin ved hjælp af de ovenfor nævnte HER2 IQFISHprotokoller. Overfør alle reagenser til de anbefalede opbevaringstemperaturer, hvis der ikke umiddelbart skal udføres yderligere ISH-farvning. B.4. Efterfarvningsprocedure Udtag objektglassene og tilfør op til 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI i objektglassets målområde. Vævssnittet skal være helt dækket af Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Afdæk med et dækglas af glas. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglas opbevares mørkt ved -18-8 C. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 35/55

Gastrisk kræft Kvalitetskontrol - Gastrisk 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Normale celler bør indeholde 1-2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN-17-PNA-proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler bør ligeledes indeholde 1-2 klart synlige røde signaler, der indikerer, at HER2 DNA-proben har hybridiseret godt til HER2-genet/-erne På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en analysefejl, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer overfordøjelse af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Der skal være mindst 20 tumorceller, der kan evalueres. 5. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning - Gastrisk Evaluerbart væv Find tumoren på det H&E-farvede objektglas, og evaluer det samme område på det FISH-farvede objektglas (i DAPI-filteret). Kun prøver fra patienter med gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang bør analyseres. I tilfælde med intestinal metaplasi og adenokarcinom i samme præparat skal kun karcinomkomponenten bedømmes. Undgå områder med kraftig inflammation, nekrose og områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Medtag ikke kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund. Start med en mikroskopisk vurdering af henholdsvis hele det FISH-farvede snit og det område, der er udpeget på H&E-snittet. Inden tælling af det FISH-farvede snit noteres den generelle signalfordeling (homogen eller heterogen) på arket til signaltælling. I tilfælde af heterogen fordeling noteres det, hvorvidt der forekommer fokal amplifikation eller enkeltcelleamplifikation (mosaik). 1) Homogen signalfordeling Såfremt signalfordelingen er homogen, tælles henholdsvis antallet af kromosomcentromerer (grønne signaler) og antallet af HER2-gener (røde signaler fra 20 celler i 1-2 repræsentative tumorområder. 2) Heterogen signalfordeling Såfremt signalfordelingen er heterogen, evalueres i alt 20 celler fra udvalgte områder som specificeret herunder: A) Hvis der er fokal amplifikation, skal der udvælges områder med amplificerede celler. B) I tilfælde af mosaikfordeling eller forekomst af amplificerede, polysomale og disomale celler tælles der i områder med amplificerede celler. Inden for disse områder skal ikke kun amplificerede celler, men også de tilstødende ikke-amplificerede celler tælles for et samlet antal på 20 celler. Undgå om muligt at udvælge overlappende områder. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 36/55

Gastrisk kræft Ignorer farvning af bakterielt DNA Et antal specialiserede celler (mastceller og makrofager), der er spredt i det gastriske væv, udviser et højt farvningsniveau ved HER2-proben pga. forekomst af bakterielt DNA. Det resulterer i røde fluorescente celler, der tydeligt adskiller sig fra tumorceller med høj HER2- genamplifikation. Signaltælling Når et område er blevet udvalgt til signalevaluering, skal analysen startes i én af de 20 tilstødende valgte kerner, og derefter skal tælling foretages celle for celle, hvor der kun ses bort fra kerner, der ikke opfylder kvalitetskriteriet. Find tumoren på det H&E-farvede objektglas, og evaluer det samme område på det FISH-farvede objektglas. Scan hele det farvede objektglas for at tage højde for eventuel heterogenitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område, idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kernegrænsen i hver evalueret celle i henhold til nedenstående retningslinjer (se også appendiks 5). - Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. - To signaler, der har samme størrelse og er adskilt af en afstand, der er lig med eller mindre end signalets diameter, tælles som kun ét signal. Afstanden skal mindst være lig med diameteren af ét signal af normal størrelse for at tælle to individuelle signaler. Når afstanden mellem to signaler er mindre end signalets diameter, skal det tælles som ét. - I kerner med høje niveauer af HER2-genamplifikation kan HER2-signalerne ligge meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I sådanne tilfælde kan antallet af HER2-signaler ikke tælles, men skal i stedet estimeres. Vær særligt opmærksom på de grønne signaler, da klynger af røde HER2-signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved hjælp af et specifikt FITC-filter. Tæl ikke kerner uden signaler, eller med signaler af kun en farve, med. Tæl kun kerner, der indeholder et eller flere FISH-signaler af hver farve. Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kernerne lapper over hinanden, ikke alle kernernes områder er synlige 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under- eller overfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donut-formede kerner). 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 37/55

Gastrisk kræft 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC-filter, eller tæl ikke Optegn tallene i en tabel som vist i Appendiks 3 og 4. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, når det er muligt, fra distinkte tumorområder. Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde HER2-signaler med det samlede antal grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold, der er større end eller lig med 2, skal betragtes som værende HER2-genamplificerede(29). Resultater på eller i nærheden af cut-off (1,8-2,2) skal fortolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er på grænsen (1,8-2,2), tælles 40 andre kerner, hvorefter forholdet beregnes for de 40 kerner. Hvis tællingen stadig er på grænsen, er resultatet af den anden evaluering gyldigt. En immunhistokemisk farvning af HER2 skal i givet fald inkluderes for bedre orientering under den anden tælling. Objektglasset med prøven skal tælles igen i tvivlstilfælde. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskeligt. Begrænsninger - Gastrisk 1. Kun til automatiseret brug i Dako Omnis-instrumenter. 2. Specialiseret træning er påkrævet for valg af væv og klargøring af objektglas samt fortolkning af IQFISH-farvning. Fortolkning af HER2 IQFISH pharmdx -farver (Dako Omnis) bør ikke udføres af farveblinde personer. 3. Resultater af FISH er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridiseringen. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. Præstationskarakteristika - Gastrisk Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten af HER2 IQFISH pharmdx blev undersøgt ved hjælp af 180 formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit, der blev undersøgt på tre forsøgscentre. Alle 180 vævssnit kunne tælles i henhold til produktets retningslinjer for tælning. Hybridiseringseffektiviteten var 100%. De HER2/CEN-17-forhold, der beregnes og anvendes i undersøgelserne af præsentationskarakteristika, er baseret på tælning af signaler i 20 kerner ved hjælp af de retningslinjer for scoring, der angives i afsnittet Fortolkning af farvning i denne brugervejledning. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev undersøgt ved hjælp af 20 forskellige prøver af gastrisk adenokarcinom (10 prøver med amplificeret HER2-genstatus og 10 ikke-amplificerede prøver). Forholdet mellem antallet af HER2-signaler og CEN-17- signaler blev beregnet på baggrund af tælning af signaler i 20 kerner fra normale celler i (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 38/55

Gastrisk kræft vævsprøverne. HER2/CEN-17-forholdet for de 20 vævsprøver af gastrisk adenokarcinom var mellem 0,94 og 1,19. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberne i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er blevet ende-sekvenseret og kortlagt for at bekræfte total dækning af 218 kb, herunder HER2 -genet. CEN-17 PNA-proberne i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er blevet undersøgt separat og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at udelukke krydshybridisering til andre kromosomer end kromosom 17 blev metafasespredninger undersøgt i henhold til standardprocedurer for Dako QC. Sammenlagt blev 275 metafasespredninger med distinkte signaler evalueret for specifik hybridisering af HER2 DNA- og CEN-17 PNA-probeblandinger. Hybridiseringen var specifik for kromosom 17 i alle 275 tilfælde. I ingen af de 275 tilfælde blev der observeret krydshybridisering til loci på andre kromosomer. Probespecificiteten var dermed 100% (275 af 275). Til måling af IQFISH-analysens evne til udelukkende at identificere målstofferne HER2 og CEN- 17 uden interferens fra andre stoffer blev vævsprøver af gastrisk adenokarcinom undersøgt ved at udelade HER2- og CEN-17-proberne fra hybridiseringsblandingen og udelukkende anvende hybridiseringsbufferen. Der blev evalueret i alt 20 prøver for forekomst af signaler, der ikke var forbundet med probeblandingen. I ingen af de 20 prøver blev der observeret detektion af andre kromosommål eller interferens med nært forbundne stoffer. Robusthedsundersøgelser Robustheden af HER2 IQFISH pharmdx -analysen (Dako Omnis) blev undersøgt ved at anvende skiftende PNA-probekoncentration, tid til target retrieval, inkubationstid for pepsin, denatueringstid, hybridiseringstid samt tid og temperatur for stringent vask. De forskellige parametre blev undersøgt på tre forskellige FFPE-vævsprøver af gastrisk adenokarcinom og FFPE-vævsprøver af den gastroesofageale overgang (GEJ) (der indgik både amplificerede eller ikke-amplificerede vævsprøver i begge grupper). Alle parametre blev undersøgt både under og over standardindstillingen for de respektive protokoller, bortset fra PNA-probekoncentration og temperatur for stringent vask, hvor standardindstillingen for protokollen indgik i opsætningen. Testparametrene var: PNA-probekoncentration: Undersøgt ved 100% og +/-17%. Tid til target retrieval: Undersøgt ved 13 min. 45 sek. samt 16 min. og 15 sek. Inkubationstid for pepsin: Undersøgt ved 14 min. 45 sek. samt 16 min. og 15 sek. Denatureringstid: Undersøgt ved 9 min. 45 sek. samt 10 min. og 45 sek. Hybridiseringstid: Undersøgt ved 70 min. og 80min. Tid for stringent vask: Undersøgt ved 8 min. 45 sek. samt 11 min. og 15 sek. Temperatur for stringent vask: Undersøgt ved 59 C, 61 C og 63 C. De tre PNA-probekoncentrationer blev vurderet i et fraktioneret eksperimentdesign (JMP-værktøj, SAS), som blev udført med 12 forskelige farvningsprotokoller som angivet i tabel 12. Tabel 12. Tolv forskellige farvningsprotokoller, der blev anvendt i robusthedsundersøgelsen. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 39/55

Gastrisk kræft Robusthedsprotokol nr. Tid til target retrieval (min) Pepsintid (min) Denatueringstid (min) Testparameter Hybridiseringstid (min) Tid for stringent vask (min) Temperatur for stringent vask ( 0 C) PNA-konc. I probeblanding 1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83% 2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100% 3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100% 4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83% 5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117% 6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83% 7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100% 8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83% 9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117% 10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117% 11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100% 12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117% Alle fem vævsprøver blev farvet ved hjælp af alle 12 protokoller. Resultatet af robusthedsundersøgelsen var signalintensitet og morfologiske kvalitet. Alle protokoller gav farvning af alle vævsprøver (60 i alt) med signaler, der var lyse, distinkte og lette af evaluere, dvs. egnet til signaltælling. Herudover blev effekten af vævstykkelsen på analyseresultatet fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersøgt ved at variere snittykkelsen på FFPE-vævsprøverne af gastrisk kræft. Der blev undersøgt i alt fem på hinanden følgende prøver af gastrisk adenokarcinom med forskellig tykkelse (2, 3, 4, 5, 6 og 7 µm) med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den gennemsnitlige varianskoefficient for HER2/CEN-17-forholdet var 3,9% (svingende fra 3,2% til 5,0%). Reproducerbarhed Reproducerbarheden i laboratoriet, fra dag til dag samt fra lot til lot blev undersøgt ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Undersøgelsen var udformet som en intern, blindet, randomiseret undersøgelse af HER2/CEN-17-forholdene ved hjælp af snit fra otte forskellige formalinfikserede, paraffinindstøbte prøver af gastrisk kræft, herunder den gastroesofageale overgang (GEJ), med forskellige grader af HER2-genamplifikation. De otte prøver var blevet undersøgt med HercepTest, og bestod af to prøver med HER2 IHC 0/1+, to prøver med HER2 IHC 2+, to prøver med HER2 IHC 3+ og to prøver med et foruddefineret HER2/CEN-17 FISHforhold på mellem 1,5 og 2,5, som var opnået ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Samtlige prøver blev farvet med tre forskellige lot af HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) på fem dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden. Sammenlagt 240 vævsfarvninger blev behandlet for hele undersøgelsen, idet hver kombination blev farvet i to kopier. Udsvingene i forholdet fra dag til dag og fra lot til lot er vist i figur 8. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box- Cox transformation via en Random Effect-model for at opnå homogen datavarians. Den samlede variationskoefficient blev anslået til 6,5%, og det observeredes, at udsvingene fra dag til dag og fra lot til lot bidrog med hhv. 0,7% og 0,8%. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 40/55

Gastrisk kræft Figur 8. HER2/CEN-17-forhold fra en laboratorieundersøgelse af reproducerbarhed på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), herunder endepunkterne lot til lot og dag til dag for reproducerbarhed. Middelværdien for samtlige vævsprøver er vist med en vandret linje. Herudover blev reproducerbarheden fra dag til dag og fra center til center for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) undersøgt eksternt på tre forskellige centre (et center i USA og to centre i Europa) i en stratificeret og blindet undersøgelse af vævssnit fra tolv forskellige formalinfikserede, paraffinindstøbte prøver af gastrisk adenokarcinom, herunder den gastroesofageale overgang (GEJ). Af disse tolv prøver var tre HER2 IHC 0/1+, tre var HER2 IHC 2+, tre var HER2 IHC 3+ og tre prøver havde et foruddefineret HER2/CEN-17 FISH-forhold mellem 1,5 og 2,5, hvilket var opnået ved hjælp af hhv. HercepTest TM og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Prøverne blev farvet og analyseret på undersøgelsescentrene. Samtlige prøver blev farvet mindst syv gange på syv dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden, og scoret af en observatør på de enkelte centre. Der blev farvet 314 snit, som alle indgik i den statiske analyse. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box-Cox transformation, og varianskomponenterne blev beregnet. Den samlede varianskoefficient, som er baseret på den øvre 95% konfidensgrænse, var 24%. Udsvingene i HER2/CEN-17-forholdet for dag til dag og center til center er angivet i figur 9. Figur 9. Variabilitetsdiagram over HER2/CEN-17-forholdene i ikke-transformerede enheder fra reproducerbarhedsundersøgelsen af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vævsprøver af gastrisk kræft for dag til dag samt center til center. Analysen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) blev undersøgt for reproducerbarhed fra observatør til observatør som led i den internt udførte undersøgelse af metodesammenligning, hvori indgik tre observatører, der scorede de farvede prøver uafhængigt af hinanden. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 41/55

Gastrisk kræft Reproducerbarheden blev undersøgt på 139 forskellige prøver af gastrisk adenokarcinom med enten ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Dataene blev analyseret ved hjælp af Box-Cox transformation. Den gennemsnitlige variationskoefficient for observatør til observatør var 18%. De gastriske adenokarcinomprøver bestod af 96,4% resektions- og 5,6% biopsiprøver. 81,3% af prøverne blev taget i maven og 18,7% i den gastroesofageale overgang. Reproducerbarhed Reproducerbarheden af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på laboratoriet blev undersøgt ved hjælp af fortløbende snit fra otte prøver af gastrisk adenokarcinom med enten ikkeamplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Væv blev undersøgt i to kopier på fem dage, der ikke lå i forlængelse af hinanden, med tre forskellige lot på i alt 240 objektglas (120 snit i kopi). Random Effects-modellen blev anvendt til dataanalysen og resulterede i en varians, der kan henføres til dage og lot (se ovennævnte interne reproducerbarhedsundersøgelse). Den resterende varians står for variansen fra kopi til kopi og dermed reproducerbarhed. Den øvre 95% konfidensgrænse for variationskoefficienten for reproducerbarhed var 7,1%. Sammenlignende undersøgelse af metode Sammenligning af HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og HER2 IQFISH pharmdx (K5731) Undersøgelsen omfattede 140 prøver af gastrisk kræft, der bestod af forskellige vævstyper af gastrisk adenokarcinom, f.eks. maven eller den gastoesofageale overgang, samt resektioner eller biopsier med homogen eller heterogen (fokal eller mosaisk) signalfordeling som vist i tabel 3. Tabel 13. Fordelingen af prøver efter gastrisk kræfttype (mave eller GEJ), signalfordelingskategori (homogen eller heterogen) samt vævstype (resektion eller biopsi). Gastrisk kræfttype Antal prøver Signalfordeling Antal prøver Vævstype Antal prøver Mave 113 Homogen 58 Resektion 134 Gastroesofageale overgang (GEJ) 27 Heterogen fokal Heterogen mosaisk 61 21 Biopsi 6 I alt 140 I alt 140 I alt 140 Prøverne bestod af 76 ikke-her2-amplificerede tilfælde og 64 HER2-amplificerede tilfælde med kendt score fra HercepTest som vist i tabel 14. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 42/55

Gastrisk kræft Tabel 14. Fordeling af prøverne på baggrund af HercepTest - og HER2 FISH-score, som er opnået med HER2 FISH pharmdx Kit (K5731). Score for HercepTest - farvning 0 1+ 2+ 3+ I alt n 39 14 45 42 140 HER2 FISH-status Amplificeret 4 1 19 40 64 Ikke-amplificeret 35 13 26 2 76 FISH-undersøgte prøver i alt 39 14 45 42 140 Resultatet af krydstabulering af HER2-status, der er opnået ved hjælp af to analyser med beregning af overordnet procentoverensstemmelse (OPA), positiv procentoverensstemmelse (PPA) og negativ procentoverensstemmelse (NPA), er vist i tabel 15. Figur 10 viser korrelationen mellem HER2/CEN-17-forholdene ved hjælp af de to analyser. Tabel 15. Krydstabulering af HER2-genstatus, som er opnået ved hjælp af HER2 IQFISH pharmdx (K5731) og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikkeamplificeret HER2- genstatus (Dako Omnis) HER2-genstatus (K5731) Ikkeamplificeret Amplificeret I alt 76 1 77 Amplificeret 0 63 63 I alt 76 64 140 OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% Figur 10. Korrelation mellem HER2/CEN-17-forhold fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) på 140 prøver af gastrisk kræft (lineær regression: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. Vægtet med omvendt varians for at tage højde for lineær regression). 95% konfidensintervallet for den gennemsnitlige forskel for de to farvningsmetoder var [0,007; 0,022] ved HER2/CEN-17-forhold = 2. Det betyder, at en forskel på over 2% ikke forventes. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 43/55

Gastrisk kræft Kliniske data Den kliniske sikkerhed og virkning af trastuzumab (Herceptin ) blev påvist i BO18255-forsøget (ToGA-forsøget, Et open-label, randomiseret, multicenter-, fase III-forsøg med traustuzumab i kombination med cisplatin og fluoropyrimidin (capecitabin eller 5-fluorouracil) (FC+H) i forhold til kun kemoterapi som førstelinjebehandling til patienter med HER2-positiv, fremskreden gastrisk kræft ) (28). Forsøget var udformet som et open-label, randomiseret, multicenter-, fase III-forsøg med HER2-positive patienter med fremskredent gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroesofageale overgang. I BO18255-forsøget var HER2-positivitet defineret som værende enten IHC-positiv (3+) ved hjælp af HercepTest (Dako) og/eller FISH-positiv (HER2/CEN-17 2,0) ved hjælp af HER2 FISH pharmdx Kit (Dako). Efter inklusion i forsøget blev patienterne randomiseret til behandling med kemoterapi (5-FU eller capecitabin og cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det primære mål for resultatet af lægemidlets effekt var overordnet overlevelse (OS), som blev analyseret ved hjælp af stratificerede Mantel-Haenzel-analyser. Den endelige OS-analyse, som var baseret på 351 dødsfald, var statistisk signifikant (et nominelt signifikansniveau på 0,0193). Der blev endvidere udført en opdateret OS-analyse 1 år efter den endelige analyse. En middel overordnet overlevelse på 13,5 måneder i armen med Herceptin plus kemoterapi var signifikant længere end de gennemsnitlige 11 måneders overordnet overlevelse i armen, hvor der kun blev anvendt kemoterapi. Resultatet af lægemidlets effekt for både den endelige og den opdaterede analyse er opsummeret i tabel 16 og figur 11. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 44/55

Gastrisk kræft Tabel 16. Overordnet overlevelse i ITT-populationen (ITT). Endelig overordnet overlevelse Antal. dødsfald (%) Median 95% KI (mdr.) Hazard-ratio 95% KI p-værdi*, tosidet Opdateret overordnet overlevelse Antal. dødsfald (%) Median 95% KI (mdr.) Hazard-ratio 95% KI FC-arm (n= 296) 184 (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) *I sammenligning med det nominelle signifikansniveau på 0,0193 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) FC + H-arm N=298 167 (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9, 15,1) Figur 11. Opdateret overordnet overlevelse hos patienter med metastatisk gastrisk kræft (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 45/55

Gastrisk kræft Tabel 17 indeholder et sammendrag af en eksploratorisk analyse af OS på baggrund af undersøgelser af genamplifikation (FISH) og overekspression af protein (IHC). Tabel 17. Eksploratoriske analyser af HER2-status med opdaterede resultater for overordnet overlevelse. FISH+ / IHC 0, 1+-undergruppe (N=133) Antal. dødsfald / n (%) Middel OS-varighed (mdr.) 95% KI (mdr.) FC N=296 a FC+H N=298 b 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) Hazard-ratio (95% KI) 1,33 (092, 1,92) FISH+ / IHC2+-undergruppe (N=160) Antal. dødsfald / n (%) 65/80 (81%) 64/80 (80%) Middel OS-varighed (mdr.) 95% KI (mdr.) 10,8 (6,8, 12,8) 12,3 (9,5, 15,7) Hazard-ratio (95% KI) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+- eller FISH-/IHC3+ c -undergruppe (N=294) 104/143 (73%) Antal. dødsfald / n (%) 13,2 Middel OS-varighed (mdr.) (11,5. 15,2) 95% KI (mdr.) Hazard-ratio (95% KI) 0,66 (0,5, 0,87) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Middeloverlevelse blev estimeret på baggrund af Kaplan-Meier-kurver. a To patienter i FC-armen, som var FISH+, men med ukendt IHC-status, blev ikke medtaget i analyserne. b Fem patienter i Herceptin -armen, som var FISH+, men med ukendt IHC-status, blev ikke medtaget i analyserne. c Omfatter seks patienter fra kemoterapiarmen, ti patienter fra Herceptin -armen med FISH-, IHC3+ og otte patienter fra kemoterapiarmen, otte patienter fra Herceptin -armen med ukendt FISH-status, IHC3+. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 46/55

Gastrisk kræft Fejlfinding Gastrisk Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler 1a. Reagenserne har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Sørg for, at der var tøris i pakken ved modtagelsen af IQISH-probeblandingen og pepsinet. Sørg for, at reagenserne er blevet opbevaret i henhold til specifikationen. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnet til brug sammen med probeblandingens fluorokromer samt at kviksølvslampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt udover den forventede levetid (se appendiks 5). I tvivlstilfælde kontaktes mikroskopleverandøren. 1c. Falmede signaler 1c. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimér eksponeringen for kraftigt lys. 1d. Forkert identificerede buffere 1d. Udskift bulkbuffere og sørg for korrekte registrering (på arbejdsstationen) og identifikation (på berøringsskærmen) af bulkbuffere. Se den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for flere oplysninger. Bemærk: ISH Pre-Treatment Solution er grønt, og ISH Stringent Wash Buffer er gult. 2. Områder uden signal 2. Der er opstået luftbobler under montering 2. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 47/55

Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning 3. Stor baggrundsfarvning 4. Dårlig vævsmorfologi 5. Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset, herunder i områder uden FFPE-væv Gastrisk kræft 3a. Forkert vævsfiksering 3a. Sørg for, at der kun anvendes formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 3b. Det hybridiserede snit har været udsat for kraftigt lys i længere tid. 4a. Forkert behandling med pepsin 4b. Pepsinbehandling i for lang tid eller en meget tynd snittykkelse kan medføre, at der kommer spøgelsesceller eller donut-celler. 5. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas. 3b. Undgå lange undersøgelser under mikroskop og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 4a. Skift til en anden af de tre forskellige farvningsprotokoller. Sørg for, at ISH Pepsin opbevares ved den korrekte temperatur. 4b. Prøv en farvningsprotokol med en kortere inkubationstid for pepsin. Sørg for, at snittykkelsen er 3-6 µm. 5. Vælg objektglas i henhold til specifikationen. Det skal sikres, at objektglassene ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Kontakt DAKOs tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp, hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 48/55

Gastrisk kræft Appendiks 3 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Scoringsskema Dato for kørslen: Id for farvekørselslog: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Prøve-id: Karakterisering af signalfordeling i væv: Homogen: Heterogen - Fokal: eller Heterogen - Mosaisk Kerneantal HER2- score (rød) Tæl signaler i 20 kerner CEN-17- score (grøn) Kerneantal HER2 - score (rød) CEN-17- score (grøn) 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 I alt (1-10) I alt (11-20) Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN-17-signaler i de samme 20 kerner, hvorefter det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er på grænsen (1,8-2,2), tælles 40 andre kerner, hvorefter forholdet for de 40 kerner genberegnes (se Scoringsskema til ny tælling, appendiks 4). Resultater på eller tæt på cut-off (1,8-2,2) skal fortolkes med forsigtighed (se tællevejledningen). (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 49/55

Gastrisk kræft Samlet score (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikation ikke observeret Forhold 2: HER2-genamplifikation observeret Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: Se Fortolkning af farvning for retningslinjer for tælling. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 50/55

Gastrisk kræft Appendiks 4 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode GM333 Scoringsskema til ny tælling Dato for kørslen: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lot: Id for farvekørselslog: Prøve-id: Signaler i 40 ekstra kerner (1-40) HER2 (rød) CEN17 (grøn) HER2 (rød) CEN-17 (grøn) HER2 (rød) CEN-17 (grøn) Kerneantal Kerneantal Kerneantal Kerneantal HER2 (rød) CEN-17 (grøn) 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 I alt I alt I alt I alt (1-10) (11-20) (21-30) (31-40) Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN-17-signaler i de samme 40 kerner, hvorefter det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN- 17-signaler. Angiv den samlede score fra de 1-40 kerner i nedenstående skema. Samlet score (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikation ikke observeret Forhold 2: HER2-genamplifikation observeret Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: Se Fortolkning af farvning for retningslinjer for tælling. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 51/55

Gastrisk kræft Appendiks 5 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode GM333 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til brug sammen med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden) 3. Objektiver Olieimmersionsobjektiver af typen 16X eller 20X gælder for screening af væv Til højeffektsforstørrelse og tælling af signaler kan der kun anbefales olieimmersionsobjektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtre udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler brug af et specifikt DAPI-filter i kombination med et Texas Red-/FITC-dobbeltfilter af høj kvalitet. DAPI-filter, f.eks. Chroma filter # 31000 Texas Red-/FITC-dobbeltfilter, f.eks. Omega Optical filter # XF53 eller Chroma filter # 51006 Texas Red- og FITC-enkeltfiltre kan anvendes til bekræftelse og til tælling. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt Deres mikroskopleverandør eller Deres Dako repræsentant, hvis De ønsker detaljeret information. 5. Olie Ikke-fluorescerende olie Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke Rhodaminfiltre kan ikke anvendes Tripelfiltre anbefales ikke Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt justeret og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Det bør tilstræbes, at prøven eksponeres for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Det anbefales, at opsætningen af mikroskopet diskuteres med producenten eller at litteraturen læses inden opstart af flourescens in situ-hybridiseringen. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 52/55

Referencer 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230:1132-9. 2. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76:34-5. 3. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:5321-5. 4. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229:974-6. 5. Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30:41-8. 6. Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61:1214-9. 7. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9:319-25. 8. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235:177-82. 9. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50:4332-7. 10. Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: 320-368. 11. Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32:3-11. 12. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16:173-82. 13. Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press. 1999. 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005. 15. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28. 1992. 16. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company. 1980. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 53/55

17. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press. 1981. 18. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92:2965-74. 19. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53:890-2. 20. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2:22-30. 21. Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3):286-98. 22. Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59:795-805. 23. Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78:26-33. 24. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59:795-805. 25. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32:89-95. 26. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27:681-5. 27. Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16:273-8. 28. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742):687-97. 29. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52:797-805. (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 54/55

Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Anvendes inden In vitro-diagnostisk medicinsk udstyr Må ikke udsættes for sollys (se afsnittet om opbevaring) Producent Se brugsanvisningen Batchkode GHS-piktogram (se afsnittet med forholdsregler) Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 www.dako.com Distribueret i USA af: Dako North America Inc. 6392 Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tlf. 805/566-6655, Gratisnr.: 800/235-5743 Bestillingsoplysninger: Tlf. 800/235-5763 Fax 805/566-6688 Teknisk service: Tlf. 800/424-0021 (129192-001) P04125DK_01_GM333/2015.07 p. 55/55