GYLLESPREDNINGS VIRKNING PÅ JORDENS FUNKTIONALITET: FOKUS PÅ KOBBER

GYLLESPREDNINGS VIRKNING PÅ JORDENS FUNKTIONALITET: FOKUS PÅ KOBBER Lektor, ph.d. Peter E. Holm Lektor, ph.d. Kristian K. Brandt Lektor, ph.d. Ole Nybroe Faculty of Life Sciences, Københavns Universitet (tidligere KVL) ATV MØDE FRA GYLLE TIL GRUNDVAND OG ANDRE MULIGE PROBLEMKILDER Schæffergården 30. januar 2007

JORDENS FUNKTIONALITET Jordbunden er en knap, og ikke-fornybar ressource, ihvertfald indenfor en tidshorisont på 100-1000 år. Ødelægges jordbunden, f.eks. ved forurening, mineralisering af jordbundens organiske stofpulje eller erosion, kan vi ikke uden videre forny ressourcen. At jordbunden repræsenterer en ikke-fornybar ressource er ikke ny viden, men det er først i de seneste årtier, at denne viden er blevet almindelig bevidsthed, og hvor der er sat fokus på at beskytte ressourcen. Den stigende opmærksomhed skyldes bl.a. at belastningen af jordbunden med maskiner, kemikalier og affaldsprodukter er øget kraftigt som følge af et globalt stigende fødevarebehov, høje krav til effektivitet i produktionen og et stigende affaldsdeponeringsbehov. Samtidig er vi blevet mere opmærksomme på jordbundens betydning for miljøet, ikke mindst vandmiljøet. Ligeledes er forståelsen for jordbundens rolle m.h.t. globale stofbalancer - primært af carbon og nitrogen - øget. Dette udmøntes ofte i ideer om bæredygtig udnyttelse af jordklodens ressourcer hvoraf jordbundsressourcen er en af de vigtigste. Bæredygtighedsbegrebet er imidlertid meget komplekst, idet det omfatter både elementer som ressourcekvalitet og -tilgængelighed, miljømæssig impact, biodiversitet, økonomisk stabilitet, og social lighed. Den stigende verdensbefolkning udgør det primære problem for den globale orientering mod bæredygtige produktionsmetoder, idet disse oftest vil give anledning til en lavere fødevareproduktion, og dermed et større sultproblem, end vi har idag. Som mål for jordbundens værdi (tidligere bonitet) benyttes begreber som jordbundskvalitet og -sundhed. Jordbundskvalitet kan bl.a. måles gennem jordens funktionelle egenskaber. Funktionerne kan f.eks. klassificeres som vist i tabel 1. Nr Funktion Funktionsbeskrivelse Økologiske funktioner F1 Biomassefunktionen Produktion af føde, foder og fibre F2 Filterfunktionen Filtrering, nedbrydning og neutralisation F3 Habitatfunktionen Levested for dyr og planter (artsdiversitet, genreserve) Tekniske og kulturhistoriske funktioner F4 Fundamentfunktionen Fysisk medium for anlæg af veje, huse og pladser F5 Råstoffunktionen Kilde til råmaterialer (grus, sand, ler, tørv etc.) F6 Kulturfunktionen Beskyttelse af fortidsminder og kulturlandskaber Tabel 1. Jordbundens funktioner I dette indlæg vil gennem fokus på af gylle og kobber (Cu) tilførslen til danske landbrugsjorde blive sat fokus på de økologiske funktioner F1, F2 og F3 (Tabel 1). GYLLE- OG CU-TILFØRSEL TIL DANSKE LANDBRUGSJORDE Ca. 62% af Danmarks areal udgøres af landbrugsjord og vores landbrugsjord tilføres tungmetaller fra mange forskellige kilder (Tabel 2). Mange af tungmetallerne er toksiske selv i lave koncentrationer (mg L -1 ). Metallernes toksisitet skyldes ofte, at de kan substituere andre

metaller i enzymer og derved forhindre enzymets normale funktion i cellen. Cu udgør et særligt problem, idet metallet tillige kan påføre levende celler et oxidativt stress. Dette sker fordi Cu fremmer dannelse af frie iltradikaler i cellerne. Samtidig er Cu et essentielt nærings-stof, og skal derfor være til stede i jorden i passende koncentrationer, for at mikroorganismer, dyr og planter kan trives. Som man kan se af tabel 2 er tilførsel af Cu gennem udbringning af husdyrgødning ganske betragtelig. Svinegylle indeholder ca. 600 g Cu t -1 (tørvægt), og blandt andet på grund af den øgede svineproduktion igennem de senere år, er skønnet over den mængde Cu, der tilføres gennem gylle, opjusteret fra tabellens 630 til 1290 g ha -1 år -1 (Bach et al. 2002). Baggrunden for Cu-indholdet i gylle er, at metallet (sammen med Zn) tilsættes foderet til stort set alle produktionsdyr i Danmark. Tilsætningen har en forebyggende effekt mod diarre, og det øger væksten af dyrene. Cd Hg Pb Ni Cr Zn Cu Spildevandsslam 2.0 2.4 96 50 65 1900 390 Handelsgødning 0.25 0 0.26 0.61 3.3 4.3 67 Husdyrgødning 1.9 <0.4 3.8 21 10 810 630 Kompost 3.2 0.66 140 89 53 970 320 Kalkning 0.6 0 <3 4 <1 13 3 Kunstvanding 0.04 0 1.0 3.3 0.6 21 1.2 Emissioner 0.01 0 0.13 2.7 0.01 0.11 0.04 Atm. deposition 0.15 0.07 12 7 10 40 7 Tabel 2. Tungmetaltilførsel til landbrugsjord fra forskellige kilder (g ha -1 år -1 ) (Miljøstyrelsen, 1996). Det er løbende blevet undersøgt, hvilke konsekvenser Cu tilførslen har på landbrugsjordenes indhold af metallet. Analyser publiceret i 1996 viste, at danske jorde i gennemsnit indeholdt 7 mg Cu kg -1 (Tabel 3). Nyere undersøgelser har vist, at Cu koncentrationen i jorder tilført gylle er steget signifikant i perioden mellem 1986 og 1998 (Gräber et al. 2005). Tillige viste disse undersøgelser, at der forgår en transport af plantetilgængeligt Cu ned gennem jordlagene. De målte Cu koncentrationer ligger endnu klart under jordkvalitetskriterierne på 30 40 mg kg -1, men med fortsat stigende udledning kan grænseværdierne nås i løbet af nogle årtier (Tabel 3). Jordkvalitetskriterier fastlægges i Danmark ud fra bestemmelse af økotoksikologiske grænseværdier for stoffer (f. eks. tungmetaller), med henblik på at bevare økosystemets struktur. Der testes indtil videre kun for påvirkning af struktur, d.v.s. arternes respons på en forurening. Dette sikrer ikke nødvendigvis økosystemets funktion, idet et økosystems funktion ikke altid afhænger entydigt af strukturen. Effekten af et stærkt toksisk stof kan være vanskelig at spore i økosystemets funktion, hvis denne f.eks. måles i form af respiration (CO 2 produktion).

As Pb Cd Cu Cr Hg Ni Zn Jordkvalitetskriterier (mg kg -1 ) Slambekendtgørelsen 40 0.5 40 30 0.5 15 100 Økotoksikologisk 2 50 0.3 30 50 0.1 10 100 Jordbundens indhold (mg kg -1 ) Median-værdier 3.3 11.3 0.16 7.0 9.9 0.04 5.0 26.8 Areal-andel over slambek. (%) 1.2 4.1 0.3 5.6 0.5 5.1 0.5 Areal-andel over økotoks. (%) 1.0 12 0.5 0.8 8.9 19 0.5 Antal års belastning for øgning af indhold med 1% Deposition 105 21 14 23 170 3 89 16 Gylle 337 71 7 0.26 22-9 0.7 Handelsgødning 145 50 6-24 25 79 Slam 5 4 0.5 13 1 8 0.5 Tabel 3. Tungmetalindhold i jord i relation til jordkvalitetskriterier og tilførsler (Larsen et al, 1996). Det skyldes, at alle heterotrofe organismer respirerer, og det kan knap nok måles, at en lille gruppe organismer falder ud. Tillige baserer jordkvalitetskriterierne sig på målinger af den totale koncentration af stofferne (f.eks. tungmetaller) i jordmiljøet, mens kun en mindre fraktion kan forventes at være tilgængelig for biologiske systemer (biotilgængelig) og dermed udøve toksicitet. Cu bindes stærkt til jordens partikler via sorptionsprocesser og udfældningsreaktioner. Sorption vil almindeligvis og i moderat forurenede jorde være den mest betydningsfulde proces for kobber s fordeling og tilbageholdelse i jord. Sorptionen er ph-afhængig og tilskrives primært organisk stof og oxider. Fordelingskoefficienter (K d -værdier) udtrykt som forholdet mellem koncentrationen af Cu i jorden og i jordvæsken kan benyttes til at kvantificere Cu s sorption i jord. De fleste rapporterede bestemmelser af Cu s er udført ved høje ikke miljørelevante koncentrationer af Cu og kan således ikke bruges til en kvantificering af Cu s sorption i f.ex. landbrugsjorde. De relevante undersøgelser som har kunnet findes viser stigende K d -værdier i niveauet 10 1000 l kg -1 for stigende ph-værdier i niveauet 4,0-6,5. Cu komplekserer desuden villigt med organisk stof i opløsning. Dette betyder, at i jordvæske vil ofte kun en mindre del af opløst Cu forefindes som Cu 2+ og uorganisk komplekseret (f.eks. hydroxy- og carbonatokomplekser) Cu, men derimod som organiske Cu-komplekser. Tilførslen af gylle til jorden kan således potentielt have væsentlig indflydelse på jordens evne til at tilbageholde metaller som Cu, idét såvel jordens ph som jordens indhold organisk stof vil påvirkes. En øgning af jordpartiklernes indhold af organisk stof vil øge sorptionen, mens en øgning af indholdet af opløst organisk stof kan forventes at mindske sorptionen og øge komplekseringen og dermed mobiliteten af Cu.

EFFEKTER AF GYLLE PÅ TOKSICITET OG BIOTILGÆNGELIGHED AF CU I JORDMILJØET Jordbundens bakterier er generelt mere følsomme overfor Cu forurening end svampe, dyr og planter. Derfor er der udviklet en række mikrobielle toksicitets-assays, der direkte kan bestemme metallets påvirkning af udvalgte bakterier. Assays der er baserede på, at toksiske stoffer hæmmer lysudsendelse fra bioluminescerende bakterier, er blevet populære på grund af deres følsomhed og hurtighed. Disse bakterier fungerer som toksicitets biosensorer. Deres begrænsninger er, at de ikke er specifikke for én bestemt toksisk påvirkning, men at enhver toksisk påvirkning kan hæmme lysudsendelsen. Desuden er de anvendte bakterier (ofte marine bakterier eller tarmbakterier) ikke altid økologiske relevante for jordmiljøet. Resultater fra forsøg med de bioluminescerende toksicitets biosensorer har afsløret, at Cu s toksicitet i jordmiljøet viser en dårlig sammenhæng med den totale Cu koncentration i jorden bestemt efter oplukning af jorden med stærk syre. Dette skyldes formodentlig at Cu s toksicitet i jord er meget afhængig af sorption og kompleksbinding, der varierer med jordens sammensætning. For at forbedre forståelsen af sammenhængen mellem Cu s speciering, toksicitet og biologiske tilgængelighed har vi udviklet et nyt testkoncept. Det omfatter et tæt samspil mellem avanceret kemisk og mikrobiologisk analyse. Den kemiske analyse dækker bestemmelse af total og opløselig kobber koncentration, specieringsanalyse og bestemmelse af Cu 2+ -ionens aktivitet med en ion-selektiv elektrode. Den mikrobiologiske analyse omfatter anvendelse af en toksicitets biosensor i en relevant jordbundsbakterie (Pseudomonas fluorescens), samt udvikling af en P. fluorescens Cu-biosensor. Cu-biosensoren udsender stigende bioluminescens som specifikt svar på stigende, sub-toksiske koncentrationer af biologisk tilgængeligt Cu (Tom-Petersen et al. 2001; Tom-Petersen et al. 2004), og har således en bedre specificitet og en højere følsomhed end de toksicitetsbiosensorer, der blev nævnt ovenfor. I vore tidlige eksperimenter i veldefinerede vandige opløsninger viste vi, at en række uorganiske og og simple organiske Cu komplekser er biologisk tilgængelige for P. fluorescens biosensor cellerne. Derimod dannede opløst organisk materiale fra en skovjord Cu-komplekser, der ikke var biotilgængelige. Efterfølgende forsøg blev udført i jord mikrokosmer, hvor der blev analyseret på vandige ekstrakter af jorden. Generelt kunne vi se, at Cu s biotilgængelighed er lav (0,04 0,4 %), når den udtrykkes som % af jorden totale Cu indhold. Samtidig bemærkede vi, at biotilgængeligheden kunne variere næsten 10 gange mellem forskellige jorde tilsat sammenlignelige Cu mængder. Tilsætning af Cu-fattig svinegylle til en Cu-holdig jord førte til en dramatisk stigning i Cu s biotilgængelighed. Stigningen varede op til tre uger efter tilsætningen, hvorefter den aftog. Den samhørende kemiske og biologiske analyse viste, at denne effekt både skyldtes en stigning i mængden af opløseligt Cu, og en øget biotilgængelighed af det opløste Cu. Resultaterne antyder, at let-omsætteligt organisk materiale fra gyllen danner opløselige komplekser med Cu, og at disse komplekser er biotilgængelige, og dermed også toksiske. Cu der bliver tilført jorden sammen med gylle kan altså forventes at være mere toksisk end Cu der tilføres som et simpelt Cu-salt.

Vi konkluderer, at vort testkoncept med integreret kemisk specieringsanalyse og brug af bakterielle biosensorer kan fremme vor forståelse af de miljøfaktorer, der påvirker biotilgængelighed og toksicitet af Cu. Den totale Cu koncentration korrelerer dårligt med Cu toksicitet og biotilgængelighed. Derfor foreslår vi, at bioassays med bakterielle biosensorer i fremtiden bør inddrages i stigende grad, når jordbundens kvalitet og sundhed skal moniteres. EFFEKTER AF CU PÅ JORDBUNDENS MIKROORGANISMER Som nævnt ovenfor er bakterier generelt mere følsomme for metallers toksicitet end jordens svampe, invertebrater eller planter. Det er derfor værd at undersøge om bestemte jordbundsbakterier udgør relevante og følsomme indikatorer for Cu forurening. Samtidig er det vigtigt at klarlægge, om metal-tilførsel kan hæmme eller udslette vigtige bakteriegrupper, der udfører nøglefunktioner i jordens mikrobielle samfund, og derfor er essentielle for jordens funktionalitet. Generelt kan man studere Cu s effekt på bakterielle samfund ved hjælp af klassiske dyrkningsmetoder (pladespredninger o.l.) eller med dyrkningsuafhængige metoder, der typisk retter sig mod analyser af DNA, som er ekstraheret fra jorden. Det har vist sig, at de klassiske metoder er de mest følsomme til at vurdere effekter af toksiske metaller på jordbundens bakterier. Vi har derfor benyttet de klassiske metoder kombineret med PCR-baseret DNA fingerprinting af bakteriesolater til vore undersøgelser. Desuden har vi valgt at tilføre Cu som Cu-sulfat i disse forsøg for at kunne fokusere på metallets virkning uden samspil med de andre biologisk aktive stoffer, der findes i gylle såsom de veterinære lægemidler. Ved at sammenligne bakteriefloraen i rodzonen af sukkerroeplanter dyrket i jord-mikrokosmer med stigende Cu koncentrationen opdagede vi, at Pseudomonas bakteriegruppen var særligt følsom overfor Cu. Dette gav sig udtryk i både en nedsat mængde af Pseudomonas bakterier, udtrykt som % af den totale mængde dyrkbare bakterier, og som en nedsat diversitet af den reducerede Pseudomonas population (Brandt et al. 2006). Pseudomonas er normalt en dominerende bakteriegruppe i rodzonen, og disse bakterier er ansvarlige for en række funktioner, der fremmer plantevækst. Herunder kan nævnes produktion af plantehormoner, samt evnen til at kontrollere en række plantepatogene mikrosvampes vækst. Den høje toksicitet af Cu overfor denne bakteriegruppe kan således have vigtige konsekvenser for jordbrugsøkosystemers funktion. Endelig har vi undersøgt Cu s effekter i et markforsøg, hvor kobber blev tilført landbrugsjord (Tom-Petersen et al. 2003). Efter flere år blev bakterier isoleret fra kobberholdig jord, og fra ikke-behandlet jord. Forsøget viste at bakterierne fra kobberholdig jord blev mere modstandsdygtige (resistente) over for kobber. Samtidig var de kobber-resistente bakterier mere resistente overfor en række antibiotika (Berg et al. 2005). Når bakterier beskytter sig mod kobbers giftige virkning, bliver de samtidig bedre til at beskytte sig mod antibiotika. Tilførsel af kobber virker som en drivkraft, der indirekte fremmer de bakterier, der er modstandsdygtige overfor antibiotika. Herfra kan modstandsdygtigheden

via jorden, afgrøder og dyr måske overføres til bakterier, der fremkalder sygdomme hos mennesker. Spredning af kobber i jordmiljøet kan derfor på sigt begrænse vore muligheder for at bekæmpe sygdomme med antibiotika. Kobber bliver ikke nedbrudt, men fjernes ekstremt langsomt fra jordmiljøet. Opholdstiden af metaller som Cu er typisk flere hundrede år i topjorden. Et øget kobberindhold i jorden kan have meget langvarige konsekvenser for forekomsten af antibiotika-resistente bakterier og for menneskers sundhed. REFERENCER Bach H., Christensen N. and Kristensen P. (eds). (2002). The state of the environment in Denmark, 2001. National Environmental Research Institute, Roskilde Berg, J., Tom-Petersen A. and Nybroe O. (2005). Copper amendment of agricultural soil selects for bacterial antibiotic resistance in the field. Letters in Applied Microbiology 40, 146-151. Brandt K.K., Petersen A., Holm P.E. and Nybroe O. (2006). Decreased abundance and diversity of culturable Pseudomonas spp. populations with increasing copper exposure in the sugar beet rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology 56, 2781-291. Gräber I., Hansen J.F., Olesen S.E., Petersen J., Østergaard H.S. and Krogh L. (2005). Accumulation of copper and zinc in Danish agricultural soils in intensive pig production areas. Danish Journal of Geography 105, 15-22 Tom-Petersen A., Hosbond C. and Nybroe O. (2001). Identification of copper-induced genes in Pseudomonas fluorescens and use of a reporter strain to monitor bioavailable copper in soil. FEMS Microbiology Ecology 38, 59-67. Tom-Petersen A., Leser T., Marsh T.L. and Nybroe O. (2003). Effects of copper amendment on the bacterial community in agricultural soil analysed by the T-RFLP technique. FEMS Microbiology Ecology 46, 53-62. Tom-Petersen A., Bruun Hansen H.C. and Nybroe O. (2004). Time and moisture effects on total and bioavailable Cu in soil solutions. Journal of Environmental Quality 33, 505-512. Larsen, M.M.; Bak, J. & Scott-Fordsmand, J. (1996) Monitering af tungmetaller i danske dyrknings- og naturjorder. Faglig rapport fra DMU, nr. 157, DMU, 77 pp. Miljøstyrelsen (1996). Miljøbelastende stoffer i landbrugsjord.