Nogle biofysiske anvendelser af Ramanspektroskopi

Nogle biofysiske anvendelser af Ramanspektroskopi Der sker hele tiden nye teknologiske landvindinger inden for Ramanspektroskopi. Analysemetoden kan bl.a. bruges til at følge ændringer i peptider og proteiners sekundærstruktur, til at få en større forståelse for vands betydning i levende organismer og til at undersøge biomolekylers kollektive dynamik Af Ole Faurskov Nielsen 1, ofn@kiku.dk, Pia Refstrup 1, Pia.Refstrup@fysik.dtu.dk, Monika Gniadecka 2, monikajustyna@hotmail.com, H.C. Wulf 2, hcw01@bbh.hosp.dk, Susanne Bang 3, SUSB@novo.dk, Karin Liltorp 4 liltorp@ruc.dk og Peter Westh 4 pwesth@ruc.dk 1 Kemisk Institut, Københavns Universitet 2 Hudafdelingen, Bispebjerg Hospital 3 Novo Nordisk A/S, Bagsværd 4 Institut for Biologi og Kemi, RUC Lys, der rammer et molekyle, spredes. I dette lys er der information om molekylernes vibrationer. Denne form for Figur 2. Svingningsbilleder for amid-i- og amid III-bånd. Figur 1. Ramanspektre af polyglycin som fast stof. Spektret i A er optaget med en Nd-YAG laser (bølgelængde 1064 nm). Spektrum B er optaget med en Ar-ion laser (bølgelængde 514,5 nm). 24 spektroskopi kaldes Ramanspektroskopi efter inderen C.V. Raman [1], der opdagede effekten i 1928. Imidlertid er det først efter fremkomsten af laseren, at Ramanspektroskopi er blevet almindelig anvendt. Laseren er netop den ideelle lyskilde for Ramanspektroskopi, idet den skaber én bestemt bølgelængde og dermed én bestemt frekvens. En laserstråle er ovenikøbet meget koncentreret, så det er nemt at ramme en lille stofmængde. I figur 1A ses Ramanspektret af polyglycin. I stedet for frekvens bruges bølgetallet (cm -1 ) ligesom i et IR-spektrum. Intensiteten i et Ramanspektrum afbildes med stigende værdier opad. Spektret i figur 1A er optaget ved en laserbølgelængde på 1064 nm. Tallet fremgår ikke af Ramanspektret, fordi der kun angives ændringer i bølgetallet svarende til de molekylære vibrationer, der angives, dvs. Ramanspektret er uafhængigt af laserens bølgelængde. Ramanspektret af den samme prøve af polyglycin optaget med en laserbølgelængde på 514,5 nm er vist i figur 1B. Det er tydeligt, at dette spektrum er forskelligt fra spektret i figur 1A. Forskellen på spektrene er, at der i polyglycin er en meget lille mængde urenhed, der fluorescerer ved 514,5 nm. Det gør den ikke ved den længere bølgelængde på 1064 nm. Fluorescensspektret af urenheden, der måske kun er til stede i størrelsesordenen 1 promille, er nok til at Ramanspektret af polyglycin ikke ses, fordi det brede fluorescensspektrum af urenheden er meget kraftigere end Ramanspektret. Peptider og proteiner vil som hovedregel indeholde små mængder urenheder, der fluorescerer ved anvendelse af de t

25

Vi ses på SCANLAB Stand H-124 Specialister i -Automatiseret Fastfaseoprensning Gilson ASPEC XL, ASPEC XLi, ASPEC XL4. - Automatisering af væskehåndtering. - HPLC, LC, SFC kromatografi. - ERWEKA Dissolution systemer. - Avancerede systemer til tabletkontrol. - Salg og kalibrering af Gilson pipetter. Biolab A/S Sindalsvej 29 DK-8240 Risskov Telefon 8621 2866 Telefax 8621 2301 E-mail: biolab@biolab.dk BIOFYSISK KEMI konventionelle lasere til Ramanspektroskopi i den synlige del af spektralområdet, som f.eks. den grønne med en bølgelængde på 514,5 nm. En farve der kendes fra jule-lasershowet på Kgs. Nytorv i København. Det var først i slutningen af 1980 erne, at det rent teknisk blev muligt at anvende lasere med en længere bølgelængde som 1064 nm og dermed undgå fluorescens. Bølgelængden ligger i den usynlige nære infrarøde del (NIR) af det elektromagnetiske spektrum, og til optagelsen af spektret bruges en Fourier-transformation (FT), derfor betegnelsen NIR-FT-Ramanspektroskopi. Peptiders og proteiners sekundærstruktur Ændringer i peptiders og proteiners sekundærstruktur kan let følges vha. Ramanspektroskopi. Specielt anvendelige er de såkaldte amid-i- og amid-iii-bånd, der begge er kraftige i Ramanspektret. Svingningsbilleder er vist i figur 2. Forskellige sekundærstrukturer giver anledning til små forskelle i bølgetallene for hver af disse bånd, f.eks ses amid-i-båndet i området 1645-1658 cm -1 for en α-helix-konformation, mens intervallet for en β-sheet-form ændres til 1665-1680 cm -1. Polyglycin kan både optræde som α-helix- og β-sheetformer. I figur 3 ses spektre for de to former af polyglycin. Båndet ved 1653 cm -1 stammer givetvis fra en α-helix-form, mens båndet ved 1670 cm -1 er fra β-sheet. Det ses, at sidstnævnte form ikke er helt ren, idet der er et svagt bånd ved 1653 cm -1 fra en lille mængde polyglycin med en α-helixsekundærstruktur. Medarbejdere i Protein NMR-gruppen ved Kemisk Institut, Københavns Universitet har for nylig i Dansk Kemi publiceret artikler om proteiners fleksibilitet, stabilitet og bioaktivitet [2,3]. Et bindeled mellem NMR- og røntgenundersøgelser NMR er i mange henseender en uovertruffen spektroskopisk disciplin til strukturopklaring af proteiner i opløsning [4]. Røntgendiffraktionsmetoder er af uvurderlig betydning for proteiner i krystallinsk tilstand. Ramanspektroskopi kan til gengæld bruges til undersøgelse af både vandige opløsninger og faste stoffer. Derved kan man sammenligne spektrene af et protein i fast tilstand og i vandig opløsning og se, om der sker ændringer i sekundærstrukturen. På den måde kan Ramanspektroskopi bruges som et bindeled mellem NMR- og røntgenundersøgelser Analyser af ændringer i peptider og proteiners sekundærstruktur Ved Ramanspektroskopi er der for faste stoffers vedkommende ikke noget krav om, at stoffet skal være krystallinsk. Det kan illustreres ved nylige undersøgelser af den insulinmodifikation, DesB30, der mangler aminosyrerest nummer 30 i insulins B-kæde [5]. Både i ethanolholdig vandig opløsning og i sure opløsniger ved ph ca. 1,8 danner DesB30-insulin fibrilagtige bundfald. I figur 4A ses Ramanspektret af DesB30 i amid-i-området. Det eksperimentelle spektrum er ved kurvetilpasning opløst i forskellige bånd. Det mest intense bånd findes omkring ca. 1655 cm -1. I lighed med ovenfor tilordnes dette bånd til en α-helix-sekundærstruktur. Båndene omkring 1600 cm -1 stammer fra (hetero)aromatiske sidekæder. I figur 4 ses Ramanspektre af bundfaldet dannet i enten ethanolholdig (4B) eller sur vandig opløsning (4C). Også i disse to spektre er der foretaget kurveopløsning. I bundfaldet dannet fra begge opløsninger er der tydeligvis sket en ændring af sekundærstrukturen. Indholdet af α-helix er mindsket eller helt forsvundet, og båndet ved 1670 cm -1 viser, at den dominerende form nu er β-sheet. Figur 4B og 4C viser også, at det er den samme struktur, der dannes i bundfaldene 26

fra henholdsvis ethanolholdig og sur vandig opløsning. Det tager ca. 15 minutter at optage et NIR-FT-Ramanspektrum, så det er hurtigt at foretage analyser af ændringer af sekundærstruktur i peptider og proteiner. Metoden er også velegnet til at undersøge, hvordan sekundærstrukturen ændres og dennes betydning for udbyttet i de enkelte trin i fastfasepeptidsynteser [6,7]. At Ramanspektroskopi hverken kræver homogene opløsninger eller krystallinske stoffer benyttes til at undersøge proteiners strukturelle ændringer og nedbrydning, når det er vigtigt ikke at foretage nogen speciel tilberedning af stofprøven. Det gælder både til diagnosticering af hudsygdomme [8] og undersøgelser af hud fra mumier [9,10]. Proteiner og vand Vi ved, at vand har afgørende betydning for levende systemer. Vi ved også, at hydrogenbinding er vigtig for vands binding til biomolekyler, og for hvordan vandmolekyler bindes sammen; men vi ved egentlig ikke ret meget om vands biologiske betydning på et molekylært niveau. Ramanspektroskopi er en hurtig spektroskopisk teknik, der tager et øjebliksbillede af alle kemiske bindinger inklusive inter- og intramolekylære hydrogenbindinger. Det kan bruges til at afgøre, om tyrosin-sidekæder i et protein er»buried«eller»exposed«i vandige opløsninger, men det kan også give information om vandets»struktur«i det korte øjebliksbillede Ramanspektret dækker (hvor vandmolekylerne er fastfrosne i deres positioner). I figur 5 ses et vandmolekyle bundet med hydrogenbindinger til fire andre vandmolekyler i en tetraederlignende struktur. Den struktur der findes i is. Den islignende struktur findes også i flydende vand, men tetraedrene er bundet Figur 3. Ramanspektre af polyglycin i amid-i området optaget med en laserbølgelængde på 1064 nm. Den blå kurve er fra en α-helix sekundærstruktur, mens den røde kurve i det væsentlige er fra en β-sheet form, dog med et lille indhold af α-helix. sammen på en mere tilfældig måde end i is. Der findes også strukturer, hvor nogle af hydrogenbindingerne er brudt, dvs. der er mindre end fire hydrogenbindinger. Vands bånd i NIR-FT-Ramanspektret OH-strækningssvingninger i vand giver bånd i NIR-FT- Ramanspektret ved ca. 3250 cm -1. Båndet stammer fra alle vandmolekyler, både dem, der er bundet direkte til biomolekyler og dem, der forekommer i vand med fire eller færre hydrogenbindinger. t PTI Technologies Inc. & Aquafine Corp. UV behandling af vand Desinfektion Flydende sukker desinfektion Klorin destruktion TOC reduktion Ozon destruktion Filtrering Clariflow Fluoroflow Polyflow Membrane Proflow Glas-Tech Polyflow Protector Steelflow Housings Capsules Mød os på Pharmatech Stand H-008 Tlf. 70 10 10 30 Totalleverandør af elementer til filtre og filtersystemer. www.danmil.dk 27

Figur 4. Ramanspektre af DesB30-insulin optaget med en laserbølgelængde på 1064 nm. I A ses Ramanspektret optaget af DesB30 i fast tilstand. I B og C ses Ramanspektre fra bundfald af DesB30 i henholdsvis ethanolholdig og sur vandig opløsning. Spektrene er vist med tilladelse fra Asian J. Phys 11, 3 (2002). I det lavfrekvente område ved ca. 200 cm -1 er der et bånd, som er karakteristisk for vandmolekyler med fire hydrogenbindinger. Det illustreres i figur 6, der viser Ramanspektret af vand ved 20 o C. Et svagt bånd ses ved ca. 200 cm -1. Det skjules næsten af det stærke bånd fra laseren, Rayleigh-linjen, der har sit maksimum ved selve laserens frekvens, svarende til 0 cm -1 i Ramanspektret. Den kraftige linje kan man nemt komme af med ved at anvende den såkaldte R(ν)-repræsentation af det lavfrekvente Ramanspektrum [11]. I flydende vand er mange af de firekoordinerede tetraederlignende vandstrukturer bundet til hinanden. Netop forekomsten af denne tetraederlignende struktur er karakteristik for den mindste enhed i det, man kan kalde flydende vand [12]. Da båndet i R(ν)-spektret ved ca. 200 cm -1 skyldes tetraederlignende hydrogenbundne vandmolekyler, kan man ud fra båndet afgøre, om vandet har egenskaber som flydende vand, eller om det på anden vis er hydrogenbundet til f.eks. proteiner og har helt andre egenskaber end flydende vand. og vand vha. Ramanspektroskopi er i gang på Kemisk Institut, KU. Ved damptryksmålinger og titreringskalorimetri foretages på Institut for Biologi og Kemi, RUC, en termodynamisk karakterisering, der omfatter fri energi, enthalpi, entropi og varmekapacitet for det proteinbundne vand, og disse resultater sammenlignes med de spektroskopiske Ramandata. Parallelt med disse undersøgelser foretages på Hudafdelingen, Bispebjerg Hospital, målinger af vand og dets struktur i menneskehud. I figur 7 ses Ramanspektre af hud fra et raskt menneske og fra et menneske med hudsygdommen basal celle carcinom (BCC). To områder af Ramanspektret er vist. I området fra 2500 til 3500 cm -1 ses et bånd med et maksimum ved ca. 2900 cm -1. Dette bånd skyldes de alifatiske CHbindinger i prøverne. Båndet ved ca. 3200 cm -1 stammer fra OH-bindingerne i vand. Det er tydeligt, at dette bånd er mest intenst i BBC-prøven. Det viser, at der er mere vand i prøven. Spørgsmålet er, om vandmolekylerne er hydrogenbundet til andre molekyler i hud, f.eks. direkte til proteiner, eller om de har en mere vandlignende struktur. For at afgøre det studeres de lavfrekvente Ramanspektre, vist i figur 8. Spektrene er i R(ν)-repræsentationen. Både spektret af rask hud og hud med sygdommen BCC har et kraftigt bånd ved ca. 100 cm -1. Båndet stammer fra hydrogenbindinger i proteinerne. Ud over dette er der et svagere bånd med et maksimum ved ca. 200 cm -1, som er mere udtalt i BCC-spektret end i spektret af normal hud. Båndet ses tydeligere, når spektret af normal hud trækkes fra spektret af hud med BCC. Det viser, at den ekstra mængde vand, der er i BCC-prøven, har en vandstruktur som i flydende vand. Vha. denne teknik er vi i gang med at undersøge, hvordan vandindholdet er i forskellige hudsygdomme, og specielt om der er mere eller mindre af den struktur, som findes i flydende vand. Forhåbentlig kan det give en idé om vands rolle i huden og mere generelt om vands rolle i levende organismer. Kollektiv hurtig dynamik i proteiner Ramanspektret afspejler den molekylære dynamik på en picosekund-tidsskala og hurtigere, for det er her de molekylære vibrationer foregår. Ved at bruge blandinger af isotopsubstituerede amider er det vist, at der foregår en kobling mellem amid-i-vibrationerne gennem hydrogenbindinger mellem simple amider i væskefase [13]. Eksempelvis ses i figur 9 Ramanspektre for amid-i-svingningerne af HC 16 ONHCH 3 og HC 18 ONHCH 3. Pga. amid-i-svingningens masseafhængighed har 18 O-forbindelsen den laveste værdi. For blandinger af de to isotopomerer ville man forvente at se de samme to bånd med et intensitetsforhold svarende til blandingsforholdet. I figur 9 er også vist spektre af blandinger af de to isotopomerer. I stedet for de forventede to bånd ses kun et bånd i hver blanding. Båndet har en frekvens, der ligger mellem værdierne for hver af de rene isotopomerer, men blandingernes værdier afhænger af blandingsforholdet, Figur 5. Et vandmolekyle i tetraederlignende omgivelser med fire hydrogenbindinger. Hydrogenbinding mellem proteiner og vand En række undersøgelser af hydrogenbinding mellem proteiner 28

Figur 6. Lavfrekvent Ramanspektrum af vand optaget ved 20 o C (rød kurve). Den blå kurve viser Ramanspektret i R(ν)-repræsentationen. Ramanspektret er optaget med en frekvensdoblet Nd- YAG laser (532 nm). Figur 7. Ramanspektre af menneskehud. Den røde kurve er fra normal, rask hud, mens den blå kurve er fra en patient med basal celle carcinom (BCC). Spektrene er optaget med en laser ved 1064 nm. Figur 8. Ramanspektre af de samme to hudprøver som i figur 7. Den grønne kurve viser differencen mellem prøven med BCC (blå) og rask hud (rød). således at båndet ved et stigende indhold af O-18 gradvist rykker fra værdien for O-16-forbindelsen til værdien for O- 18-forbindelsen. Det kan forklares ved en kobling mellem amid-i-vibrationer i de hydrogenbundne isotopsubstituerede N-methylformamidmolekyler. I hydrogenbundne proteiner findes både for α-helix og β-sheet sekundære strukturer, hydrogenbindingsstrukturer, der minder om hydrogen- 29

Ramanspektroskopi. Ramanspektre kan registreres gennem optiske fibre. Denne teknik anvendes på Hudafdelingen, Bispebjerg Hospital til diagnosticering af hudsygdomme. Nye lasere udvikles hele tiden og ved siden af FT-teknikken anvendes også i udstrakt grad CCD-detektorer, der kendes fra digitalkameraer. Herved er det muligt at lave små bærbare Ramaninstrumenter, der kan tages med i marken, f.eks. af retsmedicinere. Det åbner op for mange spændende nye analytiske anvendelser af Ramanspektroskopi, ikke bare af biofysisk karakter. En glimrende oversigt over mange forskellige anvendelsesmuligheder er givet i bogen»handbook of Raman Spectroscopy«[13]. Endelig skal nævnes, at USA i 2007 planlægger at sende et Ramaninstrument til Mars. Det bliver spændende at se, hvilke oplysninger det kan give om vand og liv på den røde planet. Figur 9. Amid-I-bånd for 16 O- og 18 O-isotopomerer af N-methylformamid og blandinger af disse. Ramanspektrene er optaget med en laserbølgelængde på 514,5 nm. bindingerne i de simple amider. Derfor forventes en tilsvarende kobling gennem hydrogenbindingerne også for proteiner. Det betyder, at anslås en amid-i-vibration et sted i molekylet, så vil den gennem kobling med andre amid-ivibrationer kunne føres gennem molekylet langs proteinets hydrogenbindinger. Populært sagt vil molekylet mærke, at amid-vibrationen er blevet anslået langt væk fra det sted, hvor denne proces foregik. Det afhænger af, om hydrogenbindingsystemet er intakt. Hvis hydrogenbindingerne brydes, vil amid-i-koblingen ikke mere kunne foregå, og molekylet vil ikke kunne sende information om, at en amid-i-vibration anslås. Et spændende spørgsmål er, om denne hurtige kollektive dynamik kan have betydning for, hvordan én del af et proteinmolekyle kan tale med en anden del. Femtosekund pulserende lasere bruges i dag til undersøgelser af den hurtige molekylære dynamik, og der er en eksplosiv udvikling inden for dette spændende felt. Der er en stigende interesse for at forstå den hurtige kollektive dynamik i biomolekyler. F.eks. er der for nylig publiceret resultater, der viser, at vibrationerne, der giver anledning til det lavfrekvente bånd ved 100 cm -1 i proteiner (figur 8), også har en kollektiv karakter med en overraskende lang levetid [14]. Nye teknologiske landvindinger Der sker hele tiden nye teknologiske landvindinger inden for feltet Ramanspektroskopi. Ramanspektre kan i dag optages gennem et mikroskop. Der kan endda lægges snit gennem et materiale (også biomaterialer som hud) ved såkaldt confocal Fokus på: Proteiners sekundærstruktur Insulinfibrillering Fastfasepeptidsyntese Hudsygdomme Mumier Hydrogenbinding Vandstruktur Vand og liv Hurtig kollektiv dynamik Signaloverførsel Referencer 1. Raman C.V. & Krishnan K.S.,»A New Type of Secondary Radiation«Nature 121, 501 (1928). 2. Keller D. & Led J.J.,»Insulins fleksibilitet og bioaktivitet«dansk Kemi 82, 21-23 (2001). 3. Kasimova M.R., Kristensen S.M. & Led J.J.»Så længe det knager, holder det: proteiners fleksibilitet versus stabilitet«dansk Kemi 83, 32-34 (2002). 4. Led J.J.»NMR Instrumentcentret på Carlsberg Laboratorium-en bemærkelsesværdig succes«dansk Kemi 83, 15-18 (2002). 5. Refstrup P., Faurskov Nielsen O. & Bang S.»Biological Raman Spectroscopy«Asian J. Phys. 11, 1-8 (2002). 6. Due Larsen B., Christensen D.H., Holm A., Zillmer R. & Faurskov Nielsen O.»The Merrifield Solid-Phase Peptide Synthesis Studied by NIR-FT-Raman Spectroscopy«J. Am. Chem. Soc. 115, 6247-6253 (1993). 7. Hansen C.L., Hansen P.R., Callisen T.H., Bauer R & Faurskov Nielsen O.»Secondary Structure and Association of Melittin During and After Solid Phase Synthesis. A Raman and Dynamic Light Scattering Study«J. Raman Spectrosc. 33, 142-146 (2002). 8. Johansson C.K., Christensen D.H., Faurskov Nielsen O., Gniadecka M. & Wulf H.C.»Nær-infrarød Fourier transform Raman-undersøgelser af menneskehud«dansk Kemi 80, 12-13 (1999). 9. Gniadecka M., Edwards H.G.M., Hart Hansen J.P., Faurskov Nielsen O., Christensen D.H., Guillen S.E. & Wulf H.C.»NIR-FT-Raman Spectroscopy of the Mummified Skin of the Alpine Ice-Man, Qilakitsoq Greenland Mummies and Chiribaya Mummies from Peru«J. Raman Spectroscopy 30, 147-153 (1999). 10. Edwards H.G.M., Gniadecka M., Petersen S., Hart Hansen J.P., Faurskov Nielsen O., Christensen D.H. & Wulf H.C.»NIR-FT- Raman Spectroscopy as a Diagnostic Probe for Mummified Skin and Nails«Vibrational Spectroscopy 28, 3-15 (2002). 11. Faurskov Nielsen O.»R(ν)-repræsentationen og dens anvendelse«dansk Kemi 68, 71-78 (1987). 12. Faurskov Nielsen O., Johansson C., Jakobsen K.L., Christensen D.H., Wiegell M.R., Pedersen T., Gniadecka M. & Wulf H.C.»Water Structure and Water/Protein Interactions in Biological Materials Characterized by Raman Spectroscopy«Proceedings of SPIE 4098, 160-168 (2000). 13. Faurskov Nielsen O.»Low-Frequency Raman Spectroscopy and Biomolecular Dynamics«i Handbook of Raman Spectroscopy, eds. Lewis I.R. and Edwards H.G.M., Marcel Dekker, Inc., New York, Basel pp. 593-615 (2001). 14. Xie A, van der Meer A.F.G. & Austin R.H.»Excited-State Lifetime Collective Modes in Proteins«Phys. Rev. Lett. 88, 018102,1-4 (2002). 30