Fødevarestyrelsens Kemiske og Mikrobiologiske Metodesamling Version : 05 15. marts 2005

J.Nr.: 1001-50/02 Fødevarestyrelsens Kemiske og Mikrobiologiske Metodesamling Version : 05 15. marts 2005

Analyseparameter Metodehenvisning Bemærkninger Aeromonas spp. Aeromonas, mesofile arter. Bestemmelse i levnedsmidler. NMKL Nr. 150, 3 udg., 2004. Antibiotika / kemoterapeutika Delvotest SP. Fra DSM, Holland (www.dsm.com). Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling, bilag 1, pkt. 23. Antibiotika / kemoterapeutika i slagtedyr Bakteriehæmmende stoffer. Mikrobiologisk undersøgelse til påvisning af restkoncentrationer af antibiotika og kemoterapeutika i nyre og muskel fra slagtedyr (4- plademetode). NMKL Nr. 121, 2. udg., 2004. Bacillus cereus Bacillus cereus. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 67, 5.udg., 2003. Bilag 1, pkt. 2. Bakteriesporetal - aerobt Aerobt bakteriesporetal. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 3. Bakteriesporetal - anaerobt Anaerobt bakteriesporetal. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 3. Bakteriologisk undersøgelse (BU) Fødevarestyrelsens cirkulære af 6. maj 1996, om udøvelse af kødkontrol, 24 og 25, Bilag 2. Brochothrix Brochothrix thermosphacta. Bestemmelse i kød og kødvarer. NMKL Nr. 141, 2.udg., 2003. Calicivirus Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 4. Campylobacter (kval.) Campylobacter jejuni/coli. Påvisning i livsmedel. NMKL Nr. 119, 2.udg., 1990. Bilag 1, pkt. 5. Campylobacter (kval.) DFVF, NMKL metodeforslag, august 2004. Campylobacter (kvant.) IFTMDFVF, NMKL metodeforslag, august 2004. Campylobacter (semikvan.) DFVF, NMKL metodeforslag, august 2004.. Campylobacter (verifik.) Accuprobe Campylobacter. Genprobe, USA. Godkendt: 31. maj 2004 Gyldig til: 31. maj 2006 Anvendes til verifikation af termofile Campylobacter (C. jejuni, C. coli og C. lari) fra fast substrat. efter isolation iht. NMKL nr.nr. 119, 2.udg., 1990. Clostridium perfringens Clostridium perfringens. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 95, 3.udg., 1997. Bilag 1, pkt. 7. Sulfitreducerende Clostridier Sulfitreducerende clostridier. Bestemmelse i næringsmidler.nmkl nr 56, 3.udg., 1994. Side 2 af 9, 15. marts 200529-08-2005

E. coli O26 DFVF metodeforslag. E. coli O103 DFVF metodeforslag. E. coli O111 DFVF metodeforslag. E. coli O145 DFVF metodeforslag. E. coli O157 Escherichia coli O157. Påvisning i levnedsmidler og foder. NMKL Nr. 164, 1999. E. coli O157 EN ISO 16654 : 2001. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157. E. coli og enterokokker til resistens Isolering af Escherichia coli og Enterococcus faecalis og E. faecium fra levnedsmidler med henblik på resistensbestemmelse. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 39.. Referencemetode efter dir. 92/46 DANMAP metode Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae. Bestämning i livsmedel och foder. NMKL Nr. 144, 2.udg., 2000. Bilag 1, pkt. 8. Enterobacteriaceae 3M Petrifilm TM Enterobacteriaceae Count Plate. Godkendt: 30.maj 2004 Gyldig til: 30. maj 2006 Enterokokker Enterococcus. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 68, 4.udg., 2004. Forbehandling ISO 8261, 2001. Milk and milk products General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination. Forbehandling Prøveudtagning og forbehandling af levnedsmidler og foderstoffer til kvantitativ mikrobiologisk undersøgelse NMKL Nr. 91, 4..udg., 2002. Gær Mögel och jäst. Bestämning i livsmedel. NMKL Nr. 98, 3.udg., 1995. Bilag 1, pkt. 9. Referencemetode efter dir. 92/46 Gær/skimmel Yeats and Mould Count Plate. 3M Petrifilm. Godkendt 5. maj 2003. Gyldig til 5. maj 2005. Helkonserves Helkonserves. Metode til holdbarhedsprøvning. NMKL Nr. 47, 2. udg. 1994. Helkonserves Mikrobiologisk undersøkelse av helkonserver. NMKL Nr. 59, 4 udg. 2004. Kim på blodagar Kim på blodagar. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling Bilag 1, pkt. 10. Kim fisk Aerobt kimtal i fisk og fiskevarer ved 20 C.Totalt kimtal og svovlbrinteproducerende bakterier. Mikrobiologisk undersøkelse av fersk og fryst sjømat, NMKL NNr. 96, 3..udg., 2003. Bilag 1, pkt. 26. Kimtal 30ºC Aeroba mikroorganismer. Bestämning i livsmedel. 30 C NMKL Nr. 86, 3.udg., 1999. Kimtal 25ºC Aeroba mikroorganismer. Bestämning i livsmedel. 25 C NMKL Nr. 86, 3.udg., 1999. Bilag 1, pkt. 11. Psykrotrofe kim Psykrotrofe mikroorganismer. Bestemmelse ved kolonitalsmetoden. NMKL Nr. 74, 3.udg., 2000 Side 3 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Fremmede kim Fremmede kim i levnedsmidler. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1 pkt. 15. Kimtal DEFT Kimtal - Bestemmelse ved direkte epiflourescens filter teknik (DEFT) i rå, hakket kød. NMKL Nr. 137, 2. udg., 2002. Kim - Petrifilm Aerobic Count Plate. 3M Petrifilm. Godkendt 5. maj 2003. Gyldig til 5. maj 2005 Kim på overflader Hygicult TPC. Orion Diagnostica. Godkendt 10. juni 2003. Gyldig til 10. juni 2005. Kimtalsbestemmelse på overflader. Kim ved spiraludspredningsteknikken Kimtalsbestemmelse ved spiraludspredningsteknikken. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 14. Kim i MA fisk Kimtal i MA-pakket fersk fisk (Long & Hammer). Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 12. Kim i mælk og mælkeprodukter EN ISO 4833:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of microorganisms -- Colony-count technique at 30 degrees C. Referencemetode efter dir. 92/46 Kim i mælk og mælkeprodukter IDF 100B:1991. Enumeration of Microorganisnms. (Colony count technique at 30º C). Kim i konsummælksprodukter Kimtal ved 21 C. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 32. Psykrotrofe kim i mælk og mælkeprodukter IDF 132 (2004) / ISO 8552. Estimation of psychrotrophic microorganisms - Colonycount technique at 21 C (Rapid Method). Kim PCA, 30º EN ISO 4833: 2003. Horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony count technique at 30 C. Kim - Proteolytiske Proteolytiske bakterier i levnedsmidler. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 21. Kim - Lactobaciller og bifidobakterier Lactobaciller og bifidobakterier. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 20. Kimtalsbestemmelse (10cm2 Aeroba mikroorganismer och presumptiva Enterobacteriaceae. Beräkning på ytor och tillbehör. NMKL Nr. 5, 5.udg., 2001. Bilag 1, pkt. 13. Referencemetode efter dir. 92/46 Anvendes ved holdbarhedsundersøgelse af pasteuriserede konsummælk-produkter. Anvendes til smør, konserves, kasein, etc. Side 4 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Kimtalsbestemmelse (26 cm2) Aeroba mikroorganismer och presumptiva Enterobacteriaceae. Beräkning på ytor och tillbehör. NMKL Nr. 5, 5.udg., 2001. Bilag 1, pkt. 13. Vand kim ved (22ºC Vandundersøgelse. Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22 C og 36 C. Dybdeudsæd. DS/EN ISO 6222, 2000 samt tillæg DS/ISO 6222/till. 1, 1. udg. 2002. Vandundersøgelse- Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22 C og 36 C-dybdeudsæd. Bilag 1, pkt. 35 Vand kim ved 36ºC Vandundersøgelse. Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22 C og 36 C. Dybdeudsæd. DS/EN ISO 6222, 2000 samt tillæg DS/ISO 6222/till. 1, 1. udg. 2002. Vandundersøgelse. Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22 C og 36 C. Dybdeudsæd. Bilag 1, pkt. 35. Mælkesyrebakterier (MRS agar) Mjölksyrebakterier. Bestämning i kött och köttprodukter. NMKL Nr. 140, 1991. Bilag 1, pkt. 19. Mælkesyrebakterier (NAP agar) Mjölksyrebakterier. Bestämning i kött och köttprodukter. NMKL Nr. 140, 1991. Bilag 1, pkt. 19. Kim i yougurt ISO 9232:2003/IDF 146: 2003 Yogurt. Identification of characteristic microorganisms (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus). Kim i yougurt ISO 7889:2003, IDF 117:2003.Yogurt. Enumeration of characteristic microorganisms. Colony count technique at 37 C. Koliforme bakterier Koliforme bakterier. Bestemmelse i næringsmidler og foder. NMKL Nr. 44, 6.udg., 2004. Koliforme bakterier 30 C IDF 73B : 1998. Enumeration of coliforms. Part 1: Colony count technique at 30 C without resucitation. Koliforme bakterier 30 C IDF 73B : 1998. Enumeration of coliforms. Part 2: Most probable number technique at 30 C without resucitation. Koliforme bakterier (presumptive E. coli, 44 C) ISO 11866-1, 2, 3: 1997. Milk and Milk products Enumeration of presumptive Escherichia coli Part 1: Most probable number technique Part 2: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Part 3: Colonycount technique at 44 C using membranes. Koliforme bakterier (presumptive E. coli 44 C) ISO 16649-1,2: 2001. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of β-glucuronidase-positive Escherichia coli Part 1: Colony-count technique at 44 C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-dglucuronide Part 2: Colony-count technique at 44 C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-glucuronide. Referencemetode efter dir. 92/46 Referencemetode efter dir. 92/46 Side 5 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Koliforme bakterier 30 C ISO/DIS 5541-1:Milk and milk products -- Enumeration of coliforms -- Part 1: Colony count technique at 30 degrees C. Referencemetode efter dir. 92/46. Anvendes til bestemmelse i produkter med forventet højt kontaminaitonsniveau; >100 cfu/g) Koliforme bakterier 30 C ISO/DIS 5541-2:1986. Milk and milk products Enumeration of coliforms Part 2: Most probable number technique at 30 C. Koliforme og termotolerante koliforme bakterier i vand Koliforme bakterier og E. coli i vand Koliforme og termotolerante koliforme bakterier i vand Koliforme bakterier (termotoleratne koliforme bakterier) Vandundersøgelse. Bestemmelse af coliforme bakterier og termotolerante coliforme bakterier. Fortyndingsmetoden (MPN-metoden). DS 2255: 2001, 2. udgave. ISO 9308-1:2000 Water quality -- Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria -- Part 1: Membrane filtration method Vandundersøgelse. Bestemmelse af coliforme bakterier og termotolerante coliforme bakterier. Fortyndingsmetoden (MPN-metoden). DS 2255: 2001 Termotolerante koliforme bakterier, MPN, 44 C. Mikrobiologisk undersøkelse av fersk og fryst sjømat Bilag 1, pkt. 29. NMKL Nr. 96, 3.udg., 2003. Koliforme bakterier (E. coli) Termotolerante koliforme bakterier, MPN, 44 C. Mikrobiologisk undersøkelse av fersk og fryst sjømat Bilag 1, pkt. 29. NMKL Nr. 96, 3.udg., 2003. Koliforme bakterier - termotolerante koliforme Koliforme bakterier præsumptiv E. coli Termotolerante koliforme bakterier. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 125, 3.udg., 1996. Bilag 1, pkt. 28. Termotolerante koliforme bakterier. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 125, 3.udg., 1996. Bilag 1, pkt. 28. Koliforme bakterier - E. coli Termotolerante koliforme bakterier. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 125, 3.udg., 1996. Bilag 1, pkt. 28. Koliforme bakterier (E. coli/koliforme) Referencemetode efter dir. 92/46 Anvendes til smør, konserves, kasein, etc.. Anvendes til bestemmelse i produkter med forventet lavct kontaminaitonsniveau; <100 cfu/g) E. coli /Coliform Count Plate. 3M Petrifilm. Godkendt 5. maj 2003. Gyldig til 5. maj 2005. Koliforme bakterier (E.coli) Select E.coli Count Plate. Petrifilm. Valideret mod ISO 16649-2: 2001. Godkendt 28. April 2004. Gyldig til 28 april 2006. Koliforme bakterier Coliform Count Plate. 3M Petrifilm.-+- Godkendt 5. maj 2003. Gyldig til 5. maj 2005. Listeria monocytogenes Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. ISO 11290-2, 1998 og ISO 11290-2:1998/Amd 1:2004. Bilag 1, pkt. 17. Listeria monocytogenes EN ISO 11290-1: 1997 og ISO11290-1:1996/Amd 1:2004 (horizontal) Microbiology of food and animal feeding stuffs -Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes Part 1: Detection method. Referencemetode efter dir. 92/46 Side 6 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Listeria monocytogenes (semikvant.) Listeria monocytogenes. Påvisning i levnedsmidler. NMKL Nr. 136, 3.udg., 2004. Bilag 1, pkt. 16. Listeria monocytogenes (kvalitativ) Listeria monocytogenes. Påvisning i levnedsmidler. NMKL Nr. 136, 3.udg., 2004. Bilag 1, pkt. 16. Listeria monocytogenes RAPID L.MONO, Biorad, Frankrig. Godkendt 20. november 2003. Gyldig til 20. november 2005. Anvendes til påvisning af Listeria monocytogenes i alle fødevarer Listeria monocytogenes Oxoid Listeria Rapid Test. FT 401 A/M. Godkendt: 28. maj 2004 Gyldig til: 28. maj 2006. Anvendes til påvisning af Listeria spp. i alle fødevarer Listeria monocytogenes Transia Plate Listeria. Diffchamb Danmark A/S. Godkendt: 12. dec. 2003. Gyldig til 12. dec. 2004. Anvendes til påvisning af Listeria spp. i alle fødevarer Listeria monocytogenes VIDAS Listeria. Godkendt: 4. maj 2003 Gyldig til 4. maj 2005 Anvendes til påvisning af Listeria spp. i alle fødevarer Listeria monocytogenes VIDAS Listeria monocytogenes II. Godkendt: 4. marts 2003 Gyldig til 4. marts 2005 Anvendes til påvisning af Listeria monocytogenes i alle fødevarer Listeria monocytogenes (verifik.) Accuprobe Listeria monocytogenes. Genprobe, USA.Nr. Godkendt: 31. maj 2004 Gyldig til: 31. maj 2006 Anvendes til verifikation af Listeria monocytogenes fra fast substrat efter isolation iht. NMKL Nr. 136, Bilag 1, pkt. 17. Prøveudtagning IDF 50C:1995. Milk and milk products General guidance for sampling. Referencemetode efter dir. 92/46 Salmonella Salmonella. Påvisning i livsmedel. NMKL Nr. 71, 5.udg., 1999. Bilag 1, pkt. 24. Salmonella Salmonella, MSRV-teknik. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling Bilag 1, pkt. 25. Salmonella Microbiology of food and animal feeding stuffs-horizontal method for the detection of Salmonella spp.. EN ISO 6579:2002. (EN ISO 6579:2002/Cor 1:2004). Salmonella EiaFoss Salmonella. TypeNr. 23000 fra Foss Electric. Godkendt: 22. nov. 2002 Gyldig til 22. november 2004. Anvendes til påvisning af Salmonella i alle fødevarer samt svaberprøver af kødkroppe. Salmonella Transia Plate Salmonella Gold. Diffchamb Danmark A/S. Godkendt: 24. april 2004 Gyldig til: 24. april 2006. Anvendes til påvisning af Salmonella i foderstoffer af animalsk oprindelse samt alle fødevarer. Side 7 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Salmonella VIDAS Salmonella.Biomerieux. Godkendt: 4. maj 2003 Gyldig til 4. maj 2005 Anvendes til påvisning af Salmonella i alle fødevarer Salmonella VIDAS Salmonella ICS. Biomerieux. Godkendt: 12. sep. 2003. Gyldig til 12. sep. 2005. Anvendes til påvisning af Salmonella i alle fødevarer samt svaberprøver af kødkroppe. Salmonella BIOLINE Salmonella Optima. Godkendt: 4. maj 2003 Gyldig til 4. maj 2005 Anvendes til påvisning af Salmonella i foderstoffer af animalsk oprindelse samt alle fødevarer. Salmonella BIOLINE Salmonella selecta. Godkendt: 28 april 2004. Gyldig til 28 april 2006. Anvendes til påvisning af Salmonella i foderstoffer af animalsk oprindelse samt alle fødevarer. Salmonella BAX System - PCR Salmonella Assay. Dupont Qualicon. Godkendt: 20. november 2003 Gyldig til 20 november 2005 Anvendes til påvisning af Salmonella i foderstoffer af animalsk oprindelse samt alle fødevarer. Salmonella LumiProbe 24 Salmonella Europrobe France. Godkendt: 4 marts 2003. Gyldig til 4 marts 2005 Anvendes til påvisning af Salmonella i alle fødevarer. Salmonella (mælk og mælkeprodukter) ISO 6785 / IDF 93:2001 eller EN ISO 6579:2002. (EN ISO 6579:2002/Cor 1:2004). Detection of Salmonella. Salmonella i fæces Påvisning af Salmonella i fæces - DFVF referencemetode, 1. udgave, 2003. Referencemetode efter dir. 92/46 Sensorisk undersøgelse Sensorisk undersøgelse.fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske Metodesamling.Bilag 1, pkt. 1. Shigella Shigella bakterier. Påvisning i levnedsmidler. NMKL Nr. 151, 1995 Shigella ISO 21567:2004: Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Shigella spp. Shigella Shigella spp. PCR-metod for påvisning i livsmedel. NMKL Nr. 174, 2. udg., 2002. Skimmel Mögel och jäst. Bestämning i livsmedel (metodeforslag). NMKL Nr. 98, 3.udg., 1995. Bilag 1, pkt. 9. Somatiske celler i mælk EN ISO 13366-3:1997. Milk Enumeration of somatic cells Part 3: Fluoro-optoelectronic method. Somatiske celler i mælk EN ISO 13366-1:1997. Milk Enumeration of somatic cells Part 1: Microscopic method. Referencemetode efter dir. 92/46 Side 8 af 9, 15. marts 200529-08-2005

Staphylococcus aureus enterotoksiner Community Reference Laboratory (CRL) metode, Detection of staphylococcal enterotoxins in milk & milk products, Version 1, December 2000. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1 pkt. 27. Staphylococcus Staphylococcus aureus. Bestemmelse i næringsmidler. NMKL Nr. 66, 4.udg., 2003. Bilag 1, pkt. 27. Koagulase positive stafylokokker Koagulase positive stafylokokker ISO 5944:2001 / IDF 60: 2001. Milk and milk products Enumeration of coagulasepositive staphylococci. Most probable number technique. IDF 145A: 1997. Milk and milk products Enumeration of coagulase-positive staphylococci. Colony count technique. Referencemetode efter dir. 92/46 Referencemetode efter dir. 92/46 Referencemetode efter dir. 92/46 Staphylococcus Staph Express Count System. 3M. Petrifilm. Godkendt 10. juni 2003. Gyldig til 10. juni 2005. Vibrio Sygdomsfremkaldende Vibrio arter. Påvisning og bestemmelse i levnedsmidler NMKL Nr. 156, 2.udg., 1997. Bilag 1, pkt. 30. Vibrio Påvisning af sygdomsfremkaldende Vibrio spp. Fødevarestyrelsens kemiske og mikrobiologiske metodesamling. Bilag 1, pkt. 37. Vibrio Miljøundersøgelse Bestemmelse af suspekte Vibrio vulnificus ved semi-kvantitativ metode med opformering i bouillon efterfulgt af udsæd på fast substrat. DS 3030, 1.udg., 2002. Yersinia Yersinia enterocolitica. Påvisning i næringsmidler. NMKL Nr. 117, 3.udg., 1996. Bilag 1, pkt. 31. Yersinia Patogen Yersinia enterocolitica. PCR- metoder for påvisning i næringsmidler. NMKL Nr. 163, 1998. Anvendes på miljøprøver. Side 9 af 9, 15. marts 200529-08-2005

J.Nr.: 1001-50/02 Fødevarestyrelsens Kemiske og Mikrobiologiske Metodesamling Bilag 1 Version : 05 15. marts 2005

1. Sensorisk undersøgelse En sensorisk undersøgelse og vurdering udgør et vigtigt led ved gennemførelse af en laboratoriemæssig undersøgelse af et levnedsmiddel. Objektive analyser, som omfatter mikrobiologiske, kemiske og fysiske undersøgelser, er ofte ikke tilstrækkelige for en vurdering af levnedsmidlets sundhedsmæssige og hygiejniske kvalitet, men må suppleres med en sensorisk bedømmelse. For visse levnedsmidler er en sensorisk analyse ofte tilstrækkelig for kontrolmyndighedens vurdering af et levnedsmiddel. Dette gælder f.eks. ved undersøgelse af friske frugter og visse produkter heraf. Såfremt der ved den indledende sensoriske bedømmelse af et levnedsmiddel er konstateret en abnorm tilstand, f.eks. abnorm lugt, kan objektive analyser medvirke til en nærmere opklaring af årsagsforholdene og som dokumentation, men er egentlig ikke påkrævet for vurderingen af levnedsmidlets hygiejniske og sundhedsmæssige kvalitet. Forhold af betydning for undersøgelsen Den sensoriske bedømmelse udføres i tilslutning til den laboratoriemæssige analyse og skal indeholde en bedømmelse af levnedsmidlets udseende, farve, konsistens, lugt og eventuelt smag. Smagsmæssig bedømmelse udelades, hvis der er mistanke om tilstedeværelse af mulige sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Vurderingen foretages i relation til en "normaltilstand", hvorfor det er vigtigt, at der til brug for bedømmelsen er erhvervet et grundigt kendskab til produkternes normale karakteristika. En sensorisk bedømmelse er behæftet med usikkerhed på grund af, at den indeholder et subjektivt skøn, og forskelle i ydre vilkår kan endvidere øge denne usikkerhed. For at reducere en uheldig virkning af de ydre vilkårs indflydelse på bedømmelsen bør laboratoriet indføre en række praktiske regler for bedømmelsens udførelse. Af sådanne regler kan nævnes: Bedømmelsen bør optimalt foretages af flere personer, som gennem erfaring og optræning har opnået et kendskab til levnedsmidlets normale sensoriske karakteristika. Bedømmelsen bør fra gang til gang foretages under de samme lokalemæssige forhold, herunder lys og temperaturforhold, og uden at der i lokalet er forstyrrende fremmede lugte og i øvrigt under rolige betingelser. Mindst 1 time før analysens gennemførelse bør der ikke indtages nydelsesmidler, mad eller lignende, der kan påvirke (bedøve) smagsevnen, ligesom også håndvask med sæbe lige før undersøgelsen forstyrrer denne. Lugtbedømmelsen bør normalt foretages ved stuetemperatur, og det er en fordel, at prøverne i forvejen er varmet op til denne temperatur. Ofte kan man dog med fordel lugtbedømme den samme vare både i kold tilstand (frossen eller kølet), og efter at denne har antaget stuetemperatur. Lugtbedømmelse foretages bedst på friske brud- eller snitflader. Mange af de kemiske forbindelser, der er ansvarlige for dårlig lugt, er luftarter med lavt damptryk, der kan erkendes allerede på frosne eller kølede levnedsmidler. Ved undersøgelse af Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 2 af 42

vakuumpakkede kødvarer kan der ofte ved pakkens åbning konstateres en karakteristisk "poselugt", som kan forsvinde, efter at pakken har været åbnet 10-15 minutter. "Poselugt" behøver ikke at betyde, at varen er mikrobielt fordærvet. Undersøgelsens gennemførelse Prøvens udseende Undersøgelsen omfatter en bedømmelse af prøvens farve, konsistens, forekomst af eventuelle defekter m.v. Det bemærkes, om levnedsmidlets overflade er fugtig, slimet, indtørret, smudskontamineret, belagt med udfældninger (f.eks. saltudslag), mugpletter eller lignende. For visse levnedsmidler bør der foretages en vurdering af såvel overflade som dybde. Bedømmelse af konsistens og tekstur kan være særlig værdifuld for vurdering af den sensoriske kvalitet af f.eks. kød, fersk fisk, pølser samt visse frugter og grønsager. Lugt Afvigende lugt skyldes ofte dannelse af flygtige nedbrydningsprodukter, hvorved levnedsmidlet kan få en lugt, der, afhængig af mikrofloraen, kan være sur, stikkende, frugtagtig, blomsteragtig, acetonelignende, kemikalieagtig, ammoniakalsk eller putrid m.m. Afvigende lugtforekomst kan imidlertid også skyldes f.eks. medikamentel behandling, restforekomst af kemikalier eller kønslugt hos slagtedyr. I tilfælde, hvor mistanke om afvigende (abnorm) lugt foreligger i kød- og fedtprøver, bør den umiddelbare undersøgelse suppleres med en koge- og/eller stegeprøve. Kogeprøve Udføres bedst ved at anbringe terninger af prøven i kogekolbe (f.eks. 300 ml Erhlenmeyer kolbe). Der tilsættes så meget vand, at prøvematerialet netop dækkes, og kolben pålægges et urglas, hvorefter kolben opvarmes til svag kogning. Man lugter til dampene i kolbens hals efter opvarmningens afslutning og efter delvis afsvaling. Stegeprøve Udføres ved stegning på omhyggelig rengjort pande eller i øvrigt efter producentens anvisning og uden anvendelse af fedtstof. 2. Bacillus cereus Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 3 af 42

Metodik Som anført i NMKL Nr. 67, 5. udgave 2003. Ved undersøgelse af levnedsmidler, som formodes at have højt indhold af gramnegative bakterier, kan blodagar tilsættes 25 I.E. polymyxin B-sulfat eller 75 I.E. kolistin sulfat pr. ml. Ved anvendelse af Bacillus cereus selektiv agar kan lecithinaseaktiviteten være svag, og kun observeres i umiddelbar nærhed af, eller under kolonierne. Ved konfirmering af kolonier kan man ofte få en tydeligere lecithinase reaktion ved at inkubere yderligere 12-24 timer. 3. Bakteriesporetal Metodik Den forbehandlede delprøve (10-1 fortynding) varmebehandles i vandbad ved 80,0 C ± 1,0 C i 10 minutter. Videre fortyndinger fremstilles ud fra denne Aerobe sporedannende bakterier: Der udsås passende fortyndinger i blodagar. Dyrkning: 30,0 C ± 1,0 C i indtil 8 døgn. Anaerobe sporedannende bakterier: Der udsås passende fortyndinger i blodagar. Dyrkning: 30,0 C ± 1,0 C i indtil 8 døgn anaerobt. Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette. 4. Calicivirus Ved mistanke om fødevarebårne Calicivirus infektioner kan prøvemateriale efter aftale indsendes til undersøgelse ved Danmarks Fødevare- og Veterinærforskning (DFVF), Afdeling for Mikrobiologisk Fødevaresikkerhed, Sektion for Zoonosediagnostik og Metodeudvikling, Mørkhøj Bygade 19, 2860 Søborg. 5. Termofile Campylobacter Metodik Som anført i NMKL Nr. 119, 2. udgave 1990, med følgende præciseringer: Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 4 af 42

Til de termofile Campylobacter af betydning for human sygelighed, der kan påvises ved denne metode, regnes primært Campylobacter jejuni, Campylobacter coli og Campylobacter lari. Pkt. 5.1 Substraternes ph skal være 7,4 ± 0,2. Som alternativ til hesteblod kan kalveblod anvendes. Citratstabiliseret blod kan anvendes som alternativ til defibrineret blod. Pkt. 5.1.7 Actidion/Cycloheximid erstattes med Amphotericin B i en konc. på 10 mg/l. Pkt. 9.1 Ved præopformeringen inkuberes 25 g prøve i 225 ml Preston-bouillon. Der kan anvendes 250 ml flaske med tætsluttende skruelåg, hvorved præopformeringsbouillonen ikke behøver mikroaerofile inkubationsbetingelser. Præopformeringbouillonen inkuberes ved 42,0 ± 0,5 C i 24 timer ± 3 timer. Pkt. 9.2 Modified Charcoal - Cefoperazone - Desoxycholate - Agar (mccda), erstatter brugen af Preston - og CBFS agar. mccda findes kommercielt tilgængelig. Pkt. 9.5 Præsumptive Campylobacter rendyrkes på blodagar (Base 2). Pkt. 9.6 Indoxyl acetat hydrolyse. Med henblik på at opnå yderligere sikkerhed i differentieringen mellem de tre "termofile" species af Campylobacter (C. jejuni, C. coli og C. lari) kan der udføres en test for indoxyl acetat hydrolyse. I denne test vil C. jejuni og C. coli være positive mens C. lari vil være negativ. Materialer Indoxyl acetat (Sigma I-3500) Acetone Concentration disks ½" (Difco 1571-33) Destilleret vand Der fremstilles en 10% (vægt/volumen) opløsning af indoxyl acetat i acetone. Hver disk påsættes 25 µl af denne opløsning. Diskene lufttørres ved stuetemperatur. Efter tørring kan diskene opbevares mørkt i en lufttæt beholder ved 4 C. De imprægnerede disks er holdbare i mindst 6 måneder, hvis de opbevares mørkt og fugtfrit ved 4 C. Fremgangsmåde Med podenål overføres kolonimasse til en indoxyl acetat imprægneret disk. Der påsættes herefter 1- Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 5 af 42

2 dråber destilleret vand. Reaktionen aflæses efter 10 minutter. Aflæsning Indoxyl acetat positiv: Udvikling af blå/blågrøn farve efter 10 min. Indoxyl acetat negativ: Ingen farveændring efter 10 min. Pkt. 9.6.1 Ved udførelse af test for hippurat-hydrolyse overføres rigelig kolonimasse til Nahippuratopløsningen. Fra Campylobacter positive prøver fra Fødevareregionernes laboratorier kan der efter behov indsendes isolater til Danmarks Fødevare- og Veterinærforskning, Afdeling for Mikrobiologisk Fødevaresikkerhed, Sektion for Zoonosediagnostik og Metodeudvikling, Bülowsvej 27, 1790 København V, for yderligere karakterisering. 7. Clostridium perfringens Metodik Som anført i NMKL Nr. 95, 3. udg., 1997 med følgende bemærkninger. Ved undersøgelse af prøver med forventet højt indhold af clostridiearter, men med lavere forekomst af C1. perfringens, kan TSCE-agar med TSC som dæklag med fordel anvendes. Pkt. 5.1.1 D-cycloserin opløses i sterilt vand.tryptose-sulfit-cycleserin agar tilsat æggeblomme. Fremstillingsmåden er som for TSC-agar. Tilsæt 20 ml 50 % æggeblommeopløsning til 250 ml smeltet TSC-agar. Pkt. 5.1.3 Følgende Bufret bevægeligheds/nitrat medium kan anvendes til undersøgelse for bevægelighed i stedet for det i metoden oplyste: Bufret bevægeligheds/ nitrat medium Kødekstrakt Pepton Kaliumnitrat, KNO 3 Di-natrium-hydrogenphosphat, Na 2 HPO 4, Galaktose 3,0 g 5,0 g 5,0 g 2,5 g 5,0 g Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 6 af 42

Glycerin, ren Agar Vand, ionbyttet ph 7,3 ± 0,2 5,0 g 3,0 g ad 1.000 ml Ingredienserne afvejes og opløses i vand. Kvælder 15 min og opvarmes til kogning til fuldstændig opløsning. Mediet luftafkøles og ph indstilles. Cirka 11 ml medium afpipetteres og autoklaveres ved 121 C i 15 min. Pkt. 5.1.5 kan erstatte pkt. 5.1.3 samt 5.1.4 Pkt. 5.1.5 Lactose sulfit medium (LS- medium) Basis medium (Sanofi Diagnostics Pasteur cat. No. 64914 eller tilsvarende) Sammensætning Kasein Gærekstrakt NaCl Lactose L-Cystein hydrochlorid Sterilt vand 5,0 g 2,5 g 2,5 g 10,0 g 0,3 g ad 1.000 ml Fremstilling Opløs ingredienserne i vand ved kogning (hvis nødvendigt). Dispensér 8 ml portioner i rør indeholdende Durham rør og autoklaver ved 121 C i 15 min. ph justeres så det efter autoklavering er 7,1 ± 0,2 ved 25 C. Mediet kan opbevares ved 3 C ± 2 C op til 4 uger. Dinatrium disulfit, vandfri opløsning Sammensætning Dinatrium disulfit (Na 2 S 2 O 5 ), vandfrit Vand 1,2 g ad 100 ml Fremstilling Opløs dinatrium disulfit i vand og sterilisér opløsningen ved filtration. Opløsningen skal anvendes inden for en dag. Ammonium jern (III) citrat opløsning Sammensætning Ammonium jern (III) citrat Sterilt vand 1,0 g ad 100 ml Fremstilling Opløs ammonium jern (III) citrat i vand og sterilisér opløsningen ved filtration. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 7 af 42

Opløsningen skal anvendes inden for en dag. Komplet medium Anvendes mediet ikke samme dag hvor det fremstilles, fjernes ilten fra mediet før det samlede medium fremstilles ved at opvarme mediet og derefter nedkøles det hurtigt. Hvis mediet har skruelåg, skal låget løsnes før opvarmning og skues fast før afkøling. Derefter tilsættes 0,5 ml af dinatrium disulfit opløsning og 0,5 ml af ammonium jern (III) citrat opløsning til hver 8 ml grundsubstrat. (Mediet må ikke hvirles op bagefter pga. ilttilførsel, selvom det er svært at blande). ph i brugsfærdigt medie: 6,5 ± 0,2. Pkt. 8.5 Dobbelthæmolyse på blodagar kan med fordel aflæses efter 48 timer. Ved anvendelse af lactose sulfit medium overføres mindst 5 kolonier fra blodagar til hvert sit rør af LS medium med en podenål. Inkubér ved 46,0 C ± 0,2 C i 18 til 24 timer i et vandbad. Bemærk: Reaktionen i lactose sulfit mediet når det inkuberes ved 46 C er meget specifik for Clostridium perfringens og nogle stammer af Clostridium paraperfringens og Clostridium absonom. Pkt. 8.5.3 Lactose sulfit medium (LS medium) LS mediet aflæses for luftproduktion og sværtning (jernsulfit precipitation). Durham rør som bliver mere end en fjerdedel fyldt med luft og rør som har et sort precipitat bedømmes som positive. Ved tvivl om det sværtede Durham rør er mindre end en fjerdedel fyldt med luft, overføres med en steril pipette i den anvendte LS medie straks 5 dråber til et nyt LS medium rør. Inkubér i vandbad ved 46 C i 18 til 24 timer. Aflæs røret som beskrevet ovenfor. I alle andre tilfælde, vil rørene blive bedømt som negative. 8. Enterobacteriaceae Metodik Som anført i NMKL Nr. 144, 2. udgave 2000 med følgende bemærkninger. Pkt. 8.3 Konfirmering udføres, når dette er ønskeligt eller nødvendigt. 9. Gær og skimmel Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 8 af 42

Metodik Som anført i NMKL Nr. 98, 3. udgave 1995, med følgende ændringer: Forbehandling af prøven kan foretages som anført i NMKL Nr. 91, 4. udgave 2002. Undersøges alene for gær kan substratet OGYE (Oxytetracyclin-Glucose-Yeats-extract) agar med følgende sammensætning benyttes: Gærekstrakt 5,0 g Glucose 20,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 7,0 ± 0,2 Opvarm til alle ingredienser er opløst. Fordel på flasker med 100-200 ml i hver og autoklavér ved 115 C i 10 minutter. Til det smeltede, til 50 C nedkølede substrat, tilsættes før brug 1 ml oxytetracyclinopløsning pr. 100 ml, der fremstilles ved at opløse 100 mg oxytetracyclin i 10 ml destilleret vand som derefter sterilfiltreres. Dyrkning 25,0 C ± 1,0 C i 5 døgn. 10. Kim på blodagar Metodik Der anvendes dybde- eller overfladeudsæd i blodagar med følgende sammensætning: Pepton 10,0 g Kødekstrakt 5,0 g Natriumklorid 7,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 7,2 ± 0,2 Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, overføres substratet til mindre flasker, der autoklaveres ved 121 C i 15 minutter. Ligeværdige formuleringer af blodagar kan anvendes. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 9 af 42

Til det smeltede og til 45-48 C afkølede substrat tilsættes 5% sterilt, stabiliseret eller defibrineret kalveblod samt evt. 25 I.E. polymyxin B-sulfat eller 75 I.E. kolistin sulfat pr. ml. Såfremt blodpladerne skal anvendes specielt til at påvise grampositive hæmolytiske bakterier, kan de gram-negative stavbakterier hæmmes ved tilsætning af polymyxin B-sulfat som oven for anført. Hvis blodpladerne derimod skal anvendes til en generel vurdering af mikrofloraen i et levnedsmiddel, anvendes blodagar uden hæmmende stoffer. Dyrkning 37,0 C ± 1,0 C i 24-48 timer. Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette. Aflæsning Aflæsning og vurdering af hæmolytiske bakterier foretages både efter 24 og 48 timer. Kimtallet aflæses efter 48 timer. Hovedgrupperne af den fremvoksende mikroflora vurderes og sammenholdes med øvrige kimtal. Såfremt hæmmende stoffer ikke er anvendt, kan samtlige kolonier tælles, og resultatet anvendes som et 37 C kimtal. Hæmolytiske bakterier kan tælles, og arten af de dominerende typer evt. angives efter fornøden identifikation. 11. Kimtal i Plate Count Agar Som anført i NMKL Nr. 86, 3. udgave 1999. Bestemmelse af total kimtal udføres ved anvendelse af Plate Count agar, inkuberet ved 25,0 C± 1,0 C i 3 døgn. 12. Aerobt kimtal i Long and Hammer agar Floraen i modificeret atmosfære pakket ferske saltvandsfisk og fiskevarer domineres ofte af fordærvelsesbakterien Photobacterium phosphoreum. Bestemmelse foretages ved overfladeudsæd på Long and Hammer agar med 1% NaCl. Metodik Der anvendes overfladeudsæd på Long and Hammer (1% NaCl) agar med følgende sammensætning: Proteose-pepton (Difco 0120-17-6, eller tilsvarende) Gelatine K 2 HPO 4 20,0 g 40,0 g 1,0 g Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 10 af 42

NaCl 10,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 7,0 ± 0,2 Bestanddelene opløses under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 C i 15 minutter. Ammoniumferricitrat (Merck 103762 eller tilsvarende) tilsættes substratet til en koncentration på 0,25 g/l i det færdige substrat. Denne koncentration opnås ved at tilsætte 0,25 ml af en 10% opløsning pr. 100 ml færdigt substrat. Fortyndingsvæske og substrat afkøles til ca. 5 C før brug. Temperaturen i prøven og i fortyndinger heraf må ikke overskride 20 C. Dyrkning 15,0 C ± 1,0 C i 5 døgn. Aflæsning Efter endt inkubation tælles antallet af kolonier. 13. Aeroba mikroorganismer och presumptiva Enterobacteriaceae. Beräkning på ytor och tillbehör. Metodik Som anført i NMKL Nr. 5, 5.udgave 2001, med følgende bemærkning: Pkt. A5.2 og Pkt. B5.1 TSA kan erstattes af PCA 14. Bestemmelse af kimtal ved Spiraludspredningsteknik Kimtalsbestemmelse kan foretages ved hjælp af spiraludspredningsteknikken i form af apparatur fra MALTEC ApS eller tilsvarende. 15. Fremmede kim Metodik Der anvendes dybdeudsæd i Sukkerfri-pepton agar med følgende sammensætning: Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 11 af 42

Pepton (kulhydratfri) 7,5 g Trypton (kulhydratfri) 7,5 g Natriumklorid 5,0 g Agar 15,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 7,6 ± 0,2 Bestanddelene opløses evt. under opvarmning. Når alle ingredienser er opløst, omhældes substratet på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 C i 15 minutter. Substratet er kommercielt tilgængeligt. Dyrkning 25,0 C ± 1,0 C i ca. 72 timer. Aflæsning Alle kolonier bortset fra pin-point kolonier tælles. Man skal være opmærksom på, at en evt. ikke-mikroaerofil del af starterkulturen vil have gode vækstbetingelser på en sukkerfri agar. Vurdering af resultatet er derfor vanskelig, med mindre starterkulturens sammensætning er kendt. Andre inkubationsbetingelser kan anvendes, når der er behov for dette. 16. Listeria monocytogenes Metodik Som anført i NMKL Nr. 136, 3. udgave 2004 med følgende præcisering: Pkt. 5.1.2 I afsnittet som starter: Opløs ingredienserne ændres til : Opløs ingredienserne (5.1.1) til basismediet i vand. Autoklaver ved 121 C i 15 min. Tilsæt 5 ml nalidixinsyreopløsning (5.1.2). Den sidste linie: Autoklaver ved 121 C i 15 min og afkøl mediet straks slettes. Pkt. 5.2.1 Nalidixinsyreopløsningen (5.2.1) tilsættes først efter autoklavering. Pkt. 5.4.2 Actidion/Cycloheximid erstattes med Amphotericin B i en konc. på 10 mg/l.pkt. 8.2Der skal laves udsæd fra alle Fraser bouilloner også ikke sværtede rør Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 12 af 42

Pkt 8.1 (Semikvantitativ metode) Ved undersøgelse af prøvemængder på 0,1g eller mindre kan fortyndingrækken også fremstilles ved at pode 1 ml fra 10-folds fotyndingsrækkerne fremstillet efter NMKL Nr. 91, 4. udg., 2002: Prøveudtagning og forbehandling af levnedsmidler og foderstoffer til kvantitativ mikrobiologisk undersøgelse. 17. Listeria monocytogenes Kvantitativ bestemmelse Metodik Som anført i ISO 11290-2:1998. Horisontal metode til optælling af Listeria monocytogenes med følgende præciseringer: Undersøgelsen indledes på Palcam og Oxford agarplader med 10-1 fortynding ved at bruge 2 x 0,5 ml pr. plade af 10-1 fortynding. Til konfirmering anvendes tynde blodagar plader jf. NMKL Nr. 136, 3. udgave 2004 i stedet for TSYEA agarplader. Der kan anvendes AccuProbe til konfirmering af enkeltliggende suspekte kolonier fra tynde BA plader. Da der er tale om en kvantitativ undersøgelse, skal den enkelte koloni, dvs. mindst 5 kolonier fra hver selektive plade, verificeres. 19. Mælkesyrebakterier Gruppen af mælkesyrebakterier er ikke helt veldefineret. Den omfatter lactobaciller, carnobakterier, pediococcer, lactococcer og Leuconostoc, hvorimod tilhørsforholdene for bl.a. enterokokkccer, aerococcer og bifidobakterier diskuteres. Mælkesyrebakterier er grampositive, oftest katalasenegative, ubevægelige, ikke sporedannende og fermenterer kulhydrater med mælkesyre som hovedprodukt. For alle medier anbefalet til selektiv dyrkning af bakterier indenfor mælkesyrebakteriegruppen kan der være problemer i form af for kraftig eller for svag selektivitet, idet vækstbetingelser er til stede for beslægtede bakterier som f.eks. enterococcer, Brochothrix og Listeria. Fortolkningen af høje mælkesyrebakteriekimtal kan således støttes af andre kimtal som f.eks. enterococcer og Brochothrix samt eventuelt periodevis basal identifikation af den fremvoksede flora. Carnobakterier tåler ikke acetat ved lave ph-værdier og vil derfor ikke vokse på MRS-agar. Disse mælkesyrebakterier er almindeligt forekommende (ofte i høje tal) i en del spiseklare produkter. Indtil for nylig kunne antallet af carnobakterier estimeres ved udsæd i NAP-agar (Nitrit-Actidion- Polymyxin tilsat APT (All Purpose Tween) agar). Grundet giftigheden af actidion, bruges dette stof Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 13 af 42

ikke mere. Actidion tilsættes primært for at hæmme gær-celler, så i produkter, hvor der ikke ventes høje gærtal, kan en NP-APT-agar anvendes. Det skal understreges, at dette ikke er en publiceret metode. NAP (eller NP) agar er ikke fuldstændigt selektivt. Der er meldt om fremvækst af både gram-positive og gram-negative bakterier på substratet.. Derfor bør der opstikkes 5 kolonier til verifikation, før et resultat opgives som antal carnobakterier pr. gram. Metodik Som anført i NMKL Nr. 140, 1991 med følgende ændringer: Pkt. 5.2 I stedet for MRS-S agar anvendes MRS Agar med ph 6,2. Pkt. 8.2 Der anvendes dybdeudsæd med dæklag, evt. overfladeudsæd i 5-10% CO 2 -atmosfære. Pkt. 8.3 Inkuberes ved 25,0 C ± 1,0 C i 5 dage. Undersøgelse for carnobakterier: Ved NP-agar anvendes APT-agar som basissubstrat og efterfølgende tilsætning af de inhiberende stoffer. Basissubstrat APT agar: Pepton 12,5 g Gærekstrakt 7,5 g Glukose 10,0 g NaCl 5,0 g Tri-Natriumcitrat 5,0 g di-kaliumhydrogenfosfat (K 2 HPO 4 ) 5,0 g Tween 80 0,2 g Magnesiumsulfat 0,8 g Manganklorid 0,14 g Jern(II)-sulfat 0,04 g Thiamindiklorid 0,001 g Agar 13,5 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 6,7 ± 0,2 Bestanddelene kvælder i vandet i mindst 10 min. og opløses derefter fuldstændigt i det destillerede vand under opvarmning. Substratet overføres til flasker med 200 ml agar, der autoklaveres ved 121 C i 15 min. Såfremt agaren skal anvendes til at undersøge drikkevarer, kan der tilsættes yderligere 1% fructose for at tilpasse substratets sammensætning til produktet. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 14 af 42

Inden brug tilsættes pr. 200 ml smeltet og til ca. 50 C afkølet substrat: 1) 1 ml steriliseret 12% (w/v) natriumnitritopløsning (12 g natriumnitrit + destilleret vand ad 100 ml). 2) 1 ml sterilfiltreret polymyxin-b-opløsning med 5000 IU/ml (fremstilling afhængig af den deklarerede aktivitet af polymyxin-b). Opløsning 1) kan opbevares 3 uger på køl mens opløsning 2) kan opbevares 1 uge på køl. Opløsningerne kan købes færdige og opbevares da efter producentens anvisning. Der anvendes dybdeudsæd med dæklag eller inkubering af pladerne, der i så fald kan være overfladeudsået i 5-10% CO 2 -atmosfære. Dyrkning 25,0 C ± 1,0 C i 3 døgn Aflæsning Der tælles på plader af passende fortyndinger. På NP agar tælles samtlige kolonier, dog undtaget typiske kolonier af Bacillus-arter og gær, der kan vokse på substratet. Brochothrix kan i visse tilfælde vokse på substratet uden at kunne skelne kolonimorfologisk, men der er ikke påvist en entydig sammenhæng mellem forekomst af Brochothrix i produktet og på NP-pladerne. Brochothrix kan skelnes fra mælkesyrebakterier ved rendyrkning på APT-plader, katalasetest (20% v/v H 2 O 2 ) og mikroskopi. Brochothrix er katalasepositiv på APT-agar, ubevægelig og stavformet (polymorf). Da også nogle gram-negative bakterier kan interferere anbefales det, at der opstikkes kolonier til verifikation som carnobakterier. 20. Lactobaciller og bifidobakterier 1.Undersøgelse af Acidophilus mælk, for indhold af Lactobacillus acidophilus: 1.1 Substrat M.R.S.-agar: (kan fås i dehydreret form) Pepton 10 g Kødekstrakt 8 g Gærekstrakt 4 g Glukose 20 g Tween 80 1 ml Dikaliumhydrogenfosfat 2 g Natriumacetattrihydrat 5 g Triammoniumcitrat 2 g Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 15 af 42

Magnesiumsulfat, 7 H 2 O Mangansulfat,4 H 2 O Agar Vand 0,2 g 0,05 g 10 g ad 1.000 ml ph 6,2 ± 0,2 1.2 Udsæd Dybdeudsæd af 1 ml af passende fortynding i M.R.S.-agar. 1.3 Inkubation Anaerob inkubation ved 37 C ± 1 C i 72 ± 3 timer. 1.4 Identifikation og tælling Identifikation af enkelte kolonier foretages ved mikroskopi og gramfarvning. Ved tælling benyttes bedst kolonitæller med forstørrelsesglas. 2. Undersøgelse af Acidophilus-Bifido sødmælk m.m., for indhold af L. acidophilus og Bifidobacterium bifidum: 2.1 Substrat M.R.S.-agar (jf. 1.1) 2.2 Udsæd Som 1.2. 2.3 Inkubation Anaerob inkubation ved 37 C ± 1 C i 72 ± 3 timer. 2.4 Identifikation og tælling L. acidophilus og B. bifidum danner kolonier, der ved brug af kolonitæller med forstørrelsesglas kan skelnes fra hinanden efter følgende karakteristika: L. acidophilus B. bifidum Størrelse 1,5-3 mm Cirka 1 mm Form Irregulær Cirkulær Overflade Flad, med granulær overflade Konveks med glat overflade Farve Hvid opalisk skinnende. Højere tæthed centralt i kolonien Hvid opalisk skinnende 2.5 Selektive principper Til selektion mellem L. acidophilus og B. bifidum med hæmning af væksten af L. acidophilus anvendes M.R.S.-agar tilsat NNL-opløsning: NNL-opløsning: LiCl 6,00 g Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 16 af 42

Nalidixic acid Neomycin-sulphat 0,03 g 0,20 g Opløses til 100 ml med destilleret vand. Justér ph til 7,2-7,5 med 0,1 n NaOH. Sterilfiltrer opløsningen og opbevar køligt. M.R.S.-agar med NNL: Umiddelbart før brug tilsættes 5,0 ml af NNL til 100 ml M.R.S.-agar. 2.5.2 Udsæd og inkubation Som anført under 2.2. og 2.3. Til selektion mellem L. acidophilus og B. bifidum med hæmning af væksten af B. bifidum anvendes aerob inkubation i stedet for den under 2.3. nævnte anaerobe inkubation. Bemærk at aerob inkubation kan nedsætte antallet af kolonidannende enheder af L. acidophilus. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 17 af 42

21. Proteolytiske bakterier Metodik Der anvendes dybdeudsæd i Gelatine agar med følgende sammensætning: Neopepton 4,0 g Gærekstrakt 1,0 g Gelatine 10,0 g Agar 10,0 g Destilleret vand ad 1.000 ml ph (brugsfærdigt substrat) 7,2 ± 0,2 Bestanddelene opløses under opvarmning, og substratet ophældes på mindre flasker, der autoklaveres ved 121 C i 15 minutter. Sulfosalicylsyre reagens: Sulfosalicylsyre Destilleret vand 20,0 g ad 100 ml Sulfosalicylsyre reagens kan opbevares i 1 måned ved < 5 C. Dyrkning 25,0 C ± 1,0 C i 48 timer. Aflæsning Efter endt inkubation overhældes pladen med 3-4 ml sulfosalicylsyre reagens og henstår cirka 5 minutter. Samtlige kolonier, der er omgivet af en klar zone, tælles som proteolytiske. 23. Restkoncentrationer af antibiotika og kemoterapeutika i mælk Screening. Foretages med Delvotest SP. Ved positivt resultat kan indhold af penicillin i mælkeprøven bekræftes med penase. Verifikation og kvantificering. På mælkeprøver, der indikerer indhold af hæmmende stof ved analyse med Delvotest SP, skal der foretages verifikation og kvantificering. Verifikation og kvantificering foretages med en metode, der kan kvantificere stoffet over de fra EU fastsatte grænseværdier med tilstrækkelig nøjagtighed. Til dette kan metoder baseret på Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 18 af 42

kromatografi (HPLC eller GC) benyttes. Til indikation af hvilken stofgruppe det hæmmende stof tilhører (sulfonamider, tetracycliner, makrolider, beta-laktamer, aminoglycosider etc.), kan Charm II benyttes. 24. Salmonella Metodik Som anført i NMKL Nr. 71, 5. udgave 1999 med følgende præciseringer: Pkt. 5.3.4 Kommercielle præparationer af RV-medier skal indeholde 29 g magnesiumklorid, 6 H 2 O/liter, svarende til 13.58 g vandfrit magnesiumklorid per liter. (Oxoid CM 669 er derfor ikke anvendeligt). Pkt. 8.4.1 På BLSF vil ikke påvises laktosepositive Salmonella, mens XLD er mindre selektiv end BLSF og evt. vil medføre et lidt højere antal biokemiske verifikationer. Rambach har i undersøgelser vist sig på højde med eller lidt bedre end XLD og BLSF, men Pseudomonas og Acinetobacter kan give suspekte positive reaktioner, ligesom enkelte Salmonella serotyper lejlighedsvis kan udvise atypisk farvereaktion (bl.a. S. Dublin og S. Typhimurium). Pkt. 8.6.1 Fra de selektive/indikative agarplader udtages suspekte kolonier, der efter rendyrkning på nonselektiv agar stikkes i TSJ og Lysin jern agar. Typisk reaktion rød/gul/luft/sværtning i TSJ og purpur/purpur/luft/sværtning i Lysin jern agar. Atypiske reaktioner kan forekomme. Ved problemer ved forekomst af Hafnia alvei (især i fersk kød), kan der med fordel suppleres med sorbitolagar. Alternativt kan verifikation ske ved at suspekte kolonier fra selektivt medie overføres til TSJ. Fra rør med typisk/suspekt reaktion overføres materiale til fast non selektivt medie (PCA) hvorfra der udtages materiale til agglutination og videre karakterisering i f.eks. API20E. Sorbitolagar Sammensætning Bacto pepton, Difco 0118-17-0 eller tilsvarende Kødekstrakt, Merck 1.03979 eller tilsvarende Bacto agar, Difco 0140-01 eller tilsvarende Ionbyttet vand 10,0 g 5,0 g 15,0 g 1.000 ml Fremstilling Bestanddelene afvejes i 1.000 ml ionbyttet vand, kvælder 15 min. Opvarmes til kogning under omrøring til fuldstændig opløsning. Derefter tilsættes 40 ml 0,2% fenolopløsning. ph justeres ikke. Autoklaveres ved 121 C i 15 min, hvorefter agaren afkøles til ca. 45 C i vandbad. Derefter tilsættes inden brug 10 ml sorbitol/200 ml agar og ophældes på plader. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 19 af 42

Phenolrødt-opløsning 0,2 %: Phenolrot, Merck 7241 eller tilsvarende 2,0 g phenolrødt opløses under opvarmning til kogning i 80 ml 0,1 M NaOH, der tilsættes ionbyttet vand ad 1.000 ml efter et kortvarigt opkog betragtes opløsningen som steril. Sorbitolopløsning, 40%: D(-)-sorbit reinst, Merck 1.07758 40 g D(-)-sorbit afvejes i 100 ml målekolbe, der fyldes næsten op til mærket med ionbyttet vand, opløses under opvarmning i vandbad (ca. 45 C), afkøles til stuetemperatur og efterfyldes til målekolbens afmærkning. Sterilfiltreres gennem et 0,22µm filter. Heraf tilsættes 10 ml pr. 200 ml agar. ph i brugsfærdigt substrat: 7,1 ± 0,2. Inkubering Fra suspekt koloni podes på overfladen af sorbitolagar-pladen, samtidig med podning af TSJ og lysinjernagar rør. Pladerne inkuberes ved 37,0 C ± 1,0 C i 18-24 timer. Forlænget inkubation medfører, at sorbitolen opbruges, og pladerne igen skifter farve til orangerød. Typisk/ suspekt Salmonella reaktion er omslag fra orangerød til gul vækst. Hafnia alvii, som ofte volder problemer ved analyse af fersk kød, forgærer ikke sorbitol. Biokemisk karakterisering kan alternativt foretages med API 20E systemet eller andre identifikationssystemer. Hafnia alvii kan give falsk positiv reaktion (hyppigt som S. Choleraesuis). Hafnia alvii kolonier fremstår med takket vækst og let ujævn overflade og lugter lidt "hengemt" og adskiller sig derfor morfologisk fra Salmonella. S. Choleraesuis er sorbitol positiv, og adskiller sig hermed fra Hafnia alvii. I tvivlstilfælde indsendes kulturen til serotypning. Objektglasagglutination Såfremt kolonierne på grundlag af disse biokemiske undersøgelser stadig må anses for Salmonella-suspekte, kan der foretages agglutinationsprøve med polyvalent Salmonella-Oantiserum, men ikke med polyvalent Salmonella- H-antiserum. Såfremt agglutinationsprøven giver positiv reaktion, skal det sikres, at den pågældende stamme ikke er spontan agglutinabel ved afprøvning af reaktionen i fysiologisk kogsaltopløsning. Det bemærkes, at en negativ agglutinationsprøve kan forekomme for Salmonella som følge af, at antigengenkendelsen hos det polyvalente Salmonella-O-antiserum er begrænset til de almindeligst forekommende typer. Sortering må derfor ikke foregå ved agglutination alene. Serotypning Den isolerede bakteriestamme indsendes til serotypning ved Danmarks Fødevare- og Veterinærforskning, Afdeling for Mikrobiologisk Fødevaresikkerhed, Sektion for Zoonosediagnostik og Metodeudvikling, Bülowsvej 27, 1790 København V, med oplysning om oprindelse. Fødevarestyrelsens Metodesamling, Bilag 1, Version : 05, 15. marts 2005, Side 20 af 42