OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6.

OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6. Bachelorprojekt Udarbejdet af Sandra Reinholt Nielsen 14.08.1981 Projektperiode: 6. April 9.juni 2009 Vejledere: Søren Jensen, Lektor, Professionshøjskolen Metropol Mogens Fenger, Overlæge, Klinisk Biokemisk Afd. HH Helle Frederikson, Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afd. HH Pernille Munck, Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afd. HH

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resumé Projektets fokus ligger på optimeringen af en PCR-analyse til amplifikation af de 10 exons i genet CerS6 med udgangspunkt i en standardprotokol på KBA Forskningsafdeling, Hvidovre Hospital, som ikke er optimeret i forhold til amplifikation af de 10 exons i CerS6-genet. Optimeringen af PCRreaktionerne har til formål at sikre en succesfuld amplificering af de ønskede DNA-sekvenser, således at en ønsket mængde PCR-produkt opnås og derefter kan anvendes til sekventering. Sekventeringen skal anvendes til at detektere eventuelle kendte eller ukendte mutationer i ovenstående gen, CerS6. Til optimeringen af PCR-reaktionerne anvendes et kit fra Qiagen indeholdende de reagenser, som er nødvendige for at kunne udføre forsøget. På baggrund af en skiftevis ændring i koncentrationerne af prøvemateriale, Taq polymerase, MgCl 2 og en udskiftning af Taq polymerase med et nyt enzym, AmpliTaq Gold, blev optimeringen af PCR-reaktionerne foretaget. En succesfuld amplificering af de 10 exons i CerS6-genet blev opnået i 72 % af prøverne med de tilhørende 10 exons. Der kan ikke gives et entydigt svar på hvilke analysebetingelser der er de optimale for hver af de 10 exons i CerS6- genet. Forord Udførelsen af forsøgene i dette projekt er foregået på Klinisk Biokemisk Afdelings Forskningsafdeling, Hvidovre Hospital. Jeg retter hermed en tak til afdelingen for at have ladet dette projekt optage plads, arbejdstid og økonomi. Jeg har følt mig privilegeret over, at måtte optage plads på kontoret og i arbejdslommerne på afdelingen. Dette har været med til at skabe et godt fundament for at kunne arbejde intensivt med projektet. Den praktiske vejledning har været uundværlig under hele projektets tilblivelse. En stor tak til Forskningsbioanalytiker Bente Madsen for at bistå med råd og vejledning til det praktiske arbejde. En tak til vejlederne Pernille Munck, Helle Frederikson og Søren Jensen for teoretisk råd og vejledning til selve rapportens tilblivelse. En særlig tak til Overlæge Mogens Fenger for at udbyde dette projekt. Jeg håber at have bidraget med brugbare resultater, som fremover kan anvendes som basis for tilblivelsen af andre projekter. Dette projekt har for mig udvidet min horisont indenfor arbejdet med genetiske analyser, således at jeg har en stor viden om dette område med i bagagen fremover. Projektet er på 78.612 tegn ekskl. indholdsfortegnelse, litteraturliste og bilag. Hvidovre Hospital, juni 2009 Sandra Reinholt Nielsen 14.08.1981 1

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Indholdsfortegnelse Resumé... 1 Forord... 1 Introduktion... 6 Indledning... 6 Formål... 7 Mål... 8 Problemformulering... 8 Begrebsdefinitioner... 8 Etiske overvejelser... 8 Teori... 9 Deoxyribonukleinsyre (DNA)... 9 CerS6-genet... 9 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 10 Temperaturprofilen... 11 Plateaufasen... 12 Gelelektroforese... 13 Primer design... 13 Primer-dimer... 13 Hot star Taq-polymerasen og AmpliTaq Gold... 14 Forberedelse af DNA-template til sekventering... 14 Sekventering Sanger Princippet... 15 Metodevalg og afgrænsning... 15 Den anvendte metode... 15 2

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Nyt primersæt til exon 6... 16 Pilotforsøg... 16 Materialer og metode... 18 Materialer... 18 Prøvemateriale... 18 Sekundært prøvemateriale til optimering af annealingtemperaturen... 18 Kvalitetskontroller... 18 Reagenser, apparatur, primersæt og genet CerS6... 18 Metode... 19 Temperaturgradienterne opstilles... 20 Gelelektroforese udføres... 20 Vurdering af resultaterne af temperaturgradienterne... 20 PCR-reaktionerne udføres... 20 Gelelektroforese udføres... 21 Ved manglende produkt foretages en yderligere optimering... 21 Pilotforsøg... 21 Design af nyt primersæt 6... 21 Oprensning af PCR-produkter... 21 Sekventerings-PCR udføres... 21 Fældning af sekvens-pcr... 22 Sekventering... 22 Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt... 23 Gelelektroforese... 24 Procedurer for optimeringen af PCR-metoden, hvor annealingtemperaturen er fastlagt... 25 3

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Pilotforsøg... 26 Oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden... 27 Sekventerings-PCR... 28 Fældning af sekvens-pcr... 29 Resultater... 30 Resultater fra temperaturgradienterne... 30 De fundne annealingtemperatur i forhold til primernes udregnede Tm... 31 Resultater fra PCR-reaktionerne... 32 Suppleringsskema over resultater fra specifikke PCR-reaktioner... 33 Resultater fra pilotforsøget med exon 6 (gamle primersæt)... 34 Resultater fra pilotforsøgene med prøve 293 exon 2... 34 Antal succesfulde amplifikationer opnået... 35 Resultater fra tjek af oprensningen af PCR-produkter... 36 Resultater fra sekventeringen af PCR-produkterne... 37 Fejlkilder... 38 Diskussion... 39 Primerdesign... 41 Primer-dimer... 42 Optimering af PCR-reaktioner... 43 Reamplifikation af PCR-produkter... 46 Oprensning, fældning og sekventering... 46 Evaluering... 47 Konklusion... 48 Perspektivering... 49 4

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Bibliografi... 50 Bilagsoversigt... 52 5

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Introduktion Indledning I 1953 lykkedes det Francis Crick og James Watson at fremstille en nøjagtig model af DNA-molekylet. Man havde tidligere kunne lokalisere generne til kromosomerne, men havde ikke før kunnet forklare den kemiske struktur af DNA. Crick og Watson s model kunne også forklare, hvordan arvematerialet kan lave en identisk kopi af sig selv i forbindelse med celledeling. Da Crick og Watson byggede denne model af DNA-molekylet, var de en del af en gruppe forskere, der konkurrerede om at komme først med et korrekt bud på arvematerialets struktur. Denne fremstilling af modellen blev en milepæl indenfor genetikkens verden. (Egebo, 2004, s. 13 og 41) Mange sygdomme opstår ved en mutation i DNA og kategoriseres derfor genetiske sygdomme. Den primære årsag til hvilken som helst genetisk sygdom er en forandring i rækkefølgen af baser i DNA, som derved ændrer, hvorledes genet kommer til udtryk. Inden for det genetiske område er det samlede billede af de molekylære defekter, der associeres med sygdommen Diabetes Mellitus type 2 (DMT2), endnu ukendt. (McPhee, Lingappa, & Ganong, 2003, s. 514) Både genetiske, miljø- og livsrelaterede faktorer har betydning for udvikling af DMT2. Sygdommen er et stigende problem i den vestlige verden og er blevet en livsstilssygdom, hvor overvægt og manglende motion spiller en væsentlig rolle for udviklingen af sygdommen. (Sand, Sjaastad, & Haug, 2004, s. 241) DMT2 er karakteriseret ved nedsat glukosetolerance, hvilket medfører højt indhold af glukose i blodet. Den høje glukose skyldes hovedsageligt en nedsat følsomhed for insulin i muskelvæv, fedtvæv og i leveren (insulinresistens) hos disse patienter. Patienter med DMT2 har samtidigt en utilstrækkelig insulinproduktion fra β-cellerne i de Langerhanske øer i pancreas. Den dominerende fejlmekanisme hos DMT2-patienter er insulinresistensen. Enkelte genetiske defekter er forbundet med udtalt insulinresistens, men hos de fleste patienter med diagnosen DMT2 har man ikke kunnet påvise en defekt i et enkelt gen, som kunne være årsag til DMT2 eller insulinresistens. Tvillingundersøgelser har kunnet påvise, at genetiske faktorer er involveret i udviklingen af insulinresistens, dog har man ikke kunnet finde én genetisk defekt som årsag til insulinresistens. (Hilsted, Borch-Johnsen, & Christiansen, 2007, s. 69, 71, 73 og 74) På Forskningsafdelingen Klinisk biokemisk afdeling (KBA) på Hvidovre Hospital (HH) bliver der forsket i sammenhængen mellem SNP er i genet CerS6 og insulinresistens hos patienter med DMT2. Dette projekt kommer til at være en del af forskningen omkring det genetiske aspekt af sygdommen DMT2. I denne opgave vil forkortelsen SNP ikke nævnes, men i stedet refereres til denne forkortelse med ordet mutationer. Et essentielt redskab i sammenhæng med denne type forskning er Polymerase Chain Reaction (PCR), som anvendes til amplificering og opformering af DNA in vitro. Metoden blev opfundet af Kary Mullis og blev publiceret i 1985 af Saiki et al. og Mullis et al. PCR-metoden er yderst specifik og sensitiv, således at et bestemt stykke DNA, på trods af, at dette er til stede i meget ringe mængde, kan opformeres til flere milliarder eksemplarer på relativ kort tid. Selvom konceptet er simpelt, er PCR- 6

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 metoden en kompliceret proces med mange forskellige reaktanter. Mange genetiske variationer associeret med sygdomme foreligger bl.a. ved hjælp af PCR-teknikken, som herved har skabt revolution indenfor molekylærbiologien. (Xu & Larzul, 1991, s. 1) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 137) (McPherson & Møller, 2006, s. 1) I dette projekt anvendes PCR-metoden som forarbejde til sekventering af et specifikt gen, hvor eventuelle mutationer kan detekteres. Mutationer er en permanent ændring af basesammensætningen i et gen og kan bestå af en ændring i et enkelt basepar. Gener koder for proteiner. Fordi strukturen og aktiviteten af hvert enkelt protein er afhængig af en aminosyresekvens, kan en mutation bevirke at proteinet ikke fungerer efter hensigten, eller slet ikke fungerer. Netop derfor er det vigtig, at detektere og identificere disse mutationer. (Alberts, et al., 2004, s. 209) For at kunne sekventere DNA kræves en vis mængde PCR-produkt. Her er det netop, at PCR-metoden skal fungere optimalt, således at den ønskede mængde produkt opnås. PCR-metoden skal kunne frembringe brugbare resultater i overensstemmelse med de kvalitetskrav og kontrolforanstaltninger, der fastsættes for metoden. PCR-reaktionerne til opformering af exons i CerS6-genet er, fra afdelingens side, ikke optimeret og dette danner grundlag for tilblivelsen af dette projekt. Formål Patienterne, hvorfra prøvematerialet stammer fra, har fået stillet diagnosen DMT2. En sygdom, som ikke endnu kan helbredes, men kun symptombehandles. Derfor vil et fund af eventuelle sygdomsfremkaldende mutationer bidrage til det samlede billede af den genetiske årsag til DMT2. Da projektet er en del af forskningen der foregår på Forskningsafdelingen KBA HH, er afdelingen interesseret i, at jeg når frem til nogle sekventeringsresultater, som videre kan bidrage med viden om årsagen til insulinresistens hos patienter med DMT2. Altså er afdelingen interesseret i at få fundet de eventuelle mutationer, der end måtte være hos disse udvalgte patienter. Min opgave er som sådan ikke direkte at finde disse eventuelle mutationer, men derimod at gøre forarbejdet til sekventeringen vha. en PCR-metode, som skal optimeres i forhold til de anvendte primere. Jeg finder eventuelt mutationer i genet CerS6 hos nogle af disse udvalgte patienter. Disse eller denne mutationer/mutation kan måske kædes sammen med årsagen til insulinresistens. Projektet danner grundlag for udvikling af en PCR-protokol, som fremover kan anvendes i forbindelse med opformering af specifikke DNA-sekvenser i CerS6-genet, således at den ønskede mængde PCRprodukt opnås, med henblik på sekventering af lige netop de 10 exons i ovenstående gen. Dette bachelorprojekt er med til at danne grundlag for videre forskning indenfor arveligheden af DMT2, som værende en lille brik i et kæmpe puslespil. 7

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Mål Mit mål er at få optimeret en PCR-metode, som er en del af forarbejdet, analysemæssigt, til selve sekventeringen af de 10 exons i genet CerS6, således at det er muligt derefter at detektere eventuelle kendte eller ukendte mutationer i de 10 exons i genet CerS6 på alle de udvalgte prøver. Protokollen for PCR-metoden til amplificering af de 10 exons i genet CerS6 er på KBA Forskningsafdelingen, HH ikke optimeret i forhold til den optimale annealingtemperatur og derfor er afdelingen interesseret i, at denne analyse optimeres. Ved de PCR-reaktioner, som ikke giver et acceptabelt udbytte, er det samtidig et mål at kunne vha. optimering af flere parametre i reaktionen, opnå det ønskede udbytte i den rette mængde. Problemformulering Hvilke analysebetingelser er de optimale for hvert af de 10 exons i CerS6-genet under amplificering af DNA ved PCR-reaktioner, med henblik på sekventering af de 10 exons i CerS6-genet? Er det med denne PCR-amplifikation muligt at sekventere de amplificerede DNA-sekvenser og derved detektere kendte og/eller ukendte SNP'er i CerS6-genets 10 exons hos DMT2 patienter? Begrebsdefinitioner Optimale analysebetingelser defineres som de faktorer, der ændrer på PCR-reaktionen således, at produktet ses som et tydeligt bånd ved udførelse af gelelektroforese. SNP er en forkortelse for Single Nucleotid Polymorphism og betyder en genetisk variation i en DNAsekvens, som opstår når en enkelt nukleotid i et genom ændres. Etiske overvejelser Prøvemateriale anvendt i projektet er eksisterende prøvemateriale fra Endobank fra patienter på Endokrinologisk afdeling, HH, som alle er diagnosticeret med DMT2. Der er indhentet skriftligt informeret samtykke ved alle prøvetagninger. KBA Forskningsafdeling, HH har fået samtykke til at anvende materialet i forbindelse med forskning på afdelingen. I forbindelse med projektet kommer jeg ikke til at have adgang til patienternes identitet. Ved modtagelse af prøvematerialet er patienternes identitet anonymiseret, hvor prøverne er nummeret med tilfældige tal. Det kan forekomme, at der detekteres mutationer, som ikke før var kendte hos patienterne. Hvis og såfremt der findes nye mutationer, lader jeg, i samråd med Overlæge Mogens Fenger, informationerne tilgå den kliniske afdeling, hvorefter der i samarbejde tages stilling til videre 8

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 behandling af disse informationer. KBA Forskningsafdelingen, HH har adgang til den database, hvor patientens identitet kan findes. Jeg har ikke adgang til denne database. Al prøvemateriale, der er anvendes til projektet, forbliver i Danmark og destrueres efter afslutning af projektet. Prøvematerialet er indsamlet inden forsøgets start ved venepunktur. Det indsamlede prøvemateriale, som allerede blev indsamlet af andre personer inden forsøgets start, indeholder det DNA, som anvendes til dette forsøg. DNA er allerede oprenset fra veneblodprøven, når jeg begynder udførelsen det praktiske arbejde. Teori Deoxyribonukleinsyre (DNA) Figur 1. (http://img.blogcu.com/uploads/kedicikkopekcik_dna2.jpg) DNA er opbygget af to komplementære strenge foldet i en dobbelthelix. Strengene består af en lang række nukleotider, som hver er opbygget af et sukkerstof, deoxyribose med fem kulstofatomer, en fosfatgruppe og en nitrogenholdig base. Strengene er bundet til hinanden via hydrogenbindinger mellem baserne. Baserne Adenin og Thymin i de to strenge sidder over for hinanden, holdt sammen af to hydrogenbindinger. Guanin og Cytosin er holdt sammen af tre hydrogenbindinger og sidder derved overfor hinanden. (Alberts, et al., 2004, s. 175) De to DNA-strenge er antiparallelle; dvs. strengene er modsat orienterede, da den ene streng har sin 5 -ende over for den andens 3 -ende. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 29) Syntesen af DNAstrengene foregår således i retning fra 5 -enden til 3 -enden. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 138) DNA-molekylet indeholder områder, som koder for aminosyrer og disse områder hedder exons. De ikke-kodende sekvenser af DNA kaldes introns og er 10 gange længere end exons i det humane genom. (Carlon, Malki, & Blossey, 2005, s. 1) I det humane genom er der 3 x 10 5 kopier DNA i 1 µg oprenset DNA. (McPherson & Møller, 2006, s. 16) CerS6-genet Genet CerS6, ceramid synthase 6 er en LAG1 homolog og befinder sig på kromosom 2, lokation 2q24.3. og mistænkes for at have indflydelse på insulinresistensen hos patienter med DMT2. 9

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR-metoden anvendes til in vitro opformering af en specifik DNA-sekvens. Denne sekvens kaldes mål-dna eller mål-sekvensen og er defineret inden metodens udførelse. Sagt med andre ord; man skal vide, hvad man leder efter. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 137) Ved syntetisering af DNA fungerer DNA-strengene som template-strenge, altså en skabelon for den ny-syntetiserede streng. Kittet fra Qiagen indeholder reagenserne som anvendes til PCR-reaktionerne. Ved udførelse af PCR-reaktioner skal der være nogle helt bestemte reagenser til stede i en bestemt mængde. Disse parametre udgør det såkaldte Master Mix; - dntp er den samlede betegnelse for deoxyribonukleotider (frie nukleotider); dgtp, ddtp, datp og dttp, som anvendes til byggesten i syntetiseringen af DNA. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 29-30) - Primerne, som er korte stykker DNA, er designet til at sætte sig et bestemt sted på det stykke DNA, der skal opformeres. Primersættet består af en forward og en reverse primer, som begge sætter sig på mål-sekvensen med 3 -enden i den retning, hvor de frie nukleotider skal påsættes. - Bufferen er til stede for at holde ph konstant. - MgCl 2 danner kompleks med dntp, som interagerer med sukker-phosfat ryggen og har indflydelse på aktiviteten af Taq polymerasen. (McPherson & Møller, 2006, s. 66) - Taq-polymerasen er et enzym, der syntetiserer DNA. Enzymet anvender de frie nukleotider til at bygge videre på primeren med udgangspunkt i den overfor liggende template streng. (Theophilus & Rapley, 2002, s. 38) - Q-solution - Destilleret H 2 O Reaktionen foregår over 3 trin, som hver har en helt bestemt temperatur og dermed et helt bestemt formål. Se eventuelt afsnittet Temperaturprofilen side 11. 1. Denatureringen af DNA 2. Annealingen af primeren til DNA-template 3. DNA-syntesen (Theophilus & Rapley, 2002, s. 37) 10

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Figur 2. (Alberts, et al., 2004, s. 349) Figuren viser hvordan et dobbeltstrenget stykke DNA bliver til mange DNA-strenge under opformering vha. PCR-metoden. Det dobbeltstrengede DNA bliver til to enkeltstrenge ved opvarmning til ca. 95 C (denaturering). Herefter binder primerne til det specifikke stykke DNA, der ønskes opformeret, vha. nedkøling til 50-60 C (annealing). De frie nukleotider, henholdsvis dgtp, ddtp, datp og dttp, bygges på 3 -enden af den bundne primer således, at der dannes en komplementær-streng til template-strengen (extension). (Egebo, 2004, s. 100) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 138) Temperaturprofilen Et trin kommer førend de tre cykler i PCR-reaktionen. Enzymet Taq-polymerasen skal aktiveres. Dette trin kaldes Præ-PCR aktiverings trinnet og foretages således, at der varmes op til ca. 95 C i ca. 12-15 min. Dette trin skal samtidig sikre at DNA-strengene er helt adskilte. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 81) (McPherson & Møller, 2006, s. 11) Denatureringen af DNA et sker ved opvarmning til ca. 95 C i 30-60 sek. Her går de to strenge fra hinanden og tillader derved, at der er plads til, at primerne kan hybridisere til template-strengene. Hydrogenbindingerne mellem baserne i DNA et bliver brudt og der dannes to enkeltstrenge. Annealingen af primeren til template-dna-stykket sker ved 50-60 C. Annealingtemperaturens øvre grænse er bestemt af primer/template-duplexets smeltepunkt, Tm. Tm defineres som den temperatur, hvor hydrogenbindingerne i halvdelen af duplexmolekylerne er brudt, altså at halvdelen af primer/template-molekylerne er gået fra hinanden. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 85 og 138) Høj annealingtemperatur medfører en specifik amplifikation, men kan resultere i få reaktioner. Dette kan bevirke at hele amplifikationen af et stykke DNA ikke bliver tydelig nok når PCR-produktet visualiseres på en gel vha. gelelektroforese. Lav annealingtemperatur medfører risiko for uspecifik annealing. Kan resultere i en masse reaktioner, hvor mange af disse er underlagt fejlpriming. Her er risikoen høj for en stigning i antallet af uspecifikke reaktioner. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) 11

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 I praksis må annealingtemperaturen fastlægges empirisk (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144), dog med en guideline, Tm, som regnes ud således; Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C) Denne formel tager dog ikke højde for en række faktorer, der spiller ind, når annealingtemperaturen skal fastlægges. Og netop derfor anvendes denne simple udregning ofte kun som guideline. Udregningen af Tm er også afhængig af koncentrationen af DNA-strenge, saltkoncentrationen og basesekvens. Forskellen på den empirisk fundne annealingtemperatur og den udregnede kan være over 15 C. (Yuryev, 2007, s. 16) Extension af DNA foregår typisk ved 72 C. Taq-polymerasen bygger videre på den bundne primersekvens med nukleotider, således at mål-dna et bliver kopieret. Varigheden af dette trin kan variere fra 20 til 60 sek. al afhængig af størrelsen af PCR-produkt og hvilken thermocykler, der er anvendt. Længere PCR-produkter kræver længere extensionstid. (Alberts, et al., 2004, s. 349) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144) (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) Den endelige extensionstid kommer efterfølgende. Denne gennemføres ved 72 C i 7-10 min. Antallet af cykler er afhængig af mængden af DNA fra starten og længden af Præ-PCR aktiverings trinnet. Anvendes 12-15 min. ved 95 C i præ-pcr aktiverings trinnet, vil 32-34 cykler være tilstrækkeligt for at få PCR-produkt i den ønskede mængde. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) Plateaufasen Figur 3. (McPherson & Møller, 2006, s. 15) De tidlige cykler (E), De midterste cykler (M) og Plateaufasen (L) ses på figuren. Den eksponentielle opformering af mål-dna foregår i løbet af De midterste cykler og det er netop her, PCR-reaktionen bør stoppes. Fortsætter PCR-reaktionen ind i plateaufasen pga., at enzymet er optaget af at syntetisere og derved er i underskud, kan der opstå amplifikation af uønskede produkter, som er opstået ved en smule mispriming i de tidlige cykler i reaktionen. Dette forekommer dog oftest ved en reamplifikation af PCR-produkter. (McPherson & Møller, 2006, s. 17) (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 5-6) 12

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gelelektroforese Separation af DNA-sekvenser vha. elektroforese er baseret på molekylernes længde og rummelige struktur under indflydelse af elektrisk potentiale. DNA består af nukleotider, der alle indeholder en fosfatgruppe, som i vandige opløsninger med ph over 3 er negativt ladede. De negativt ladede molekyler vandrer i gelen mod den positive pol. Den støbte gel er bygget op af et tredimensionelt netværk, som fungerer som et filter for DNA-molekylerne. Porerne i gelen tillader de mindste molekyler at vandre længst, hvorimod de større molekyler vil opleve mere modstand i gelen. Størrelsen af molekylerne i denne sammenhæng besluttes ud fra, hvor lange DNA-sekvenser der er tale om, altså hvor lange kæderne af nukleotider er. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 61) Primer design Primere skal designes efter, hvilket stykke DNA der skal opformeres. For at opnå optimalt fungerende primere, tages udgangspunkt i følgende; - Primernes længde bør være mellem 15-25 nukleotider. - G/C-indholdet bør ikke være mindre end i det stykke DNA, der skal opformeres. Menneskers G/C-indhold er omkring 40 %. - Man bør undgå mange på hinanden efterfølgende A/T eller C/G nukleotider, da den optimale annealingtemperatur herved vil være forskelligt gældende fra den ene ende af primeren til den anden. Endvidere kan en 3 -ende med mange C/G nukleotider binde uafhængigt om 5 - enden binder. Dette kan føre til fejlpriming. - Man bør ligeså undgå komplementaritet mellem primerne, specielt 3 -enden, da dette kan føre til primer-dimer. Dette gør at primerne optager hinanden i stedet for at sætte sig på DNA et. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146) Primer-dimer Disse nærmest udviskede bånd vil fremstå i bunden af gelen som nogle lyse pletter, hvis der er tale om primer-dimer. Disse molekyler løber meget længere på gelen end mål-sekvenserne, da primerne kun er ca. 20 basepar lange og ikke fylder lige så meget som de større molekyler. Primer-dimer kan enten forekomme ved, at de to primere sætter sig sammen eller ved, at en primer annealer til sig selv ved komplementaritet mellem basesekvenserne. (McPherson & Møller, 2006, s. 27) 13

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Figur 4. (http://www.uq.edu.au/vdu/pdu_pcrprimers.htm) På figuren fremgår det, hvordan to forskellige primere i stor mængde annealer til hinanden. Ved extensions-trinnet i PCR-reaktionen syntetiseres to lige lange sekvenser. Derved opformeres primer-dimer-artefakterne i stedet for den ønskede nukleotid-sekvens. Hot star Taq-polymerasen og AmpliTaq Gold Hot star Taq-polymerase og AmpliTaq Gold er enzymer, som anvendes i forbindelse med syntesen af DNA ved anvendelse af PCR-metoden. Disse enzymer er varmestabile, hvilket bevirker, at der ikke skal tilsættes nyt enzym efter hver cyklus i PCR-reaktionen. Men ved høje temperaturer bliver enzymet langsomt inaktivt. Halveringstiden for inaktiveringen af Taq polymerasen er 5 min. ved 97,5 C, 40 min. ved 95 C og 130 min. ved 92,5 C. Enzymkoncentrationen kan varieres fra 5 til 50 U/mL. For meget enzym reducerer specificiteten og for lidt enzym gør udbyttet af reaktionen mindre. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 143 og 148) Forberedelse af DNA-template til sekventering - Oprensning af PCR-produkt - Sekventerings-PCR - Fældning Med henblik på sekventering af PCR-produkterne, skal template-strengene oprenses. Det vigtigste er fjernelse af primere og eventuelle primer-dimer-artefakter. Der skal bruges rene DNA-templates ved sekventering. Oprensningen sker vha. søjlemetoden, hvor DNA tilbageholdes i filteret pga. sin størrelse. Da der skal bruges mange rene template-kopier til sekventering, er en opformering af de oprensede PCR-templates nødvendig at foretage. Denne opformering kan udføres vha. en yderligere PCRmetode, hvor der anvendes specifikke primere, som ikke blandes sammen. Altså opsættes PCR-rør med en forward primer og pcr-rør med en reverse primer igen, dog adskilt. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 145 og 162) Princippet i fældning er at ethanol fjerner de polære vandmolekyler der ligger rundt om DNA. Positive Na + vil derefter kunne binde til ladede phosfatgrupper på polynukleotidet og derved fælder DNA ud. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 48) 14

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Sekventering Sanger Princippet Figur 5. (http://www.humgen.au.dk/medicinskgenetik/materiale/metoder.pdf) Sanger-sekventering kaldes også dideoxy-metoden og har til formål at bestemme sekvensen af DNA-fragmenter. DNA-syntesen foregår i rør inde i et apparat, hvori der foruden nukleotider, er tilsat en meget lille mængde af henholdsvis ddgtp, dddtp, ddatp og ddttp (dideoxynukleotider). Når disse 4 dideoxynukleotider tilfældigt sættes på den ny-syntetiserede DNA-streng, stopper reaktionen. Polymerasen er ikke i stand til at sætte yderligere nukleotider på dideoxynukleotider. Dette resulterer i mange DNA-strenge af forskellige længder. De 4 dideoxynukleotider er mærket med hver sit fluorescerende molekyle, som udsender hver sin farve, når de aktiveres. Inde i apparatet bliver produkterne kørt på en gel. De fluorescerende molekyler vil blive aktiveret vha. en laserstråle, når de passerer i gelen. Farverne, der udsendes, vil blive fanget af en detektor, der sender oplysningerne videre til en computer, som er programmeret til at omdanne farverne til baser. (Sørensen, Falkenberg, Gasbjerg, & Jensen, 2002, s. 217) Metodevalg og afgrænsning Prøvematerialet anvendt til dette forsøg stammer fra en biobank på Endokrinologisk Afdeling, Hvidovre Hospital (HH), hvor prøvemateriale fra en lang række patienter med diagnosen DMT2 er oplagret. Kriteriet var at patienterne skulle have en glukoseværdi på over 11 mmol/l i blodet. Hvis værdien på de ikke-fastende patienters prøver gentagne gange ligger over 11 mmol/l, regnes diagnosen derved som sikker. (Lyngbye, 2001, s. 193) Den anvendte metode PCR-metoden anvendes til, at kunne svare på problemformuleringen i dette projekt. Jeg har valgt, at udføre PCR-reaktioner efter en standard PCR-metode med anvendelse af Taq polymerase, som er 15

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 varmestabil og derfor ligger til grund for automatiseringen af metoden. Udgangspunktet for udførelsen af PCR-metoden er standardprotokollen på KBA Forskningsafdelingen, HH, som mangler optimering af flere parametre, hvis og såfremt der ikke viser sig at være produkt på gelen ved gelelektroforesen. Argumenterne for ændring af parametre, som har indflydelse på PCR-reaktionen, er diskuteret i afsnittet Diskussion på side 43. En optimering af de PCR-reaktioner, der ikke i første omgang gav et acceptabelt resultat er udført efter, hvad der fremgår af litteraturen og efter hvilke råd og vejledning, som KBA Forskningsafdelingen, HH har bistået med. Nyt primersæt til exon 6 Kriterierne for valg af nyt primersæt til exon 6 indtastes i programmet Primer3, som findes på webadressen: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi - Længden skal være mellem 18-22 med en optimal længde på 20. - C/G-indholdet i primerne skal være 40-50 % med et optimalt indhold på 50 %. Herefter finder programmet et sæt primere, der opfylder de valgte krav. Med egne øjne kigges på om der er komplementaritet mellem eller i de to primere således, at de to primere kan binde til hinanden eller sig selv. Komplementaritet bør undgås, da dette resulterer i en masse primer-dimerartefakter, der kan forstyrre opformeringen af det ønskede produkt. Ligeledes kigges på, hvor de to primere er placeret i forhold til mål-sekvensen. I dette tilfælde blev de placeret således, at de indkredser et område på ca. 250-800 bp. Dette skyldes at mål-sekvenserne for de andre exons i længde er indenfor disse grænser. Hvis der vælges længere mål-sekvenser, er det nødvendigt at optimere ud fra, at der arbejdes med amplificering af længere mål-sekvenser. Eksempelvis bør extensions-tiden sættes op i PCR-reaktionen. En anden observation der er nødvendig ved primerdesign er om Tm for hhv. primer forward og reverse ligger tæt på hinanden. Hvis ikke Tm er nogenlunde ens for de to primere, skal der anvendes to forskellige annealingtemperaturer. Dette er ikke hensigtsmæssigt, da arbejdet med PCR-reaktionerne derved kompliceres. Pilotforsøg Det første pilotforsøg der blev udført, omhandler det gamle primersæt til exon 6 og den manglende amplificering af dette exon. For at være sikker på at dette exon ikke var muligt at amplificere, udførte jeg en slags dobbeltbestemmelse for at se, om det alligevel kunne være muligt, at opnå en amplificering. Samtidig med at dette pilotforsøg udgør en dobbeltbestemmelse, var hensigten med forsøget også at kontrollere om der skulle være en af de to thermocyklere der ikke virkede. Derfor blev forsøget udført på 2 forskellige thermocyklere. De andre pilotforsøg, der blev udført, omhandler Exon 2 i prøve 293 og den manglende amplificering af denne prøve. Disse pilotforsøg blev udført på baggrund af råd og vejledning fra KBA Forskningsafdelingen, HH og ud fra hvad litteraturen siger om ændring af MgCl 2. I litteraturen fremgår det, at MgCl 2 er en vigtig parameter at optimere. Anvendelse af et andet enzym, AmpliTaq 16

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gold til amplificering af denne prøve er udført ud fra, hvad KBA Forskningsafdelingen, HH rådede mig til at prøve efter den manglende amplificering af denne prøve, det pågældende exon. Optimering af PCR er en udviklingsproces. Mange steder i litteraturen beskrives der, at rækkefølgen og parametre der optimeres er op til den enkelte. Jeg har valgt at optimere parametre, der indenfor projektets naturlige tidsbegrænsning, samt den begrænsede mængde prøvemateriale, er mulige at optimere. Dette ligger til grund for, at ikke flere parametre er optimeret i dette projekt. 17

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Materialer og metode Retningslinjerne for arbejdet med PCR følges; God Laboratorie Praksis. Laboratoriet er opdelt således, at der arbejdes hhv. i et rent og et urent rum. Intet apparatur eller reagens må tages fra det urene til det rene rum. Handsker anvendes i alle rum, dog udskiftes disse ved udgang af et rum. Stativer mv., som efter brug skal tilbage til det rene rum, lægges i en spand 0,1 M HCl natten over og derefter til vask. Opsætning af PCR til dette forsøg foregår i flowbænken anført DNA og pipetter, hvorpå der er anført DNA, anvendes. Papirarbejde skal så vidt muligt foregå på kontorerne og ikke inde i laboratoriet. (Olsen, Ambye, Madsen, & Jäger, 2004, s. 6) Materialer Prøvemateriale Der er udvalgt 15 EDTA-stabiliseret fuldblodsprøver fra DMT2-patienter tilknyttet Endokrinologisk afdeling, Hvidovre Hospital (HH). Blodprøverne stammer fra Endobank, som er en biobank med blodprøver fra DMT2-patienter. Prøverne stammer fra anonymiserede patienter. Der er ikke adgang til informationer angående patienterne. Sekundært prøvemateriale til optimering af annealingtemperaturen Prøverne er ligeledes fra biobanken på Endokrinologisk afd., HH og indgår som sekundært prøvemateriale. Disse sekundære prøver anvendes til udførelse af temperaturgradienter ved optimeringen af annealingtemperaturen, samt ved afprøvning af større mængde DNA ved PCRreaktionerne, når disse reaktioner ikke forekommer. Disse prøver er blevet opbevaret på samme vis som det primære prøvemateriale og har ligeledes gennemgået samme behandling mht. oprensningen af DNA et fra fuldblod. Kvalitetskontroller Som intern kontrol på analyseserien, hver gang en PCR opsættes, anvendes et ekstra PCR-rør indeholdende H 2 O i stedet for prøvemateriale. Denne vandprøve medtages som kontrol på kontaminering af reagenserne. Hvis der er produkt i sporet for vandprøven ved udførelse af gelelektroforese, forkastes serien. Der er ingen ekstern kontrol på thermocyklerne, dog udføres service en gang årligt. Sekventeringsapparatet Genetic analyzer - ABI PRISM, 3130x indgår i to eksterne kvalitetsprogrammer; DEKS (Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring) og EMQN (European Molecular Genetics Network). (Olsen, Ambye, Madsen, & Jäger, 2004, s. 5) Reagenser, apparatur, primersæt og genet CerS6 Anvendte reagenser og apparaturer fremgår af Bilag 3. En oversigt over primerne fremgår af Bilag 5. En oversigt over hvor primerne er placeret i forhold til de 10 exons fremgår af bilag 6. 18

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra a Reinholt Nielsen 2009 Metode Figur 6. Denne figur er en oversigt over metoden i projektet. Temperaturgradienter opstilles Gelelektroforese udføres Vurdering af resultaterne af gradienterne PCR-reaktionerne udføres Gelelektroforese udføres Oprensning af PCRprodukter Ved manglende PCRprodukt, foretages en yderligere optimering Sekventerings-PCR udføres Fældning af sekvens-pcr 3 pilotforsøg udført Sekventering Tjek af oprensningen af PCRprodukter Design af nyt primersæt 6 19

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Temperaturgradienterne opstilles Den optimale annealingtemperatur for de anvendte primersæt, som er tilknyttet de 10 exons i CerS6- genet, står som første led i optimeringsproceduren. Opstil 7-8 forskellige PCR-rør med samme indhold i hver rør, altså Mastermix + prøve. Der anvendes her det sekundære prøvemateriale. Prøvenumre fremgår af Bilag 4. Indstil derefter Thermocykleren således, at temperaturen varierer med ca. 1-2 C fra PCR-rør til PCR-rør. Efter råd og vejledning fra KBA Forskningsafdelingen, HH, sættes temperaturen for de 10 temperaturgradienter til 60 ± 5 C. Gennemsnit af Tm for hver af de 10 primersæt anvendes kun som en guideline for, i hvilket område temperaturgradienten skal opstilles, dog ikke som endegyldigt facit på den optimale annealingtemperatur. Hvis og såfremt det ikke er muligt at finde en fælles annealingtemperatur, skal der stræbes efter at benytte så få forskellige annealingtemperaturer som muligt, da det er en ideel analysebetingelse at kunne udføre alle exons ved samme annealingtemperatur. Optimeringen udføres ud fra, at definitionen på den optimale annealingtemperatur bestemmes ved, at et tydeligt bånd fremgår af gelen efter udførelse af gelelektroforese og at der i nabosporet ikke må forekomme et spor uden PCR-produkt. Gelelektroforese udføres Efter opstilling af temperaturgradienter for primerne tilhørende de 10 exons, udføres en gelelektroforese for at kunne vurdere resultaterne. Elektroforesen udføres på en agarosegel, som fremstilles i laboratoriet fra bunden. Procedure for fremstilling af gelen, udførelse af en gelelektroforese og betjening af Image VDS Camera, se Protokol 2. Vurdering af resultaterne af temperaturgradienterne På billedet af gelen, hvorpå prøvematerialet fremgår som bånd, aflæses, hvor langt DNA er vandret. Dette gøres ved at sammenligne det fremkomne bånd med markøren, som udformer sig som en trappestige. Den opformerede mål-sekvens har et bestemt antal basepar, som er klarlagt, idet primerne er designet. Derved sammenholdes det kendte antal basepar med det aflæste. Dette gøres for at sikre, at det rigtige produkt er amplificeret. Den optimale annealingtemperatur vælges ud fra, hvilket bånd på gelen, der er mest klart og tydeligt afgrænset. Et kriterium for om et bånd vurderes til at repræsentere den optimale annealingtemperatur er, at der ikke må være tomt i sporet ved siden af det pågældende bånd. PCR-reaktionerne udføres PCR-reaktionerne udføres efter Protokol 1. Den tidligere fundne optimale annealingtemperatur anvendes, dvs. thermocykleren indstilles derefter. Der medtages en vand-prøve efter hver serie, indeholdende Master Mix + samme mængde H 2 O som der er prøvemateriale i foregående PCR-rør. 20

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gelelektroforese udføres Produkterne fremgår af gelen, hvis og såfremt mål-sekvensen er blevet amplificeret i thermocykleren. Hvis et bånd viser sig ud fra det elektroforesespor tilhørende den brønd, hvori prøven er tilsat, kan oprensning af PCR-produkt udføres. Ved manglende produkt foretages en yderligere optimering Hvis ikke der fremkommer en visualisering af produkt på gelen efter PCR-reaktionen, følges optimeringstrinnene beskrevet i Protokol 3. Pilotforsøg Exon 6 (med gamle primersæt)blev ikke opformeret ved anvendelse af de udleverede primere til amplificering dette exon. Derfor blev et ekstra forsøg udført for at vurdere, om primerne virkede til opformering af det pågældende exon. Forsøget blev udført i henhold til Protokol 1 og Protokol 4. Se evt. Tabel 5 side 34. Prøven 293 exon 2 undergik 2 pilotforsøg, hvortil udførelsen er i henhold til Protokol 1 og Protokol 4. Se evt. Tabel 6 side 34. Design af nyt primersæt 6 Da exon 6 stadig ikke blev amplificeret, blev et nyt primersæt designet. Til design af nyt primersæt 6 anvendtes et computerprogram, Primer3, på webadressen: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi Oprensning af PCR-produkter Oprensningen udføres vha. et kit tilhørende laboratoriet; GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit. Dette trin udføres i henhold til Protokol 5. Sekventerings-PCR udføres Ud fra gelen, hvor PCR er udført tidligere, vurderes, hvor stor en mængde oprenset prøvemateriale, der skal tilsættes til rørene for netop at få opformeret en passende mængde DNA ved sekventerings- PCR. Hvis båndene på gelen er forholdsvis svage, tilsættes en smule mere prøvemateriale, end hvis båndene på gelen fra tidligere er meget tydelige. Er der derimod meget tykke bånd på gelen fra tidligere, tilpasses mængden af det oprensede prøvemateriale derudfra, således at der tilsættes en smule mindre oprenset prøvemateriale til rørene. Denne PCR udføres efter oprensningen, men vær opmærksom på, at cyklerne er anderledes designet end ved den almindelige PCR. Se Protokol 6. 21

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Fældning af sekvens-pcr Fældning af sekvens-pcr udføres efter Protokol 7. Sekventering Sekventeringen foregår i et sekventeringsapparat og har en varighed af ca. 2-3 timer, alt afhængig af, hvor mange prøver der sekventeres samtidig. Efter sekventering vurderes sekventeringen i programmet SeqScape, hvor de kortlagte sekvenser sammenholdes med kontrolsekvenser, som indeholder allerede kendte DNA varianter. 22

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 1. Hver gang der henvises til standardprotokollen fra KBA Forskningsafdelingen, HH, er det denne protokol der henvises til. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til amplificering af de 10 exons i genet CerS6. Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt Der fremstilles en Mastermix-opløsning til n+1 prøve. Mastermixet indeholder alle reagenser undtagen DNA. Primerne skal fortyndes inden brug. Fabrikanten leverer primerne med en fast koncentration på 100 µm. Derfor fortyndes primerne 1:10 med H 2 O inden brug. Fremstilling af mastermix: Stock-koncentration Koncentration i 25 µl PCR µl mix pr prøve dntp 5 mm 0,2 mm 1,0 µl Primer 10 µm 0,5 µm 1,25 µl Primer 10 µm 0,5 µm 1,25 µl Taq 5 U/µl 0,5 U 0,1 µl 10x buffer 15 mm MgCl 2 1xbuffer + 1,5mM MgCl 2 2,5 µl MgCl 2 25 mm 1,5 mm 1,5 µl 5xQ Solution x1 5 µl H 2 O 11,4 µl DNA 50 ng/µl 3 µl I 0,2 μl eppendorfrør afpipetteres 25 µl mastermix + 3 µl DNA arbejdsopløsning 50 ng/µl. Rørene lukkes og anbringes i thermocykler til opformering. Thermocykleren indstilles til den, for PCR-produktet, bestemte optimale annealingtemperatur, tid (denaturering, annealing, extension) og antal cykler. Temperatur Tid Start, præ-denaturering 95 C 10 min. Denaturering 95 C 30 sek. Annealing bestemmes 30 sek. x35 Extension 72 C 70 sek. Slut, endelig extension 72 C 10 min. Hold 10 C forever 23

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 2. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH for udførelse af Agarose gelelektroforese. Gelelektroforese Gelkar Gel 1xTBE buffer Agarose Low melt agarose GelStar 10 x 20 cm 2 % 100 ml 1,0 g 1,0 g 15 µl Afvej henholdsvis 1,0 g Seakem agarose og 1,0 g low melt agarose i en 250/300 ml kolbe. Tilsæt 100 ml 1xTBE buffer som anført i tabellen og ryst kolben jævnt (undgå klumper). Kolben sættes i mikroovnen 2 min. og 15 sek., tænd ovnen på 650 W (indtil gelen koger). Når gelen koger, tages kolben ud og omrystes. Kolben med gel afkøles under rindende koldt vand eller stilles på bordet, til opløsningen når en temperatur der er ca. 50-60 C. Tilsæt fortyndet GelStar (fortyndet 1:10 med TBE-buffer) og omryst forsigtigt (undgå for mange luftbobler). Hæld gelen jævnt ud i en støbeform og sæt kammen i. Det er vigtigt, at gelen ikke er for varm, da kammen derved vil røre bunden af støbeformen og skabe hul helt igennem gelen. Gelen skal størkne i 15-30 min. Fjern forsigtigt kammen og check, at brøndene er dybe og intakte. Støbeformen med gelen placeres i et bufferkar med 1xTBE buffer, som skal dække brøndene. (Skal den færdige gel ikke bruges med det samme, kan den opbevares i fugtighedskasse i køleskab). Der loades 5 µl PCR-prøve, samt vand-prøve + 5 µl GLM loadingbuffer pr. brønd. 5 µl molekylevægtsmarkør (fortyndet) loades i første og sidste brønd. Tilslut strømmen (check at strømmen vender rigtigt!). 135 V. Løbetiden er ca. 30 min. Gelen fjernes forsigtigt fra gelbakken og lægges over i bakken på Image Cameraet. Med indstilling 1 fås visuelt billede af de enkelte bånd. Hvis der er behov for at lade DNA vandre længere, kan gelen placeres i støbeformen igen og elektroforesen kan fortsættes i karret som før. Ved bortskaffelse af den aflæste gel anvendes den gule spand mærket "Gelstar Affaldsgruppe 2.22 B". Der tages billede af den færdige gel med Image VDS Camera. 24

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 3. Protokollen er udarbejdet ud fra hvilke parametre, der ændres på, ved manglende produkt på gelen efter forsøg på amplificering af de 10 exons. Procedurer for optimeringen af PCR-metoden, hvor annealingtemperaturen er fastlagt Optimeringen foregår ved forskellige ændringer af reagenser. Opstillingen af PCR-reaktionerne er udført i henhold til Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt fra Protokol 1 side 23. a. PCR med 3µL DNA b. PCR med 4µL DNA c. PCR med 6µL DNA d. PCR med 1µL DNA + dobbelt Taq-polymerase e. PCR med 3µL DNA + dobbelt Taq-polymerase f. PCR med 6µL DNA + dobbelt Taq-polymerase g. PCR med 1 µl MgCl 2 h. PCR med 3 µl MgCl 2 i. PCR med 0,1 µl AmpliTaq Gold enzym j. PCR med 0,2 µl AmpliTaq Gold enzym Om b. eller c. vælges, afhænger af, om der er prøvemateriale nok til at vælge c. 25

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 4. Protokollen er udarbejdet efterhånden, som der ikke viste sig en amplificering af de pågældende prøver med de tilhørende exons. Der er taget udgangspunkt i hhv. hele exon 6 (1. Pilotforsøg) og prøve 293 exon 2 (2. og 3. Pilotforsøg). Pilotforsøg 1. Exon 6 kørt med sekundært prøvemateriale på 2 forskellige thermocyklere 2 x 3 reaktioner blev opstillet med hhv. primer 6 forward og 6 reverse (gamle primersæt). De anvendte prøver er en del af de sekundære prøver; numrene 2, 384 og 426. De to thermocyklere anvendt er fra hhv. Eppendorf og MJ Research. 2. MgCl 2 optimeringstrin g. og h. Dette pilotforsøg omhandler kun prøve 293 exon 2. Der blev taget udgangspunkt i Protokol 1 standardprotokollen til fremstilling af PCR-produkt. Koncentrationen af MgCl 2 blev derefter ændret. Der blev opstillet 2 reaktioner med hhv. 1 µl og 3 µl MgCl 2 i stedet for 1,5 µl. 3. AmpliTaq Gold enzym optimeringstrin i. og j. Dette pilotforsøg omhandler kun prøve 293 exon 2. Igen blev der taget udgangspunkt i Protokol 1 standardprotokollen til fremstilling af PCR-produkt. Et nyt enzym, AmpliTaq Gold blev her tilsat i stedet for Hot Start Taq-polymerase. Hhv. 0,1 µl og 3 µl blev tilsat. 26

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 5. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden. Denne metode indgår i forberedelsen til sekventeringen af prøverne. Oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden Oprensningen af PCR-produkterne foregår i GFX 1 søjler indeholdende et filter, hvor DNA et, ved centrifugering, sætter sig fast og derefter vaskes/oprenses. Til sidst opsamles DNA i et eppendorfrør. Anbring GFX-søjlen i et opsamlingsrør (begge er fra oprensningskittet 2 ). Tilsæt 500 µl capture buffer til GFX søjlen. Påsæt PCR-opløsning til søjlen, dog højest 100 µl. Bland omhyggeligt ved at pipettere op og ned 4-6 gange. Centrifuger i en microcentrifuge ved 11266 G (fuld hastighed i ca. 30 sek.) Tøm opsamlingsrøret for det opsamlede væske og sæt GFX-søjlen tilbage i opsamlingsrøret. Tilsæt 500 µl wash buffer 3 til søjlen og centrifuger ved 2133 G. (fuld hastighed i ca. 30 sek.) Smid opsamlingsrøret væk og flyt GFX-søjlen til et rent 1,5 eppendorfrør. Påsæt 50 µl H 2 O (elution buffer) direkte til toppen af søjlen. Dette skal ske, således at hele filteret er dækket, men dog uden at røre filteret med pipetten. Lad søjlen stå i 1 minut ved stuetemperatur. Centrifuger ved 2133 G (fuld hastighed i ca. 1 minut) for at opsamle det oprensede DNA. Volumen af dette vil være omkring 40 µl. 1 Dobbelstrenget DNA fra 100 bp til 48 kbp kan oprenses. 2 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit. 3 Wash buffer en skal fortyndes før brug. Til flasken med wash buffer tilsættes 48mL 96 % ethanol. Bland opløsningen ved at vende flasken. Der noteres på låget, hvornår ethanol er tilsat. 27

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 6. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til amplificering af PCR-produkt, som forberedelse til sekventering. Sekventerings-PCR Mix pr. prøve BDT-mix (Big Dye Terminator v 3.1) Primer 1,6 pmol/μl milliq vand 5x seq buffer I alt 2μL 2μL 12μL 3μL 19μL Der tilsættes 1-2μL oprenset PCR-produkt. Program til thermocykler: På thermocykleren fra MJ Reseach hedder programmet TERMINATOR. 96 C i 1 min. 96 C i 10 sek. 50 C i 5 sek. x 25 60 C i 4 min. 10 C forever 28

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 7. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til fældning af sekvens-pcr. Denne metode indgår i forberedelsen til sekventeringen af prøverne. Fældning af sekvens-pcr Rørene sættes op i plaststativet i omvendt rækkefølge numerisk, da pladen Optical 96-Well Reaction Plate, som sættes i sekventeringsapparatet, er nummereret omvendt 1. Til PCR 20μL tilsættes 2μL Natriumacetat (NaOAc) 3M ph 5,2, og 50 μl 96 % ethanol. Mix på vortex-mixer og lad blandingen stå i 10 min. Centrifuger ved max hastighed i 30 min. Supernatanten suges fra. Vask pellet med 175μL 70 % ethanol. Mix på vortex-mixer. Centrifuger ved max hastighed i 5 min. Supernatanten suges fra. Tør pellet ved at placere rørene med åbne låg ved stuetemperatur, evt. i stinkskab. Prøverne opløses i 15μL H 2 O. (Prøverne kan også opløses i 15μL Hi Di formamid. Signalerne ved sekventering bliver højere, når prøverne er opløst i H 2 O, men holdbarheden er bedre ved opløsning i Hi Di formamid) 1 H G F E D C B A 1 2 3 4 29

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resultater Resultater fra temperaturgradienterne Tabel 1. Tabellen viser en oversigt over de temperaturgradienter, der er blevet opstillet, hvilken annealingtemperatur der er optimal for PCR-reaktionerne, om temperaturgradienterne er godkendt, observationer, kommentarer og en henvisning til, hvor temperaturgradienterne fremgår, i form af et billede af gelen, i Bilag 1. Kriterierne for en succesfuld amplifikation er, at båndene på gelen skal være tydelige og afgrænsede. Da der her er tale om temperaturgradienter, er det samtidig et kriterium, at der ingen tomme spor eller meget svage bånd må være i nabosporet på gelen, hvis denne skal kunne accepteres/godkendes. Exon og prøvenr. Exon 1 Temperatur C godkendt/ikke godkendt Kommentarer Observation prøve 41 60 ikke godkendt intet produkt Primer-dimer prøve 224 60 ikke godkendt Nabospor tomt primer-dimer Henvisning til billede i bilag prøve 2 60 godkendt Alle kriterier opfyldt g5 Exon 2 prøve 42 60 ikke godkendt bånd ikke afgrænset primer-dimer prøve 140 60 godkendt Alle kriterier opfyldt primer-dimer g1 Exon 3 prøve 26 60 ikke godkendt intet produkt prøve 163 60 godkendt Alle kriterier opfyldt primer-dimer g1 Exon 4 prøve 323 60 godkendt Alle kriterier opfyldt g3 Exon 5 prøve 384 60 ikke godkendt Meget svage bånd prøve 105 60 ikke godkendt intet produkt prøve 140 60 ikke godkendt intet produkt prøve 163 54 godkendt Alle kriterier opfyldt g7 Exon 6 prøve 384 60 Tidligere godkendt overstreget på billedet af gelen gamle primere prøve 163 60 godkendt Alle kriterier opfyldt nye primere g5 Exon 7 prøve 299 60 ikke godkendt intet produkt primer-dimer prøve 31 60 godkendt Alle kriterier opfyldt g4 Exon 8 prøve 389 60 ikke godkendt Meget svage bånd prøve 426 60 ikke godkendt intet produkt prøve 469 60 ikke godkendt intet produkt prøve 323 54 godkendt Alle kriterier opfyldt g6 Exon 9 g3 30

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 prøve 426 60 godkendt Alle kriterier opfyldt g2 Exon 10 prøve 469 60 ikke godkendt båndene er meget svage prøve 105 54 ikke godkendt intet produkt prøve 224 60 godkendt Alle kriterier opfyldt g4 De fundne annealingtemperatur i forhold til primernes udregnede Tm Tabel 2. Tabellen viser en oversigt over Tm for de forskellige primere tilhørende de forskellige exons. Gennemsnittet af de to primere er udregnet og kan sammenlignes med den empirisk fundne annealingtemperatur. Pågældende exon Tm Forward primer Tm Reverse Primer Tm gennemsnit annealingtemperatur Exon 1 57,9 57,9 58,8 60 Exon 2 55,3 55,3 55,3 60 Exon 3 55,3 55,3 55,3 60 Exon 4 52,8 53,2 53 60 Exon 5 54,5 53,2 53,9 54 Exon 6 (gammel) 53,2 51,2 52,2 60 Exon 6 (ny) 60 58 59 60 Exon 7 56,7 57,3 57 60 Exon 8 54,5 53,2 53,9 54 Exon 9 55,3 55,2 55,3 60 Exon 10 54,5 53,2 53,9 60 31

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resultater fra PCR-reaktionerne Tabel 3. Tabellen er en oversigt over, hvilke forsøg der er udført for henholdsvis hver prøve, hvert exon ved optimeringen af PCR-reaktionerne. Denne optimering er udført efter optimeringen af annealingtemperaturen. Reaktionerne for exon 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9 og 10 er udført ved 60 C. Reaktionerne for exon 5 og 8 er udført ved 54 C. Ved exon 6 skelnes mellem to forskellige primersæt. Forsøg på amplificering med det gamle primersæt er markeret med *, som det fremgår nedenfor. Bogstav- og farveforklaring fremgår under tabellen. Prøve/exon Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 Exon 10 22 a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 26 a. a. a. a. a.a. a*. a. a. a. a. a. 32 a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 41 a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 42 a.a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 56 a.a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 83 a.a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 100 a.a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 127 a.b. a.c. a. a. a. a. a. a. a. 131 a.a. a.a. a.a. a.a. a.d.e. a*. a. a.a. a.a. a.a. a.a. 180 a.a.c. a.c. a.c. a.c. a.c. a*. a. a.b. a.b. a.b. a.b. 252 a. a. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 293 a. a.a.c.d.e.f.g.h.i.j. a. a. a. a*. a. a. a. a. a. 314 a.c.d.e. a. a. a.c.d.e. a.c.d.e. a*.a. a. a.c.d.e. a.c.d.e. a.c.d.e. 356 a.a. a. a. a. a. a*.a. a. a. a. a.b. 418 a. a. a. a. a.b.c.d.e. a*.a. a. a. a. a. 431 a.b. a.c. a. a. a. a*.a. a. a. a. a. 471 a.a.c.d.e. a. a. a. a.d.e. a*.a*.a. a. a. a. a. 523 a.a. a. a. a. a. a*.a. a. a. a. a. a. PCR med 3µL DNA Intet produkt efter PCR b. PCR med 4µL DNA Produkt efter PCR c. PCR med 6µL DNA * gammelt primersæt anvendt d. PCR med 1µL DNA + dobbelt Taq-polymerase e. PCR med 3µL DNA + dobbelt Taq-polymerase f. PCR med 6µL DNA + dobbelt Taq-polymerase g. PCR med 1 µl MgCl 2 dette trin fremgår af Tabel 6. h. PCR med 3 µl MgCl 2 dette trin fremgår af Tabel 6. i. PCR med 0,1 µl AmpliTaq Gold enzym dette trin fremgår af Tabel 6. j. PCR med 0,2 µl AmpliTaq Gold enzym dette trin fremgår af Tabel 6. Eksempel på tolkning af resultaterne: 314 exon 8 er amplificeret med en annealingtemperatur på 54 C. Prøven har undergået optimeringstrinnene a., c., d. og e. Da prøven er markeret med grøn er dette en succesfuld amplificering. Prøven blev ikke amplificeret ved forsøg med optimeringstrin a., c. og d. (se evt. også Tabel 4 side 33). 32

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Suppleringsskema over resultater fra specifikke PCR-reaktioner Tabel 4. Prøverne 131.5, 293.2, 314.4, 314.8, 314.9, 314.10, 471.1 og 471.5 har undergået trin d. og e. i optimeringsproceduren. Prøven 293.2 har undergået trin d., e. og f. Reaktionerne er udført parallelt og det er ikke muligt ud fra ovenstående tabel (Tabel 3, Resultater fra PCR-reaktionerne), at udlede hvornår DNA-amplificeringen er tilfredsstillende. Altså om det kun er i trin f., at DNA blev amplificeret, eller om amplificeringen af DNA fandt sted i både trin d., e. og f. Derfor er denne supplerende tabel udført. Farve- og bogstavforklaring ses under tabellen. Prøve+exon/trin d. e. f. 131.5 293.2 314.4 314.8 314.9 314.10 471.1 471.5 amplificeringen lykkes amplificeringen ikke lykkes d. PCR med 1 µl DNA + dobbelt Taq-polymerase e. PCR med 3 µl DNA + dobbelt Taq-polymerase f. PCR med 6 µl DNA + dobbelt Taq-polymerase 33

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resultater fra pilotforsøget med exon 6 (gamle primersæt) Tabel 5. Tabellen herunder viser et ekstra forsøg, der blev udført med det sekundære prøvemateriale på 2 forskellige thermocyklere, altså blev 3 reaktioner udført på hver af de to anvendte thermocyklere; 1. Thermocykler er fra Eppendorf. 2. Thermocykler er fra MJ Research. Exon 6 viste ikke produkt på gelen ved gelelektroforese, når det primære prøvemateriale blev anvendt. Derfor blev et ekstra forsøg udført, anvendende det sekundære prøvemateriale, for at fastslå, at primerne 6 forward og 6 reverse ikke virkede, således at DNA blev opformeret i PCR-reaktionerne. En forklaring på farverne ses under tabellen. Exon 6 (gamle primersæt) 1. thermocykler: 384 a. 2 a. 426 a. 2. Thermocykler: 384 a. 2 a. 426 a. Intet produkt efter PCR Produkt efter PCR a. PCR med 3µL DNA Resultater fra pilotforsøgene med prøve 293 exon 2 Tabel 6. Tabellen herunder viser de 2 pilotforsøg, som blev udført med prøve 293 exon 2. De er forsøgt amplificeret DNA ved hhv. at ændre MgCl 2 -koncentrationen til 1 µl og 3 µl og udførelse af PCR-reaktioner med et nyt enzym, AmpliTaq Gold. Farve- og bogstavforklaring ses under tabellen. Exon 2 MgCl 2 293 g. 293 h. AmpliTaq Gold enzym 293 i. 293 j. Intet produkt efter PCR Produkt efter PCR g. PCR med 1 µl MgCl 2 h. PCR med 3 µl MgCl 2 i. PCR med 0,1 µl AmpliTaq Gold enzym j. PCR med 0,2 µl AmpliTaq Gold enzym 34

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Antal succesfulde amplifikationer opnået Tabel 7. Denne tabel er en oversigt over antal succesfulde amplifikationer der er opnået vha. PCR-reaktioner. Ved succesfulde amplifikationer menes en opformering af det ønskede stykke DNA i en acceptabel mængde vha. PCRreaktioner. I tabellen er anført antal amplificeringer og antallet i %. Succesfulde amplificeringer Optimeringstrin Antal Antal i Procent [%] a./a.a. 127 67 b./c. 3 2 d./e. 7 3 f. 0 0 g. 0 0 h. 0 0 i. 0 0 j. 0 0 amplificeret 137 72 I alt 190 100 35

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resultater fra tjek af oprensningen af PCR-produkter Tabel 8. Tabellen viser, om der var DNA til stede ved gelelektroforese af oprensede PCR-produkter. Kun nogle prøver og exons blev undersøgt. Som det fremgår af Tabel 9 blev nogle af prøverne sekventeret med positivt resultat. Disse prøver har samtidig ikke undergået dette tjek. Udvælgelsen af prøverne til denne ekstra analyse blev udvalgt tilfældigt ud fra mængden af prøver, der ikke blev sekventeret med et tilfredsstillende resultat. I alt er 61 opsamlingsrør analyseret for PCR-produkt efter oprensningen. Som det ses på nedenstående tabel, viste der sig at være PCR-produkt til stede i 47 af de i alt 61 opsamlingsrør. Farve- og bogstavforklaring ses under tabellen. Prøve/exon Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 Exon 10 26 ja ja O O O O 41 ja ja ja O 42 ja O ja 83 O ja ja O O O 100 ja ja ja ja ja ja 127 ja ja ja ja ja ja ja ja 131 ja ja ja ja ja 418 ja ja ja O ja O O 431 ja ja ja ja ja ja ja ja 471 ja ja ja O ja ja ja ja ja betyder DNA til stede i opsamlingsrøret O betyder at der ikke var DNA til stede i opsamlingsrøret betyder at den pågældende prøve ikke undergik dette tjek 36

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resultater fra sekventeringen af PCR-produkterne Tabel 9. Tabellen viser resultaterne fra sekventeringen af PCR-produkterne. Ved tilfredsstillende sekvenser menes, at det er muligt at aflæse basesammensætningen på hele det pågældende exon. Ved ikke-tilfredsstillende sekvenser menes, at dele af exon ikke er kommet op ved sekventeringen og at baserne derved ikke kan aflæses på de billeder, der bliver overført til Seqscape fra sekventeringsapparatet. I alt blev 93 prøver forsøgt sekventeret. 29 blev sekventeret med et tilfredsstillende resultat og 64 med et ikke-tilfredsstillende resultat. Tegn- og farveforklaring fremgår under tabellen. Prøve/exon Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 Exon 10 22 I I I I I O I I I I 26 I I I I O O I I I I 32 I I I I I O I I I I 41 I I I I I O I I I I 42 O I I I I O I I I I 56 O O O O O O O O O O 83 I I I I O O O I I I 100 O I I I I O I I I I 127 O O O O O O O O O O 131 I I I I I O I I I I 180 O O O O O O O O O O 252 I I I I I O I I I I 293 I O I I I O I I I I 314 O I O O O O O O O O 356 O O O O O O O O O O 418 I I I I O O I I O I 431 O O O O O O O O O O 471 O O O O I O O O O O 523 O O O O O O O O O O I I O Forsøgt sekventeret med tilfredsstillende sekvenser som resultat Forsøgt sekventeret med ikke-tilfredsstillende sekvenser som resultat ikke forsøgt sekventeret 37

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Fejlkilder Tabel 10. Disse to prøver og de tilhørende exons, undtaget er exon 6, blev efter første amplificering forkastet og derefter lavet om, da vandprøven i første omgang manglede som negativ kontrol af reaktionerne i analyseserien. Prøve Exon 131 1-5 og 7-10 471 1-5 og 7-10 38

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Diskussion Hvordan optimeres en PCR-reaktion i den rigtige rækkefølge? Dette spørgsmål stillede jeg mig selv inden forsøgets start. Svaret fandt jeg noget nær afslutningen af projektet og dette svar matcher de svar, jeg kan udlede af litteraturen. Kigges dybt i litteraturen, er forklaringen på fremgangsmåden i optimeringen af PCR-reaktioner ofte begrundet med empiri. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 65) ligger svaret på ovenstående spørgsmål et sted mellem nogle standardregler og et empirisk Hit-and-miss forløb. Der tages udgangspunkt i en standardprotokol, hvorefter forskellige parametre reguleres én efter én, indtil mængden af det ønskede produkt er opnået. Herved findes de rette betingelser for en optimal amplifikation af et specifikt stykke DNA. Den første parameter der blev optimeret var annealingtemperaturen i form af udførelse af temperaturgradienter. Det blev anbefalet fra KBA, Forskningsafdelingen, HH, at PCR-reaktionerne skulle udføres med en annealingtemperatur på 60 C, da afdelingen har opnået gode resultater med amplifikationer af DNA ved denne temperatur. Dette resulterede i mange succesfulde amplifikationer efterfølgende. Dog blev amplificeringen af exon 5 og 8 udført med en annealingtemperatur på 54 C, da temperaturgradienterne viste, at den optimale annealingtemperatur lå herved. Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144) nævner at annealingtemperaturens øvre grænse er fastsat af Tm. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 29) bør annealingtemperaturen sættes 5 C under Tm. Ud fra ovenstående udsagn overvejes det her, om de fastsatte annealingtemperaturer for PCR-reaktionerne matcher disse udsagn om hvor annealingtemperaturen bør være. Som det fremgår af Tabel 2 på side 31, er annealingtemperaturen for primerne tilhørende exon 1, 5, 6 (nyt primersæt), 7 og 8 meget tæt på gennemsnittet af Tm for disse primersæt. Vurderes resultaterne af amplificeringen af DNA-sekvenserne for disse exons, fremgår det at exon 6 (nyt primersæt) er blevet amplificeret ved de fleste af prøverne. Exon 7 og 8 er amplificeret ligeså, næsten uden problemer. Dog er exon 1 og 5 delvist amplificeret, af hvilket jeg kan udlede, at der her skal sættes fokus på andre optimeringstrin. Vurderes det gamle primersæt til exon 6 ud fra Tabel 2 side 31, ses her et eksempel på en gennemsnitlig Tm, som befinder sig langt fra den fastsatte annealingtemperatur. Tm for de anvendte primere er i gennemsnit 52,2 C ved exon 6 (det gamle primersæt), hvilket er meget lavt i forhold til, at annealingtemperaturen er sat til 60 C ved udførelse af PCR-reaktionerne. Hvis rådet fra McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 29) om at skulle sætte annealingtemperaturen til 5 C under Tm var blevet fulgt, ville annealingtemperaturen skulle have været sat til 47,2 C. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 67) falder specificiteten, jo lavere annealingtemperatur der vælges. Derfor tror jeg ikke det ville være hensigtsmæssigt at vælge en så lav annealingtemperatur, da risikoen for mispriming mellem primer og template derved kan forekomme. For exon 6 (med gamle primersæt) blev temperaturgradienten opstillet således, at spektret af temperaturer var 60 C ± 5 C. Se evt. Tabel 1 side 30, hvor det fremgår, at denne temperaturgradient (exon 6 gamle primersæt) blev amplificeret ved en annealingtemperatur på 60 C med et fint resultat og derved dannede grundlag for at fortsætte udførelsen af PCR-reaktionerne 39

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 ved denne annealingtemperatur (60 C), hvorefter selve PCR-produkterne mærkeligt nok ikke blev amplificeret. Grunden til denne forskel mellem temperaturgradienten og manglende udbytte af PCRamplificeringen af prøverne er mig en gåde. Resultaterne af det ekstra forsøg, der blev udført, ses på Tabel 5 side 34. Dette forsøg blev udført som et ekstra tjek af, om de foregående opstillinger kan have været skyld i at denne amplificering af exon 6 (med gamle primersæt 6) ikke virkede. Jeg har overvejet alt fra en fortynding af primerne til forkert indstilling af thermocykleren, således at apparatet anvendte en annealingtemperatur ved temperaturgradienten, som lå lavere end den hvorved intentionen om at udføre reaktionerne ved 60 C, lå. Fortynding af primerne med andre reagenser er en usandsynlig fejlkilde, da opmærksomheden omkring skiftning af pipettespids lå i højsædet ved opstilling af PCR-rørene. En anden fejlkilde kan være den kontinuerlige nedfrysning og optøning af primerne, som foregik i starten af forsøget pga. min uvidenhed omkring behandling af reagenser. Men jeg tænker her, at dette er en usandsynlig fejlkilde, da alle de andre primere ligeså gennemgik denne nedfrysning og optøning og stadig virker derefter. Løsningen på problemet med primersæt 6 (gamle) findes et sted, men dette er hinsides min forstand indenfor dette emne. Ved valg af et nyt primersæt til exon 6, blev mål-sekvensen amplificeret i 12 tilfælde ud af 19 i første forsøg. 1 succesfuld amplifikation fandt sted i andet forsøg. At disse PCR-reaktioner er lykkedes i så mange af tilfældene ved amplificering med et nyt sæt primere, kan tyde på, at det forhenværende primersæt har været dårligt fungerende i forhold til amplifikation af mål-sekvensen. Det er derfor vigtigt at holde i mente hver gang der udføres PCR-reaktioner, at fremgangsmåden og koncentrationerne af de forskellige reagenser stort set ikke er ensartet beskrevet i litteraturen. Der er mange måder at udføre PCR-reaktioner på, lige fra forskellige typer af PCR til forskellige mængder af et specifikt reagens i et Mastermix. Derfor valgte jeg at starte ét sted ved at tage udgangspunkt i standardprotokollen på KBA Forskningsafdelingen, HH. Protokollen er som sådan ikke tilpasset i forhold til den amplificering af DNA, jeg har udført, men den giver et godt udgangspunkt for udførelse af PCR-reaktioner. Ved at vurdere Tabel 3 side 32 ses det, at de grønne felter med kun et a. tilknyttet er dér, hvor standardprotokollen faktisk står til baggrund for en succesfuld amplificering af DNA-sekvenser, med et forsøg på optimering af en enkelt parameter, nemlig annealingtemperaturen for alle exons. I alt 100 reaktioner, ud af 150 i alt, lykkedes i første forsøg på amplificering med en annealingtemperatur på 60 C. Efter design af nye primere til exon 6 lykkedes 13 reaktioner yderligere ved første amplificering. Jeg vurderer, at denne standardprotokol er brugbar som udgangspunkt til videre optimering af specifikke PCR-reaktioner. Ved at kigge nærmere på antallet af cykler i reaktionen, kan jeg hurtigt fastslå at antallet af cykler i denne standardprotokol er højt sat. Antallet af cykler skal ifølge Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144) begrænses til 30. Der nævnes ligefrem, at der er noget alvorligt galt med en PCR, hvis ikke der er tilfredsstillende udbytte efter 30 cykler. Af Innis m.fl. (Innis M. A., Gelfand, Sninsky, & White, 1990, s. 8) bliver Kary Mullins citeret for at have sagt følgende If you have to go more than 40 cycles to amplify a singlecopy gene, there is something seriously wrong with your PCR. 40

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Jeg har derfor undret mig over, om det høje cyklusantal, der anvendes til udførelse af PCR-reaktioner i standardprotokollen fra KBA Forskningsafdelingen, HH, er passende. Antallet af cykler er her sat til 35. Koncentrationen af DNA i prøvematerialet er højt, udregnet til at være 2.000.000 kopier af genomet i 3 µl prøvemateriale. Udregningen fremgår af Bilag 2. Da prøvematerialet er bestående af så høj en mængde DNA (2.000.000 kopier), formoder jeg at cyklusantallet kan sættes ned. Ifølge Innis m.fl. (Innis M. A., Gelfand, Sninsky, & White, 1990, s. 8) skal det optimale antal cykler bestemmes ud fra startkoncentrationen af DNA. Jo større mængde DNA, jo færre cykler. Samtidig nævner McPherson og Møller, (McPherson & Møller, 2006, s. 18) at det generelt er bedst at stoppe PCRreaktionen efter 30-35 cykler i forhold til, at plateaufasen opstår på dette tidspunkt i reaktionen. Af dette kan jeg udlede, at mange cykler kan føre til reaktionens indtræden i plateaufasen. I afsnittet Plateaufasen side 12 er jeg kommet mere ind på, hvorfor det ofte ikke er hensigtsmæssigt, at PCRreaktionen når plateaufasen, inden denne stoppes. Om de udførte PCR-reaktioner når ind i plateaufasen, har jeg samtidig undret mig over. Plateaufasen opnås når der er mangel på reagenser, især Taq polymerasen (enzymet), grundet halveringstiden for inaktivering af denne. Halveringstiden for inaktiveringen af enzymet er 5 min. ved 97,5 C, 40 min. ved 95 C og 130 min. ved 92,5 C. Ifølge den anvendte standardprotokol er enzymet udsat for 95 C i 17,5 min. + 10 min. i starten. Derfor er der teoretisk set halvdelen af enzymets aktivitet bevaret efter en PCR-reaktion ifølge den anvendte standardprotokol. Vælges der at køre flere PCR-cykler efter at reaktionen har nået plateaufasen, kan det øge risikoen for uspecifikke reaktioner og derved amplifikation af misprimede produkter. Jeg tror det er således, at fordi der er så høj koncentration af det ønskede PCR-produkt i PCR-røret, vil disse template-strenge sammenkædes og den smule Mastermix, der er tilbage, vil amplificere det misprimede produkt i stedet, da template-strenge ikke er ledige til annealing af den smule primere, der end måtte være tilbage. I dette forsøg, hvor 35 cykler er valgt, er der som sagt ingen fejlprodukter amplificeret og dette kunne tyde på, at det store antal cykler ikke har negativ indflydelse på disse reaktioner, i form af opformering af uspecifikke stykker DNA. Jeg tænker derfor, det ikke er nødvendigt at optimere cyklusantallet. KBA Forskningsafdelingen, HH kan have valgt dette antal cykler ud fra erfaring med, at et lavere antal cykler ikke var tilstrækkeligt. Om PCR-reaktionerne når plateaufasen eller ej, stiller jeg stadig spørgsmålstegn ved. Antallet af cykler er samtidig afhængig af længden i Præ-PCR aktiverings trinnet, som tidligere nævnt i afsnittet Temperaturprofilen side 11. Anvendes 12-15 min. ved 95 C i præ-pcr aktiverings trinnet, vil 32-34 cykler være tilstrækkeligt for at få PCR-produkt i den ønskede mængde. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) Producenten Qiagen (QIAGEN, s. 10) skriver, at der skal 15 min. til aktivering af enzymet i præ-aktiverings-trinnet ved 95 C. Innis m.fl. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 81) skriver at den indledende denaturering og aktivering af enzymet bør være 12-15 min. I dette projekt anvendes kun 10 min. inkubationstid ved 95 C til aktivering af enzymet og opnåelse af optimal denaturering af DNA et. Jeg formoder dette kan være endnu en begrundelse for at KBA Forskningsafdelingen, HH har bevaret det høje antal cykler. Primerdesign Det fremgår af McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 65) at når man tager et nyt sæt primere i brug, er det en god idé at udføre reaktioner med hver primer adskilt, for at finde ud af, 41

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 hvordan begge virker hver for sig. Dette modsiger McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 65) et andet sted, hvor det fremgår, at man succesfuldt kan udføre PCR-reaktioner med én primer og når denne derefter skal arbejde sammen med en anden primer, kommer der intet udbytte af reaktionen. Jeg mener, det er oplagt at finde ud af, om primerne hver især kan anneale til templatestrengen. Da der blev taget et nyt primersæt (nyt primersæt til exon 6) i brug i dette projekt, udførtes ikke denne kontrol af primernes annealingevne hver for sig. Dette viste sig ikke at være nødvendigt i dette tilfælde, da amplificeringen med det nye primersæt blev succesfuld allerede ved første forsøg. Men på den anden side er det ikke klarlagt, om den ene primer alene har været skyld i denne amplificering af exon 6 og ikke i samspil med den anden. Jeg tror, at hvis den ene primer alene var skyld i denne amplificering af exon 6, ville udbyttet have været mindre, dvs. et svagt bånd på gelen ved gelelektroforese. Det fremgår af billedet p25 i Bilag 1, at de fremkomne produkter er visualiseret på gelen som meget tydelige bånd og dette kunne tyde på, at hver af primerne i det nye primersæt for exon 6 begge virker efter hensigten. Amplifikationen af exon 3 var den mest succesfulde amplificering. Her vil jeg kigge nærmere på designet af primersættet til exon 3. I forhold til længden overholder dette primersæt den længde, der anbefales af Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146). C/G-indholdet for begge primere er 45 %, hvor anbefalingen fra Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146) er 40 % C/G-indhold. På KBA Forskningsafdelingen, HH anbefales 50 % C/G-indhold i primeren, da dette høje indhold giver den bedste annealing til template. Det fremgår af Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146) at fordelingen af G/C i primeren samtidig helst skal være jævnt fordelt, da en C/G-rig 3 -ende kan binde til template uanset, om 5 -enden binder og dette kan føre til mispriming. Samtidig vil den optimale annealingtemperatur være forskelligt gældende fra den ene ende af primeren til den anden. Primersættet til exon 3 ses nedenfor. Primer 3 Forward: 5 GGG CAG ATC TGT TTA TAG TG 3 Primer 3 Reverse: 5 TGG CAT GAG TAC TTA GGT CT 3 C/G-regionerne er markeret i form af rød skrift. Her ses det, at disse primere ikke har en 3 -ende udelukkende bestående af C/G-indhold, men derimod en 5 -ende med større koncentration af C/G end A/T. Teoretisk set tror jeg, at dette ville have en betydning for specificiteten af primer annealingen, da annealingtemperaturen i 5 -enden er højere end i 3 -enden, men resultaterne af PCR-reaktionerne for exon 3 viser, at dette formentlig ikke har haft en betydning i praksis, da amplifikationen af exon 3 som sagt er den mest succesfulde. Primer-dimer Citeret fra Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 145) Den vigtigste del af optimeringen går ud på at finde balancen mellem dannelse af det ønskede produkt på den ene side og fejlprodukter samt primer-dimer-artefakter på den anden. På nogle af gelerne forekommer der en visualisering af både PCR-produkt og dannelse af primerdimer-artefakter. Båndet som repræsenterer det pågældende PCR-produkt, er ikke nødvendigvis 42

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 blevet forringet, på trods af, at der er opstået dannelse af primer-dimer. Mange af primer-dimerartefakterne er ret tydelige og jeg tænker her, at disse duplexer derfor optager mange primere til dannelse af disse duplexer, hvor der derved ikke ville være tilstrækkelig mængde af primere til at anneale til template. Udbyttet af det ønskede produkt ville blive forringet. Ved fejlprodukter til stede på gelen ved gelelektroforese kunne det ønskede produkt ifølge Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 145) blive forringet, da fejlprodukter kan dræne reagenser fra dannelsen af det ønskede produkt. Da disse fejlprodukter ikke er til stede på gelerne ved gelelektroforesen, er dette ikke aktuelt i dette projekt. Ud fra gelerne med PCR-produkterne visualiseret kan det aflæses, når primer-dimer forekommer. På billederne P10, P11, P13, P22a, P22b, P28, P32 + 33 i Bilag 1 ses eksempler på primer-dimer. Efter at have analyseret gel-billederne, kan jeg se en tendens til primer-dimer dannelse ved især primersættet til exon 5. Ved et kig på Tabel 3 side 32 ses det, at der var problemer med amplifikationen af exon 5 i form af 4 prøver, der ikke blev amplificeret. Efter optimering på PCRreaktionerne ved prøve 314 og 418, blev de pågældende prøver stadig ikke amplificeret. (Optimeringstrinnene kommer jeg senere ind på) Noget kan her tyde på, at det har været primersættet, der ikke var i stand til at anneale til mål-sekvensen, da disse enten har annealet til sig selv hver især eller til hinanden, dvs. self-priming er her forekommet. For at finde en eventuel komplementaritet mellem de to primere, har jeg stillet hhv. Primer 5 Forward og Reverse over for hinanden: Komplementær baseparring mellem primerne, som kan have ført til primer-dimer dannelse, er indtegnet på primerne som streger i forskellige farver. Ved at kaste et hurtigt blik på de to primere ses at der er masser af muligheder for baseparring mellem de to primere. Jeg formoder, at dannelsen af primer-dimer-artefakter derfor har gjort amplifikationen af mål-sekvenserne, exon 5, svagere. Optimering af PCR-reaktioner Det fremgår af Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 145), at optimeringsproceduren indledningsvis har det formål at opnå produkt og senere skal der fokuseres på at opnå det rigtige produkt. Jeg tror, at denne prioritering afhænger af udgangspunktet for optimeringen. I dette projekt var udgangspunktet, som tidligere nævnt, standardprotokollen fra KBA Forskningsafdelingen, hvori mange af parametrene formentlig med tiden har undergået en optimering. Optimeringstrinnene b. og c. handler om at kompensere for en eventuel lav startkoncentration af DNA i prøvematerialet. Da mængden af prøvemateriale i de pågældende prøver hele tiden begrænsede antallet af optimeringsforsøg, valgte jeg at optimeringstrinnet, omhandlende dét at sætte DNA-koncentrationen op, skulle deles op i to (b. og c.). Trinnet b. blev indført for at tage 43

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 hensyn til videre optimering af prøverne, hvis det senere ville vise sig, at være en anden parameter i reaktionen, der manglede optimering for at opnå en amplificering. Eksempelvis er PCR-reaktionerne for prøven 180 exon 7, 8, 9 og 10 blevet udført med 4 µl DNA, i stedet for 6 µl i andet forsøg på amplificering af disse. Dette har formentlig vist sig stadig at være en for lille mængde DNA til at opnå en amplificering af disse exons. Da exon 3 i prøve 180 blev amplificeret anden gang med 6 µl, altså dobbelt mængde prøvemateriale, og viste sig at blive amplificeret under samme forhold som de ovennævnte exons, kunne dette måske tyde på, at prøvematerialet har en lav koncentration af DNA, siden der skulle 6 µl prøvemateriale til en amplificering. På den anden side var det mindre problemfrit at amplificere exon 3 vha. den anvendte standardprotokol, i forhold til mange af de andre exons. Optimeringstrin d., e. og f. er en ændring i mængden af DNA og mængden af Taq polymerase som tilsættes reaktionen. Det sker ofte, at DNA polymerasen adskiller sig fra template-strengen under syntetiseringen af den pågældende template. Dette kan ske efter kun at have syntetiseret 10 baser eller måske 100 baser. Når denne adskillelse af enzym og template-streng finder sted, overtager et andet enzym dennes plads ved 3 -enden af den hidtil syntetiserede streng og syntetiserer videre ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 36). Hvis en høj startkoncentration af DNA forekommer i reaktionen, kan jeg forestille mig, at der er en risiko for at ende ud med at have en masse halve DNA-strenge som template-strenge i efterfølgende PCR-cyklus. Alle enzymerne vil være optaget pga. overskuddet af DNA-templates i reaktionen. Enzymerne adskiller sig skiftevis fra den template, som er under syntetisering og når derved ikke at syntetisere strengen fuldt ud, i forhold til det ønskede mål-dna. Temperaturen stiger herefter til endnu en denaturering ved de 95 C og her syntetiseres nu kun ud fra en ny template, som måske kun udgør halvdelen af det ønskede mål-dna. Ved at sætte mængden af DNA ned og enzymmængden op, er der god chance for, at enzymet ikke vil være optaget ved alle template-strenge. Men på den anden side formoder jeg, at dette derved øger risikoen for opformering af uspecifikke produkter, da enzymet er i overskud og konkurrerer om de template-strenge, der er i reaktionen. Jeg tror det her handler om at finde en balance mellem længden af template-strenge syntetiseret og uspecifikke DNA-sekvenser, som opformeres, fordi enzymet er i overskud og ikke har et bindingssted på det ønskede stykke DNA. I udførelsen af PCRreaktionerne i dette projekt oplevede jeg hverken for korte DNA-sekvenser opformeret eller amplifikation af uspecifikke DNA-stykker. Ved trin d. og e., hvor mængden af Taq polymerase blev sat op, opnåede jeg amplifikation af exon 4, 8, 9 og 10 i prøve 314, exon 5 i prøve 131, exon 1 og 5 i prøve 471, som det fremgår af Tabel 4 side 33. Det kunne tyde på, at enzymet før har været i underskud og været optaget af at syntetisere få DNA-sekvenser. Udbyttet af reaktionen har simpelthen ikke været tilstrækkeligt til en visualisering af produktet på gelen ved gelelektroforese. Dette understøttes af følgende udsagn fra Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 143 og 148) For meget enzym reducerer specificiteten og for lidt enzym gør udbyttet af reaktionen mindre. En anden parameter, som tidligere er beskrevet, har ligeså indflydelse på specificiteten. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 4) fremgår det, at jo højere annealingtemperatur, jo højere specificitet. Annealingtemperaturen i PCR-reaktionerne viste sig 44

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 formentlig at være sat højt (hhv. 54 og 60 C) og derfor mener jeg, specificiteten burde være tilgodeset, da en høj annealingtemperatur resulterer i høj specificitet. Der er ikke sket amplifikation af forkert produkt i dette projekt og dette kan tyde på at den høje annealingtemperatur har sikret en høj specificitet af metoden. Andre parametre spiller ind ved et overskud af DNA i reaktionen. Et overskud af DNA vil også hæmme reaktionen ved binding til alle primere. McPherson og Hames (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 19) bruger udtrykket at hæmme reaktionen. Dette tror jeg er et spørgsmål om at tilføre reaktionen flere primere, hvis der samtidig med DNA ville være overskud af de andre reagenser. Eller kan mængden af DNA sættes ned i forhold til mængden af primere. Ifølge McPherson og Hames (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 9) er nøglen til en optimering af en PCR-reaktion Mg 2+. Ifølge Kielberg m.fl. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146) bør prioriteringen af optimeringstrin være således, at MgCl 2 -koncentrationen bliver optimeret først. I dette projekt er der ikke som første trin ændret ved den koncentration af MgCl 2, som fremgår af standardprotokollen fra KBA, Forskningsafdelingen, HH. Prioriteringen af optimeringstrinnene i dette projekt er i første ombæring dannet på baggrund af råd og vejledning fra KBA, Forskningsafdelingen, HH. Efterhånden som reaktionerne ikke resulterede i en amplificering af det ønskede DNA, tog jeg råd og vejledning til mig fra diverse litteratur, som i dette afsnit er henvist til. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 66) er en optimering af MgCl 2 -koncentrationen vigtig. Derfor blev et lille pilotforsøg udført med prøve 293 exon 2 (optimeringstrin g. og h.), hvor der endnu ikke var kommet produkt på gelen efter adskillige optimeringstrin. Som det fremgår af Tabel 6 side 34, viste resultatet af pilotforsøget, at ændringer i koncentrationen af MgCl 2 ikke hjalp reaktionen i gang. Derved er det formentlig sådan, at det ikke er nødvendigt at optimere koncentrationen af MgCl 2 i forhold til den anvendte standardprotokol fra KBA Forskningsafdelingen, HH. Optimeringstrinnene i. og j. handler om amplifikation af DNA med enzymet AmpliTaq Gold. Forskellen på de to anvendte polymeraser, Taq Polymerase og AmpliTaq Gold er ikke så tydeligt beskrevet i litteraturen. Ifølge McPherson og Møller (McPherson & Møller, 2006, s. 37-38) fører Taq polymerasen til forbedret specifikke bindinger af primer-template og mindre risiko for amplifikation af uspecifikke DNA-sekvenser. Om enzymet AmpliTaq Gold fremgår samme beskrivelse. Ved anvendelse af AmpliTaq Gold enzymet til amplifikation af exon 2 i prøve 293, lykkedes det ikke at opnå en amplifikation af DNA-sekvensen, som det fremgår af Tabel 6 side 34. Resultatet undrer mig ikke, da forskellen på de to enzymer ikke er at finde i litteraturen. Det eneste exon, der nærved undergik alle optimeringstrin, er netop exon 2 i prøve 293. De andre exons i denne prøve blev amplificeret i første forsøg, kun med en optimering af annealingtemperaturen. Her ses bort fra, at det gamle primersæt for exon 6 ikke kunne amplificere det pågældende exon og et nyt primersæt blev designet. Man kunne umiddelbart mistænke prøvematerialet for at være blevet fortyndet ved en fejl, men dette kan ikke være forekommet, da optimeringstrinnene er udført parallelt for de forskellige exons i prøven. Var fejlkilden til manglende amplificering af exon 2 prøvematerialet ville de andre exons i prøve 293 ligeså ikke være blevet 45

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 amplificeret. Grunden til, at lige præcis exon 2 i prøve 293 skulle modsætte sig amplificering, er mig uvis. Men vurderes exon 2 generelt for de andre udvalgte prøver ses, at der ikke er gentagne problemer med en amplificering af dette exon. Af dette kan jeg udlede, at primersættet fungerer acceptabelt og reagenserne synes at fungere ligeså. Reamplifikation af PCR-produkter Da prøvematerialets ophørelse hele tiden sætter en stopper for, at der kan udføres ydereligere PCRreaktioner med mål-sekvenser, hvor amplifikationen i første omgang ikke er lykkes, fik jeg den idé at reamplificere PCR-produkterne. Alligevel valgte jeg ikke at gøre dette, da ifølge McPherson og Møller, McPherson og Hames m.fl. (McPherson & Møller, 2006, s. 17) (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 5-6) kan opstå amplificering af uønskede produkter i stedet for mål-sekvensen. Da startkoncentrationen af DNA er meget høj ved reamplifikation af PCR-produkter, vil disse DNAstrenge sammenkædes. Med andre ord vil der opstå dimerization eller i værre tilfælde polymerization, således at der vil være bånd af en højere molekylvægt end det ønskede produkt (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 6). Dette kunne dog forhindres ved nøje udregning af primertemplate ratio. Samtidig er et argument for ikke at udføre denne reamplifikation dét, at ved opnåelse af plateaufasen kan opstå misprime-produkter. (McPherson & Møller, 2006, s. 17) (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 5-6). Fra KBA Forskningsafdelingen, HH s side blev det heller ikke anbefalet at udføre dette forsøg, da det er både tidsmæssigt og ressourcemæssigt krævende. Oprensning, fældning og sekventering Som det fremgår af Tabel 9 side 37 blev 29 sekventeringer udført med tilfredsstillende resultat ud af 93 forsøg. Dette viser, at de fremkomne PCR-produkter er mulige at sekventere. Ud fra den ringe succesrate for sekventeringen på 31 % kan det hurtigt fastslås, at noget ikke helt er gået som det skulle under forberedelsen af prøverne til sekventering eller ved selve sekventeringen. Selve arbejdet med sekventeringen er forholdsvis simpelt, men ved de forberedende trin kan noget gå galt, hvis ikke man har erfaring med udførelsen af disse trin. Ved fældningen af PCR-produktet kan en fejlkilde være, at DNA suges op sammen med ethanol når ethanol suges fra. Se evt. metoden i Protokol 7 side 29. I centrifugen sættes PCR-rørene på en bestemt måde, således at DNA et sætter sig opad den ene side af PCR-røret. Efter centrifugeringen suges ethanol op ved at hælde PCR-røret til siden. Suget køres ned langs den modsatte side end den, hvor DNA befinder sig. Denne handling mener jeg kræver erfaring, da usikkerheden omkring præcis hvordan og hvor meget der skal suges fra, er stor hos en nybegynder. Jeg mener derfor, at dette er en mulig fejlkilde til, at succesraten for sekventeringen ikke er højere. En anden fejlkilde til den manglende sekventering mistænkte jeg værende oprensningen af PCR-produktet fra PCR-reaktionerne, da jeg observerede at Capture buffer forsvandt gennem filteret inden tilsætning af PCR-produkt. For at udelukke dette som værende fejlkilde, påførte jeg de oprensede PCR-produkter en gel, hvorved der opnås en visualisering af produkterne, hvis og såfremt dette er til stede. Se Tabel 8 side 36. I de 47 ud af 61 prøver befandt DNA sig i opsamlingsrørene. Derfor vurderer jeg at oprensningen ikke er den primære årsag til de manglende amplificeringer. 46

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Evaluering I løbet af udførelsen af projektet har jeg draget mig nogle erfaringer. Da fokus lå på at skulle komme i gang med projektet og derved hurtigt opnå resultater, gik jeg umiddelbart på kompromis med min viden om kvalitetssikring af analysen og medtagelse af kontroller. Jeg kunne have valgt at bruge de resultater fra PCR-amplificeringen, som ikke undergik kvalitetssikring i form af kontroller, men dette ville være at trodse min bioanalytiske overbevisning om, at resultater skal være valide i form af nogle kontrolforanstaltninger. I stedet for at anvende resultaterne, valgte jeg at lave forsøgene om, således at de svarede til de standarder, jeg har besluttet som et minimum for at et forsøg er validt. Prøverne 131, 471 exon 1-5 og 7-10 i begge, er eksempler på forkastede prøver pga. manglende vandprøve. Se evt. Tabel 10 i afsnittet Fejlkilder på side 38. Der skal som minimum medtages negativ kontrol i form af vandprøve ved PCR-reaktionerne. Jeg lærte bl.a. at kende vigtigheden af kontrolforanstaltningerne i analysen, i form af negativ kontrol ved selve PCR-amplificeringen. Hvis ikke disse vandprøver er medtaget i forsøget, kan den eventuelle kontaminering af PCR-reaktionerne resultere i en opformering af udefrakommende DNA, som ikke nødvendigvis kan afsløres ved at aflæse PCRprodukternes længde ud fra en gelelektroforese. En anden kontrolforanstaltning der følges som minimum i udførelsen af PCR-reaktionerne i dette projekt, er måden hvorpå reagenserne tilsættes ved opstilling af PCR-rør. For at minimere fejlene ved afpipettering, som kan føre til kontaminering af bl.a. prøvematerialet, forberedes Mastermix et indeholdende alle andre reagenser end selve prøvematerialet på forhånd og udportioneres. Herefter tilsættes prøvematerialet til PCR-rørene. En kontaminering af eksempelvis prøvematerialet med andre reagenser ville føre til en fejl-fortynding af det pågældende prøvemateriale. Samtidig kan for mange afpipetteringer føre til tilsætning af forkert mængde reagens. I dette forsøg er jeg ikke stødt på positive vandprøver eller amplificering af uspecifikke produkter og dette kan jeg sige med god samvittighed, da de PCR-reaktioner, der ikke blev kontrolleret i form af vandprøve, blev kasseret og lavet om. Dette har både været ressourcekrævende og tidskrævende i den henseende, at det kostbare prøvemateriale skulle amplificeres på ny og at målet om at nå detektionen af SNP er i CerS6-genet på alle prøver, ikke er nået. Herved opstod idéen om at reamplificere PCR-produkterne, hvilket jeg vil komme yderligere ind på i afsnittet Perspektivering side 49. Målet med projektet er delvist nået. Amplifikationen af de 10 exons i genet CerS6 lykkedes delvist, som det fremgår af Tabel 3 side 32. I løbet af projektet løb jeg ind i adskillige problemer, som resulterede i at ikke alle prøverne med de tilhørende exons blev amplificeret. Som det fremgår af Tabel 7 side 35 blev 72 % af alle prøverne amplificeret ud fra den optimeringsprocedure, jeg tidligere i dette afsnit har valgt at vurdere. Med en succesrate på 72 % har jeg en idé om, hvordan en PCR-reaktion optimeres. Dog mener jeg ikke, der ikke noget samlet svar på hvilke analysebetingelser der er optimale for et specifikt exon. Dette afhænger af mange parametre, som skal være til stede under en PCR-reaktion og kvaliteten af disse. 47

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Konklusion Der er ikke noget entydigt svar på, hvilke analysebetingelser, der er de optimale for de 10 exons i genet CerS6. For hver af de 10 exons var der størst succes med amplificering, hvor kun annealingtemperaturen blev optimeret med standardprotokollen fra KBA Forskningsafdelingen, HH som udgangspunkt. Den optimale annealingtemperatur for primersæt tilhørende exon 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9 og 10 er 60 C. Ved amplifikation af exon 5 og 8 er den optimale annealingtemperatur 54 C. Ydereligere succesfulde amplificeringer af mål-sekvenserne lykkedes med en ændring i koncentrationen af Taq polymerasen og DNA i de pågældende PCR-reaktioner. Med henblik på sekventeringen lykkedes det at opnå en succesfuld sekventering af få af de amplificerede prøver med de tilhørende exons. Dog er der ikke fundet kendte/ukendt mutationer i de sekventerede prøver. Det kan her konkluderes at det er muligt at sekventere de amplificerede prøver med de tilhørende exons. 48

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Perspektivering Først og fremmest vil jeg fastslå, at organisering er nøglen i et projekt som dette. En organisering af arbejdsgangen fra ende til anden er nødvendig når der arbejdes med PCR og en prøvemængde af denne størrelsesorden. Et eksempel på bedre organisering kunne være, at sørge for at opstille en PCR med et exon af gangen. Dette kunne være med til at skabe en bedre overskuelighed. Ligeså ville det minimere fejl, eksempelvis tilsætning af reagenser og prøvemateriale, da en hel serie kun repræsenterer et exon. En reamplificering af PCR-produkterne kan være nødvendig at foretage ved mangel på prøvemateriale, selvom dette strider imod råd og vejledning fra KBA Forskningsafdelingen, HH. Problemet med de manglende amplificeringer af vilkårlige prøver med vilkårlige exons, ville formentlig kunne løses ved en reamplificering af PCR-produkterne. Udføres dette, skal der ikke på samme måde tages hensyn til mangel på prøvemateriale undervejs. Hvis det tidsmæssigt var muligt ville jeg fortsætte optimeringen af PCR-reaktionerne med henblik på, at sætte mængden af Taq polymerase op for flere af de udvalgte prøver, da denne optimering resulterede i en del amplifikationer. Medtagelse af en positiv kontrol, som har til formål at kontrollere om alle reagenser er tilsat PCRrørene. Når manglende amplificering af DNA-sekvenserne forekommer, kan det være hensigtsmæssigt i forhold til fejlfinding, at medtage denne positive kontrol af reaktionen. 49

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Bibliografi Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., et al. (2004). Essential Cell Biology. New York: Garland Science. Carlon, E., Malki, M. L., & Blossey, R. (2005, maj 6.). Exons, Introns, and DNA Thermodynamics. PHYSICAL REVIEW LETTERS; PRL 94, 178101, pp. 1-4. Egebo, L. A. (2004). Genetikbogen - Genetik, genteknologi og evolution. Århus C: Nucleus Forlag Aps. Hilsted, J., Borch-Johnsen, K., & Christiansen, J. S. (2007). Diabetes. København: Munksgaard Danmark. Innis, M. A., Gelfand, D. H., & Sninsky, J. J. (1999). PCR Applications - protocols for functional genomics. San Diego, California: Academic Press. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., & White, T. J. (1990). PCR Protocols a guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press. Kielberg, V., Nørby, S., & Rasmussen, L. (2003). DNA og RNA - en håndbog. København: G.E.C. Gads Forlag. Lyngbye, J. (2001). Dansk Laboratoriemedicin - en håndbog. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck. McPhee, S. J., Lingappa, V. R., & Ganong, W. F. (2003). Pathology of Disease. The McGraw-Hill Companies. McPherson, M., & Møller, S. (2006). PCR, 2nd edition. Abingdon, U.K.: Taylor & Francis Group. McPherson, M., Hames, B., & Taylor, G. (1995). PCR2. New York: Oxford University Press. Olsen, B., Ambye, L., Madsen, B., & Jäger, A. C. (2004, Oktober). Vejledning nr. 1580 - PCR (Polymerase Chain Reaktion) teknik. Hvidovre: Klinisk Biokemisk Afdeling, Hvidovre Hospital. QIAGEN. (n.d.). HotStarTaq PCR Handbook - Februar 2008. Retrieved Maj 18, 2009, from http://www1.qiagen.com/products/pcr/hotstartaqsystem/hotstartaq.aspx?r=1670#tabs=t2 Sand, O., Sjaastad, Ø. V., & Haug, E. (2004). Fysiologi. København: Munksgaard Danmark. Sørensen, A. B., Falkenberg, H., Gasbjerg, P. K., & Jensen, G. S. (2002). Genetik - Grundbog. Århus C: Systime. Theophilus, B. D., & Rapley, R. (2002). PCR Mutation Detection Protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press. 50

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Xu, L. Z., & Larzul, D. (1991, Vol. 14, No. 3). The polymerase Chain Reaction: Basic Methodology And Applications. Comp. Immun. Microbiol. infect., pp. 209-221. Yuryev, A. (2007). PCR Primer Design. Totowa, New Jersey: Human Press Inc. 51

Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Bilagsoversigt Bilag 1: Gelbilleder af temperaturgradienterne Gelbilleder af PCP-produkterne Gelbilleder fra Gelelektroforese af oprensede PCR-produkter Bilag 2: Mængde af DNA fra start i forhold til valgte antal cykler Udregning af antal kopier af DNA-template i prøvematerialet Bilag 3: Anvendte reagenser og apparaturer Bilag 4: Liste over primære og sekundære prøvenumre Bilag 5: Primeroversigt inklusiv det nye primersæt til exon 6 Bilag 6: Primernes placering i forhold til de 10 exons Bilag 7: Oversigt over sekventeringsresultater 52

Bilag 1 Gelbilleder af temperaturgradienterne G1 G2 G3

G4 G5 G6

G7 Gelbilleder af PCR-produkterne P10

P11 P12

P13 P14 P15

P16a og b

P17 P21

P22a P22b

P23 P24

P25

P32 og P33 Gelelektroforese af oprensede PCR-produkter P 100

P 101

P 102

Bilag 2 Mængde af DNA fra start i forhold til valgte antal cykler Oversigt over hvor mange cykler der skal anvendes i PCR-reaktionen i forhold til startkoncentrationen af DNA i prøvematerialet. Antal mål-sekvenser Antal cykler 300.000 25-30 15.000 30-35 1000 35-40 50 40-45 Udregning af antal kopier af DNA-template i prøvematerialet I det humane genom er der 3 x 10 5 kopier DNA i 1 µg oprenset DNA. (McPherson& Møller, 2006, s. 16) Konc. for DNA 50 ng/µl 3 µl x 50 = 150 ng i 3 µl => 0,15 µg => 3 x 10 5 kopier i 1 µg => (3 x 10 5 )/ 0,15 = 2.000.000 = 2 x 10 6

Bilag 3 Anvendte reagenser og apparaturer Reagens/apparatur LOT-nr. Fabrikant Opbevaring Det rene rum: PCR dntp(100 mm solution ph 7,5) datp dttp dctp dgtp Batch 348639 Batch 348642 Batch 348640 Batch 348641 Amersham Biosciences Primere [10 µmol/l] Primer 1 Forward 13-5281-57/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 1 Reverse 13-5281-58/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 2 Forward 13-5281-60/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 2 Reverse 13-5281-59/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 3 Forward 13-5281-62/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 3 Reverse 13-5281-61/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 4 Forward 13-5281-63/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 4 Reverse 13-5281-64/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 5 Forward 13-5281-66/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 5 Reverse 13-5281-65/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 6 Forward 13-5281-67/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 6 Reverse 13-5281-68/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 7 Forward 13-5281-69/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 7 Reverse 13-5281-70/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 8 Forward 13-5281-72/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 8 Reverse 13-5281-71/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 9 Forward 13-5281-74/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 9 Reverse 13-5281-73/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 10 Forward 13-5281-75/77 MWG-Biotech AG Frys Primer 10 Reverse 13-5281-76/77 MWG-Biotech AG Frys HotStar Taq polymerase 130175267 Qiagen Quality Frys [5 U/µL] MgCl2 25 mm 130177488 Qiagen Quality Q solution 5x 130179120 Qiagen Quality PCR Buffer 10x 130179954 Qiagen Quality MilliQ vand Eppendorfrør 0,6 ml 071026-119 Eppendorf Eppendorfrør 0,2 ml Eppendorf LAF bænk apparat nr. 73594 Holten LaminAir Finnpipette 0,2-2 µl H19705 Labsystems Finnpipette 0,5-10 µl F05688 Labsystems Finnpipette 5-40 µl D38759 Labsystems Finnpipette 40-200 µl C37945 Labsystems

Vortexer serie nr. 2-82355 Scientific Industries Thermocycler serie nr. 73584 Eppendorf Thermocycler serie nr. EW 7526 MJ Reseach Reagens/apparatur LOT-nr. Fabrikant Opbevaring Elektroforeserum: Elektroforese SeaKem LE agarosa 93913 Lonza 18-26 C NuSieve agarose AG035L Lonza 18-26 C TBE buffer x10 130179954 H:S Apotek Reagensafdeling BBH GelStar Stain 18B2-2c BMA BioWhittaker -20 C Molecular Applications Gel Loading Mix (GLM) loadingbuffer 20337 MBI Fermentas -20 C Markør - 100 bp Plus DNA Ladder Plus Automatisk pipette 2-20 µl 28313 Fermentas Lifescience K0506792A Rainin Finnpipette 5-40 µl B88081 Labsystems Finnpipette 5-100 µl P82037 BioHT Proline Konisk kolbe Støbeform og kam Elektroforesekar serie nr. 013710 Apollo instrumentation Elektroforesekar 0350ECA Midicell EC350 Vægt 2905114 Sartorius Mikrobølgeovn KKHH nr. 92 Whirlpool Image VDS Camera serie 9805-E- Pharmacia Biotech 706 Strømkilde serie Biorad 283BR10073 Strømkilde serie 283BR19511 Biorad Reagens/apparatur LOT-nr. Fabrikant Opbevaring

Det urene rum: Capture buffer type 2 363113 GE Healthcare 20-25 C Oprensning Wash buffer type 1 363114 GE Healthcare 20-25 C 96 % ethanol 1.009.711.000 Merck KgaA GFX søjle 367.823 GE Healthcare Opsamlingsrør 406.158 GE Healthcare Eppendorfrør 1,5 ml D-028-2 Eppendorf Finnpipette 5-40 µl 84692 Labsystems Finnpipette 0,5-10 µl E88331 Labsystems Mikrocentrifuge Apparatnr. 72835 Heraeus Instruments Mikrocentrifuge Apparatnr. 73326 Heraeus Instruments Fældning af sekvens-pcr Reagens/apparatur LOT-nr. Fabrikant Opbevaring Natriumacetat (NaOAc) 3M ph 5,2 H:S Apotek Reagensafdeling BBH 96 % ethanol 1009711000 Merck KgaA 70 % ethanol: 96% Køleskab ethanol fortyndes med vand MilliQ vand Finnpipette 40-200 µl B80051 Labsystems Finnpipette 100-1000 µl N68764 Thermo Labsystems Eppendorf Centrifuge 5810 serie nr. 5810-02602 Eppendorf Reagens/apparatur LOT-nr. Fabrikant Opbevaring Sekventering Big Dye Terminator v 3.1 810068 AB APLied Biosystems 5x seq buffer 811158 AB APLied Biosystems Primer 1,6 pmol/μl MilliQ vand Plade - Optical 96-Well N801-0560 MicroAmp Reaction Plate Eppendorfrør 0,2 ml Genetic analyzer - ABI PRISM, 3130x apparat nr. 72885 AB APLied Biosystems -15-25 C 2-8 C

Bilag 4: Liste over primære og sekundære prøvenumre Denne tabel viser prøvenumre og tilhørende fasteglukoseværdi. Første kolonne viser numrene på de oprindelige prøver, hvorefter 4 af disse udgik og blev erstattet af 4 nye, som ses i anden kolonne med prøvenumre. De udgåede prøver er mærket med mørk grå farve. Prøvenummer Mmol/L Prøvenummer Mmol/L 22 14,1 127 15,5 26 14,8 131 15,6 32 14,5 431 15,6 41 15,1 471 15,3 42 15,2 56 14,8 83 14,8 100 14,9 180 15,1 252 14 293 14 314 14,5 356 14,9 418 14,8 523 14,9 Tabel over sekundært prøvemateriale, som anvendes til udførelse af temperaturgradienter. Prøverne er vist med prøvenummer og tilhørende fasteglukoseværdi. Prøvenummer Mmol/L 2 8,7 31 8,8 105 8,8 140 8,8 163 8,8 224 8,7 299 8,8 323 8,7 384 8,8 389 8,8 426 8,7 469 8,8

Bilag 5 Primeroversigt inklusiv det nye primersæt til exon 6

Bilag 6: Primernes placering i forhold til de 10 exons

Bilag 7 Oversigt over sekventeringsresultater Prøve 22 exon 2

Prøve 22 exon 3

Prøve 22 exon 7

Prøve 26 exon 3

Prøve 26 exon 7

Prøve 32 exon 2

Prøve 32 exon 3

Prøve 32 exon 7

Prøve 41 exon 2

Prøve 41 exon 3

Prøve 41 exon 7

Prøve 42 exon 2

Prøve 42 exon 3

Prøve 42 exon 4 Prøve 42 exon 5

Prøve 42 exon 7

Prøve 83 exon 2

Prøve 100 exon 2

Prøve 100 exon 7

Prøve 131 exon 1

Prøve 131 exon 2

Prøve 131 exon 3

Prøve 131 exon 7

Prøve 252 exon 2

Prøve 252 exon 3

Prøve 252 exon 7

Prøve 293 exon 3

Prøve 293 exon 7

Prøve 314 exon 2