Optimering af Real-time High Resolution Melt analyse til detektion af H275Y i Influenza A

Transkript

1 Optimering af Real-time High Resolution Melt analyse til detektion af H275Y i Influenza A Af Sacha Piil Haagensen Modul 14 Professionsbachelor 2014 Bioanalytikeruddannelsen K-vejleder: Bioanalytikerunderviser Janne Føns Møller I-vejleder: Bioanalytikerunderviser Charlotte Birk Olsen Laboratoriepartnere: Camilla Lundsgaard Jensen, Rajan Hassani Antal anslag: Antal sider: 68 Billede er den lokaliseret på:

2 Resumé Baggrund På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Slagelse Sygehus er der blevet behov for en analyse, der kan detektere mutationen H275Y i Influenza A virus. Derigennem vil immunsupprimeret patienter ikke risikere at modtage det antivirale stof Oseltamivir, hvis de er smittede med en Influenza der indeholder resistensmutationen. Formål Formålet med nærværende studie er at opsætte og optimere Real-time High Resolution Melt så analysen i fremtiden vil kunne anvendes til detektion af mutationen H275Y hos Influenza A. Materiale og metode Der blev anvendt 21 Influenza A prøver fra henholdsvis Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Slagelse Sygehus og Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Odense Universitets Hospital, samt 2 Influenza B prøver og 1 negativ Influenza prøve. Forskellige primersæt og unlabeled prober er med Real-time High Resolution Melt(HRM) blevet anvendt til detektion af H275Y, mens konventionel PCR blev anvendt til PCR optimering og gelelektroforese til visualisering af PCR-produkter. Derudover blev prøverne sendt til sekventering, som blev benyttet som referencemetode. Resultater Primersættene blev optimeret gennem forskellige temperaturgradienter, primermængde og annealingstid. Efter optimering var alle uspecifikke produkter forsvundet, hvorefter forsøget blev gentaget som Real-time HRM, der viste en non-target mutation i prøve 3. Ingen af prøverne indeholdte mutationen H275Y. Dette blev bekræftet af sekventeringen. Konklusion Gennem nærværende studie er det bevist at Real-time HRM kan detektere enkeltbase mutationer i Influenza A H1N1 prøver. Derimod er der brug for yderligere optimering for at opnå tilfredsstillende smeltekurver og flere prøver for en fuldstændig validering af Real-time HRM, så den i fremtiden vil kunne benyttes i en rutinesammenhæng. 1

3 Indholdsfortegnelse Resumé... 1 Baggrund... 1 Formål... 1 Materiale og metode... 1 Resultater... 1 Konklusion... 1 Forord Introduktion Baggrund Problemformulering Influenza A virus og resistens Real-time PCR High Resolution Melt (HRM) Sekventering Metodiske overvejelser Materiale og metode Prøvemateriale Apparatur Reagenser Primerdesign og afprøvning Fremstilling af cdna Delforsøg 1: Real-time HRM Optimering af annealingstemperatur Optimering af primerpar1 og annealingstiden Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Aflæsning og fortolkning af resultater Resultater Delforsøg 1: Real-time HRM Optimering af annealingstemperatur

4 3. 3 Optimering af primerpar1 og annealingstiden Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Sekventering Diskussion Delforsøg 1: Real-time HRM Optimering af annealingstemperatur Optimering af primerpar1 og annealingstiden Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Præparation af prøvemateriale RNA-måling Primer og probedesign Benyttelse af Oseltamivir Real-time HRM som en rutinemetode Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag 1: Oversigt over anvendte prøver Bilag 2: MultAlin resultat Bilag 3: Mied base codes Bilag 4: Quick Guide til RNA-koncentrationsmåling på Eperion System Bilag 5: Godkendte og frasorterede prøver fra det indledende HRM forsøg Bilag 6: HRM kurver fra det indledende HRM forsøg Bilag 7: Gelbillede resultater fra indledende HRM forsøg Bilag 7.1: Gelbillede resultater fra optimeringsforsøg Bilag 7.2: Gelbillede resultater fra optimeret HRM forsøg Bilag 8: Skematisk oversigt over gelbillede resultater Bilag 9: Godkendte og frasorterede prøver ved det optimerede HRM forsøg Bilag 10: RNA koncentrationsmålinger Bilag 11: Sekvensanalyse med primerpar1 og primerpar Bekræftelse for udfærdigelsen af den skriftlige besvarelse Analyseskema

5 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet i perioden uge til uge og som besvarelse på modul 14: Professionsbachelorprojekt på Bioanalytikeruddannelsen. Jeg vil gerne give en stor tak til alle som har hjulpet mig igennem dette projektforløb. En tak til alle på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Slagelse Sygehus for interessen omkring projektet og tålmodigheden i forhold til benyttelse af rutineapparaturer og lange arbejdsdage. En særlig tak til afdelingens molekylærbiolog Tina Vasehus Madsen og adjunkt, cand., scient. Kim Blanksø Pedersen fra for besvarelse af de endeløse spørgsmål og deres store engagement i projektet. En stor tak skal også lyde til mine hjælpsomme vejledere bioanalytikerunderviser Janne Føns Møller og bioanalytikerunderviser Charlotte Birk Olsen, der altid var klar til at dæmpe panikken og tænkte rationelt i vanskelige situationer. Til sidst vil jeg gerne takke mine to samarbejdspartnere Camilla Lundsgaard Jensen og Rajan Hassani for god støtte og godt samarbejde. 4

6 1. Introduktion Baggrund Influenza A virus inficerer hvert år 5 millioner mennesker og medfører, gennem følgesygdomme, dødsfald på verdensplan heraf i Danmark (1). Influenza A er en sæsonvirus som forekommer i perioden november til marts og inddeles i subtyper, afhængig af dets glykoproteiner hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). På nuværende tidspunkt er der registreret 17 HA subtyper og 10 NA subtyper (2). Influenza A medfører i gennemsnit fire pandemier hvert århundrede, der defineres som en sygdom, der har spredt sig over flere verdensdele, mens en epidemi er når antallet af syge fordobles i løbet af en uge i et geografisk afgrænset område (3). Gennem tiden har flere pandemier med Influenza A fundet sted. I 1918 døde 50 millioner af subtypen H1N1 (Den Spanske Syge), i 1957 kom subtypen H2N2, i 1968 H3N2 og i 2009 kom en ny variant af H1N1, nemlig H1N1 v09, der blev kendt som svineinfluenzaen (1). Når Influenzavirus danner nye subtyper skyldes det, at virus kan ændre sin molekylestruktur ved mutationer eller når typer fra svin, fugle og mennesker bliver blandet sammen (4). Dannelsen af H1N1 v09 kan betegnes som antigenisk-shift, da der skete en blanding med svinevira. Når to Influenza virus inficerer den samme celle på en gang, kan der ske blanding af gener under replikationen. Derved opstår en ny subtype som kan indeholde dyrevira. Hvis disse typer vira bliver introduceret til en population, som ikke før har været inficeret med typen, kan dette lede til en pandemi (5). Når nye mutationer dannes, kan der udvikles resistens overfor antivirale stoffer som Oseltamivir og Zanamivir, der tilhører gruppen neuraminidasehæmmere (NAI). Når virus frigives fra værtscellen spalter NA sialinsyren på glykoproteinerne, men ved tilstedeværelse af NAI blokeres spaltningen og virus frigives ikke. Mutationen H275Y medfører resistens over for Oseltamivir, så NA ikke længere blokeres (6). Behandling med Oseltamivir reducerer sygdomsperioden med 1 døgn for den sygdomsramte men ved tilfælde af resistens overfor Oseltamivir, benyttes Zanamivir som alternativ (7). I Influenzasæsonen sås stigende antiviral resistens, med op til 25 % resistente stammer i Europa, som følge af H275Y i NA genet (8). Punktmutationen benævnes både H274Y og H275Y, hvilket afhænger af nummereringsmetoden (9). 275 er aminosyrepositionen H til Y mens 823 er basepositionen C (vildtype) til T (mutation) (10). I sæsonen steg forekomsten af Oseltamivirresistente stammer op til 90 % (8). I sæsonen skete der en ændring, da der opstod den nye variant af H1N1, (H1N1) v09, og resistens overfor Oseltamivir antageligt forsvandt. Ved antiviral behandling ændrer virus omgivende miljø, derfor vil præmissen for virus replikationsevne også ændre sig. Hvor det før var vildtypen, der replikerede sig bedst, er det nu varianter, som bærer 5

7 mutationen, der muliggør replikation i tilstedeværelse af antiviralt stof (11,12). Hvis man derimod fjerner tilførslen af antiviralt stof, vil de resistente stammer ikke være de dominerende varianter længere (13). På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse Sygehus (KMA SLS) diagnosticeres der for Influenza A, Influenza A(H1N1) v09 og Influenza B. Da KMA SLS ikke har mulighed for at foretage resistensundersøgelser, sendes disse til Statens Serum Institut (SSI). SSI analyserer prøven for den pågældende punktmutation H275Y, men da det ikke er en rutineanalyse, kan svartiden være op til 10 dage og analysen koster 1947 kr. (14). Patienter, der kan have brug for antiviralbehandling, er oftest immunsupprimerede og kan have nedsat lungefunktion, hjerte-kar sygdomme, diabetes eller svækket immunsystem som følge af kræft. Da Oseltamivir skal gives indenfor 48 timer efter symptomdebut, har disse patienter brug for hurtig, effektiv behandling (7). Det kan derfor være en fordel, at KMA SLS selv kan udføre resistensundersøgelse for Influenza. Ud fra udviklingen af Influenza A H1N1 er det interessant, at undersøge, om prøvemateriale fra sæson alle besidder Oseltamivir-resistens mutationen. Derudover også i hvor stor udstrækning mutationen findes i den nye variant (H1N1) v09 i prøverne fra sæsonen Endvidere vil resistensbestemmelse af H1N1 v09 være relevant i sammenhæng med fremtidens måske stigende Oseltamivirresistens. Fokus i denne opgave er, at optimere et Real-time HRM forsøgsdesign, så der i fremtiden vil kunne opsættes en rutinemetode for afdelingen KMA SLS, til detektion af mutationen H275Y i Influenza A virus Problemformulering Hvordan kan Real-time High Resolution Melt opsættes og optimeres således, at analysen i fremtiden vil kunne anvendes til detektion af mutationen H275Y hos Influenza A? Influenza A virus og resistens Influenza A virus er en human patogen virus, der giver ophav til influenza, som er en luftvejsinfektion. Influenzavirus er en kugleformet partikel med en diameter på nm. Figur 1 viser opbygningen af Influenzavirus. Yderst er en dobbelt lipidmembran, hvorunder matriproteinet M1, der omkranser virusgenomet ligger (15). I lipidmembranen sidder matriproteinet M2, der fungerer som en ionkanal og dermed forbinder det indre af virus med det ydre. På overfladen af lipidmembranen, sidder hæmaglutinin (HA) og neuraminidase (NA) proteinerne (15). 6

8 Figur 1 (16): Influenza A virus opbygning. Under lipidmembranen ligger matriproteinet M1, mens matriproteinet M2 sidder i lipidmembranen og fungerer som en ionkanal. Yderst sidder proteinerne hæmaglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Inderst findes viralt RNA. Genomet består af otte gensegmenter opbygget af negativt enkeltstrenget RNA. Seks af segmenterne koder for et protein, mens de to sidste segmenter koder for to proteiner (17). HA og NA er overfladeglykoproteiner, der fungerer som virale antigener. HA binder til værtscellen og spaltes derefter til to mindre proteiner HA1 og HA2. NA er ansvarlig for at frigøre virus fra værtscellen efter infektion (17). M1 og M2 er matriproteiner, der sammen danner segment syv. M1 er det centrale i virus membranen og medvirker ved replikationen, mens M2 fungerer som en ionkanel og hjælper ved RNA frigivelse (17). Når virus inficerer en celle, binder HA til sialinsyreholdige glykoproteiner på værtscellens overflade (18). Dette muliggør fusion af viruspartikel og værtscelle og ved hjælp af endocytose kommer virus ind i cellen. Inde i cellen frigives viralt RNA ved hjælp af M1 og M2, som nedbryder virus membranen. Herefter sker transskription i cellekernen, hvorefter det nye virus RNA transporteres til lipidmembranen. Den nye viruspartikel frigives fra lipidmenbranen ved afsnøring. Den har HA på overfladen, hvorfor den forbliver bundet til lipidmembranen på grund af sialinsyren på overfladen. NA spalter sialinsyren fra glykoproteinerne på celleoverfladen, hvorved HA ikke kan bindes til celleoverfladen længere. Dermed frigives den dannede viruspartikel fra værtscellen og kan inficere nye celler (15,18). Når man vælger at behandle influenza hos en patient, skyldes det ofte, at patienten er immunsvækket. Ved behandling med antivirale stoffer anbefaler Sundhedsstyrrelsen derfor lægerne, ikke at udskrive antivirale stoffer til personer, som ikke er i risikogruppen for at undgå at skabe resistens (19). Den molekylære ændring af Influenza gør det kompliceret, at tilrettelægge en god behandling for patienter med influenza. Der findes forskellige stoffer til behandling af Influenza 7

9 hvor de mest anvendte er Oseltamivir og Zanamivir. Stofferne hæmmer aktiviteten af NA-enzymet (20) Real-time PCR PCR er en metode til at detektere DNA, ved at amplificere target DNA. Én amplifikation kaldes en cycle og består af tre trin: 1. Denaturering, 2. Annealing og 3. Etension. De tre trin gentages flere gange (amplifikation), hvorved man får dannet store mængder af det ønskede DNA (21). Ved Realtime PCR anvendes samme princip, dog kan der inkorporeres en probe, der kan udsende lys, ved brug af en fluorokrom der er bundet til proben. Proben er fremstillet, så den er specifik for et lille stykke DNA i det område man amplificerer. Under etension-trinnet i PCR, klippes proben i stykker ved hjælp af eonukleaseaktivitet. Når proben nedbrydes udsendes der fluorescerende lys. Fluorescenssignalet er direkte proportionalt med mængden af PCR-produkt i reaktionen (22). Der findes mange forskellige typer prober, både specifikke og uspecifikke. Valg af probe er afhængig af den pågældende analysemetode, og hvilken mutation man vil detektere. I nærværende studie benyttes unlabeled prober, som har den fordel, at de er specifikke til enten vildtypen eller mutanten (i dette tilfælde mutanten) og har en blokeret 3 ende således, at den forbliver bundet til DNAstrengen og ikke klippes i stykker af polymerasen undervejs i amplifikationen (23). Unlabeled prober udsender ikke fluorescerende lys, som for eksempel Taqman-prober. Når en unlabeled probe benyttes, kan man anvende fluorescerende reagens som SsoFAST EvaGreen. Taqman-prober er specifikke og udsender et lys, når proben klippes i stykker under amplificeringen. Resultatet af en Real-time PCR er en amplifikationskurve, hvor der på -aksen ses antal cycles og på y-aksen fluorescensniveauet. Ved analysering af data, beregnes en threshold (cut-off), hvorfra amplifikationskurven bedømmes. Threshold kan indstilles manuelt, men bliver ofte beregnet af softwaren ud fra kurverne. En amplifikationskurve er positiv, når den kommer over threshold. Alt der ligger under threshold er baggrundsfluorescens. I det punkt hvor kurven skærer threshold kaldes Ctværdien, altså ved hvilken cycle prøven bliver positiv, se figur 2 (21). Figur 2 (24): Real-time PCR kurve. Threshold er linjen som afskiller baggrundsfluorescens fra positive prøver. CT er punktet hvor prøven s fluorescens skærer threshold. Den eksponentielle fase er hvor prøven amplificeres og plateau fasen er hvor reaktionen flader ud og løber til ende. 8

10 1. 5. High Resolution Melt (HRM) Når man kobler HRM på sin Real-time PCR, så får man også en smeltepunktsanalyse som især er god til at detektere punktmutationer som H275Y. Som udgangspunkt er teorien bag HRM bygget på, at PCR-produkter vil give forskellige smeltepunkter afhængig af nukleotidsekvensen. Vildtype-DNA vil give et smeltepunkt, mens mutant-dna giver et andet smeltepunkt. I HRM benyttes en gradient, hvor man øger temperaturen gradvist med 0,2 C, hvorefter temperaturen får lov til at stabilisere sig i ca. 5 sekunder. Når man foretager en langsom temperaturstigning, vil dobbeltstrenget DNA langsomt skilles ad, så selv enkelt-basemutationer vil medføre fald i smeltepunkt (10,25). Nogle mutationer er sværere at detektere end andre, da de giver et mindre fald i smeltepunktet, så de er svære at adskille fra vildtype-dna. Mutationer deles op i Single Nucleotide Polymorphisme (SNP) klasser, der indeholder forskellige enkeltbase mutationer. Mutationerne C til T, T til C, G til A og A til G tilhører klasse I, mens mutationerne A til T og T til A tilhører klasse IV. Klasse I er mutationer som giver størst ændring i smeltepunktet, mens klasse IV er mutationer som giver mindst ændring og derfor er sværest at detektere (26). For at opnå en succesfuld HRM, er der nogle forholdsregler, der kan tages. Primerne skal have en meget specifik binding, så de giver et enkelt PCR-produkt ved gelelektroforesen. Ellers vil der ikke kunne konkluderes om smeltepunktsforskelle skyldes mutation eller uspecifikke PCR-produkter (26). Derudover vil et mindre PCR-produkt (50 bp) give større forskelle i signal på en bestemt temperatur, så det visuelt er nemmere at vurdere smeltepunkter. Resultatet af HRM består blandt andet af en smeltekurve og en differenskurve. Smeltekurven viser fluorescens på y-aksen og temperatur på -aksen og består af tre faser. Præ-smeltefasen, hvor DNA er dobbeltstrenget, smeltefasen hvor DNA skifter fra dobbeltstrenget til enkeltstrenget og postsmeltefasen, hvor DNA er enkeltstrenget. Temperature of Melting (Tm) repræsenterer det punkt, som ligger midt på smeltekurven i smeltefasen og dermed kurvens smeltepunkt, se figur 3 (26). Figur 3 (27): Smeltekurve. Den farvede kasse repræsenterer området hvor DNA skifter fra dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget DNA. Midt på kurven ligger punktet Tm, som betegner kurvens smeltepunkt. 9

11 Som et resultat af en HRM analyse, kan softwaren også beregne en differenskurve, som samler alle kurverne i grupper efter dem, som ligner hinanden mest i Tm. Derefter vælges den største gruppe af prøver, som de andre prøver trækkes fra. Man benytter derfor den største gruppe som referencegruppe og ser på forskellen mellem dem og de andre prøver (26) Sekventering I nærværende studie anvendes sekventering som referencemetode og udføres hos GATC Biotech i Tyskland, der udfører Sangersekventering. Sekventering er en dyr, tidskrævende men effektiv metode hvor der benyttes specielle nukleotider, der har en kemisk anderledes struktur end det oprindelige DNA. Disse nukleotider, ddntp (dideoiribonukleotid), er fluorescensmærket og forskellige fra de oprindelige dntp (deoiribonukleotid) ved, at de mangler OH-gruppen, der muliggør binding til et nyt nukleotid. Under etension, hvor polymerasen begynder at syntisere DNAstrengen, vil den stoppe, når den kommer til en ddntp. Det er tilfældigt, hvor ddntp inkorporeres, så der dannes fragmenter med mange forskellige nukleotidlængder. Alle nukleotiderne har, gennem deres fluorokrom, forskellige bølgelængder, hvilket kan måles med en laser. Dermed kan man aflæse DNA sekvensen (21) Metodiske overvejelser Problemformuleringen blev besvaret gennem et kvalitativt eksperimentelt retrospektivt studie, hvor det blev undersøgt, om mutationen H275Y var til stede i Influenza A prøverne. Mutationen H275Y er valgt, da den koder for Oseltamivirresistens, hvilket er væsentligt fra et patientorienteret perspektiv. Der blev analyseret 21 prøver, hvoraf 9 af dem var fra KMA SLS og 12, der blev sendt fra Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Odense Universitetshospital (KMA OUH). Prøverne fra KMA SLS var fra influenza sæsonen mens KMA OUH prøverne var fra sæsonen. Til studiet blev der benyttet tre forskellige primersæt, hvor primerpar1 er blevet beskrevet af Lee H.K. et al. (28), primerpar2 af Arvia R. et al. (29) og primerpar3 af Tong S.Y.C. et al. (10). Derudover er forskellige forsøgsdesign anvendt, hvoraf forsøgsdesign 1 er blevet beskrevet af Tong S.Y.C. et al. (10) og forsøgsdesign 2 af Lee H.K. et al. (28). Dette blev foretaget, for at kunne vurdere hvilket forsøgsdesign, der var det bedste til at detektere resistensmutationen hos influenza A virus. Dog blev der foretaget ændringer af forsøgsdesignene undervejs, da alle forhold ikke kunne gengives som beskrevet. Primerne var designet specifikt for influenza A (H1N1) v09 med mutationen H275Y og baseret på sekvensen af NA-genet fundet på National Center of Biotechnology Information (GenBank GU ) (30). Prøverne blev først oprenset, derefter analyseret på Real-time PCR apparaturet 10

12 CFX96 Touch TM med tilhørende smeltepunktanalyse på. For at sikre, at alle mutationer blev fundet, blev sekventering benyttet som referencemetode. Dette blev udført ved at sende prøverne til GATC Biotech i Tyskland, som benyttede en 96-kapillær ABI sekvenator. Derefter blev resultaterne sammenlignet og forsøgsdesignene optimeret, så de i fremtiden vil kunne benyttes i en rutinesammenhæng. Derudover blev konventionel PCR også anvendt til påvisning af produktlængder og primereffektivitet. Udover prøver fra forskellige Influenzasæsoner, blev en negativ kontrol også anvendt som test for kontaminering. Til negativ kontrol blev DNAse- og RNAsefrit vand (PCR-vand) anvendt. Der var ingen etiske problemstillinger forbundet med projektet, da prøverne allerede var taget til det formål at undersøge for Influenza. Prøverne blev blot genanalyseret. Af økonomiske årsager er der kun benyttet Real-time HRM til to forsøg, mens alt optimeringen er foretaget som konventionel PCR. Det medfører, at der er benyttet forsøgsdesigns på det konventionelle PCR udstyr, som herefter overføres til Real-time HRM. Det mest korrekte er, at optimere forsøgsdesignene direkte på Real-time HRM, men dette er ikke en mulighed, på grund af økonomi og lokalitetsvanskeligheder. For at forbedre kvalitetssikringen af metoden, kan der benyttes positive kontroller i form af positive influenza prøver indeholdende resistensmutationen H275Y. Dermed kan Real-time HRM detektere mutationen, og derigennem undersøge, hvilke andre prøver, som har samme smeltepunkt, og derfor også mutationen. De nævnte parametre ville have forbedret kvaliteten af forsøget, men på grund af den begrænsede tidshorisont i nærværende studie, har dette ikke været muligt. 2. Materiale og metode 2. 1 Prøvemateriale Til forsøget blev der anvendt 21 positive Influenza A H1N1 virusprøver, heraf 9 prøver fra KMA SLS og 12 prøver fra KMA OUH samt 2 Influenza B og 1 negativ Influenza prøve (bilag 1, tabel 7). Alle prøver var tidligere diagnosticeret ved molekylærbiologiske metoder. Prøvematerialet fra KMA Slagelse Sygehus (SLS) var podninger fra nasopharyn eller luftvejssekret, mens materialet fra KMA Odense Universitetshospital (OUH) var af ukendt oprindelse. Prøverne fra KMA SLS blev indsamlet i Influenzasæsonen , og prøverne fra KMA OUH i Influenzasæsonen Alle prøverne var nedfrosset i Universal Transport Medium (UTM) ved - 80 C. KMA OUH prøverne blev sendt ved stuetemperatur og ved modtagelse blev prøverne frosset ned ved - 80 C. RNA blev 11

13 oprenset fra 250 µl prøvemateriale på NucliSENS easymag og der blev elueret i et totalvolumen på 60 µl Apparatur NucliSENS easymag fra BioMérieu blev anvendt til oprensning af RNA. Til cdna-fremstilling og konventionel PCR blev Veriti 96-well Thermocycler fra Applied Biosystem anvendt. Forinden HRMforsøgene blev der udført RNA koncentrationsmåling på Eperion System fra Bio-Rad (cat. no ) og Real-time HRM blev foretaget på CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System fra Bio- Rad på (UCSJ). Udvidet smeltekurveanalyse blev udført i Precision Melt Analysis TM Software fra Bio-Rad. QIAcel Advanced System fra Qiagen blev anvendt til analysering af PCR-produkter. Til visualisering af PCR-produkternes størrelse blev QIAcel Screengel fra Qiagen benyttet. Prøverne blev sendt til sekventering hos GATC Biotech (Tyskland). Sekvensanalyse blev udført ved hjælp af CLC Main Workbench version 6 fra CLC bio Reagenser Eperion RNA StdSens Analysis Kit (Bio-Rad; cat. no eller ) blev anvendt til RNAkoncentrationsmåling. Til fremstilling af cdna blev iscript TM cdna Synthesis Kit (Bio-Rad; cat. no ) anvendt. QuantiFAST Multiple PCR + R Kit (Qiagen; cat. no ) blev brugt til alt konventionel PCR, mens SsoFAST TM EvaGreen Supermi (Bio-Rad; cat. no og ) blev benyttet til Real-time HRM. De anvendte primere og proben var fra Eurofins MWG Operon (Tyskland). Til fortyndinger af diverse reagenser og som kontamineringskontrol blev nukleasefrit vand (PCR-vand) benyttet Primerdesign og afprøvning Primerpar1 og proben, se tabel 1, blev designet ud fra artiklen af Lee H.K. et al. (28) Primerpar2 og primerpar3 blev designet ud fra artiklerne af henholdsvis Arvia R. et al. (29) og Tong S.Y.C. et al. (10) Sekventeringsprimere blev designet ved hjælp af primerblast. Programmet blev sammen med Primer3 brugt til at undersøge for primer-dimer, og for at se, om primerne også matchede Influenza A non-h1n1 subtyper og Influenzavirus B. Programmet Oligo Analyzer blev anvendt til at finde primernes og probens længde og smeltepunkt (T m ). Endvidere blev programmet MultAlin (bilag 2) anvendt til at undersøge om sekventeringsprimerne lå i et konserveret område i NA-genet. Reverse primeren lå i et ikke-konserveret område og derfor blev der designet en modificeret udgave ved at inkorporere mied base codes (se tabel 1 og bilag 3). 12

14 Tabel 1: Anvendte primer- og probesekvenser, deres produktlængder og T m. Primere Sekvens Produkt længde T m Forward primer1 Reverse primer1 5 -CAAGTGATGGACAGGCCTCATAC-3 5 -ATGCCAGTTATCCCTGCACAC bp 57,5 C 57,7 C Unlabeled probe 5 - GGAGCATTCCTCATAGTAATAATTAGGGGC(C3 Spacer)-3 58,4 C Forward primer2 Reverse primer2 5 -ATGACCGATGGACCAAGTGA-3 5 -ACTAGAATCAGGATAACAGGAGC bp 56 C 53,7 C Forward primer3 Reverse primer3 5 -GTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTAT-3 5 -GGATAACAGGAGCATTCCTCATAGT-3 59 bp 58,9 C 56,1 C H1N1_Seq_F H1N1_Seq_R H1N1_Seq_Rmod a 5 -TGAGTCAGTCGCTTGGTCAG-3 5 -CTGTCCCAGTCCATCCGTTC-3 5 -GTCCATCCRTTMGGATCCCAAATCATCTC bp 612 bp 59,68 C 60,11 C 58,5-62 C a Ved den modificerede reverse primer H1N1_Seq_Rmod, er mied base angivet med rødt. a R = A/G og M = A/C (bilag 3, figur 13) (31). De frysetørrede primerstocks og den unlabeled probe blev opløst med PCR-vand efter producentens medfølgende anvisning. Ud fra primerstockopløsningerne blev der fremstillet primerfortyndinger med koncentrationen 10 µm ved at overføre 10 µl primer til 90 µl PCR-vand. Samme procedure blev anvendt for probestockopløsningen. Ud fra fortyndingerne blev der fremstillet primermi med hvert primerpar ved at blande 10 µl forward primer med 10 µl reverse primer og 80 µl PCR-vand. Primerne blev testet på Influenza A-(H1N1) v09 (prøve 1 og 2), Influenza B (prøve 22 og 23) og en negativ Influenza (prøve 24) (bilag 1, tabel 7). 5 µl RNA-eluat blev blandet med QuantiFAST Multiple PCR + R Kit samt de enkelte primerpar. PCR-reaktionerne blev amplificeret på Veriti 96-well Thermocycler og efterfølgende analyseret på QIAcel Advanced System. Det resterende prøvemateriale blev frosset ved - 80 C og eluatet blev efterfølgende frosset ned ved -20 C Fremstilling af cdna cdna blev fremstillet ved hjælp af two-step reverse transkriptase, hvortil iscript TM cdna Synthesis Kit blev anvendt. Per reaktion blev der anvendt 4 µl 5 iscript reverse transcription supermi, 1 µl iscript reverse transcriptase, 10 µl PCR-vand samt 5 µl RNA, hvilket gav et totalvolumen på 20 µl. Reaktionen blev opvarmet på Veriti 96-well Thermocycler efter anvisning fra Bio-Rad (se tabel 2). cdna blev fremstillet på KMA SLS ud fra det ekstraherede RNA, lige efter oprensningen. Det 13

15 fremstillede cdna blev efterfølgende opbevaret ved 4 C, indtil det blev transporteret til UCSJ, for Real-time HRM analyse. Tabel 2: PCR-protokol til fremstilling af cdna fra Bio-Rad (32). Step Priming Reverse transcription (RT) RT inactivation Temperatur/tid 25 C i 5 min. 42 C i 30 min. 85 C i 5 min. Nedkøling 4 C 2. 6 Delforsøg 1: Real-time HRM Før hvert Real-time HRM forsøg blev der fortaget RNA-koncentrationsmåling af eluatet på Eperion Automated Electrophoresis Station. Til koncentrationsmålingen blev der anvendt Eperion System og denne blev udført efter producentens medfølgende Quick Guide (bilag 4). Til begge HRM forsøgsdesigns blev der arbejdet med et totalvolumen på 20 µl. cdna udgjorde 5 µl og SsoFAST TM EvaGreen Supermi 10 µl af totalvolumen, mens der blev anvendt varierende volumener af primerpar, probe og PCR-vand. Til primerpar2 og 3 blev der anvendt 1 µl af hver primer (10 µm) og 3 µl PCR-vand. Til primerpar1 blev der anvendt 0,5 µl forward primer (10 µm), 0,4 µl reverse primer (10 µm), 0,5 µl unlabeled probe (10 µm) og 3,6 µl PCR-vand. Forsøgsdesign 1 blev afprøvet med primerpar3, mens forsøgsdesign 2 blev afprøvet med både primerpar1 og 2. Til begge forsøgsdesign blev følgende prøver benyttet 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 (bilag 5, tabel 8). Forsøgsdesign 1 var en Touch down Real-time PCR-metode, efterfulgt af en udvidet smeltekurveanalyse fra artiklen af Tong S.Y.C. et al. (10) (jævnfør tabel 3). Touch down processen bestod i alt af otte cycles, som hørte sammen parvis. Hver cycle i processen bestod af denaturering og annealing, hvor denatureringstemperaturen konstant var på 95 C, mens annealingstemperaturen blev sænket med 2 C hver anden cycle i temperaturintervallet C, antallet af cycles var 45. Forsøgsdesign 2 var en Real-time PCR og efterfølgende smeltekurveanalyse (HRM) fra artiklen af Lee H.K. et al. (28) (jævnfør tabel 4), antallet af cycles var 50. PCR-protokollerne blev udført på CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System. Smeltekurverne blev analyseret i Precision Melt Analysis TM Software. 14

16 Tabel 3: PCR-protokol for forsøgsdesign 1 fra Tong S.Y.C. et al. (10). Program Step Temperatur/ tid Real-time PCR Hot-start 95 C i 3 min. Touch down a 68 C 60 C Denaturering Annealing Etension 95 C i 10 sek. 68 C i 15 sek. 50 C i 20 sek. HRM Gradient (0,2 C) 69 C -90 C hold at 10 sek. a Touch down step med 8 parvise cycles, hvor hver cycle bestod af denaturing ved 95 C og annealing i temperaturintervallet C. Annealingstemperaturen blev sænket med 2 C, hver anden cycle. Tabel 4: PCR-protokol for forsøgsdesign 2 fra Lee H.K. et al. (28). Program Step Temperatur/ tid Real-time PCR Hot-start 95 C i 2 ½ min. Denaturering Annealing Etension Opvarmning Nedkøling Opvarmning 95 C i 10 sek. 60 C i 20 sek. 68 C i 25 sek. 95 C i 15 sek. 40 C i 30 sek. 55 C i 1 sek. HRM Gradient (0,2 C) 58 C -90 C hold at 10 sek Optimering af annealingstemperatur For at danne mere specifikke PCR-produkter blev annealingstemperaturen optimeret for primerpar1 og 2, ved at foretage gradient-pcr fra C og C. Der blev arbejdet med et totalvolumen på 25 µl. 5 µl cdna, 12,5 µl 2 QuantiFAST Multiple RT-PCR Master Mi, 0,25 µl QuantiFAST RT Mi, 1 µl primermi (10 µm) og 6,25 µl PCR-vand. Gradient-PCR fra C blev afprøvet med begge primerpar på prøverne 1, 2, 20 og 21 (bilag 1, tabel 7). Gradient-PCR fra C blev afprøvet med primerpar1 på prøverne 8 og 9 (bilag 1, tabel 7). Prøverne blev amplificeret på Veriti 96-well Thermocycler, som two-steps PCR med 45 cycles, se tabel 5. Efterfølgende blev PCR-produkterne analyseret på QIAcel Advanced System. 15

17 Tabel 5: Konventionel PCR-protokol fra Qiagen (33). Step Reverse transcription (RT) Hot Start Denaturering Annealing/Gradient Final etension Afkøling Temperatur/ tid 50 C i 20 min. 95 C i 5 min. 95 C i 15 sek C/60-68 C i 30 sek. (15 sek.) 72 C i 5 min. 4 min Optimering af primerpar1 og annealingstiden Efter observation af færre uspecifikke bånd ved gradient-pcr fra C for primerpar1, blev det samme opsæt afprøvet med den dobbelte primerkoncentration. Hertil blev prøverne 8 og 9 anvendt (bilag 1, tabel 7). cdna fra disse prøver blev amplificeret og analyseret som tidligere gradient-pcr ved C (se tabel 5). Annealingstiden blev afkortet til 15 sek. for at fjerne uspecifikke PCR-bånd. Den afkortede annealingstid og gradient-pcr fra C (se tabel 5) blev efterfølgende afprøvet med begge primerpar på prøverne 5 og 6 (bilag 1, tabel 7). Alle PCR-produkterne blev analyseret på QIAcel Advanced System Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Forsøgsdesign 2 blev optimeret til et two-steps program, der mindede om den konventionelle PCRprotokol (se tabel 6). Real-time HRM programmet bestod af 50 cycles. Den optimerede protokol blev afprøvet med begge primerpar og prøve 1-9 fra KMA SLS og prøve fra KMA OUH (bilag 1, tabel 7). Der blev arbejdet med et totalvolumen på 20 µl. Mastermi til primerpar1 bestod af 10 µl SsoFAST TM EvaGreen Supermi, 0,5 µl forward primer (10 µm), 0,4 µl reverse primer (10 µm), 0,5 µl unlabeled probe (10 µm), 3,6 µl PCR-vand og 5 µl cdna. Til primerpar2 blev der anvendt mastermi bestående af 10 µl SsoFAST TM EvaGreen Supermi, 1 µl af forward primer (10 µm), 1 µl af reverse primer (10 µm), 3 µl PCR-vand og 5 µl cdna. PCR-protokollerne blev udført på CFX96 Touch TM Real- Time PCR Detection System. Smeltekurverne blev analyseret i Precision Melt Analysis TM Software. Efterfølgende blev PCR-produkterne analyseret på QIAcel Advanced System. 16

18 Tabel 6: Optimeret two-steps Real-time HRM-protokol. Program Step Temperatur/ tid Real-time PCR Hot-start 98 C i 2 ½ min. Denaturering Annealing Final etension Opvarmning Nedkøling Opvarmning 95 C i 10 sek. 64, 5 C i 15 sek. 72 C i 5 min. 95 C i 15 sek. 40 C i 30 sek. 55 C i 1 sek. HRM Gradient (0,2 C) 58 C -90 C hold at 10 sek Aflæsning og fortolkning af resultater En succesfuld smeltekurveanalyse (HRM) afhænger af kvaliteten af de enkelte amplificerede PCRprodukter. En anden forudsætning er, at reaktionerne skal være nået til plateau-fasen og have en Ct på under 30 cycles (se figur 4). Ved post-pcr delen kræves det endvidere, at kurverne har nogenlunde ens fluorescens intensitet ved deres end-point (se figur 5). HRM data kan efterfølgende afbildes med en differenskurve (se figur 6), som visuelt tydeliggør forskellen i smeltekurveforløbet af de enkelte PCR-produkter. Differenskurver genereres ved at subtrahere hver kurve fra den gruppe af kurver, som ligner hinanden mest (26). Ud fra de kurver som er ens, udvælger software en reference, som den automatisk subtraherer de andre kurver fra. Smelteprofilen for et unlabeled probe assay vil indeholde to smeltepunkter (se figur 7) på baggrund af probens og produkternes forskellige længder. Probens smeltepunkt ligger i regionen C, mens produkterne smelter fra C (23). Da nogle af reaktionerne i nærværende opsæt ikke overholder disse krav, fravælges disse under databehandlingen. Figur 4 (35): Real-time kurver med Ct værdier på over og under 30 cycles. Nogle reaktioner når ikke plateau fase. Figur 5 (26): Smeltekurver med PCR-produkter, som denatureres i intervallet C. 17

19 Figur 6 (26): Differenskurver som viser tre forskellige grupper af prøver. Figur 7 (23): Normaliserede smeltepunkter i temperaturintervallet fra C. Proben smelter fra C, mens PCR-produkterne smelter fra C. 3. Resultater Resultaterne fra nærværende studie vil i dette afsnit, som følge af store mængder data, overvejende blive præsenteret som tekst sammen med udvalgte grafer og gelbilleder. For alle resultater i grafer og gelbilleder henvises der til bilag. Når der i den efterfølgende diskussion refereres til bilag, refereres der samtidig til resultatteksten i resultatafsnittet Delforsøg 1: Real-time HRM Resultaterne for forsøgsdesign 2 med primerpar 1 og proben blev genereret ved, at der blev frasorteret fire af de i alt 10 analyserede prøver (bilag 5, tabel 8). Prøverne blev frasorteret på baggrund af tidligere nævnte HRM krav, jævnfør afsnittet aflæsning og fortolkning af resultater. Resultaterne viste, at de analyserede prøver var opdelt i to grupperinger (bilag 6, figur 15), hvor prøve 1 og 2 fra KMA SLS havde det samme kurveforløb og samme end-point. Det samme var gældende for prøverne 10, 12, 13 og 18 fra KMA OUH. Gelbillederne viste, at det udelukkende var prøverne 1 og 2, som havde PCR-bånd af den forventede længde på 155 bp (bilag 7, figur 18 og bilag 8, tabel 9). Ved resultaterne fra samme forsøgsdesign 2 med primerpar2 (bilag 6, figur 16), var det udelukkende prøverne 1 og 2, som nåede plateau fasen og havde samme kurveforløb. Gelbillede resultaterne (bilag 7, figur 19 og bilag 8, tabel 9) viste, at der kun var PCR-produkter med den forventede længde på 135 bp for prøve 1 og 2. Resultaterne fra forsøgsdesign 1 med primerpar3 (bilag 6, figur 17) viste, at det igen kun var prøverne 1 og 2, som nåede plateau fasen, havde ens kurveforløb og en Ct på mindre end 30 cycles. Gelbillede resultatet for primerpar3 var blankt og data er derfor ikke vist. 18

20 3. 2 Optimering af annealingstemperatur Det var kun muligt at indstille Veriti 96-well Thermocycler til at foretage parvise temperaturstigninger, hvilket betød at brøndene 1 og 2, 3 og 4 og så videre, hørte parvis sammen og havde den samme temperatur. Dette resulterede i, at hver anden brønd i PCR-strippen ikke indeholdte cdna, derfor ses udelukkende PCR-bånd i hver anden brønd på samtlige gelbilleder. Resultaterne fra prøve 1 (bilag 7.1, figur 20 og 21) og prøve 2, (se figur 8 og bilag 7.1, figur 22 og 23) viste, at annealingstemperaturen på 63 C var bedst for både primerpar1 og 2. Der var uspecifikke produkter i lane 1-9, men disse blev tydeligt reduceret i lane 11, ved begge prøver med begge primerpar. Samtidig var der PCR-bånd af den forventede produktlængde, på 155 bp for primerpar1 og 135 bp for primerpar2 ved samtlige annealingstemperaturer. Resultatet fra prøve 20 (bilag 7.1, figur 24 og 25) viste produkter af den forventede længde, med begge primerpar. Resultatet med primerpar1 (bilag 7.1, figur 24), viste det specifikke produkt ved alle annealingstemperaturer, mens primerpar2 (bilag 7.1, figur 25) kun viste produktet i lane B1 og B3. Prøve 21 (bilag 7.1, figur 26 og 27) viste kun uspecifikke PCR-produkter og ingen af de forventede længder, hverken med primerpar1 og 2. Figur 8: Gelbillede af prøve 2 med primerpar1. Gradient-PCR fra C. Det forventede PCR-produkt var ved samtlige annealingstemperaturer. Samtidig var der en del uspecifikke PCR-produkter, undtagen i lane C Optimering af primerpar1 og annealingstiden Resultaterne fra prøve 8 (bilag 7.1, figur 28 og 29) og 9 (bilag 7.1, figur 30 og 31) viste produkter af den forventede længde, uanset primerkoncentration. Der var dog flere uspecifikke produkter ved den dobbelte primerkoncentration (bilag 7.1, figur 29 og 31). Prøve 8 (bilag 7.1, figur 29) viste, at der blev dannet flest uspecifikke produkter ved annealingstemperaturene 66 C og 68 C. Der var ingen ændringer ved prøve 9 (se bilag 7.1, figur 31), uanset annealingstemperatur. Resultaterne fra prøve 6 19

21 (se figur 9 og bilag 7.1, figur 33 og 34) og 5 (bilag 7.1, figur 35 og 36) med annealingstiden 15 sekunder, viste specifikke produkter af den forventede længde ved alle annealingstemperaturer, for både primerpar1 og 2. Der var dog tydeligere PCR-bånd med primerpar2 ved begge prøver (bilag 7.1, figur 34 og 36). Figur 9: Gelbillede af prøve 6 med primerpar2. Gradient-PCR fra C med reduceret annealingstid på 15 sek. Det forventede PCR-produkt var ved samtlige annealingstemperaturer Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Resultaterne fra det optimerede forsøg med primerpar1 og unlabeled probe, se figur 10, viste at det kun var 8 ud af 20 prøver (bilag 9, tabel 11) som levede op til de tidligere nævnte HRM krav. Prøverne 5, 6, 7, 8, 9, 17 og 19 var alle ens og havde samme kurveforløb, med undtagelse af prøve 3, som havde en anden T m og skilte sig ud med et anderledes forløb, jævnfør den grønne kurve på den normaliserede smeltekurve og differenskurven på figur 10. Ved resultaterne for det optimerede forsøgsdesign og primerpar 2, se figur 11, opfyldte følgende 10 prøver 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 17 og 19 ud af 20 kravene (bilag 9, tabel 11). Samtlige prøver havde ens kurveforløb, på nær prøve 3, som igen skilte sig ud med et anderledes kurveforløb, jævnfør den grønne kurve på den normaliserede smeltekurve og differenskurven på figur 11. Prøve 1 og 2 var medtaget, selvom deres Ct var præcis 30 cycles, da deres end-point matchede de andre prøver. 20

22 Figur 10: Amplifikationskurve, smeltekurve og normaliseret smeltekurve samt differenskurve for prøve 3, 5-9, 17 og 19 med primerpar1. På amplifikationskurven havde nogle af prøverne en Ct større end 30 cycles, disse nåede ikke plateau fasen i løbet af de 50 cycles. Smeltekurven og den normaliserede smeltekurve viste, at PCRprodukterne smeltede i intervallet C. På den normaliserede smeltekurve og differenskurven havde prøve 3 et anderledes kurveforløb og en anden T m, jævnfør den grønne kurve. Figur 11: Amplifikationskurve, smeltekurve og normaliseret smeltekurve samt differenskurve for prøve 1-3,5-9, 17 og 19 med primerpar2. På amplifikationskurven havde mange af prøverne en Ct over 30 cycles, disse nåede ikke plateau fasen. På smeltekurven og den normaliserede smeltekurve, blev PCR-produkterne denatureret i intervallet C. Den normaliserede smeltekurve og differenskurven angav, at prøve 3 havde et anderledes forløb og en anden T m, jævnfør den grønne kurve. Resultaterne fra gelbillederne (bilag 7.2, figur og bilag 8, tabel 10) viste PCR-produkter af den forventede længde, 155 bp og 135 bp for henholdsvis primerpar1 og 2, med prøve 1-9 fra KMA SLS, 17 og 19 fra KMA OUH. Ved primerpar1 (bilag 7.2, figur og bilag 8, tabel 10) var der uspecifikke PCR-produkter for OUH-prøverne 10, 13, 15, 16 og 18, mens der udelukkende var uspecifikke PCRprodukter for OUH-prøve 12 med primerpar2 (bilag 7.2, figur 38 og bilag 8, tabel 10). Med primerpar1 og OUH-prøverne 11, 12 og 14 (bilag 7.2, figur 40 og bilag 8, tabel 10) blev der ikke dannet PCR-produkter. Det samme var gældende for OUH-prøverne 10, 11, 13, 14, 15, 16 og 18 med 21

23 primerpar2 (bilag 7.2, figur og bilag 8, tabel 10). Der var ingen PCR-produkter i den negative kontrol for begge primerpar (bilag 7.2, figur 39 og 41). Resultatet af RNA-eluat koncentrationsmålingerne fra delforsøg 1 (bilag 10, figur 42) viste utroligt lave koncentrationer, mens koncentrationsmålingerne fra delforsøg 2 (bilag 10 figur 43), viste høje koncentrationer. Da ladderen ikke er loaded korrekt ved delforsøg 2, kan der ikke stoles på de enkelte målinger Sekventering Resultaterne fra sekvensanalysen (bilag 11, figur 44 og 45) viste at prøverne 1-9, 17 og 19 var vildtype og ikke havde H275Y mutationen. Prøve 3 havde en anden non-target punktmutation fra A > G i position 771 bp. 4. Diskussion I det følgende afsnit diskuteres forskellige forhold, der kan have påvirket kvaliteten af Real-time HRM analysen. Som start analyseres der på, hvilken betydning optimering har for Real-time HRM. Derefter fortolkes på, hvilken effekt annealingstemperaturen og tiden har for Real-time HRM analysen. Derudover vil betydningen af prøvernes præparation, og hvilken effekt dette har haft på forsøget blive diskuteret. Efterfølgende diskuteres resultatet af RNA-målingen i forhold til de optimerede smeltekurver. Herefter diskuteres forskellen mellem konventionel PCR og Real-time HRM, samt primer- og probe-designs påvirkning af dette. Ved afsnittets slutning diskuteres en fremtidig implementering af Real-time HRM analysen på KMA SLS, samt en sammenfattet konklusion og perspektivering. Når der i følgende afsnit refereres til bilag, refereres samtidig til de beskrevne resultater i resultatafsnittet Delforsøg 1: Real-time HRM I dette afsnit diskuteres resultaterne fra Real-time HRM forsøget, samt hvilke parametre der kunne have haft effekt på dem. Som tidligere nævnt findes der forskellige forholdsregler, som kan benyttes, når en HRM analyse skal foretages. I nærværende studie blev tre primerpar benyttet, som blev designet ud fra tidligere lignende studier (10, 28, 29). Primerpar3 er et specielt HRM primerpar med kort produkt (59 bp), hvilket ifølge Taylor S. et al. (26) skulle give tydelige HRM smeltekurver, men produktet er i nærværende studie for kort til at kunne ses på gelelektroforesen (data ikke vist). Det er på den baggrund svært at optimere, da resultatet fra gelelektroforesen er grundlag for visualisering af PCR-produkterne. I et studie udført af Asif M et al. (36) er der benyttet Metaphor Agarose Gel 22

24 Elektroforese (MAGE), som kunne afskille PCR-produkter ned til 20 bp, hvilket måske havde været et bedre alternativt til primerpar3. Derudover kunne der være anvendt Polyakrylamidgel-elektrofose (PAGE), der også er i stand til at adskille korte PCR-produkter. Ulempen ved PAGE er, at det indeholder upolymeriserede akrylamid, der er en nervegift, hvilket gør arbejdet med PAGE risikofyldt (37). På grund af de korte produkter fra primerpar3 er dette primerpar valgt fra, hvorimod primerpar1 og 2 havde produkter på henholdsvis 155 bp og 135 bp der var mulige at visualisere på gelelektroforesen. Resultatet fra Real-time HRM forsøget viser tydeligt en forskel på differenskurven mellem prøverne fra KMA SLS og KMA OUH (bilag 6, figur 15 og 16) hvilket kan undre, da prøverne skulle være samme Influenza A subtype. Dermed er der brug for optimering, for at sikre at forskellen mellem prøverne ikke skyldes en dårlig Real-time HRM analyse, men en molekylær forskel Optimering af annealingstemperatur Ved konventionel PCR, blev der benyttet en temperaturgradient for at finde den temperatur, der giver ophav til et specifikt bånd ved gelelektroforesen. Resultaterne herfra viser færre uspecifikke produkter jo højere annealingstemperatur (bilag 7.1, figur 20 og 21), hvilket også bekræftes af Rychlik W. et al. (38). I nærværende studie kunne derfor konkluderes, at primerne havde haft for lav annealingstemperatur og derfor bundet til andre steder på DNA templaten (37). Lee H.K. et al. (28) har benyttet annealingstemperaturen 60 C mens Arvia R. et al. (29) har benyttet annealingstemperaturen 55 C, hvilket ikke fungerede i nærværende studie, da mange uspecifikke produkter blev dannet ved begge temperaturer. Derudover viste primerpar2 mere specifik binding end primerpar1, hvilket medførte mere optimering af primerpar1. Da den unlabeled probe hørte sammen med primerpar1, ville det mest optimale være at få PCR for primerpar1 til at være så specifik som muligt. Igen viste prøverne fra KMA OUH anderledes resultater end prøverne fra KMA SLS, da der for prøve 20 (bilag 7.1 figur 24 og 25) blev dannet specifikke PCR-produkter med primerpar1 ved alle annealingstemperaturer. For prøve 20 med primerpar2 blev der dannet specifikke PCR-produkter ved de lave annealingstemperaturer 55 og 56,5 C. Dette var det modsatte i forhold til prøverne fra KMA SLS, der viste nødvendigheden af en højere annealingstemperatur Optimering af primerpar1 og annealingstiden Der blev afprøvet dobbelt primermængde af primerpar1, men er her fastslået at 1 µl primermængde, var tilstrækkelig for reaktionen, da flere uspecifikke produkter viste sig ved den dobbelte primermængde (bilag 7.1, figur 29 og 31). Ifølge Higuchi R. et al. (39) vil en for lille primermængde medføre færre reaktioner, der når plateau fasen, og dermed ikke analyseres til ende. Der er dog ikke 23

25 undersøgt, hvilken effekt en for høj primermængde kan have (39). Ved gradienten C, kan det konkluderes, at den temperatur, som giver det tydeligste PCR-produkt lå på C for primerpar1 (bilag 7.1, figur 28). Da der stadig er uspecifikke produkter, selv ved den bedste annealingstemperatur for primerpar1, blev det undersøgt, om annealingstiden er for lang. Kielberg V. et al. (37) beskriver, at en for lang annealingstid kan medvirke til at polymerasen har for god tid til at amplificere PCR-produkterne, så den begynder at amplificere andre produkter. På den baggrund blev tiden sat ned til halvdelen af den oprindelige tid, det vil sige fra 30 sek. til 15 sek., hvilket fjernede alle de uspecifikke produkter ved gelelektroforesen med både primerpar1 og 2 (bilag 7.1, figur 33-36). I studier udført af Tong S.Y.C. et al. (10), Lee H.K. et al. (28) og Arvia R. et al. (29) er henholdsvis 15 sekunder, 20 sekunder og 30 sekunder annealingstid benyttet, hvilket bekræfter, at PCR optimering er nødvendig for at tilpasse de enkelte apparaturer og reagenser for hvert forsøgsdesign Delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM Resultaterne i figur 10 og 11 viste, at kun prøve 17 og 19 fra KMA OUH overholdte de tidligere nævnte Real-time HRM krav. Det var også kun de samme to prøver (17 og 19), der viste PCR-bånd af den forventede længde i gelelektroforesen, så derfor kunne der kun sekventeres på disse to, som de eneste af KMA OUH prøverne. Derimod overholdt seks prøver fra KMA SLS kravene. Begrundelsen for dette kunne være, at KMA OUH prøvernes RNA blev nedbrudt under transporten til KMA SLS, og dermed kun to prøver, hvor RNA var bevaret. Årsagen kunne også være, at nogle af prøverne tilhørte en anden Influenza A subtype som H3N2 eller H2N2, hvortil det ikke var muligt for primerne at anneale. Ved resultaterne fra begge primerpar, kunne smelte- og differenskurverne fastslå at prøve 3 fra KMA SLS havde et andet smeltepunkt end de andre prøver fra KMA SLS og de to prøver fra KMA OUH. Resultaterne fra sekventeringen (bilag 11) viste en klasse I punktmutation i prøve 3, som ingen af de andre prøver indeholdte. Dermed var det muligt at detektere punktmutationer hos Influenza A med Real-time HRM (se figur 10,11), hvilket blev bekræftet i andre studier hvor HRM også blev benyttet som detektionsmetode til H275Y (10, 28, 29, 40). Derimod var det ikke muligt, at afgøre hvilken punktmutation den pågældende prøve indeholdte, da probens formål kun var at detektere H275Y Præparation af prøvemateriale Prøverne fra KMA SLS er, efter tidligere analysering, nedfrosset i UTM ved -80 C, som kan have en betydning for RNA-bevaringen. Resultaterne fra RNA-målingerne viste, at der ikke har været meget RNA tilstede i hverken prøverne fra KMA OUH og KMA SLS (bilag 10). UTM er et transport medie, der kan benyttes ved opbevaring og transport af virus og bevaring af viralt RNA (41). Ved længere tids 24

26 opbevaring anbefales der af producenten opbevaring på minimum -70 C, hvor -20 C er mindre effektivt og kan medvirke tab af viralt RNA. Ved transport anbefales 2-8 C eller på is (41), hvor prøvematerialet fra KMA OUH er transporteret på stuetemperatur og derefter nedfrosset igen ved - 80 C. Det kan derfor ikke udelukkes i nærværende studie, at flere optøninger og nedfrysninger kan have medført et tab af RNA. Et tidligere studie med brug af UTM har dog ikke beskrevet nogen problemer med RNA-mængden (28). Den mindre RNA-mængde i prøverne kan også have negativ effekt på Real-time HRM resultaterne ifølge Tong S.Y.C. et al. (10), da resultaterne bliver upålidelige ved små mængder RNA. Et alternativ til UTM er Vircell Transport Medium, der også kan benyttes til opbevaring og transport af virus og er anvendt i et tidligere studie, uden beskrevet vanskeligheder (40). Ved dette medie anbefaler producenten, Vircell Microbiologists, at prøven sendes ved stuetemperatur, undtagen ved lang transport hvor 2-8 C anbefales (42) RNA-måling Denne måling skulle være en kontrol af mængden af RNA i prøverne, hvis smeltekurverne viste at der ikke var sket en reaktion. Smeltekurverne viste reaktion, mens der ikke kunne måles RNA i prøverne (bilag 10, figur 42). Dette kunne skyldes, at RNA-mængden i prøverne var meget lav, eller at RNA blev nedbrudt under transporten fra KMA SLS til UCSJ. Ved Real-time HRM analysen benyttes der cdna, hvilket blev fremstillet på KMA SLS, og derefter transporteret på tøris. Ifølge Kielberg V et al. (37) er cdna mere stabilt, og derfor svære at nedbryde end RNA. Dette skyldes RNAs struktur og RNAnedbrydende enzymer(rnaaser), som findes i alle levende celler og kan nedbryde RNA, hvis de og RNA ikke holdes afskilt (37). Dette kan være baggrunden for den manglende RNA-mængde ved RNAmålingen, men tydelige smeltekurver ved Real-time HRM. Derudover kan manglende erfaring med apparaturet også have indflydelse, da ladderkontrollen heller ikke viste forventede tydelige peaks ved resultaterne fra RNA-målingerne ved delforsøg 2: Optimeret Real-time HRM (bilag 10, figur 43) Primer og probedesign Under overvejelserne af primer og probedesign, er tre primerpar nøje udvalgt på baggrund af gode beskrevne erfaringer med samme studiedesign af Tong S.Y.C. et al. (10), Lee H.K. et al. (28) og Arvia R. et al. (29). Da alle primerpar havde et kort produkt ( bp), blev der at designet nogle specielle sekventerings primere, som kunne sekventere et langt produkt af hver prøve (se tabel 1). Under sekventeringen skal forward primer og reverse primer kunne overlappe hinanden med 100 bp på hver side af target, hvorfor der ikke anbefales produktlængder under 259 bp (43,44). Under primerdesign blev der undersøgt, om de lå i et konserveret område i NA-genet (bilag 2), hvilket ikke var tilfældet med reverse primeren. Dette betyder, at reverse primeren var placeret i et område af 25

27 Influenza A H1N1, der havde mange basevariationer, og derfor dårlig match mellem primer og template. En ny reverse primer med modificerede baser, baseret på udvalgte databasesekvenser for NA-genet. Modificerede baser er en blanding af to baser (31) som derfor har større sandsynlighed for at anneale til forskellige Influenza A H1N1 typer. Studiedesignet beskrevet af Lee H.K. et al. (28) benytter en unlabeled probe til detektion af H275Y, hvortil samme probe benyttes også i nærværende studie. Ifølge Chou LS et al. (45) er det vigtigt, at proben har højere Tm end primerne, for at være sikker på, at proben er helt hybridizeret inden primer etensionen. Det samme beskrives af desilva D. et al. (25), der også tilføjer, at probens Tm helst skal være 5 C højere end primernes. Derudover beskrives, at probens blokerede 3 ende er vigtig for at undgå etension, samt fordelen ved at foretage asymmetrisk PCR, som er forskellige koncentrationer af forward og reverse primer (25). Ved brug af primerpar1 og proben er der i nærværende studie foretaget asymmetrisk PCR. Dette bevirker en overproduktion af én af DNA strengene, som bliver genkendt af proben, hvilket medfører et stærkt fluorescerende signal fra probe regionen. Dermed skal proben have samme koncentration som den tilhørende primer afhængig af, hvilken DNA-streng den er designet til, om det er til plus eller minus strengen, altså forward eller reverse primeren (25). Den unlabeled probe i nærværende studie var designet til minus strengen og da det var forward primeren, der havde størst mængde, virkede det ikke efter hensigten. Da det ikke er muligt at foretage nøjagtig samme studiedesign med hensyn til apparatur og reagenser, kan dette have haft indvirkning på resultatet. Ifølge Tong S.Y.C. et al. (10), der anvendte apparaturet Rotor-Gene 6000 fra Corbett Life Science, blev det opdaget, at Rotor-Gene generelt målte 0,5 C højere end andre afprøvede apparaturer. Dette er der ikke taget højde for i nærværende studie. Alle primerpar er designet til Real-time HRM (10, 28, 29), derfor ville det have været mest korrekt, at foretage alle forsøg og optimering på samme apparatur i stedet for optimeringen som konventionel PCR. Dette har medvirket, at metodens reproducerbarhed har været svær at vurdere. Derudover var det ikke muligt at optimerer på proben med kun begrænset adgang til Real-time HRM apparaturet, hvilket også ses på resultaterne af figur 10 og 11, da probens smeltepunkt ikke blev visualiseret. Real-time HRM er en billig og mindre tidskrævende molekylærbiologiske metode, der i modsætning til konventionel PCR, giver mulighed for at detektere enkelt base mutationer (10, 28, 29). Ifølge Lee H.K. et al. (28) er Real-time HRM en meget sensitiv metode, også til non-target mutationer. Der beskrives dog vanskeligheder ved mutationer på position 822, der kan have negativ indflydelse på sensitiviteten af detektion af H275Y (28). I nærværende studie er der ikke opstået 26

28 vanskeligheder med mutationer i nærheden af H275Y, men dette kunne også skyldes det mindre antal af prøver, hvorved færre forskellige mutationer var repræsenteret. Andre molekylære metoder som TaqMan baseret RT-PCR er også benyttet til detektion af H275Y (46, 47, 48) samt RT-PCR efterfulgt af restriction fragment length polymorphism (49) og SYBR Green baseret RT-PCR (50). Ulempen ved de andre metoder, er at de foretages i flere steps, der medfører åbne rør, hvor der også er øget risiko for kontaminering af både prøve og omgivelser. Derimod er Real-time HRM er en simpel metode, der kan anvendes i ét step, og dermed gør den mere oplagt i en rutinesammenhæng (10). Metoder baseret på SYBR Green RT-PCR kan også være at foretrække i forhold til EVAGreen, der er anvendt i nærværende studie. I forhold til SYBR Green kan EVAGreen benyttes i højere koncentrationer og viser ligeværdig binding med GC-rige og AT-rige regioner (28). I forhold til unlabeled prober er mærkede TaqMan prober dyre og tidskrævende hvilket gør unlabeled prober at foretrække ved dette forsøgsdesign (45) Benyttelse af Oseltamivir Da Oseltamir skal gives 48 timer efter symptomdebut og kun forkorter sygdommen med 1 døgn (7), kan der diskuteres, hvor meget det gavner patienterne i sidste ende. Hvis sygdomsperioden reduceres, med behandling, kunne det medvirke til, at patienternes immunforsvar har styrke til at modarbejde de følgesygdomme, et svækket immunsystem kan medføre. I forhold til Zanamivir, gav mutationen H275Y i H1N1 virus ikke ophav til Zanamivirresistens, hvilket giver mulighed for at benytte Zanamivir som alternativ til Oseltamivir. Der findes dog mutationer i Influenza A NA-gen, som giver ophav til Zanamivirresistens, bare ikke i samme grad som Oseltamivir (51). De danske anbefalinger angiver at man benytter Oseltamivir som førstevalg, og Zanamivir som substitut, hvis der ses en nedsat effekt med Oseltamivir. Dette kan blandt andet skyldes, at Oseltamivir skal tages som tabletform, mens Zanamivir er et inhalationsmiddel. Hvis patienterne i forvejen har luftvejsproblemer, kan der være svært at anvende inhalationsmidler, og dermed øges risikoen for at doseringen af medicinen ikke bliver korrekt. Desuden er der flere kliniske data omkring brugen af Oseltamivir i forhold til Zanamivir, hvilket kan få læger til at benytte det bedst dokumenterede (7) Real-time HRM som en rutinemetode Generelt er Real-time HRM en billig og hurtig metode til at detektere enkeltbasemutationer, hvilket også konkluderes i andre studier (26, 28, 29, 40). Real-time HRM kan detektere enkelt base mutationer uden brug af probe, men har brug for proben ved detektion af specifikke mutationer. Derfor vil Real-time HRM ikke kunne erstatte sekventering, men vil kunne benyttes som sceeningsmetode (40). I nærværende studie blev RT-steppet foretaget som et twostep, da 27

29 placeringen af udstyret medførte lang transport, og cdna skønnes at være mere stabilt. rutinesammenhæng vil onestep RT være at foretrække, da det kan sættes direkte ind i PCRprogrammet. På den måde er der mindre prøvehåndtering for personalet og mindre risiko for kontaminering, da det ikke er nødvendigt at åbne rør undervejs i proceduren (52). HRM er ikke et specifikt udstyr, men kan benyttes ved at koble HRM software til et almindelig Real-time apparat, hvilket de fleste molekylærbiologiske afdelinger allerede anvender Konklusion På baggrund af nærværende studie kan det konkluderes, at Real-time HRM kan anvendes til at detektere enkeltbase mutationer i Influenza A H1N1 i NA-genet. Det vil kræve et større antal prøver for en fuldstændig validering af analysen end, hvad der var tilgængeligt ved nærværende studie. Da ingen af de anvendte prøver indeholdt mutationen H275Y, kan der ikke fastslås, om detektion af denne ville have været muligt med den anvendte metode. Dette kan derimod bekræftes af andre studier (10, 28, 29). Når en Real-time HRM metode skal optimeres, er det vigtigt at foretage dette på en Real-time HRM maskine og ikke på en konventionel PCR maskine, da disse metoder ikke umiddelbart kan sammenlignes. Under optimeringen er primerannealingen væsentlig, da dette kan have stor indflydelse på sensitiviteten af Real-time HRM metoden. Derfor kan det konkluderes, at arbejdet med annealingstemperaturen og annealingstiden var meget essentiel, da begge parametre havde stor indflydelse på resultaterne. For, at der i fremtiden vil kunne opsættes en Real-time HRM til detektion af H275Y, er optimering af proben og anvendelse af positive kontroller altafgørende. For at kunne detektere H275Y, er proben vigtig, da den er specielt designet til mutationen, og derfor vil påvise den ved smeltepunktsanalysen. Yderligere optimering af proben anbefales på denne baggrund. Brugen af positive kontroller vil ligeledes hjælpe i forbindelsen med detektionen af H275Y. Kontrollerne vil gruppere sig anderledes på differenskurven, og kan dermed identificere prøver som har samme smeltepunkt Perspektivering I fremtiden vil yderligere optimering være nødvendigt, da proben ikke fungerede efter hensigten. Næste step vil være, at foretage optimering på CFX96 Touch TM Real-Time PCR, for at øge den specifikke binding mellem proben og produktet. Dette kan foretages ved, at øge forskellen i mængden mellem forward primer, reverse primer og proben, der vil forstærke signalet af proben (23). I den forbindelse vil forsøgsdesignet skulle ændres, så mængden af reverse primer og probe er ens, i stedet for ens mængde af forward primer og probe, da proben i nærværende studie er designet til minus strengen, hvilket ikke medførte det stærkeste fluorescenssignal (25). Som tidligere nævnt I en 28

30 giver en større forskel i Tm mellem primere og probe også øget fluorescenssignal, hvilket kan foretages ved at designe proben til vildtypen i stedet for mutationen (23). Dette øger probens Tm med 1,6 C. For at kunne optimere proben, er det også nødvendigt med positive kontroller i form af en positiv Influenza A prøve med mutationen H275Y og en positiv Influenza A prøve uden mutationen. Kontrollerne vil medføre to klare grupperinger på differenskurven, hvorefter man kan konkludere, at den ene gruppe indeholder mutationen, mens den anden gruppe er vildtype. 29

31 5. Referenceliste 1. Statens Serum Institut. Influenza. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: p 2. Schrauwen E, Reassortments and Mutations Modulating Virulence and Transmission of Influenza A Virus. Erasmus Postgraduate School Molecular Medicine okt Statens Serum Institut. Tema om Influenza. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: 4. Nikolenko G.N., Svarovskaia E.S., Delviks K.A., Pathak V.K. Antiretroviral Drug Resistance Mutations in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Transcriptase Increase Template-Switching Frequency. Journal of Virology. 2004; 78(16): Hajjara S.A., McIntosh K. The first influenza pandemic of the 21st century. Annals of Saudi Medicin. 2010; 30(1): Baz M., Abed Y., Simon P., Hamelin M.E., Boivin G. Effect of the Neuraminidase Mutation H274Y Conferring Resistance to Oseltamivir on the Replicative Capacity and Virulence of Old and Recent Human Influenza A(H1N1) Viruses. The Journal of Infectionus Diseases. 2010; 201: Gerstoft J., Iversen J.. Neuraminidasehæmmere (Influenza). København: Pro.medicin.dk; 2013 [ ]. Lokaliseret på: 8. Madsen L., Nielsen A., Lundgren J.. Naturligt forekommende oseltamivirresistens hos influenza A. Ugeskrift for Læger. 2010; 172(32): Meijer A., Lackenby A., Hungnes O., Lina B., van der Werf S., Schweiger B., Opp M. et al. Oseltamivir- Resistant Influenza Virus A (H1N1), Europe, Season. Emerging Infectious Diseases. 2009; 15(4): Tong S.Y.C., Dakh F., Hurt A.C., Deng Y., Freeman K., Fagan P.K. et al. Rapid Detection of the H275Y Oseltamivir Resistance Mutation in Influenza A/H1N by Single Base Pair RT-PCR and High- Resolution Melting. PlosOne. 2011; 6(6): van Maarseveen N.M., de Jong D., Boucher C.A.B., Nijhuis M. An increase in viral replicative capacity drives the evolution of protease inhibitor.resistant human immunodeficiency virus type 1 in the absence of drugs. Acquir Immune Defic Syndr. 2006; 42(2): Nijhuis M., Deeks S., Boucher C. Implications of antiretroviral resistance on viral fitness. Infectious Diseases. 2001; 14: Hayden F.G. Antiviral resistance in influenza viruses. The New England Journal of Medicine. 2006; 354(8): Statens Serum Institut. Virus-Priser. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: 30

32 15. Degre M., Hovig B., Rollag H. Medisinsk Mikrobiologi. 3 udgave. Oslo: Gyldendal Norsk Forlag AS Rapid Reference to Influenza. The Influenza virus: Structure and Replication.[ ] Lokaliseret på: Nelson M.L., Holmes E.C. The evolution of epidemic influenza. Nature Reviews Genetics. 2007; 8: Basler C.F., Aguilar P.V. Progress in identifying virulence determinants of the 1918 H1N1 and the southeast asian H5N1 influenza A viruses. Antiviral Research. 2008; 79: Sundhedsstyrelsen. Retningslinjer for håndtering af influenza. København: Sundhedsstyrelsen; 2011 [ ]. Lokaliseret på: McKimm-Breschkin J., Trivedi T., Hampson A., Hay A., Klimov A., Tashiro M., Hayden F., Zambons M. Neuraminidase Sequence Analysis and Susceptibilities of Influenza Virus Clinical Isolates to Zanamivir and Oseltamivir. Antimickrobial Agent and Chomotherapy. 2003; 47(7): Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J. Medical Genetics. 4 udgave. Philadelphia: Mosby Elsevier; National Center for Biotechnology Information (NCBI). Real-time qrt PCR. NCBI [ ]. Lokaliseret på: Janukonyte J., Vestergaard E.M., Ladefoged, S.A., Nissen, P.H. High-resolution melting analysis using unlabeled probe and amplicon scanning simultaneously detects several lactase persistence variants. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 2010; 70: Real time PCR research. What is real time PCR? [ ] Lokaliseret på: desilva D. og Blackett J. Assay: High resolution melting unlabeled probes. GEN Magazine Articles. 2007; 27(3): Taylor S., Scott R., Kurtz R., Fisher C., Patel V., Bizouarn F. A Practical Guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Bio-Rad Laboratories Corbett Research. High Resolution Melt Assay, Design and Analysis. CorProtocol July Lee H.K., Chun L.K., Tze L.P., Julian T.W., Tambyah P.A., Koay E.S. High-resolution melting approach to efficient identification and quantification of H275Y Mutant Influenza H1N1/2009 Virus in Mied-virus- Population Samples. Journal of Clinical Mikrobiology. 2011; 49(10): Arvia R., Corcioli F., Azzi A. High resolution melting analysis as a tool to detect molecular markers of antiviral resistance in influenza A viruses. Journal of Virological Methods. 2013; 189: National Center of Biotechnology Information GenBank. GU [ ] Lokaliseret på: DNA Baser. Nucleotide ambiguity code (IUPAC) [ ] Lokaliseret på: 31

33 32. Biorad Laboratories. iscript cdna Synthesis Kit. Biorad Laboratories cat nr / Qiagen. Quick-StartProtocol: QuantiFast Multiple RT-PCR +R Kit. Qiagen cat nr / / Biorad Laboratories. Eperion TM RNA StdSens Analysis Kit: Quick Guide. Biorad Laboratories. 35. Biorad Laboratories. Demo-file fra Precision Melt Analysis TM Software. Biorad Laboratories. 36. Asif M., Mehboob-ur R., Mirza J.I., Zafar Y. High Resolution Metaphor Agarose Gel Electrophoresis For Genotyping With Microsatellite Markers. Pakistan Journal of Agricultural Sciences. 2008; 45(1): Kielberg V., Nørby S., Rasmussen L. DNA og RNA En håndbog. 1 udgave. København: Gads Forlag; Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research. 1990; 18(21): Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology. 1993; 11: Varillas D., Bermejo-Martin J.F., Almansa R., Rojo S., Nogueira B., Eiros J.M., Rico L., Iglesias V., de Lejarazu R.O. A new method for detection of pandemic influenza virus using High Resolution Melting analysis of the neuraminidase gene. Journal of Virological Methods. 2011; 171: Copan Diagnostics Inc. Copan Universal Transport Medium (UTM-RT). Copan Diagnostics Inc Vircell Microbiologists. New Transport Medium virus, chlamydia and mycoplasma. Vircell Microbiologists [ ] Lokaliseret på: _EN.pdf 43. Roche. 454 Sequencing System Guidelines for Amplicon Eperimental Design. Roche BioSer Oulu. Guidelines for amplicon sequencing. BioSer Oulu [ ]. Lokaliseret på: Chou L.S., Meadows C., Wittwer C.T., Lyon E. Unlabeled oligonucleotide probes modified with locked nucleic acids for improved mismatch discrimination in genotyping by melting analysis. BioTechniques. 2005; 39(5): Bolotin S., Robertson A.V., Eshaghia A., De Lima C., Lombos E., Chong-King E., Burton L., Mazzulli T., Drews S.J. Development of a novel real-time reverse-transcriptase PCR method for the detection of H275Y positive influenza A H1N1 isolates. Journal of Virological Methods. 2009; 158: van der Vries E., Jonges M., Herfst S., Maaskant J., Van der Linden A., Guidemeester J., Aron G.I., Bestebroer T.M. et al. Evaluation of a rapid molecular algorithm for detection of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus and screening for a key oseltamivir resistance (H275Y) substitution in neuraminidase. Journal of Clinical Virology. 2010; 47: Chidlow G.R., Harnett G.B., Williams S.H., Tempone S.S., Speers D.J., Hurt A.C., Deng Y.M., Smith D.W. The detection of oseltamivir-resistant pandemic influenza A/H1N viruses using a real-time RT- PCR assay. Journal of Virological Methods. 2010; 169:

34 49. Guo L., Garten R.J., Foust A.S., Sessions W.M., Okomo-Adhiambo M., Gubareva L.V., Klimov A.I. et al. Rapid identification of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses with H274Y mutation by RT- PCR/restriction fragment length polymorphism assay. Antiviral Reseach. 2009; 82(1): Medina R.A., Rojas M., Tuin A., Huff S., Ferres A., Martinez-Valdebenito C., Godoy P. et al. Development and Characterization of a Highly Specific and Sensitive SYBR Green Reverse Transcriptase PCR Assay for Detection of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus on the Basis of Sequence Signatures. Journal of Clinical Miccrobiology. 2011; 49(1): Hurt A.C., Holien J.K., Parker M., Kelso A., Barr I.G. Zanamivir-Resistant Influenza Viruses with a Novel Neuraminidase Mutation. Journal of Virology. 2009; 83(20): Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. Bio-Rad Laboratories

35 Bilag 1: Oversigt over anvendte prøver Tabel 7: Oversigt over de 21 anvendte Influenza A (H1N1), 2 Influenza B og 1 negativ Influenza prøve. Prøverne er nummeret fra 1-24, samtidig er det oprindelige prøve nummer og afdeling angivet. Prøve nr. 1-9 samt er fra Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Slagelse Sygehus (KMA SLS) og prøve nr er fra Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Odense Universitetshospital (KMA OUH). Prøve nr.: Oprindelig prøve nr.: Influenza subtype: Afdeling: A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA SLS A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH A KMA OUH B KMA SLS B KMA SLS Negativ Influenza KMA SLS 34

36 Bilag 2: MultAlin resultat 35

37 Figur 12: MultAlin resultat. Sammenligning af seks udvalgte Influenza A (H1N1) NA-gener, fundet i GeneBank samt sekventeringsprimerne: H1N1_Seq_F og H1N1_Seq_R. 36

38 Bilag 3: Mied base codes Figur 13: Mied base codes. Skemaet angiver hvilken mied base code, man skal anvende til de fire forskellige nukleotider A, T, C og G. 37

39 Bilag 4: Quick Guide til RNA-koncentrationsmåling på Eperion System. 38

40 39

41 40

42 Bilag 5: Godkendte og frasorterede prøver fra det indledende HRM forsøg Tabel 8: Godkendte og frasorterede prøver fra det indledende Real-time HRM forsøg. Prøverne blev godkendt, hvis de opfyldte de tidligere nævnte HRM krav, mens nogle prøver måtte frasorteres. Primerpar1 og 2 er afprøvet med forsøgsdesign 2, mens primerpar3 er afprøvet med forsøgsdesign 1. Ved primerpar1 blev 6 prøver godkendt og 3 frasorteret, mens kun 2 prøver blev godkendt ved primerpar2 og 3, mens 7 blev sorteret fra. Forsøgsdesign 2 Forsøgsdesign 1 Primerpar 1 Primerpar2 Primerpar3 Prøve nr. Afdeling Godkendt Frasorteret Godkendt Frasorteret Godkendt Frasorteret 1 KMA SLS KMA SLS KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH

43 Bilag 6: HRM kurver fra det indledende HRM forsøg Figur 15: Amplifikationskurve, smeltekurve, normaliseret smeltekurve samt differenskurve for prøve 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 med primerpar1 og unlabeled probe. Fire ud af ni prøver er sorteret fra, da de ikke opfyldte tidligere omtalte HRM krav. På differenskurven ses to grupper af prøver, hvor prøve 1 og 2 havde samme kurveforløb (blå og beige kurver). Dette var også gældende for prøverne 10, 12, 13 og 18. Figur 16: Amplifikationskurve, smeltekurve, normaliseret smeltekurve samt differenskurve for prøve 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 med primerpar2. Kun prøve 1 og 2 nåede plateau fasen og havde samme kurveforløb, hvorfor de resterende prøver er sorteret fra. 42

44 Figur 17: Amplifikationskurve, smeltekurve, normaliseret smeltekurve samt differenskurve for prøve 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 med primerpar3. Kun prøve 1 og 2, som havde samme kurveforløb, opfyldte kravene og blev godkendt. 43

45 Bilag 7: Gelbillede resultater fra indledende HRM forsøg Figur 18: Gelbillede for prøve 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 samt en negativ kontrol og primerpar1 som resultat af indledende HRM forsøg. Der ses PCR-bånd af den forventede længde samt en del uspecifikke produkter i lane A1 og A2, der indeholdte prøve 1 og 2. I de resterende lanes ses udelukkende uspecifikke produkter. Figur 19: Gelbillede for prøve 1, 2, 10, 12, 13, 14, 15, 16 og 18 samt en negativ kontrol og primerpar2 som resultat af indledende HRM forsøg. Der ses PCR-bånd af den forventede længde samt uspecifikke produkter i lane B1 og B2, der indeholdte prøve 1 og 2. I de resterende lanes ses udelukkende uspecifikke produkter. 44

46 Bilag 7.1: Gelbillede resultater fra optimeringsforsøg Figur 20: Gelbillede af prøve 1 med primerpar1 Gradient-PCR fra C. Gennemgående var der bånd af den forventede produktlængde ved alle annealingstemperaturer. Det specifikke produkt blev dog skarpere ved 63 C. Endvidere ses uspecifikke produkter ved alle temperaturer, som blev reduceret ved de højere annealingstemperaturer. Figur 21: Gelbillede af prøve 1 med primerpar2. Gradient-PCR fra C. Det specifikke produkt af den forventede længde var ved alle annealingstemperaturer. Antallet af uspecifikke bånd reduceres efterhånden som annealingstemperaturen øges. I B7 ved 59,5 C ses en tydelig reduktion af uspecifikke bånd. 45

47 Figur 22: Gelbillede af prøve 2 med primerpar1. Gradient-PCR fra C. Det forventede PCR-produkt var ved samtlige annealingstemperaturer. Samtidig var der en del uspecifikke PCR-produkter, undtagen i lane C11. Figur 23: Gelbillede af prøve 2 med primerpar2. Gradient-PCR fra C. Det specifikke produkt var ved alle annealingstemperaturer. Der var uspecifikke PCR-produkter i alle brønde undtagen D11 hvor annealingstemperaturen er 63 C. Figur 24: Gelbillede af gradient optimering fra C med prøve 20 og primerpar1. Der ses bånd ved den forventede produktlængde på 155 bp. Der ses ingen uspecifikke produkter. Figur 25: Gelbillede af gradient optimering fra C med prøve 20 og primerpar2. Der ses udelukkende bånd af den forventede længde i B1 og B3, mens der ses uspecifikke bånd i alle brønde. 46

48 Figur 26: Gelbillede prøve 21 og primerpar1. Gradient optimering fra C. Der ses udelukkende uspecifikke PCRbånd og ingen med den forventede båndlængde. Figur 27: Gelbillede af prøve 21 med primerpar2. Gradient optimering fra C. Der ses udelukkende uspecifikke bånd og ingen af den forventede bånd længde. 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C Figur 28: Gelbillede af prøve 8 og primerpar1 med normal primerkoncentration og gradient C. Her ses udelukkende PCR-bånd af den forventede længde. Figur 29: Gelbillede af prøve 8 og primerpar1 med dobbeltprimerkoncentration og gradient C. Her ses PCR-bånd af den forventede længde i alle brønde men også en del uspecifikke produkter, især ved 66 og 68 C. 47

49 68 C 66 C 64,5 C 63 C 61,5 C 60 C 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C Figur 30: Gelbillede med prøve 9 og primerpar1 med normal primerkoncentration og gradient C. Her ses kun PCR-bånd af den forventede længde. N.B. strippen er vendt om! Figur 31: Gelbillede af prøve 9 og primerpar1 med dobbeltprimerkoncentration og gradient C. Det forventede PCR-bånd samt uspecifikke ses i alle lanes. 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C Figur 32: Gelbillede af negativ kontrol med normal primerkoncentration og gradient C. Her ses kun uspecifikke produkter. Figur 33: Gelbillede af prøve 6 med primerpar1, annealingstiden 15 sekunder og gradient C. Der ses udelukkende PCR-bånd af den forventede længde. 48

50 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C Figur 34: Gelbillede af prøve 6 med primerpar2, annealingstiden 15 sekunder og gradient C. Her ses kun PCR-bånd af den forventede længde. Figur 35: Gelbillede af prøve 5 med primerpar1, annealingstiden 15 sekunder og gradient C. Her ses kun PCR-bånd af den forventede længde. 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C 60 C 61,5 C 63 C 64,5 C 66 C 68 C Figur 36: Gelbillede af prøve 5 med primerpar2, annealingstiden 15 sekunder og gradient C. Her se kun PCR-bånd af den forventede længde. Figur 37: Gelbillede af negativ kontrol med primerpar1, annealingstiden 15 sekunder og gradient C. Her ses ingen PCR-bånd. 49

51 Bilag 7.2: Gelbillede resultater fra optimeret HRM forsøg Figur 38: Gelbillede med prøverne 3-14 og primerpar2. Her ses det forventede produkt ved prøve 3-9 (lane A1-A7), uspecifikt produkt for prøve 12 (lane A10), mens ingen PCR-produkter ses ved prøve 10, 11, 13 og 14 (lane A8-A9 og A11-A12). Figur 39: Gelbillede med prøverne (lane B1-B5), prøve 1-2 (lane B7-B8) samt en negativ kontrol (lane B6) med primerpar2. Der ses PCR-bånd af den forventede længe ved prøve 17, 19, 1 og 2, mens der ved prøverne 15, 16, 18 og den negative kontrol ikke ses nogle PCR-bånd. Figur 40: Gelbillede med prøverne 3-14 og primerpar1. Her ses det forventede produkt ved prøve 3-9, mens der ses uspecifikke produkter for prøve 5, 10 og 13 og ingen produkter for prøve 11, 12 og 14. Figur 41: Gelbillede med prøve (lane D1-D5), prøve 1-2 (lane D7-D8) og en negativ kontrol (lane D6) med primerpar1. Her ses det forventede produkt ved prøve 17,19, 1 og 2, mens der ses uspecifikke produkter for prøve 15, 16 og 18. Der er ingen produkter i den negative kontrol. 50

52 Bilag 8: Skematisk oversigt over gelbillede resultater Tabel 9: Gelbillede resultater fra indledende Real-time HRM forsøg med primerpar1, 2 og 3. Primerpar1 giver det forventede produkt med prøve 1 og 2 og uspecifikke produkter ved prøve 10, 12, 13, 14, 15 og 16. Primerpar2 giver det forventede produkt med prøve 1 og 2, uspecifikt produkt ved prøve 14, mens de resterende prøver ikke viste et produkt. Gelbilledet for primerpar3 var uden produkter. Prøve nr. Forventet produkt Primerpar1 Primerpar2 Primerpar3 Uspecifikt Intet Forventet Uspecifikt Intet Forventet Uspecifikt produkt produkt produkt produkt produkt produkt produkt Intet produkt 51

53 Tabel 10: Gelbillede resultater for primerpar1 og 2 ved optimeret Real-time HRM forsøg. Det forventede produkt ses ved prøve nr. 1-9 fra KMA SLS og ved prøve nr. 17 og 18 fra KMA OUH med begge primerpar. Ved de resterende OUH-prøver ses enten uspecifikt eller intet produkt. Primerpar1 Primerpar2 Prøvenr: Forventet produkt Uspecifikt produkt Intet produkt Forventet produkt Uspecifikt produkt Intet produkt

54 Bilag 9: Godkendte og frasorterede prøver ved det optimerede HRM forsøg. Tabel 11: Godkendte og frasorterede prøver fra det optimerede Real-time HRM forsøg. Prøverne blev godkendt, hvis de opfyldte de tidligere nævnte HRM krav, mens nogle prøver måtte frasorteres. Med primerpar1 blev prøverne 3, 5-9, 17 og 19 godkendt, mens prøve 1, 2, 4, og 18 måtte frasorteres. Med primerpar2 blev prøverne 1-3, 5-9, 17 og 19 godkendt, mens prøve 4, og 18 igen måtte sorteres fra. Eget forsøgsdesign Primerpar 1 Primerpar2 Prøve nr. Afdeling Godkendt Frasorteret Godkendt Frasorteret 1 KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA SLS KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH KMA OUH

55 Bilag 10: RNA koncentrationsmålinger Figur 42: RNA koncentrationsmåling på RNA-eluat fra prøver analyseret ved delforsøg 1: real-time HRM. Målingerne viste en lav RNA koncentration for samtlige prøver. 54

56 Figur 43: RNA koncentrationsmåling på RNA-eluat fra prøver analyseret ved delforsøg 2: optimeret real-time HRM. Målingerne viste en høj RNA koncentration for samtlige prøver, men ladderen er ikke korrekt, hvorfor målingerne er upræcise. 55

57 Bilag 11: Sekvensanalyse med primerpar1 og primerpar2 56

58 Figur 44: Sekvensanalyse for prøve 1-9 samt prøve 17 og 19 med primerpar1. Markeringen viser positionen 823 bp hvor H275Y ville have ligget. Sekvenserne viser at det udelukkende er prøve 3 (904_PI), som skiller sig ud med en anden sekvens end de andre prøver, jævnfør consensus sekvensen. 57

59 58

60 59

61 Figur 45: Sekvensanalyse for prøve 1, 2, 4-8 samt 17 og 19 med primerpar2. Markeringen viser positionen 823 bp hvor H275Y ville have ligget. 60

62 Bekræftelse for udfærdigelsen af den skriftlige besvarelse 61

63 Videnskab og forskning, på dansk, peerreviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peerreviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) Analyseskema Litteraturliste - Analyseskema til oversigt over brugen af referencer/ressourcer i et læringsforløb med et skriftligt produkt. Navn: Studienummer: Bn10s005 Modul: 14 Produktionsår: 2013/2014 Titel: Optimering af Real-Time High Resolution Melt analyse til detektion af H275Y i Influenza A. Problemformulering: Hvordan kan Real-time High Resolution Melt opsættes og optimeres, således at analysen i fremtiden vil kunne anvendes til detektion af mutationen H275Y hos Influenza A? Reference Bemærkninger Statens Serum Institut. Influenza. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: enza.asp X 1 Reference-kategorier: Kategori 1: Videnskab og forskning (peer-reviewed), på dansk; Kategori 2: Videnskab og forskning (peer-reviewed), andre sprog end dansk; Kategori 3: Lærebog; Kategori 4: Faglig artikel (ikke peer-reviewed artikler f fra fagblade); Kategori 5: Debat- og populærartikel (holdningsprægede artikler (uden referencer), indlæg, avisartikler, radio- og tv-interviews, samtaler mv.) Kategori 6: Andet (under andet skrives, hvad dette er, eksempelvis film fra YouTube (faglig, debat el. lign. angives), analysevejledning, datasheet osv.) 62

64 Reference Bemærkninger Schrauwen E, Reassortments and Mutations Modulating Virulence and Transmission of Influenza A Virus. Erasmus Postgraduate School Molecular Medicine okt Statens Serum Institut. Tema om Influenza. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: Nikolenko G.N., Svarovskaia E.S., Delviks K.A., Pathak V.K. Antiretroviral Drug Resistance Mutations in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Transcriptase Increase Template- Switching Frequency. Journal of Virology. 2004; 78(16): Hajjara S.A., McIntosh K. The first influenza pandemic of the 21st century. Annals of Saudi Medicin. 2010; 30(1): 1-10 Baz M., Abed Y., Simon P., Hamelin M.E., Boivin G. Effect of the Neuraminidase Mutation H274Y Conferring Resistance to Oseltamivir on the Replicative Capacity and Virulence of Old and Recent Human Influenza A(H1N1) Viruses. The Journal of Infectious Diseases. 2010; 201: Gerstoft J., Iversen J.. Neuraminidasehæmmere (Influenza). København: Pro.medicin.dk; 2013 [ ]. Lokaliseret på: Madsen L., Nielsen A., Lundgren J.. Naturligt forekommende oseltamivirresistens hos influenza A. Ugeskrift for Læger. 2010; 172(32): Meijer A., Lackenby A., Hungnes O., Lina B., van der Werf S., Schweiger B., Opp M. et al. Oseltamivir-Resistant Influenza Virus A (H1N1), Europe, Season. Emerging Infectious Diseases. 2009; 15(4): Tong S.Y.C., Dakh F., Hurt A.C., Deng Y., Freeman K., Fagan P.K. et al. Rapid Detection of the H275Y Oseltamivir Resistance Mutation in Influenza A/H1N by Single Base Pair RT-PCR and High-Resolution Melting. PlosOne. 2011; 6(6): 1-5 van Maarseveen N.M., de Jong D., Boucher C.A.B., Nijhuis M. An increase in viral replicative capacity drives the evolution of protease inhibitor.resistant human immunodeficiency virus 63

65 Reference Bemærkninger type 1 in the absence of drugs. Acquir Immune Defic Syndr. 2006; 42(2): Nijhuis M., Deeks S., Boucher C. Implications of antiretroviral resistance on viral fitness. Infectious Diseases. 2001; 14: Hayden F.G. Antiviral resistance in influenza viruses. The New England Journal of Medicine. 2006; 354(8): Statens Serum Institut. Virus-Priser. København S: Statens Serum Institut; 2013 [ ] Lokaliseret på: Degre M., Hovig B., Rollag H. Medisinsk Mikrobiologi. 3. udgave. Oslo: Gyldendal Norsk Forlag AS 2008 Rapid Reference to Influenza. The Influenza virus: Structure and Replication.[ ] Lokaliseret på: Nelson M.L., Holmes E.C. The evolution of epidemic influenza. Nature Reviews Genetics. 2007; 8: Basler C.F., Aguilar P.V. Progress in identifying virulence determinants of the 1918 H1N1 and the southeast asian H5N1 influenza A viruses. Antiviral Research. 2008; 79: Sundhedsstyrelsen. Retningslinjer for håndtering af influenza. København: Sundhedsstyrelsen; 2011 [ ]. Lokaliseret på: McKimm-Breschkin J., Trivedi T., Hampson A., Hay A., Klimov A., Tashiro M., Hayden F., Zambons M. Neuraminidase Sequence Analysis and Susceptibilities of Influenza Virus Clinical Isolates to Zanamivir and Oseltamivir. Antimicrobial Agent and Chemotherapy. 2003; 47(7): Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J. Medical Genetics. 4 udgave. Philadelphia: Mosby Elsevier; National Center for Biotechnology Information (NCBI). Real-time qrt PCR. NCBI [ ]. 64

66 Reference Bemærkninger Lokaliseret på: Janukonyte J., Vestergaard E.M., Ladefoged, S.A., Nissen, P.H. High-resolution melting analysis using unlabeled probe and amplicon scanning simultaneously detects several lactase persistence variants. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 2010; 70: Real time PCR research. What is real time PCR? [ ] Lokaliseret på: desilva D. og Blackett J. Assay: High resolution melting unlabeled probes. GEN Magazine Articles. 2007; 27(3): 1-2. Taylor S., Scott R., Kurtz R., Fisher C., Patel V., Bizouarn F. A Practical Guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Bio-Rad Laboratories Corbett Research. High Resolution Melt Assay, Design and Analysis. CorProtocol July Lee H.K., Chun L.K., Tze L.P., Julian T.W., Tambyah P.A., Koay E.S. High-resolution melting approach to efficient identification and quantification of H275Y Mutant Influenza H1N1/2009 Virus in Mied-virus-Population Samples. Journal of Clinical Mikrobiology. 2011; 49(10): Arvia R., Corcioli F., Azzi A. High resolution melting analysis as a tool to detect molecular markers of antiviral resistance in influenza A viruses. Journal of Virological Methods. 2013; 189: National Center of Biotechnology Information GenBank. GU [ ] Lokaliseret på: DNA Baser. Nucleotide ambiguity code (IUPAC) [ ] Lokaliseret på: Biorad Laboratories. iscript cdna Synthesis Kit. Biorad Laboratories cat nr / Qiagen. Quick-StartProtocol: QuantiFast Multiple RT-PCR +R Kit. Qiagen cat nr / 65

67 Reference Bemærkninger / Biorad Laboratories. Eperion TM RNA StdSens Analysis Kit: Quick Guide. Biorad Laboratories. Biorad Laboratories. Demo-file fra Precision Melt Analysis TM Software. Biorad Laboratories. Asif M., Mehboob-ur R., Mirza J.I., Zafar Y. High Resolution Metaphor Agarose Gel Electrophoresis For Genotyping With Microsatellite Markers. Pakistan Journal of Agricultural Sciences. 2008; 45(1): Kielberg V., Nørby S., Rasmussen L. DNA og RNA En håndbog. 1 udgave. København: Gads Forlag; Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research. 1990; 18(21): Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology. 1993; 11: Varillas D., Bermejo-Martin J.F., Almansa R., Rojo S., Nogueira B., Eiros J.M., Rico L., Iglesias V., de Lejarazu R.O. A new method for detection of pandemic influenza virus using High Resolution Melting analysis of the neuraminidase gene. Journal of Virological Methods. 2011; 171: Copan Diagnostics Inc. Copan Universal Transport Medium (UTM-RT). Copan Diagnostics Inc Vircell Microbiologists. New Transport Medium virus, chlamydia and mycoplasma. Vircell Microbiologists [ ] Lokaliseret på: _EN.pdf Roche. 454 Sequencing System Guidelines for Amplicon Eperimental Design. Roche. BioSer Oulu. Guidelines for amplicon sequencing. BioSer Oulu [ ]. Lokaliseret på: 66

68 Reference Bemærkninger Chou L.S., Meadows C., Wittwer C.T., Lyon E. Unlabeled oligonucleotide probes modified with locked nucleic acids for improved mismatch discrimination in genotyping by melting analysis. BioTechniques. 2005; 39(5): Bolotin S., Robertson A.V., Eshaghia A., De Lima C., Lombos E., Chong-King E., Burton L., Mazzulli T., Drews S.J. Development of a novel real-time reverse-transcriptase PCR method for the detection of H275Y positive influenza A H1N1 isolates. Journal of Virological Methods. 2009; 158: van der Vries E., Jonges M., Herfst S., Maaskant J., Van der Linden A., Guidemeester J., Aron G.I., Bestebroer T.M. et al. Evaluation of a rapid molecular algorithm for detection of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus and screening for a key oseltamivir resistance (H275Y) substitution in neuraminidase. Journal of Clinical Virology. 2010; 47: Chidlow G.R., Harnett G.B., Williams S.H., Tempone S.S., Speers D.J., Hurt A.C., Deng Y.M., Smith D.W. The detection of oseltamivir-resistant pandemic influenza A/H1N viruses using a real-time RT-PCR assay. Journal of Virological Methods. 2010; 169: Guo L., Garten R.J., Foust A.S., Sessions W.M., Okomo-Adhiambo M., Gubareva L.V., Klimov A.I et al. Rapid identification of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses with H274Y mutation by RT-PCR/restriction fragment length polymorphism assay. Antiviral Reseach. 2009; 82(1): Medina R.A., Rojas M., Tuin A., Huff S., Ferres A., Martinez-Valdebenito C., Godoy P. et al. Development and Characterization of a Highly Specific and Sensitive SYBR Green Reverse Transcriptase PCR Assay for Detection of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus on the Basis of Sequence Signatures. Journal of Clinical Microbiology. 2011; 49(1): Hurt A.C., Holien J.K., Parker M., Kelso A., Barr I.G. Zanamivir-Resistant Influenza Viruses with a Novel Neuraminidase Mutation. The Journal of Virology. 2009; 83(20): Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. Bio-Rad Laboratories