Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Resistensbestemmelse af Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola ved disk diffusion og E-test metode. En bestemmelse af resistens for den ikke tidligere grundigt undersøgte Aerococcus species i forbindelse med EUCAST standardisering. Blod agar plade med påsat benzylpenicillin antibiotika disk og E-test strip. Forfatter: Bioanalytikerstuderende Bjørn Aaberg Westh, UCSJ Næstved Vejledere: Klinisk bioanalytikerunderviser Anne Bonde Jensen, Slagelse KMA, og cand. Ph.d i molekylær mikrobiologi Thomas Lausten, UCSJ Næstved Rapporten er baseret på bachelorprojekt i perioden 8/1 213 1/1 214 Side 1
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Abstract There have previously not been set any breakpoint for Aerococcus genus. This project tested 84 strains, 47 of which were identified as Aerococcus urinae, and 37 were identified as Aerococcus sanguinicola. The antibiotics tested for included benzylpenicillin, cefotaxime, meropenem, erythromycin, clindamycin, vancomycin, linezolid, and rifampicin. Testing for resistance for these eight antibiotics was done via disk diffusion and E- test methods. From the results was concluded that all strains were susceptible to all antibiotics with the exception of two strains that both had outlying resistance towards erythromycin and clindamycin. Side 2
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Indholdsfortegnelse Abstract... 2 Forord... 5 Introduktion... 6 Problembaggrund... 6 Problemformulering... 6 Teori... 7 Agar diffusion... 7 Agar dilution... 7 E-tests... 7 Breakpoints... 8 ECOFFs... 8 SIR-modellen... 8 Wild Type naturlig og erhvervet resistens... 8 EUCAST... 9 Antibiotika:... 9 Metodiske overvejelser... 1 Materialer og metode... 1 Bakteriestammer... 1 Materialer... 11 Apparatur... 11 Metode... 11 Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale:... 11 Udsåning:... 11 Resistensbestemmelse:... 12 Kontrol... 12 Aflæsning... 12 Behandling af data:... 13 Resultater... 13 E-tests... 13 ECOFFs... 14 Inhibitionszonediameter... 14 Regressionsanalyse... 14 Clindamycin... 15 Aerococcus urinae og sanguinicola data varians... 15 Diskussion... 18 Side 3
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Inhibitionszonediameter ved agar diffusion... 18 E-tests... 19 Clindamycin... 19 Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola... 19 ECOFFs og S-I-R... 2 Sensitive stammer og outliers... 2 Vejledende breakpoints... 2 Kliniske breakpoints... 2 Unikt studie... 2 EUCAST... 21 Konklusion... 21 Perspektivering... 21 Side 4
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Forord Denne bachelorrapport er udarbejdet i forbindelse med modul 14 af Bioanalytikeruddannelse ved UCSJ Næstved. Projektet til baggrund for rapporten blev udført på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Slagelse sygehus. I forbindelse med projektet gives der tak til organisationen NoricAST for samarbejdet og muligheden for udførsel af dette klinisk relevante projekt. Ligeledes takkes Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Slagelse sygehus der forsynede projektgruppen med ressourcer, apparatur og lokaler samt den uundværlige MALDI- TOF analyse for samtlige bakteriestammer. Tak til gruppens to vejledere: Senior Lecturer, MVO, Bioanalytikerunderviser Charlotte Birk Olsen, University College Lillebælt, Odense, for hendes faglige indsigt, og Klinisk Bioanalytikerunderviser Anne Bonde Jensen, KMA Slagelse, for hendes værdsatte hjælp som vejleder, og en hjælpende hånd med aflæsning når tiden var knap. Tak til cand. Ph.d i molekylær mikrobiologi Thomas Lausten, UCSJ Næstved, for at springe til som vejleder da der blev brug for det. En hjertelig tak til Mikrobiologisk Overlæge Jens Jørgen Christensen, KMA Slagelse, for ikke kun hans arbejde med at stable projektet på benene, men også for adgang til hans enorme faglige viden, hans hjælp med udførsel af analyserne, og specielt det gode selvskab. Til sidst en tak til Bioanalytikerstuderende Sonny Nielsen og Alona Bækkel for godt samarbejde. Side 5
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Introduktion Aerococcus genus har i lang tid ikke været specielt interessant i en klinisk sammenhæng, da den indtil 1992 kun inkluderede en enkelt species Aerococcus viridans, som blev identificeret i 1953. Dog er der siden Aerococcus urinae blev klassificeret i 1992 tilføget 5 yderligere species til denne genus. Specielt Aercococcus urinae og Aerococcus sanguinicola, som blev tilføget i 21, har siden vist sig at have klinisk relevans via nyfundet patogenese. Aerococcus species er en Gram-positiv kok, og både Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola er i hobe. Disse to species er blevet rapporteret som årsag til urinvejsinfektioner som det hyppigste, men kan ved komplikationer forårsage bakteriæmi og endda endokarditis (1). I dette projekt forsøges der at kortlægge resistensmønstrene for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola i forhold til relevante antibiotika. Dette arbejde udføres i samarbejde med klinisk mikrobiologisk afdeling på Slagelse hospital, og The European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST. Resultaterne fra dette projekt skal bruges i forbindelse med EUCASTs arbejde i forhold til at fastsætte breakpoints som en standard for klinisk resistensbestemmelse, og den tilknyttede infektionsbehandling. Problembaggrund Årsagen til nødvendigheden af dette projekt kommer af den tidligere nævnte nyfundne patogenese for specielt Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. De fleste infektionstilfælde sker i urinvejene. Disse kan dog udvikle sig til komplicerede urinvejsinfektioner, og dermed forårsage bakteriæmi. I cirka en tredjedel af de rapporterede tilfælde med bakteriæmi kan denne udvikle sig til endokarditis (1). I de tilfælde med bakteriæmi og endokarditis er den normale behandling af en urinvejsinfektion selvsagt ikke tilstrækkelig. Det er derfor vigtigt i denne sammenhæng at undersøge resistensmønstrene for denne bakteriegruppe således at breakpoints, og dermed en standard, kan fastsættes til klinisk brug. Denne standard forbedre ikke kun det tidsmæssige aspekt af infektionsbehandlingen, et aspekt der er særlig relevant for bakteriæmi og endokarditis, men også kvaliteten og sikkerheden af behandlingen. Problemformulering Hvorledes fordeler zonestørrelser og E-test værdier sig på udvalgte antibiotika for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola, efter EUCAST standardmetoder Side 6
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Teori Agar diffusion Agar diffusion omhandler brug af antibiotikadisks til resistensbestemmelse for et specifikt antibiotika for en specifik bakteriestamme. Ved brug af antibiotikadisks spredes der først en bakteriesuspension med et kendt inokulum homogent på overfladen af et agarmedie. De relevante antibiotikadisks påsættes og agarmediet inkuberes i 18-24 timer. Antibiotika fra disken vil under inkubationen diffundere ud i agarmediet og vil ved antibiotikafølsomhed dermed danne en Figur 1: MH-F plade med E-test og antibiotikadisk. Der ses en inhibitionszone rundt om både antibiotika disk og E-test strip. hæmningszone; en zone rundt om disken hvor der ikke er bakterievækst (Figur 1). Ved agar diffusion er der adskillige faktorer der spiller ind. I relation til bakterievækst er der inokulum, bakteriens generationstid, nødvendigt antal bakteriedelinger for synlig vækst, varighed af lag-fase (tid til eksponentiel vækst starter). I relation til antibiotika skal der tages forhold til antibiotikakoncentration, fysiske og kemiske forhold der påvirker antibiotikummets effekt så som proteinbindinger og ph og antibiotikummets molekylestørrelse. Ved agarmediet skal der ikke kun tages højde for om mediet indeholder de rigtige ressourcer for den specifikke bakterietype (så som blod eller NAD), men også mediets viskositet og dets tykkelse. Endeligt skal der overvejes temperatur og tid under inkubationsfasen samt stakhøjde af plader i inkubatoren (2). Agar dilution Agar dilution bruges i forbindelse med fastsættelse af den mindst hæmmende koncentration (MIC); altså den koncentration af antibiotika hvor ingen vækst fremkommer. Koncentration beskrives ved mg/l eller µg/ml. Dette foregår ved en to-folds fortyndingsrække med enten agar- eller bouillon som medie. En to-folds fortynding foregår ved at der opstilles en række for eksempel bouilloner med en koncentration af antibiotika homogent fordelt i hele fortyndingen. I den ene ende af fortyndingsrækken er der tilføget en lav koncentration. Denne koncentration fordobles for hver bouillon i rækken hen mod den anden ende. De valgte minimum- og maksimumskoncentrationer variere alt efter hvilket antibiotika der bruges. Efter endt inkubationstid undersøges der hvor i rækken, og dermed ved hvilken koncentration, der er sket end fuldstændig hæmning af synlig vækst. Denne kaldes for den mindst hæmmende koncentration, eller MIC. Der gælder de samme fysiske faktorer som ved agar diffusion (2, 4). E-tests Som et mindre tidskrævende og mere økonomisk alternativ til MIC bestemmelse ved agar dilution er der E- test metoden. Denne metode er en kombination af agar diffusion og agar dilution. En E-test består af en plastik strip hvorpå der er afsat antibiotika i geometrisk stigende koncentrationer (figur 1). E-testen bruger Side 7
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 således både dilution via den stigende koncentration på strippen, men samtidig agar diffusion da den påføres mediet på samme måde som en antibiotikadisk. Aflæsning af E-testen sker ved den øvre værdi hvor hæmningszonen slutter. For at kunne sammenligne med MIC-værdier kan der noteres de øvre 2-folds fortyndingstrin da MIC-værdier findes udelukkende ved brug af disse (2). Breakpoints Breakpoints er en standard for hvor meget antibiotika der skal bruges i forbindelse med infektionsbehandling. Denne fastsættes af EUCAST baseret på fundne MIC-værdier sammen med overvejelser omkring farmakokinetik og farmakodynamik. Farmakokinetik omhandler antibiotikummets forhold så som absorption, vævspenetration og proteinbinding. Farmakodynamik handler hovedsageligt om dosering og bivirkninger (2). Breakpoints kan inddeles i klinisk breakpoints og non-species-related breakpoints. Non-species-related breakpoints er de samm som kliniske breakpoints indtil en species inddeles i Wild Type, eller der ikke ses resistens i forbindelse med et antibiotikum (1). ECOFFs Epidemiological cut-off values (ECOFFs) bliver bedømt ud fra MIC-værdier fundet ved agar dilution. Disse ECOFFs findes enten ved statistisk beregning af normalfordeling, eller visuel vurdering via pivot diagram. En bakteries ECOFF for et givent antibiotika er essentielt den MIC-værdi der definere skillet mellem Wild Type og stammer med erhvervet resistens. ECOFFs har ikke nogen definitiv korrelation med kliniske breakpoints. ECOFFs fastsat med nok data er konstante uanset hvor, hvornår eller hvordan prøven er fundet. Nærmere beskrevet er ECOFFs de samme for en bakterie i forhold til et givent antibiotika om de teoretisk set blev fundet i jordprøver, hos dyr eller mennesker, et bestemt årstal eller et bestemt geografisk punkt (1). SIR-modellen Der bruges inden for klinisk mikrobiologi en klassifikationsmodel nogle steder kaldet S-I-R modellen. Modellen går ud på at inddele en bakteries resistensmønster i S for sensitiv, I for intermediær eller R for resistent. Hvis en bakterie er sensitiv over for et bestem antibiotikum kan der behandles med dette antibiotikum i tilfælde af en infektion. Den intermediære klassifikation bruges ikke af alle laboratorier, men dækker over bakterier der har aktive resistensmekanismer, men ikke defineres som fuldt ud resistente. En infektion af en bakterie kan stadig behandles med antibiotikum klassificeret som intermediært for denne bakterie såfremt antibiotikummet kan sikkert administreres, og ophobes i høje nok doser. Klassifikationen resistent gives for antibiotika til bakterier der ikke kan behandles med dette antibiotika (2). Wild Type naturlig og erhvervet resistens Antibiotikaresistens kan beskrives som enten naturlig eller erhvervet. Naturlig resistens forekommer når en bakterie som udgangspunkt ikke kan påvirkes af en antibiotikums virkningsmetode. For eksempel har en bakterie uden en cellevæg, altså en der kun har en cellemembran, en naturlig resistens mod beta-lactamer, Side 8
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 da disse som nævnt påvirker syntesen af cellevægen. En anden naturlig resistens kan forekomme hvis antibiotikummet ikke er i stand til at trænge gennem cellevægen. Et andet eksempel kunne være hvis antibiotikummet kræver oxygen for at virke. Således ville anaerobe bakterier være naturligt resistente mod dette antibiotikum (4). Erhvervet resistens sker ved enten mutation hos en individuel bakteriestamme, eller ved tilførsel af udefrakommende DNA. Denne erhvervelse af resistens kan betyde for eksempel en udvikling af proteinpumper således at antibiotikummet ikke når ind til dets virkningsområde i bakterien. Bakterier er defineret som Wild Type (WT) ved manglende erhvervet resistens (4). EUCAST Projektet er udarbejdet I samarbejde med organisationen Nordisk Komité for resistensbestemmelse (NordicAST) til brug hos EUCAST. EUCAST er organiseret af et samarbejde mellem European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) og de Europæiske nationale breakpoint komiteer. EUCAST har til formål at fastsætte og harmonisere breakpoints for bakterier. Dette har betydning for standardiseringen af klinisk mikrobiologisk diagnostik, og infektionsbehandling i Europa (3). Forsøgsdata bliver behandlet af NordicAST i sammenligning med de MICværdier Statens Seruminstitut (SSI, København) har til opgave at finde. Antibiotika: Til projektet blev der brugt 8 antibiotika udvalgt af EUCAST: Benzylpenicillin, cefotaxime, meropenem, erythromycin, clindamycin, vancomycin, linezolid og rifampicin. De 3 første indgår i gruppen beta-lactam. Beta-lactam antibiotika er baktericidt, og virker ved at binde sig til de penicillinbindende proteiner (PBP), og stopper derved syntesen af peptidoglycan da PBP indgår i denne. Den baktericide effekt kommer af at peptidoglycan er et vigtigt element i cellevægen. Den manglende peptidoglycan svækker derfor cellevægen der efterfølgende sprænges grundet det osmotiske tryk. Det kan nævnes at beta-lactamer er mere effektive mod gram positive bakterier da disse typisk har flere lag af peptidoglycaner, samt et højere osmotisk tryk (4). Erythromycin virker som de andre macrolider ved binding til 5S-subenheden i ribosomet. Denne binding er bakteriostatisk og hæmmer translokationen af peptidkæden fra acceptorstedet til donorstedet. Macrolider er effektive mod Gram-positive bakterier da antibiotikummet nemt ophobes inde i cellen (4). Clindamycin er en lincosamid og virker ligesom macrolider ved at binde sig til 5S I ribosomet. Lincosamider er ligeledes bakteriostatiske men virker ved at hæmme initieringen for peptidsyntesen. Yderligere er et resultat af den hæmmede proteinsyntese at bakterietoxiner også hæmmes, hvilket er relevant i forhold til infektionsbehandling. Clindamycin virker hovedsageligt mod Gram-positive kokker, og Gram-negative stave (4). Side 9
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Vancomycin er et glycopeptid og virker ved dannelse af komplekser med D-alanyl-D-alanin sidekæderne. Vancomycin virker udelukkende mod gram positive bakterier da molekylet er for stort til at trænge gennem den Gram-negative ydremembran. Vancomycin er bakteriostatisk mod Enterococcus, nogle betahæmolytiske streptokokker og Staphylococcus haemolyticus, men baktericidt mod alle andre Gram-negative bakterier. Det kan nævnes at den baktericide effekt fra vancomycin er langsommere end den beta-lactamme baktericide effekt (4). Oxazolidinonen kaldet linezolid er bakteriostatisk og hæmmer proteinsyntesen ved at binde sig til 23S på 5S subenheden i ribosomet. Her hæmmer den processen der kobler 5S og 3S sammen for at danne intitieringskomplekset. Oxazolidinoner bliver brugt mod Gram-positive bakterier(4). Rifampicin tilhøre gruppen rifamycin. Det er baktericidt og virker mod mange Gram-negative bakterier, og de fleste Gram-positive. Rifampicin binder sig stabilt til enzymet RNA-polymorase. Ved denne binding bliver starten af RNA-syntesen hæmmet, en syntese hvoraf DNA-syntesen er afhængig. Den baktericide effekt er gældende både for intracellulære og ekstracellulære bakterier (4) Metodiske overvejelser Til projektet blev der gjort en række overvejelser i forbindelse med de brugte metoder. Disse overvejelser blev gjort på baggrund af to pilotprojekter og EUCASTs forskrifter. Af det første pilotprojekt blev det konkluderet at visse stammer skulle bruge CO 2 for vækst. Yderligere blev det etableret at brucella pladen var den hvor flest stammer kunne vokse på (5), men i det andet pilotprojekt blev det konkluderet at da den nationale standard er MH-F blev det af økonomiske årsager urealistisk fortsat at satse på brucella pladen (6). Ligeledes blev der i det første pilotprojekt at den ifølge EUCAST standard inokulum på,5 McF for de fleste bakterier ikke var tilstrækkelig. Der blev derfor til dette projekt valgt et inokulum på 1 McF. Endnu en overvejelse var inkubationstiden. Den nationale standard er her ligeledes 24 timer, men efter aflæsning af de første 25 stammer var der 4 (16%) uden fremkommen vækst (se bilag 1, ark 24v48). Efter NordicASTs instruktioner skulle inkubationstiden være på 24 timer, og der blev således justeret på udsåningsmetoden for at opnå tilstrækkelig vækst efter 24 timer. Denne justering er essentielt en forhøjelse af inokulum via udsåning i stedet for en forhøjelse af inokulummet i bakteriesuspensionen. Til aflæsning blev efterfulgt forskrifter fra EUCAST (7). Til behandling af data blev der på baggrund af et lignende projekt valgt udførsel af regressionsanalyse på de opnåede resultater (8) Materialer og metode Bakteriestammer Til projektet blev der brugt 84 isolater, hvoraf 45 var af Aerococcus urinae og 37 af Aerococcus sanguinicola. Stammerne blev indsamlet fra flere lokationer i Europa. Stammerne er gram positive kokker i hobe, ikke tilhørende enterokokker eller streptokokker. De blev opbevaret i frysebouillon ved -8 C på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse Sygehus. Side 1
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Materialer 5 % blodagar plader, 9 cm fra SSI, København blev brugt til opformering og fremstilling af renkultur fra frysebouillon. MH II agar plader med 5 % blod og NAD, 9 cm fra SSI, København blev brugt som medie til resistensbestemmelse., 9 % NaCl opløsning blev brugt under fremstilling af inokulum til resistensbestemmelse. Til projektet blev der udvalgt 8 antibiotika, brugt i disk-form og som E-test. Apparatur Densitometer fra Vitek densichek, Biomerieux, blev brugt til at måle inokulum under resistensudsåning. Pladespreder blev brugt til udsåning af resistensplader Varmeskab fra Struers med CO 2 mulighed blev brugt til inkubation under hele forløbet. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight (MALDI-TOF) blev brugt til kontrol af de brugte bakteriestammer, således at de var korrekt identificeret. Metode Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale: Bakteriematerialet blev taget fra frysebouillon og blev udsået med tretrinsspredning på 5 % blodagar. Pladerne blev inkuberet i varmeskab med 5 % CO 2 ved 35 C i 18-24 timer. For at opnå renkultur blev stammerne omsået fra en enkeltliggende koloni med tretrinsspredning på 5% blodagar og inkuberet i 18-24 timer. Renkultur til resistensbestemmelse blev anvendt inden for 6 timer efter endt inkubation. Udsåning: Til resistensbestemmelse blev der efter EUCAST-forskrift fremstillet en baktieriesuspension i,9% NaCl svarende til,9-1,1 McFarland (EUC ref). Bakteriekolonier blev opløst i,9 % NaCl-opløsning og målt med densitometer. Bakteriesuspensionen blev udsået med vatpind på MH-II ved brug af en pladespreder indenfor 15 minutter efter en acceptabel McFarland var opnået. Udsåningen blev udført ved at vatpinden blev kørt over agarpladen to gange frem og tilbage, hvorefter vatpinden dyppes i bakteriesuspensionen igen og endnu engang køres over pladen 2 gange. Både antibiotikadisk og E-test påsættes med en pincet indenfor 15 minutter efter spredningen er færdiggjort, men samtidig skulle pladerne være forholdsvis tørre for at undgå bevægelse af E-test og disk efter påsætning. E-test skulle desuden have opnået stuetemperatur inden påsættelse på pladerne. Efter påsætning af E-test skal strimlen kontrolleres for luftbobler, som derefter skal fjernes, hvis de er at finde. Dette gøres med pincet fra lav den lave gradient mod den højere. Pladerne skal inkuberes i varmeskab med 5 % CO 2 ved 35 C i 18-24 timer. Disse stilles med bunden opad og i ikke mere end 5 plader per stak. Side 11
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Resistensbestemmelse: Resistensbestemmelsen for Aerococcus species blev udført ved agar disk diffusion- og E-test metode efter EUCASTs standardiserede metode for kræsne bakterier. Referencestammen Streptococcus pneumoniae, American Type Culture Collection (ATCC) 49619 blev udvalgt som kvalitetskontrol til resistensbestemmelsesmetode. Staphylococcus pneumoniae er en af de anerkendte stammekollektioner. Acceptgrænserne for zonestørrelser for disse findes på EUCAST hjemmeside. Efter 18-24 timer i inkubation blev pladerne aflæst for zonediameter omkring antibiotikadisk og MIC- værdier for E-test. Aflæsningen af resistenspladerne foregik ved brug af skydelære og efter EUCASTs foreskrift for aflæsning. Ved disk blev der aflæst ved 1% hæmning og ved E-test blev der taget højde for om antibiotika var bakteriostatiske eller bakteriocide. Alle aflæsninger blev foretager 3 cm fra øjnene og ved brug af lys. E- test blev aflæst ved de på stripsene tykke streger, som er de værdier, der bruges, når der fastsættes MICværdi. Kontrol Kontroludsåning fra saltvandsdispenser, og disckontrol for S. pneumoniae, ATCC 49619, blev udført en gang per resistensbestemmelsesbatch. ATCC-stammen blev udsået på en MH-II plade ved hjælp af en pladespreder og i et inokulum på,5 McFarland, som er fastsat af EUCAST og dernæst blev de tilhørende disks påsat. Samtidig udføres en kontrol af NaCl-opløsningen ved at udtage,5ml fra dispenseren direkte på en 5% blodagarplade og disse inkuberes sammen med resistenspladerne i 18-24 timer ved 5% CO 2. ATCCstammen skal opbevares midt i varmeskabet i midten af den midterste bunke. Pladen for saltvandsdispenseren kontrolleres efter endt inkubation for vækst. Samtidig kontrolleres zonestørrelsen på de udvalgte disks på ATCC-stammen i forhold til de fastsatte zonestørrelser, der bør opnås ved denne bakteriestamme. Hvis begge tests kan godkendes, kan resistenspladerne godkendes til aflæsning. Til yderligere kontrol blev alle stammer sendt til MALDI-TOF for identifikation, således at kun de udvalgte stammer blev brugt. Aflæsning Aflæsning af resistensplader foregår 18-24 efter inkubation er startet. Aflæsningen af resistenspladerne foregår ved brug af skydelære og efter EUCASTs forskrift for aflæsning. Ved disk blev der aflæst ved 1% hæmning og ved E-test blev der taget højde for om antibiotika var bakteriostatiske eller bakteriocide, da de bakteriocide skal måles ved 8% hæmning og bakteriostatiske aflæses ved 1% hæmning, samtidig skal linezolid aflæses ved 9% hæmning på E-test. Alle aflæsninger blev foretager 3 cm fra øjnene og ved brug af lys. Zonemålinger foregik kun ved diameter for at undgå store udsving som kan forefindes ved måling af Side 12
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 radius. E-test blev aflæst ved de på stripsene tykke streger, som er de værdier, der bruges, når der fastsættes MIC-værdi. Behandling af data: Til databehandling blev der brugt Excel, hvor alle antibiotika fik deres egen pivot-tabel for at illustrere både fordelingen af zoner, samt fordelingen af E-test værdier. Herefter var det muligt, at finde ECOFFs ud fra E- test værdierne, som blev fastsat ud fra de førnævnte tabeller, hvor ECOFFs sættes til efter en population. Efter alle antibiotika var opsat i pivot-tabeller, blev tallene overført til et punktdiagram, hvor zonestørrelserne blev sat over for E-test værdierne for hvert enkelt antibiotika. E-test værdierne blev konverteret logaritmisk for at kunne bruge regressionsanalyse til at fastsætte eventuelle breakpoints for zonestørrelsen. Denne analyse foregik ved at tage regressionslinjens ligning som er y=a*ln(x)+b. I denne ligning er y zonediameter og x er ECOFF fastsat af gruppen og b bliver det vejledende breakpoint for antibiotikummet og Y-værdien for dette punkt blev kaldt D (vejledende breakpoint). Indtil data blev vurderet skulle de 2 stammer Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola være delt op. Da data tydede på, at der ikke var signifikant forskel på resistensmønsteret, blev de 2 stammer kombineret og betegnet Aerococcus species. E-test værdier i µg/ml Penicillin Cefotaxime Meropenem Erythromycin Clindamycin Vancomycin Linezolid Rifampicin Resultater Resultaterne for dette projekt fremkommer i første omgang i form af 2 datasæt for de 84 brugte stammer som de fordeler sig for hvert antibiotika: Et for de målte inhibitionszonediameter, og et for de aflæste E-test værdier. E-test værdierne blev derefter brugt til at fastsætte ECOFFs for hver antibiotika. Derefter blev disse ECOFFs brugt via regressionsanalyse til at finde de korresponderende inhibitionszonediametre, her kaldet vejledende breakpoints. E-tests E-test værdierne, fremført i tabel 1, er målt i koncentrationen for antibiotika (µg/ml), og er et udtryk for den mindst hæmmende koncentration af antibiotika. Disse værdier er fremkommet ved aflæsning af de E-test strips der blev brugt til,2 N/A N/A N/A N/A N/A 2,4 N/A 1 N/A N/A N/A N/A 9,8 3 N/A 3 N/A N/A N/A N/A 17,16 12 1 1 18,32 34 3 3 2 8 14,64 3 1 34 6 18 2,125 4 28 5 1 7 1 4,25 27 1 35 14 8 4,5 12 28 13 44 21 1 3 21 29 46 2 1 1 1 13 4 8 16 32 64 N/A N/A N/A 128 N/A N/A N/A 256 N/A N/A 2 2 N/A Tabel 1: Antallet af E-test-værdier for de 8 forskellige antibiotika, som de fordeler sig over de 2-foldsfortyningskoncentrationer af antibiotika, der blev brugt for de relevante E-test strips. N/A: Not Applicable. Side 13
Inhibitionszonediameter i mm Antal stammer,2,4,8,16,32,64,125,25,5 1 2 4 8 16 32 Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 resistensbestemmelse under projektforløbet. E-test analysen foregår ved den beskrevne metode der kombinere agar diffusion og agar dilution. ECOFFs E-test værdierne blev brugt til at fastsætte Epidemiological cut-off values. Disse ECOFFs er en værdi brugt til at bestemme grænsen for hvilke MIC værdier (minimum inhibiting concentration) høre til Wild Type. I dette projekt blev ECOFFs fundet visuelt baseret på EUCASTs foreskrevne metode på et pivot diagram af E-test værdier, som vist i Figur 2. De fastsatte ECOFFS er vist i tabel 2. ECOFF for benzylpenicillin er <,25. ECOFF for cefotaxime er <2. ECOFF for meropenem er <,5. ECOFF for erythromycin er <1. ECOFF for clindamycin er <4. ECOFF for vancomycin er <4. ECOFF for linezolid er <4. ECOFF for rifampicin er <,25. 4 3 2 1 Penicillin Aerococcus species ECOFF Figur 2: Pivot diagram for E-test værdier sat for Penicillin. Metoden for visuel vurdering af ECOFF er indtegnet manuelt i diagrammet. Inhibitionszonediameter Inhibitionszonediametrene for de 84 Aerococcus-stammer er målt i mm, o g er diameteren målt for zonen hvor der ikke er fremkommet bakterievækst. Denne diameter blev målt på en agar plade hvorpå der var påført en antibiotika-disk, som bruges ved metoden for agar diffusion. Disse værdier ses i tabel 3 fordelt over 6-5 mm. 6 mm er minimum zonediameter da antibiotika disken har en diameter på 6 mm. Benzylpenicillin fordeler sig over 21-42 mm. Cefotaxime fordeler sig over 2-41 mm. Meropenem fordeler sig over 26-5 mm. Erythromycin fordeler sig over 24-41 mm med 2 outliers på 6 mm. Clindamycin fordeler sig over 12-39 mm med 2 outliers på 6 mm. Vancomycin fordeler sig over 19-29 mm. Linezolid fordeler sig over 22-4 mm. Rifampicin fordeler sig over 23-43 mm med 1 outlier på 5 mm. Regressionsanalyse Side 14 46 41 36 31 26 21 16 11 Antibiotika ECOFF (x) D (y) Penicillin <,25 2 Cefotaxime <2 18,9 Meropenem <,5 27,6 Erythromycin <1 26,2 Clindamycin <4 13 Vancomycin <4 21,3 Linezolid <4 26,5 Rifampicin <,25 24,7 Tabel 2: ECOFFs (x) fastsat visuelt for de 8 forskellige antibiotika, samt de via regressionsanalyse beregnede vejledende breakpoints, her kaldt D (y). Regressionsanalyse for Penicillin y = -4,757ln(x) + 13,44 R² =,51 6,2,2,2 2 2 Log (E-test) (µg/ml) A. Aerococcus D=2 ECOFF=,25 Log. (A. Aerococcus) Figur 3: Regressionsanalyse for penicillin. Inhibitionszonediameter er sat over for logaritmen til E-test værdi. Der blev indsat logaritmisk tendenslinje og lavet regressionsanalyse af denne. Den fremkomne formel blev brugt i forbindelse med ECOFF til at finde det vejledende breakpoint (D), der hvor ECOFF krydser tendenslinjen. ECOFF er sat ind med en vertikal linje, og vejledende breakpoint (D) med en horisontal linje.
,16,32,64,125,25,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Antal stammer Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 For at give et statistisk billede af forholdet mellem inhibitionszonediametrene fra agar diffusion og E-test værdierne fra kombinationen af agar diffusion og agar dilution blev der foretaget en regressionsanalyse via punktdiagram for alle 8 antibiotika. I eksemplet på Figur 3 ses et punktdiagram for penicillin hvor inhibitionszonediameteren er sat over for logaritmen til E-test værdien. Der blev lavet en regressionsanalyse på disse data ved at tilføje en logaritmisk tendenslinje. Af regressionsanalysen for tendenslinjen lavet på inhibitionszonediameter- og E-test-data for benzylpenicillin fremkommer ligningen: y=-4,757ln(x)+13,44, hvor y er inhibitionszonediameter, og x er den naturlige logaritme til E-test værdierne (µg/ml). Denne formel blev brugt til at beregne vejledende breakpoints ud fra de fremkomne ECOFFs. ECOFF værdien for hver antibiotika blev sat ind som x i ligningen y=a*ln(x)+b (inhibitionszonedimeteren svarende til ECOFF er lig a gange den naturlige logaritme til ECOFF værdien plus b) for at finde det punkt hvor ECOFF værdien møder regressionslinjen. Y-værdien for dette punkt blev kaldt det vejledende breakpoint, og fik betegnelsen D. D- værdier for de 8 antibiotika kan ses i tabel 2. Clindamycin Data fremkommet for clindamycin viste en mindre Clindamycin Aerococcus - E-test regelmæssig fordeling i forhold til de andre 25 antibiotika. Dette er synligt for både de målte E-test værdierne i figur 4, og for inhibitionszonediametre i tabel 3. Data for E-test skal bruges til at bedømme ECOFFs ud fra en vurdering at eventuelle toppe, 2 15 1 5 3 5 4 14 1 6 1 13 6 2 7 1 1 1 fremkommet ved en normalfordelingsmodel så som et pivot diagram. E-test data for Aerococcus species viste til gengæld ikke en klar normalfordeling med én top, men noget der kunne ligne to tætliggende toppe. Den ene top ligger på 18 stammer målt til,64 µg/ml, derefter er der et drastisk fald ved,125 µg/ml hvor dette kun er målt ved 7 stammer. Aerococcus urinae Aerococcus sanguinicola Figur 4: Pivot diagram af E-test data for clindamycin. Aerococcus urinae (den mørkeblå) er fordelt over,32 µg/ml til 1 µg/ml. Aerococcus sanguinicola (lyseblå) er fordelt over,32 µg/ml til 2 µg/ml. Der kan ses en klar forfordeling af de to species, med et skillepunkt mellem,25 µg/mlog,5 µg/ml. Herefter stiger antallet igen til 14 for,25 µg/ml, og 13 for,5 µg/ml. Den anden top ses ved 1 µg/ml hvorved der blev gjort 21 målinger. Aerococcus urinae og sanguinicola data varians Det blev bedømt at begge Aerococcus-stammer, urinae og sanguinicola, havde samme resistensmønstre, og kunne derfor slås sammen med betegnelsen Aerococcus species. Der var dog 2 antibiotika hvor for fordelingen af data ikke overlappede præcist. Clindamycin var den ene der udviste denne varians mellem Aerococcus urinae, og Aerococcus sanguinicola. E-test data for clindamycin var for begge species fordelt over 6 2-foldsfortyninger, fra,32 µg/ml til 1 µg/ml, med en enkelt Aerococcus sanguinicola stamme på 2 Side 15
,2,4,8,16,32,64,125,25,5 1 2 4 8 16 32 Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 µg/ml. Variansen lå i antalsfordelingen, hvor hoveddelen af Aerococcus urinae stammer lå i 25 Rifampicin Aerococcus - E-test området,32 µg/ml til,25 µg/ml (4 2- foldsfortyndinger) med 38 stammer (8,9%). 2 15 1 Aerococcus sanguinicola lå hovedsageligt fordelt over koncentrationerne,5 µg/ml til 1 µg/ml (2 2- foldsfortyndinger) med 26 stammer (7,3%). 1 5 2 1 8 17 17 11 2 3 4 Rifampicin udviste som den anden varierende data for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. Hos rifampicin lå hovedfordelingen af Aerococcus urinae over koncentrationerne,4 µg/ml til,16 µg/ml (3 2-foldsfortyndinger) med 42 stammer (89,4%). For Aerococcus sanguinicola var hoveddelen af stammerne fordelt over koncentrationerne,32 µg/ml til,125 µg/ml (3 2-foldsfortyndinger) med et stammeantal på 35 (94,6%). Figur 5: Pivot diagram af E-test data for rifampicin. Aerococcus Aerococcus urinae urinae (den mørkeblå) Aerococcus fordelt sanguinicola over,2 µg/ml til,32 µg/ml. Aerococcus sanguinicola (lyseblå) er fordelt over,4 µg/ml til,125 µg/ml. Der kan ses en klar forfordeling af de to species, med et skillepunkt mellem,16 µg/mlog,32 µg/ml. Side 16
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 IZD i mm Benzylpenicillin Cefotaxime Meropenem Erythromycin Clindamycin Vancomycin Linezolid Rifampicin 6 2 2 7 8 9 1 11 12 2 13 1 14 8 15 4 16 2 17 2 18 4 19 2 8 2 2 2 14 21 1 4 18 22 2 2 9 14 1 23 3 3 4 14 1 24 3 3 2 4 1 2 25 5 4 1 2 4 1 1 26 2 3 1 2 3 5 27 14 13 1 2 6 1 28 3 5 4 5 1 11 4 29 6 8 1 11 2 1 9 6 3 8 8 1 12 6 12 9 31 5 6 12 5 11 6 32 11 1 3 6 1 9 5 33 2 1 1 7 4 9 12 34 7 4 8 1 4 7 35 4 4 6 6 1 3 9 36 2 2 5 2 1 2 2 37 1 1 4 3 2 38 2 7 1 4 39 1 2 8 2 1 1 4 1 1 11 1 1 3 41 1 1 8 1 6 42 1 8 1 43 1 4 1 44 4 45 5 46 1 47 1 48 1 49 1 5 3 1 Tabel 3: Antallet af inhibitionszonediameter (IZD) datamålinger for de 8 forskellige antibiotika fordelt over 6-5 mm. 6 mm er anført ved ingen inhibitionszone da antibiotikadisken målte 6 mm i diameter. Side 17
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Diskussion Projektet blev lavet med det formål at skaffe data til EUCAST således at de kan fastsætte breakpoints for Aerococcus genus. Til disse breakpoints skal der bruges målinger af inhibitionszonediametre fundet via agar diffusion, samt MIC værdier fundet via agar dilution. Derudover skal der inddrages farmakokinetik, og farmakodynamik. Dette projekt levere således kun data for en ud af fire faktorer til fastsættelse af breakpoints for Aerococcus species. Vigtigheden af at fastsætte disse breakpoints kommer af den konstaterede patogenese for specielt Aerococcus urinae. I et studie fra 211 vises det at af 26 cases med urinvejsinfektioner forårsaget af Aerococcus urinae var mortaliteten på over 5%. Af de 26 cases var 21 patienter mandlige, og 2 var over 7 år (9). Fejlidentifikation er også et problem i forbindelse med Aerococcus urinae. Denne species er en kok der vokser i hobe, har alpha-hæmolyse på blodagar og er resistent over for sulphonamider. Aerococcus urinae minder herved om Staphylicoccus, Streptococcus og Enterococcus, og bliver ofte fejlidentificeret som Streptococcus i kliniske laboratorier (9). I et en ekstern kvalitetskontrol i Norge identificerede kun 6 ud af 24 laboratorier Aerococcus urinae korrekt (1). Resultaterne fremført i rapporten, der blev fundet på baggrund af de 84 stammer, udgøres af inhibitionszonediametre, E-test værdier, med derfra estimerede ECOFFS, og vejledende breakpoints. De vejledende breakpoints er baserede på regressionsanalyser hvortil der blev brugt de 3 første af de nævnte datasæt, som beskrevet i regressionsanalyse afsnittet under metoder. Inhibitionszonediameter ved agar diffusion Inhibitionszonediameter blev fundet ved måling af zonen rundt omkring den på agaren påførte antibiotikadisk, hvor der ikke fremkom vækst efter endt inkubation. Denne zonediameter fortæller om blandt andet bakteriestammens væksthastighed i forhold til antibiotikummets diffusionshastighed, samt en eventuelt resistens over for antibiotikummet. Aflæsning af inhibitionszonediametrene sker manuelt med en skydelære. Resultaterne for Inhibitionszonediametrene viser en bred spredning, men giver et billede af resistensmønsteret som fundet ved agar diffusion. Benzylpenicillin fordeler sig for eksempel over 21-42 mm, men med hoveddelen fordelt mellem 27 mm med 14 målinger, til 32 mm med 11 målinger. Selv om antallet af målinger mellem 27 mm og 32 mm er lavere end for disse to toppe, kan spredningen stadig bruges til at vurdere den generelle populationsfordeling. Det ville have været foretrækkeligt at have haft flere stammer, da man kan antage at der herved ville fremkomme en mere synlig normalfordelt top. Side 18
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Data for inhibitionszonediametre fundet ved agar diffusionen er dog ikke i sig selv nok til at konkludere på, men skal ses i sammenhæng med agar dilution. Den gyldne standard er MIC værdier fundet udelukkende ved agar dilution, men i dette projekt blev der af økonomiske årsager samt en tidsbegrænsning brugt E-test værdier. E-tests E-test metoden, som er en kombination af agar diffusion og agar dilution, blev brugt i stedet for MIC værdier ved kun agar dilution. Denne beslutning blev taget på baggrund af den på gruppen tillagte tidsbegrænsning, samt overvejelser omkring ressourcer. Det var derfor meningen at Statens Seruminstitut skulle yde disse MIC værdier. Dette skete ikke da de havde deres egne tidsmæssige begrænsninger. De resulterende E-test målinger kan ses i tabel 1. E-test værdierne blev sat op i pivot diagrammer som set i Figur 2, Figur 3 og Figur 4. Disse pivot diagrammer viser en naturlig normalfordeling, og kan derved bruges til at sætte ECOFFs for hver antibiotika. Clindamycin Clindamycin var den eneste med en væsentligt bredere spredning både for E-test værdier og inhibitionszonediametre. Hvorvidt denne meget brede spredning skyldes en måleusikkerhed, eller om data viser de 3 toppe der udgøre sensitiv, intermediær og resistent vil kunne afklares ved inddragelse af flere stammer da normal fordelingen antageligt vil vise en mere tydelig top i pivot diagrammet. Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola Resultaterne viste for de fleste antibiotika en stor regelmæssighed i forhold til data for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. For to antibiotika var der dog en variation. For clindamycin of rifampicin var der en variation mellem data for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. I Figur 4 for clindamycin, og i figur 5 for rifampicin ses en tydelig forskel i normalfordelingen mellem Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. For clindamycin fordeler Aerococcus urinae sig over,32 µg/ml til 1 µg/ml, hvor Aerococcus sanguinicola fordeler sig over,32 µg/ml til 2 µg/ml. Begge har en enkelt outlier på 256 µg/ml. Denne spredning er stort set ens. Variansen kommer dog af antalsfordelingen af de aflæste E-test koncentrationer. Hos Aerococcus urinae lå fordelingen hovedsageligt fra og med,32 µg/ml til,25 µg/ml med 38 stammer, udgørende 8,9%. For Aerococcus sanguinicola lå hovedfordelingen fra og med,5 µg/ml til 1 µg/ml med 26 stammer, udgørende 7,3%. Hos rifampicin var der ligeledes en klar opdeling af de to species. Aerococcus urinae lå hovedsageligt fordelt fra og med,4 µg/ml til,16 µg/ml med 42 stammer, udgørende 89,4%. For Aerococcus sanguinicola var hovedsageligt fordelt over koncentrationerne,32 µg/ml til,125 µg/ml med 35 stammer, udgørende 94,6%. At disse antalsprocenter ikke overlapper kan have en klar betydning for hvorvidt Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola burde slås sammen til Aerococcus species som det blev besluttet i dette projekt. Antagelsen at de burde blev taget på baggrund af at begge species udviste Side 19
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 sensitivitet, og at deres ECOFFs varierede med ikke mere end 1 2-folds fortyndingstrin. Om denne antagelse er korrekt ville blive synliggjort ved yderligere data fra fremtidige studier. ECOFFs og S-I-R Data for E-tests blev som nævnt brugt til at sætte ECOFFs. Disse ECOFFs blev sat manuelt via visuel vurdering af data stillet op i et pivot diagram som forskrevet af EUCAST (1). Disse bruges til at skabe en vurdering om hvorvidt der er tale om naturlig resistens, eller om der er tale om en Wild Type. Data for E-test værdierne ligger for de 8 antibiotika fordelt over 7 2-folds fortyndingskoncentrationer som det højeste. Dette er en lav nok spredning til at der ved hjælp af de satte ECOFFs kan angives at Aerococcus species er en Wild type over for de 8 undersøgte antibiotika. Vigtigheden af ECOFFs består i at disse ikke ændres over tid, og ved yderligere dataindsamling. Med vores data kan vi kun sætte ECOFFs for disse Wild Types, men ved fremtidig resistensudvikling og/eller dataindsamling vil diagramtoppe for intermediær og resistent kunne fremkomme. Sensitive stammer og outliers Der blev i samarbejde med Jens Jørgen Christensen, mikrobiolog hos KMA Slagelse, vurderet at alle 84 Aerococcus species stammer var følsomme over for alle 8 antibiotika på nær 2 outliers der begge var resistente over for erythromycin, og clindamycin men sensitive for resten. Disse 2 outliers udgjorde 2,5% af det samlede stammeantal, og det er usikkert hvorvidt disse er er et produkt af fejlidentifikation eller fejlbehandling af bakterien. Siden der blev fåretaget en MALDI-TOF undersøgelse, og siden data for de resterende 6 antibiotika ligger i lighed med resten af stammerne bliver disse data set som værende korrekte. Ud fra denne konklusion har Aerococcus species potentiale for resistensudvikling. Dette forøger vigtigheden af overvågning af denne udvikling. Vejledende breakpoints De vejledende breakpoints fundet via regressionsanalyse kan bruges til at danne et overblik, og give en vejledning i forhold til infektionsbehandling. Da disse vejledende breakpoints ikke medtager hver farmakokinetik eller farmakodynamik er de ufuldstændige, men kan stadig bruges i mangel af bedre, indtil de kliniske breakpoints bliver fastsat. Disse vejledende breakpoints fik betegnelsen D, og er defineret som den inhibitionszonediameter hvorover en stamme kan anses som værende følsom (inhibitionszonediameter >D er følsom). Tallene for de vejledende breakpoints kan ses i tabel 2. Kliniske breakpoints Kliniske breakpoints kan ikke etableres ud fra dette projekt da der både skal indtages farmakokinetik og farmakodynamik. Derudover skal der bruges MIC-værdier fundet via agar dilution i stedet for E-test værdier som er en kombination af agar diffusion og agar dilution. Unikt studie Dette projekt udgør på nuværende tidspunkt det eneste studie udført hvor både analyser med disk diffusion via agar diffusion, og E-test der kombinere agar diffusion og agar dilution. I et tidligere projekt fra 21 Side 2
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 foretaget af Jens Jørgen Christensen et al blev der undersøgt 56 stammer af Aerococcus urinae i forhold til 14 antibiotika. I projektet fra 21 blev der udelukkende undersøgt for MIC værdier via agar dilution. I projektet fra 21 blev der brugt 4 antibiotika der også indgik i dette projekt. Disse 4 antibiotika inkluderer benzylpenicillin, erythromycin, vancomycin og rifampicin. E-test værdiresultaterne fra dette projekt er spredt over 7 2-folds fortyndingstrin som det maksimale for et enkelt antibiotika. Den laveste målte E-test værdi var,2 µg/ml, og 2 µg/ml som det højeste. MIC værdierne fra 21 projektet fordeler sig kun over 4 2-folds fortyndinger som det maksimale, altså en mere samlet spredning af E-test data. Denne variation kan skyldes 2 ting: Som det første blev der i dette projekt kombineret data fra Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola, hvor der i det tidligere projekt kun blev medtaget Aerococcus urinae. Dette kan tyde på en variation af resistensmønster for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola. Det kan også skyldes den usikkerhed der kommer af at bruge E-test værdier. Usikkerheden opstår ved at der skal aflæses en zone på en agar plade ved brug af E-tests. De resulterende data bliver således i højere grad afhængig af aflæserens evne til at aflæse sig til en regelmæssigt og reproducerbart måling. Denne fejlkilde undgår man i højere grad ved udelukkende at bruge agar dilution. Da hver 2-foldsfortyningstrin er opdelt i hver sit medie. EUCAST Formålet med projektet er at give EUCAST data der skal bruges til at fastsætte breakpoints. EUCAST er en organisation der står for standardiseringen i form af breakpoints. Denne standardisering er sat i værk for at skabe en international kvalitetssikring, og dermed formindske den menneskeskabte. Fordelen ved EUCASTs breakpoints er til dels kvaliteten af afgivet svar på grund af den større mængde data der ligger til grund for det, men også den fremkomne ensartede behandling der er resultat heraf. Selv om der er en højere kvantitet af data involveret, medføre dette dog ikke nødvendigvis en højere standard af kvalitetssikring hvis ikke alle involveret forholder sig kritisk til dette. Konklusion Via E-test-værdierne kan man konkludere at Aerococcus species er følsomme over for samtlige antibiotika. Både de fint samlede toppe dannet af E-tests og de mere spredte inhibitionszonediametre tyder på minimal resistens over for alle 8 udvalgte antibiotika. Perspektivering Som nævnt er de EUCAST fastsatte breakpoints udviklet med det formål at forøge kvalitetssikkerheden og ensartetheden via brug af breakpoints som en international standard. Denne forcerede standardisering medføre dog en problematik i forhold til den naturlige variation af vækstfaktorerne. I dette projekt fremkom der ikke acceptabel vækst for alle stammer ved brug af EUCASTs forskrifter for inolukumsfremstilling og udsåning. Den nødsagede afvigelse fra den foreskrevne metode var et resultat af den, i forhold til mange andre arter, langsommere formering, og den naturlige kræsenhed af Aerococcus species. Side 21
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Ifølge den tidligere nævnte eksterne kvalitetskontrol i Norge kunne kun 6 ud af 24 laboratorier yde en korrekt identifikation af Aerococcus urinae i urinprøver (1). Dette er en foruroligende statistik, specielt taget i betragtning af denne genus lave, men stadig tilstedeværende potentiale for livsfarlige sygdomme så som bakteriæmi og endokarditis. Dette lave tal kunne drastisk forhøjes ved et mere omfattende brug af en mere pålidelig metode så som MALDI-TOF. MALDI-TOF bliver brugt som klinisk analyse i Danmark, men kun hvis der er usikkerhed i forhold til identifikationsprocessen. Det er dog langt fra en europæisk standard, og selv i Danmark er analysen relativt nyligt indført. En kritik af det Europæiske standardiseringssystem kunne være, at der er for mange forskellige organisationer involveret. Dette kunne afhjælpes af en sammenslåning af diverse komiteer og organisationer således at der opstår bedre kommunikationsmuligheder. Det kan nævnes at der i USA bliver brugt agar plader med fåreblod, hvor der i Europa bliver brugt hesteblod til fremstilling af MH-F plader. Denne forskel kan have en indflydelse på mængde af bakterievækst. I dette projekt blev der fåretaget en undersøgelse af denne potentielle forskel (bilag 1, ark Får&Heste). Forsøget viste en lille men regelmæssig forskel. Da der ikke kun var brugt forskellige typer blod i agaren, men også var en højdeforskel på agaren bør der foretages yderligere sammenligninger for at komme med en endelig konklusion. Dog står det fast at der på nuværende tidspunkt ikke med validitet kan bruges data fra USA i en Europæisk sammenhæng, og ligeledes heller ikke Europæiske data i en Amerikansk klinisk sammenhæng. En forbedring af denne mangel på internationalt samarbejde kunne potentielt forbedre kvaliteten af ikke kun det diagnostiske arbejde udført på klinisk mikrobiologiske afdelinger på et globalt niveau, men også den dertil relaterede kvalitet af behandlingen verden over. Side 22
Bjørn Aaberg Westh Bachelor project - Jan 214 Referencer 1: Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, Jens Jørgen Christensen. M.D., DMSc, Robert Skov, M.D. November 211. Fundet på http://antimicrobe.org/b75rev2.asp, sidst set d. 3/1 214. 2: Klaringsrapport, Dansk Selvskab for Klinisk Mikrobiologis referencegruppe vedrørende Antibiotika Resistensbestemmelse, 2.4.24. Fundet på http://www.dskm.dk/pdf/rapporter/dskmrapporter/klaringsrapport-rettet.pdf, sidst set d. 3/1 214. 3: http://www.eucast.org/, sidst set d. 3/1 214. 4: Degré et al. Medicinsk Mikrobiologi. 3. Udgave. Gyldendal Norsk Forlag AS 28. 5: Bestemmelse af vækstkrav for gram-negative kokker i kæde, Sonny Nielsen (bilag 4) 6: Vækstoptimering af katalase negative Gram positive kædekokker, Bjørn Westh (bilag 5) 7: http://e-dok.rm.dk/e-dok/e_72632.nsf/$cxiv/attach-rmap-8gbbll/$file/5%2- %2EUCAST%2afl%C3%A6sningsguide.pdf, sidst set d. 3/1 214. 8: Chaohiu et al. Levofloxacin Susceptibility Testing for Helicobacter pylori in China: Comparison of E-test and Disk Diffusion method. 211 Blackwell Publishing Ltd, 28; 16: 119 123 9: Senneby et al. Clinical and microbiological features of bacteraemia with Aerococcus urinae. 211The Authors 1: Brown. EUCAST definitions (and breakpoint table, MIC and zone distribution website conventions). 211. ECCMID, Milan. Side 23
Litteraturliste - Analyseskema til oversigt over brugen af referencer/ressourcer i et læringsforløb med et skriftligt produkt. Navn: Bjørn Westh Studienummer: 2 Modul: 14 Produktionsår: 214 Titel: Resistensbestemmelse af Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola ved disk diffusion og E-test metode. Problemformulering: Hvorledes fordeler zonestørrelser og E-test værdier sig på udvalgte antibiotika for Aerococcus urinae og Aerococcus sanguinicola, efter EUCAST standardmetoder Reference 1 1 2 3 4 5 6 Bemærkninger 1: Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, Jens Jørgen Christensen. M.D., DMSc, Robert Skov, M.D November 211. Fundet på http://antimicrobe.org/b75rev2.asp, sidst set d. 3/1 214. 2: Klaringsrapport, Dansk Selvskab for Klinisk Mikrobiologis referencegruppe vedrørende Antibiotika Resistensbestemmelse, 2.4.24. Fundet på http://www.dskm.dk/pdf/rapporter/dskmrapporter/klaringsrapport-rettet.pdf, sidst set d. 3/1 214. Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed X X Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peerreviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 3: http://www.eucast.org/, sidst set d. 3/1 214. X Hjemmeside 4: Degré et al. Medicinsk Mikrobiologi. 3. Udgave. Gyldendal Norsk Forlag AS 28. X 1 Reference-kategorier: Kategori 1: Videnskab og forskning (peer-reviewed), på dansk; Kategori 2: Videnskab og forskning (peer-reviewed), andre sprog end dansk; Kategori 3: Lærebog; Kategori 4: Faglig artikel (ikke peer-reviewed artikler fx fra fagblade); Kategori 5: Debat- og populærartikel (holdningsprægede artikler (uden referencer), indlæg, avisartikler, radio- og tv-interviews, samtaler mv.) Kategori 6: Andet (under andet skrives, hvad dette er, eksempelvis film fra YouTube (faglig, debat el. lign. angives), analysevejledning, datasheet osv.) Revideret d. 23-9-21 af KMO