Metodevalidering i kemisk analytiske laboratorier Nr. : RL 1 Kvantitative analysemetoder Dato : Side : 1 af 25

Transkript

1 Side : 1 af Forord Med indførelsen af DS/EN ISO/IEC 17025:2000 er der sket en uddybning af kravene vedrørende dokumentation af metoder, herunder metodevalg og validering af metoder. Omfanget af den dokumentation, som DANAK kræver på området for kemisk prøvning afhænger fortsat af om der er tale om - standardmetoder, modificerede metoder eller egne metoder. Da der i enhver standard er mulighed for fortolkning, har det længe været et ønske fra flere sider, at få udarbejdet et uddybende dokument for at sikre en mere ensartet fortolkning af kravene til validering. Et sådant arbejde blev påbegyndt før indførelsen af ISO og endeligt genoptaget i perioden december juni 2003, hvor dette dokument blev færdiggjort på grundlag af tidligere udarbejdede udkast. Dokumentet er udarbejdet af en arbejdsgruppe, nedsat af DANAK og bestående af en repræsentant fra DA- NAK samt af repræsentanter fra laboratorierne oprindelig udpeget via repræsentanter fra sektorudvalgene for hhv. miljø-området og fødevare-området. Der har ikke været deltagelse af repræsentanter fra sundhedsområdet. Der har i projektets forløb vist sig behov for ikke blot at fortolke standardens krav overfor laboratorierne på området; men også at vejlede i bedømmelse af laboratorier. Det færdige dokument skal generelt opfattes som en retningslinie for kemisk analytiske laboratorier; men indeholder desuden enkelte afsnit, som alene er rettet mod DANAK s assessorer på området (Intern Vejledning). Hvor afsnit alene henvender sig til DANAK s assessorer fremgår det af teksten. Desuden indeholder dokumentet instruktion og eksempler på, hvordan metodevalidering kan gennemføres. Det er en vigtig forudsætning for at kunne indføre fleksibelt akkrediteringsområde (også kaldet flexible scope ) i kemiområdet at retningslinierne i dette dokument følges. Indholdsfortegnelse 1 Forord... side 1 2 Formål og gyldighedsområde... side 1 3 Referencer... side 2 4 Definitioner... side 4 5 Omfang af en metodevalidering... side 9 6 Gennemgang af de karakteristiske parametre for en analysemetode... side 14 7 Opfølgning på metodevalidering... side 24 8 Laboratoriets kompetance... side 24 9 Laboratoriets dokumentation... side Ikrafttræden... side 25

2 Side : 2 af Formål og gyldighedsområde DANAK s retningslinier omhandler DANAK s tolkning af relevante paragraffer i akkrediteringskriterierne, udarbejdet med henblik på at sikre en ensartet sagsbehandling og bedømmelse af ansøgende og akkrediterede laboratorier samt for at ligestille behandlingen af danske laboratorier med laboratorier i andre lande. Denne retningslinie fastlægger DANAK s fortolkning af pkt. 5.4 og specielt pkt i DS/EN ISO/IEC 17025:2000 for kemisk analytiske laboratorier, vedrørende metodedokumentering herunder især laboratoriernes stillingtagen til nødvendig validering af anvendte analysemetoder, samt til vurdering af resultaterne af et sådant valideringsarbejde. Retningslinien er udarbejdet med udgangspunkt i gældende internationale standarder og guidelines på området jfr. referencerne anført i pkt. 3. DANAK s tolkning af akkrediteringskravene er i denne retningslinie formuleret som krav til laboratorierne; men disse kan dog fraviges, hvis et laboratorium opnår DANAK s skriftlige accept af en alternativ tolkning af kravene i ISO Måleusikkerhed (usikkerhedsbudgetter), som bør være en del af metodevalideringen er ikke uddybende behandlet i dette dokument. Der henvises her til hhv. GUM dokumentet [17] samt Eurachem, CITAC dokumentet [18]. Retningslinien dækker i denne udgave udelukkende kvantitative, analytiske metoder; men dækker ikke prøveudtagning i forbindelse med gennemførelse af disse metoder. I de tilfælde, hvor der er specifikke krav fastsat af myndigheder (i bekendtgørelser, m.m.), skal disse krav følges uanset, at der kan være afvigelser i forhold til denne retningslinie. Enkelte afsnit beskriver alene vejledning til DANAK s assessorer (5.5 pind 6 og 5.7) og dokumentet betegnes derfor også Intern Vejledning. Desuden indeholder dokumentet vejledning og eksempler på, hvordan metodevalidering kan gennemføres (afsnit 6). Retningslinien kan dog ikke som sådan betragtes som en håndbog i metodevalidering i forbindelse med laboratoriernes efterlevelse af kravene i ISO Retningslinien er gældende for alle kemisk analytiske laboratorier, som er, eller ansøger om at blive, akkrediteret til prøvning. 3. Referencer [ 1] McNaught & Wilkinson: Compendium of Chemical Terminology, 2 nd ed., IUPAC,1997 (ISBN ). BEMÆRKNINGER: Kendt som IUPAC s Gold Book. Tilgængelig på internet-adressen: [ 2] DS 2344: Metrologi. Terminologi. Grundlæggende og generelle begreber. 2. udgave, Dansk Standard, Dansk oversættelse af: International vocubulary of basic and general terms in metrology (VIM) (BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML, 2 nd ed., 1993)

3 Side : 3 af 25 [ 3] DS/EN ISO/IEC 17025: Generelle krav til prøvnings- og kalibreringslaboratoriers kompetence, 1. udgave, Dansk Standard, april [ 4] CITAC/Eurachem Guide: Guide to Quality in Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation. Prepared jointly by CITAC (The Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry) and Eurachem (A Focus for Analytical Chemistry in Europe), BEMÆRKNINGER: 1. Guiden er baseret på de tidligere dokumenter CITAC Guide 1 og Eurachem Guidance Document No. 1/WELAC Guidance Document No. WGD 2, idet der er taget højde for skiftet fra EN til ISO/IEC som akkrediteringsstandard. 2. Guiden baserer sig især på CITAC-dokumentet, idet der er foretaget relativt få ændringer og tilføjelser bl.a. vedr. omfanget af en metodevalidering. 3. Det tidligere dokument er ophævet som officielt EA-dokument (tidl. EA-4/05); dette dokument har (foreløbig) ikke fået tilsvarende status. [ 5] IUPAC: Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical report). Resulting from the Symposium on Harmonization of Quality Assurance Systems for Analytical Laboratories, Budapest, Hungary, 4-5 November 1999, held under the sponsorship of IUPAC, ISO & AOAC INTERNATIONAL. Prepared for publication by Michael Thompson, Stephen L.R. Ellison and Roger Wood. Published in Pure Appl. Chem, Vol. 74, No.5, 2002 (s ). [ 6] IUPAC: Harmonized guidelines for the use of recovery information in analytical measurement (Technical report). Resulting from the symposium on harmonization of internal quality assurance systems for analytical laboratories, Orlando DC, USA, 4-5 September 1996, held under the sponsorship of IU- PAC, ISO & AOAC INTERNATIONAL. [ 7] Miljøstyrelsens referencelaboratorium: Håndbog i Metodevalidering for Miljølaboratorier, VKI sag nr /910, Sept [ 8] NMKL-procedyre Nr. 4: Validering av kjemiske analysemetoder, Nordisk Metodikkomite for næringsmidler, 2. utgave (2002) (Draft). [ 9] Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, 1 st edition, Eurachem, Dec [10] DS/EN ISO 9000: Kvalitetsstyringssystemer Grundprincipper og ordliste. 1. udgave, Dansk Standard, december [11] Youden, W.J. & Steiner, E.H.: Statistical Manual of the AOAC, Association of Official Analytical Chemists, [12] DS/ISO : Nøjagtighed (korrekthed og præcision) af målemetoder og resultater. Del 1:Generelle principper og definitioner, Dansk Standard, Standarden findes på dansk i et uofficielt udkast til oversættelse fra oktober 1998 [13] ISO :1993: Statistics Vocabulary and symbols. Part 1: Probability and general statistical terms, ISO, Den foregående udgave af ISO 3534 fra 1977 findes i en dansk oversættelse som DS 2163, Statistik. Terminologi og symboler, Dansk Standard, Oktober Denne udgave af ISO findes ikke i dansk oversættelse.

4 Side : 4 af 25 [14] ISO Guide 30:1992, Terms and definitions used in connection with reference materials, ISO [15] ISO Guide 43-1:1997: Proficiency testing by interlaboratory comparisons. Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes. [16] ISO Guide 43-2:1997: Proficiency testing by interlaboratory comparisons. Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by laboratory accreditation bodies. [17] BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML: Guide to the expression of uncertainty in measurement, ISO, Geneva, Dokumentet omtales ofte som GUM. Tolket på det kemisk, analytiske område i form af dokumentet Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement [18]. [18] Eurachem, CITAC: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, 2. edition, 2000 BEMÆRKNINGER: Dokumentet betegnes af Eurachem og CITAC som QUAM:2000. P1. EA refererer til dokumentet som en officiel fortolkning af akkrediteringskravene. [19] Poulsen, Holst & Molin Christensen: Metodeevaluering og kvalitetsstyring af kemiske måleprocesser, Arbejdsmiljøinstituttet, København (ISBN ). [20] Funk, Dammann & Donnevert: Quality Assurance in Analytical Chemistry, VCH Verlagsgesellschaft mbh, Weinheim, Tyskland, 1995 (ISBN ). [21] IUPAC: Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities. Recommendations Published in Pure Appl. Chem. Vol 67 (1995) p Definitioner og beskrivelse af begreber Her defineres de begreber, der anvendes i denne retningslinie for at sikre en klar og entydig forståelse af begreberne. Så vidt muligt er der taget udgangspunkt i internationalt anerkendte definitioner, men der er tilfælde, hvor disse ikke er entydige, og der er derfor valgt en egen definition gældende for denne retningslinie. Mange af begreberne kan også have andre - mere eller mindre branchespecifikke - benævnelser, hvilket er acceptabelt, hvis laboratoriet har gjort sig betydningen klar i valideringsmæssig sammenhæng. Som eksempel kan nævnes, at man i denne retningslinie har valgt at anvende udtrykket analyseparameter (til forskel fra karakteristisk parameter jf. definition i punkt 4.9) for den størrelse eller egenskab, der analyseres for (jf. definition i punkt 4.2). Andre benævnelser kunne her være komponent, målestørrelse, analyt, species eller andet. Bemærk, at der i videst muligt omfang er medtaget de noter, der er knyttet til definitionen i den anførte reference (NOTE(R)). I enkelte tilfælde er der endvidere tilføjet nogle bemærkninger af betydning for forståelsen af den pågældende definition i relation til denne retningslinie (BEMÆRKNING(ER)). 4.1 Analysemetode [egen definition] Forskrift, der detaljeret beskriver et kemisk analytisk forløb med henblik på at bestemme/identificere en eller flere analyseparametre.

5 Side : 5 af Analysemetode er det almindeligt anerkendte og anvendte begreb i laboratorierne, men der findes ikke nogen officiel definition af begrebet. I definitionsstandarden, DS 2344 [2] defineres begreberne: 2. Målemetode = logisk sekvens af operationer, generisk beskrevet, anvendt ved udførelsen af målinger. - Måleprocedure = sæt af operationer, detaljeret beskrevet, anvendt ved udførelsen af bestemte målinger i overensstemmelse med en given målemetode. 4.2 Analyseparameter [egen definition] Det grundstof, den kemiske forbindelse eller den egenskab, der ønskes detekteret og kvantificeret ved gennemførelse af en analysemetode. I denne retningslinie anvendes begrebet analyseparameter ikke kun for rent kemiske stoffer og forbindelser, men også for størrelser som f.eks. tørstof, ph, ledningsevne, diverse samleparametre m.v. 4.3 Bias [12] (eng.: Bias) Forskel mellem den forventede middelværdi af måleresultatet og en accepteret referenceværdi. NOTE: Bias er den totale systematiske fejl i modsætning til den tilfældige fejl. Der kan være én eller flere systematiske fejlkomponenter, der bidrager til bias. En stor systematisk afvigelse fra den accepterede referenceværdi giver sig udtryk i en stor bias. 4.4 Blindværdi [egen definition] En blindværdi fås som resultat af analyse af en prøve, der så vidt muligt er uden indhold af de(n) aktuelle analyseparameter(tre) - og ved gennemførelse af hele analysemetoden. BEMÆRKNINGER: 1. Den anførte type af blindværdi, kaldes også for prøveblind, og er den størrelse, der refereres til i resten af denne retningslinie. 2. Til forskel fra prøveblind opereres der i visse sammenhænge også med reagensblind. 4.5 Detektionsgrænse [egen definition] (eng.: Limit of Detection) Der findes mindst to forskellige opfattelser i relation til definitionen af begrebet detektionsgrænse : (1) Detektionsgrænsen defineret ud fra ønsket om at undgå, at en prøve uden indhold af analyseparameter fejlagtigt tilskrives en koncentration (falsk positiv), og samtidig at undgå at en prøve som indeholder analyseparameteren fejlagtigt rapporteres som ikke detekteret (falsk negativ). Definitionen af detektionsgrænse bliver da: Det laveste indhold af en analyseparameter, som kan detekteres med en nærmere defineret grad af konfidens (f.eks. 95, 99 eller 99,7%) ved anvendelse af en given analysemetode. (2) Detektionsgrænsen defineret ud fra ønsket om en vis maksimal usikkerhed på resultatet. Definitionen af detektionsgrænse bliver da: Det mindste indhold, som kan måles med en rimelig statistisk sikkerhed [9]. BEMÆRKNINGER: 1. Udtrykt i statistiske termer kan definition (1) også formuleres som Resultatet af en måling udført med en given måleprocedure, for hvilket sandsynligheden for et analytisk falsk negativt resultat er β, givet at sandsynligheden for et analytisk falsk positivt resultat er α. IUPAC anbefaler at α og β som udgangspunkt tillægges værdien 0, Hvis en måling giver en værdi under detektionsgrænsen, kan resultatet opgives som nul eller mindre end detektionsgrænsen - IKKE som nul. 4.6 Frihedsgrader [egen definition] (eng.: Degrees of Freedom) Antal uafhængige bestemmelser (estimationer) af en given statistisk størrelse (f.eks. gennemsnit eller standardafvigelse), der kan gennemføres på baggrund af et givet datasæt. Jo større antal frihedsgrader, jo bedre er det statistiske grundlag for bestemmelsen af den pågældende størrelse.

6 Side : 6 af Følsomhed [2 + 9] (eng.: Sensitivity) Ændringen i respons på et måleinstrument divideret med den tilsvarende ændring i stimulus. NOTE: Stimulus kan f.eks. være mængden af tilstedeværende analyt. Følsomheden kan afhænge af værdien for den pågældende stimulus. Selv om denne definition tydeligvis vedrører måleinstrumenter, så kan den også anvendes i forbindelse med analysemetoder som helhed, idet der også tages hensyn til andre faktorer som prøveforberedelse m.v. Følsomheden kan ofte udtrykkes ved hældningen af den lineære kalibreringskurve. 4.8 Genfinding [egen definition] (eng.: Recovery) Påvisning af en kendt mængde af en analyseparameter, der er tilsat en prøve og medtaget gennem hele analysemetoden. Efter at have fratrukket eventuelt påvist indhold af den pågældende analyseparameter i den oprindelige prøve uden tilsætning kan genfindingsprocenten beregnes som procent af den tilsatte mængde. BEMÆRKNINGER: 1. Tilsætningen skal tilstræbes at være på et niveau i forhold til prøvens indhold, så der ikke skal udføres forskellige fortyndinger, men samtidig også være så stort, at differencen mellem prøvens indhold og prøve plus tilsat analyseparameter kan bestemmes med en usikkerhed ikke større end ved bestemmelse af prøvens indhold. 2. Genfindingsforsøg anvendes blandt andet til at følge ekstraktions-, oprensnings- og inddampningstab, men kan ikke anvendes alene til vurdering af f.eks. ekstraktionseffektiviteten. 3. Genfindingsforsøg anvendes til at fjerne bias. 4.9 Karakteristisk parameter [egen definition] (eng.: Performance Parameter / Characteristic) Karakteristika for en analysemetode, der fastlægger dens muligheder og begrænsninger (måleområde, specificitet, præcision m.v.) Blev tidligere kaldt ydeevneparameter Korrekthed [12] (eng.: Trueness) Grad af overensstemmelse mellem middelværdien for en population af måleresultater og den accepterede referenceværdi. NOTER: 1. Korrekthed udtrykkes normalt som metodens bias. 2. Korrekthed har været betegnet som nøjagtighed af middelværdien. Denne sprogbrug bør undgås Kvantifikationsgrænse [egen definition] (eng.: Limit of Quantitation) Den laveste koncentration som kan bestemmes med en acceptabel laboratoriereproducerbarhed og korrekthed. BEMÆRKNINGER: 1. Kvantifikationsgrænsen udgør den nedre grænse for måleområdet. 2. I tidligere definitioner af begrebet ses ofte refereret til repeterbarhed i stedet for laboratoriereproducerbarhed Laboratoriereproducerbarhed [egen definition] Præcision under reproducerbarhedsbetingelser, idet disse i dette tilfælde ikke omfatter udførelse i forskellige laboratorier. Kaldes også Intermediær præcision, Intern reproducerbarhed m.m Linearitet [egen definition] (eng.: Linearity) Evnen til at frembringe et signal (respons), som er ligefrem proportionalt med koncentrationen af den givne analyseparameter.

7 Side : 7 af 25 BEMÆRKNINGER: 1. Fastlæggelse af linearitet anvendes blandt andet i forbindelse med udarbejdelse af en kalibreringskurve. 2. Ved fastlæggelse af kalibreringskurver kan ikke-linearitet forekomme 4.14 Lineært område [1, egen oversættelse] Koncentrationsområde inden for hvilket, intensiteten af det opnåede signal er direkte proportionalt med koncentrationen af analyseparameteren, der frembringer signalet. I originalteksten [1] er anvendt det lidt specielle udtryk species, for det, der her er oversat til analyseparametre Matrice [1, egen oversættelse] (eng.: Matrix) Alle komponenter i prøven, med undtagelse af de(n) aktuelle analyseparameter(tre) Måleområde [7] (eng.: Measuring Range) Det koncentrationsområde, inden for hvilket den aktuelle analyseparameter kan bestemmes med en nærmere fastlagt korrekthed og præcision. NOTER: 1. Måleområdet kan godt indeholde et bredere koncentrationsområde end et lineært område, idet sammenhæng mellem respons og koncentration ikke i alle tilfælde skal betragtes som værende lineære. 2. Måleområdet skal defineres i forhold til analyt, matrice og relevant anvendelsesområde. 3. Korrekthed og præcision skal være acceptable i hele det validerede måleområdet. 4. Undertiden kan det forekomme, at målemetodens totale måleområde ikke er kendt og dokumenteret Måleusikkerhed [2] (eng.: Measurement Uncertainty) En parameter knyttet til måleresultatet og som karakteriserer de værdiers spredning, som med rimelighed kan tillægges målestørrelsen. NOTER: 1. Denne parameter kan fx være en standardafvigelse (eller et givent multiplum af denne) eller den halve bredde af et interval, som har et angivet konfidensniveau. 2. Måleusikkerhed omfatter i almindelighed mange komponenter. Nogle af disse kan evalueres på basis af den statistiske fordeling af resultaterne af måleserier og kan karakteriseres ved eksperimentelle standardafvigelser. Andre komponenter, som også karakteriseres ved standardafvigelser, er evalueret på grundlag af antagne sandsynlighedsfordelinger baseret på erfaring eller på anden information. 3. Det skal forstås, at måleresultatet er det bedste estimat af målestørrelsens værdi og at alle usikkerhedskomponenter, inklusive dem som stammer fra systematiske effekter (fx komponenter knyttet til korrektioner og referencenormaler), bidrager til spredningen. [Denne definition er den samme som i Guide to the expression of uncertainty in measurement [17] i hvilken den logiske begrundelse er detaljeret (især i afsnit og anneks D)] Nøjagtighed [12] (eng.: Accuracy) Grad af overensstemmelse mellem et måleresultat og den accepterede referenceværdi NOTE: Anvendt i forbindelse med en række måleresultater omfatter udtrykket nøjagtighed en kombination af tilfældige komponenter og en fælles systematisk fejl eller biaskomponent I GUM en [17] udtrykkes definitionen i relation til sand værdi af målestørrelsen i stedet for..den accepterede referenceværdi Præcision [12] (eng.: Precision) Grad af overensstemmelse mellem uafhængige måleresultater, som er opnået under fastlagte betingelser. NOTER: 1. Præcision afhænger kun af fordelingen af de tilfældige fejl, og har ingen relation til en sand værdi, en konventionel sand værdi eller en accepteret referenceværdi.

8 Side : 8 af Præcision udtrykkes ofte som mangel på præcision og beregnes som spredningen af måleresultaterne. Mindre præcision svarer til større spredning. 3. Udsagnet uafhængige måleresultater betyder, at resultaterne er opnået på en måde, så de ikke er påvirket af nogen tidligere resultater for det samme eller lignende måleobjekter. Kvantitative mål for præcision afhænger kritisk af de fastlagte målebetingelser. Repeterbarheds- og reproducerbarhedsbetingelser er yderpunkter for fastlagte målebetingelser Repeterbarhed [12] (eng.: Repeatability) Præcision under repeterbarhedsbetingelser Repeterbarhedsbetingelser [12] (eng.: Repeatability Conditions) Betingelser, hvor uafhængige måleresultater opnås med samme metode på identiske prøver i samme laboratorium, af samme operatør, med samme udstyr og inden for korte tidsintervaller Repeterbarhedsstandardafvigelse [12] (eng.: Repeatability Standard Deviation) Spredning i fordelingen af måleresultater opnået under repeterbarhedsbetingelser. NOTER: 1. Repeterbarhedsstandardafvigelsen er et udtryk for variationen i fordelingen af måleresultater under repeterbarhedsbetingelser. 2. Tilsvarende kunne repeterbarhedsvarians og repeterbarhedsvariationskoefficient defineres og anvendes som et udtryk for variationen af måleresultater under repeterbarhedsbetingelser Reproducerbarhed [12] (eng.: Reproducibility) Præcision under reproducerbarhedsbetingelser Reproducerbarhedsbetingelser [12] (eng.: Reproducibility Conditions) Betingelser, hvor uafhængige måleresultater opnås med samme metode på identiske prøver i forskellige laboratorier af forskellige operatører med forskelligt udstyr Reproducerbarhedsstandardafvigelse [12] (eng.: Reproducibility Standard Deviation) Spredningen i fordelingen af måleresultater opnået under reproducerbarhedsbetingelser. NOTER: 1. Reproducerbarhedsstandardafvigelsen er et udtryk for variationen i fordelingen af måleresultater under reproducerbarhedsbetingelser. 2. Tilsvarende kunne reproducerbarhedsvarians og reproducerbarhedsvariationskoefficient defineres som udtryk for variationen i fordelingen af måleresultater under reproducerbarhedsbetingelser Robusthed [8 + egen definition] (eng.: Robustness/Ruggedness) Analysemetodens grad af uafhængighed af mindre afvigelser i analysemetodens eksperimentelle betingelser Selektivitet [4, egen oversættelse] (eng.: Selectivity) Selektiviteten af en analysemetode refererer til i hvilken grad analysemetoden er anvendelig til at bestemme tilstedeværelsen af specifikke analyseparametre i en kompleks blanding (matrice) uden interferenser fra andre analyseparametre i blandingen. BEMÆRKNINGER: 1. En analysemetodes evne til kun at måle, hvad den er tiltænkt at måle (metodens specificitet ). 2. Manglende selektivitet af en analysemetode kommer bl.a. til udryk ved de interferenser, der kan genere bestemmelsen af den søgte analyseparameter. 3. Selektiviteten skal ses i forhold til den aktuelle analyseparameter - hvad enten denne er et enkelt stof eller en stofgruppe Validering [10] (eng.: Validation) Bekræftelse af - ved tilvejebringelse af objektivt vidnesbyrd* - at kravene til en specifik tilsigtet brug eller anvendelse er blevet opfyldt.

9 Side : 9 af 25 NOTER: 1. Udtrykket valideret anvendes til at betegne den tilsvarende status. 2. Ved validering kan brugs-/anvendelsesforholdene være virkelige eller simulerede. [* Objektivt vidnesbyrd defineres i [10]: Data, der underbygger tilstedeværelsen af eller sandheden om noget (NOTE: Objektivt vidnesbyrd kan opnås ved observation, måling, prøvning eller på andre måder)] - Forskellen på begreberne validering og verificering mht. den praktiske håndtering heraf diskuteres nærmere i afsnit 5 i denne retningslinie Verificering [10] (eng.: Verification) Bekræftelse af - ved tilvejebringelse af objektivt vidnesbyrd - at specificerede krav er blevet opfyldt. NOTER: 1. Termen verificeret benyttes til at betegne den tilsvarende status. 2. Bekræftelse kan omfatte aktiviteter som fx: - gennemførelse af alternative beregninger - sammenligning af en ny produktspecifikation med en lignende gennemprøvet produktspecifikation - udførelse af prøvninger og demonstrationer - gennemgang af dokumenter inden udstedelse. BEMÆRKNINGER: 1. Forskellen på begreberne validering og verificering mht. den praktiske håndtering heraf diskuteres nærmere i afsnit 5 i denne retningslinie. 2. Verificering vil i denne retningslinie blive opfattet som en eftervisning af de fundne værdier for karakteristiske parametre, der tidligere er fundet ved metodevalidering - enten af laboratoriet selv eller i forbindelse med udgivelse og dokumentation af en udgivet og anerkendt metode. 5. Omfang af en metodevalidering Laboratoriet skal i forbindelse med enhver prøvning inden for akkrediteringsområdet have foretaget en bevidst vurdering af den anvendte analysemetodes egnethed i forhold til formålet med den givne prøvning. Egnetheden skal være afstemt med rekvirentens behov og være dokumenteret gennem en hensigtsmæssig validering, idet der for hver prøvetype (matrice), analysemetoden tænkes anvendt på, skal være opstillet og gennemført et passende valideringsprogram (en protokol). Der eksisterer en række generelle, overordnede krav til, hvor omfattende et sådant valideringsprogram skal være (bl.a. i DS/EN/ISO/IEC 17025). Heraf fremgår det imidlertid også at omfanget af et valideringsprogram som helhed, såvel som omfanget af vurderingen af den enkelte karakteristiske parameter skal fastlægges i relation til den konkrete situation. Dette afsnit i retningslinien gennemgår en række væsentlige aspekter vedrørende fastlæggelse af det relevante omfang af en metodevalidering. De enkelte karakteristiske parametre og deres betydning i forbindelse med en metodevalidering bliver gennemgået i afsnit 6 i denne retningslinie. 5.1 Validering / verificering Begreberne validering og verificering bliver ofte knyttet sammen i forbindelse med omtalen af det nødvendige omfang af en metodevalidering, idet verificering ofte bliver omfattet som en proces, der er mindre omfattende (og dermed mindre arbejdskrævende) end en validering. Det er vigtigt, at laboratoriet har foretaget en behovsvurdering af den konkrete opgave og på baggrund heraf har fastlagt et valideringsprogram (en protokol), med udgangspunkt i 1) opgavens karakter herunder rekvirentens krav hertil

10 Side : 10 af 25 2) den aktuelle analysemetode og dokumentationen heraf i forhold til en opgave af den karakter Er der i situationen ikke stillet nye krav til analysemetoden og har alle relevante, karakteristiske parametre været fuldt dokumenterede i forbindelse med en tidligere validering, kan laboratoriet have valgt at verificere én eller flere (evt. alle) karakteristiske parametre. Herved skal laboratoriet have dokumenteret, at man under udførelse af analysemetoden i den givne situation overholder specifikationerne, som de er fastlagt i forbindelse med et tidligere valideringsarbejde. Dette tidligere valideringsarbejde kan være udført af laboratoriet selv eller stamme fra udgivelse og dokumentation af en anerkendt metode. Afhængig af situationen kan et valideringsarbejde altså komme til at bestå af alt mellem fuld validering af alle karakteristiske parametre (dvs. ingen verificeringer) og lutter verificeringer af alle relevante karakteristiske parametre (se oversigten i afsnit 5.3). I de tilfælde, hvor laboratoriet kan nøjes med en verificering af en tidligere valideret karakteristisk parameter, kan denne bestå i f.eks. eftervisning af lineært område ved måling på færre niveauer end ved den oprindelige validering sammenligning af resultater fra metode før og efter modifikation eftervisning af præcision med færre antal gentagelser end ved den oprindelige validering.. Laboratoriet kan også have argumenteret for, at alle karakteristiske parametre for en analysemetode er verificeret under ét gennem deltagelse i et præstationsprøvningsprogram, forudsat at det prøvede materiale har været repræsentativt for den aktuelle anvendelse af metoden mht. matrice, analyseparametre, koncentrationsniveau(er) m.v. Omfanget af verificeringen skal have stået i et rimeligt forhold til de aktuelle krav til laboratoriets udførelse af metoden. Enhver anvendelse af verificering som en del af et valideringsarbejde skal være velbegrundet - specielt når laboratoriet har en akkreditering med flexible scope, idet der her lægges vægt på laboratoriets kompetence og rutine på det pågældende område. 5.2 Generelle krav til omfang af metodevalidering Valideringen skal være så omfattende, som det er nødvendigt for at imødekomme behovene i forbindelse med den givne anvendelse eller det givne anvendelsesområde. En validering bør (som minimum) omfatte: 1) en specifikation af rekvirentens behov i forbindelse med den pågældende prøvning; 2) fastlæggelse af analysemetodens karakteristiske parametre i forhold til det aktuelle behov; 3) en undersøgelse af om de aktuelle behov kan imødekommes ved anvendelse af analysemetoden med de fastlagte karakteristiske parametre; 4) udarbejdelse af en erklæring vedrørende analysemetodens validitet. I den resulterende erklæring, skal der også være en bevidst stillingtagen til, hvorfor visse af analysemetodens karakteristiske parametre evt. ikke er fundet relevante i forbindelse med den pågældende validering. Det kunne f.eks. være en udeladelse af validering af detektionsgrænsen, hvis metoden udelukkende skal anvendes ved høje koncentrationer. Findes der branchespecifikke krav mht. form og omfang af en metodevalidering, må det accepteres, at laboratoriet følger disse krav.

11 Side : 11 af Omfang af metodevalidering afhængigt af type analysemetode Omfanget af metodevalidering skal vurderes konkret i det enkelte tilfælde, idet det er afgørende hvilken type analysemetode, der skal anvendes i den aktuelle situation. I akkrediteringsstandarden, DS/EN/ISO/IEC fastslås det i pkt , at: Laboratoriet skal anvende prøvnings- og/eller kalibreringsmetoder, herunder metoder til prøveudtagning, der opfylder rekvirentens behov, og som er relevante for de prøvninger og/eller kalibreringer, laboratoriet påtager sig. Der skal fortrinsvis anvendes metoder, der er udgivet i form af internationale, regionale eller nationale standarder og videre: Hvis rekvirenten ikke specificerer metoden, der skal anvendes, skal laboratoriet vælge egnede metoder, der enten er udgivet i internationale, regionale eller nationale standarder eller af anerkendte tekniske organisationer eller i relevante videnskabelige publikationer eller er specificeret af fabrikanten af udstyret. Selv-udviklede metoder eller metoder indført af andre laboratorier kan også anvendes, hvis de er egnede til det givne formål, og hvis de er validerede. Rekvirenten skal oplyses om den valgte metode. Laboratoriet skal dokumentere, at det kan anvende standardmetoder korrekt, inden det indfører prøvnings- eller kalibreringsmetoderne. Hvis standardmetoden ændres, skal valideringen gentages Standardiserede analysemetoder udgives af standardiseringsorganer (f.eks. DS, CEN, ISO) og anerkendte tekniske organisationer (f.eks. NMKL, AOAC m.fl.), m.v., men dokumentationen for den standardiserede analysemetode varierer. I visse tilfælde findes der ingen valideringsrapport som basis for analysemetoden, eller de karakteristiske parametre er ikke - eller kun delvist valideret. Er dette tilfældet, er en verificering af laboratoriets evne til at anvende analysemetoden ikke umiddelbart mulig, og en validering er nødvendig. I denne retningslinie anvendes i øvrigt flere steder udtrykket anerkendt analysemetode for analysemetoder af ovennævnte karakter, idet der dermed altså ikke er nogen sikkerhed for hvor godt en sådan analysemetode er dokumenteret. 5.4 Situationsafhængige krav til omfang af metodevalidering Nedenfor er givet nogle eksempler, som kan anvendes som udgangspunkt for vurderingen i forskellige situationer. Generelt skal det nævnes, at kvantifikationsgrænse kun behøver at være medtaget, såfremt det er krævet for det specifikke prøvningsområde.

12 Side : 12 af 25 Eksempler på omfang af metodevalidering/-verificering i en række forskellige situationer: Situation 1. Analysemetoden er udviklet internt. Herunder anvendelse af en standardiseret analysemetode på en matrice, som ikke er beskrevet i metoden 2. 2a Analysemetoden er publiceret i videnskabelig litteratur, men mangler vigtige karakteristiske parametre 2b Analysemetoden er publiceret i videnskabelig litteratur og specificerer vigtige karakteristiske parametre 3. 3a Analysemetoden er standardiseret eller er i øvrigt veletableret, men data fra ekstern validering er ikke tilgængelige 3b Analysemetoden er publiceret af en af standardiseringsorganisationerne, f.eks. DS, CEN, AOAC, NMKL, ISO m.fl.. Analysemetoden er eksternt valideret 4. Analysemetoden er veletableret inden for prøvningsområdet (jf. pkt. 2b ell. 3b) men anvendes med modifikation Forventet omfang af laboratoriets metodevalidering/-verificering Fuld intern validering: Laboratoriet skal tage stilling til samtlige karakteristiske parametre (se afsnit 6), og gennemføre en passende validering heraf. I tilfælde af udeladelse af enkelte karakteristiske parametre i valideringsarbejdet, skal laboratoriet redegøre for udeladelsen. Fuld intern validering som angivet under punkt 1. Laboratoriet skal verificere sin evne til at anvende analysemetoden mht. de specificerede karakteristiske parametre. Laboratoriet skal vurdere behovet for validering af eventuelle manglende karakteristiske parametre. Laboratoriet skal vurdere behovet for validering af de karakteristiske parametre, som er kritiske for analysemetoden. Laboratoriet skal som minimum dokumentere sin evne til at anvende analysemetoden med en kvalitet, som opfylder kundens behov. Laboratoriet skal have verificeret sin evne til at leve op til de specificerede karakteristiske parametre for analysemetoden. Selektivitet og robusthed kan med rimelighed forventes undersøgt i forbindelse med standardiseringsprocessen. Laboratoriet skal foretage en begrundet vurdering af hvilke mulige påvirkninger en modifikation af analysemetoden kan have på de enkelte karakteristiske parametre. I de tilfælde, hvor der er tale om en relevant påvirkning, skal den pågældende karakteristiske parameter valideres. Laboratoriet skal verificere den modificerede metode i forhold til specifikationerne for karakteristiske parametre i den oprindelige metode. 5. Skift af analysemetode Omfanget er principielt det samme, som anført under punkt 2 og 3. Såfremt laboratoriets eksisterende analysemetode ved validering/- verificering viser sig at være fri for kendte systematiske fejl kan fremgangsmåden ved undersøgelse af korrekthed være en sammenligning af resultaterne opnået med den ny og den gamle analysemetode. Muligheden for undersøgelse af korrekthed bliver dermed forbedret, da enhver naturlig prøve kan inddrages i arbejdet. 6. Udvidelse af en allerede indkørt og valideret analysemetodes måleområde 7. Udskiftning af apparatur til nyt apparatur men med samme måleprincip Korrekthed og præcision skal undersøges for det ny måleområde, f.eks. ved undersøgelse af homogene kontrolmaterialer (punkt 5.6) eller deltagelse i interlaboratorieundersøgelser. Måleområde, linearitet, detektionsgrænse, korrekthed og præcision skal være sammenlignet med data fra det gamle apparatur ved hjælp af homogene kontrolmaterialer (verificering) (se afsn. 5.6).

13 Side : 13 af Omfang af metodevalidering i forbindelse med multimetoder Da multimetoder (dvs. analysemetoder, som i samme analysegang bestemmer to eller flere analyseparametre, f.eks. de fleste chromatografiske analyser) finder større og større anvendelse, samt løbende bliver mere og mere omfattende i deres anvendelsesområde, udgør de en speciel problemstilling mht. fastlæggelse af et relevant og tilstrækkeligt valideringsomfang. Validering skal som minimum omfatte analyseparametre som beskrevet herefter. Omfanget af validering eller verificering for de valgte analyseparametre afhænger af det konkrete tilfælde. Det anførte under punkt 1 til 7 ovenfor kan anvendes som udgangspunkt ved fastlæggelsen heraf. For alle analyseparametre skal laboratoriet have undersøgt instrumentel specificitet (f.eks. spektral eller chromatografisk adskillelse) og detektionsgrænse. Analyseparametre kan herefter være opdelt i grupper, hvor hver gruppe omfatter analyseparametre, der er kemisk/fysisk beslægtede (f.eks. mht. kogepunkt, polaritet, funktionelle og strukturelle ligheder m.v.), og som kan forventes at opføre sig ens under analysegangen. Laboratoriet skal have dokumenteret begrundelsen for opdelingen i grupper. Inden for hver gruppe skal der være foretaget validering af et relevant antal analyseparametre i gruppen, dog mindst to, i-det der fortrinsvis bør være valgt analyseparametre, der repræsenterer yderpunkterne i den pågældende gruppe. Valget af analyseparametre skal være begrundet. For analyseparametre, som herefter ikke er selvstændigt validerede/verificerede for alle karakteristiske parametre, skal analysemetoden indeholde særlige krav til bestemmelse af relevante karakteristiske parametre, første gang analyseparameteren detekteres i den pågældende matrice. Disse karakteristiske parametre kan f.eks. være specificitet, detektionsgrænse, korrekthed og præcision. Assessoren bør sikre sig, at denne supplerende validering er gennemført ved at gennemgå et passende antal analyserapporter med henblik på at afdække, om der har været behov for opstilling og validering af særlige krav. Som opfølgning på valideringen af multimetoder bør laboratoriet i den interne kontrol på metoderne medtage et relevant antal analyseparametre, ud over dem, der blev udvalgt til den oprindelige validering. Kontrollen bør være gennemført på mindst 2 niveauer, og altid på lavt niveau. 5.6 Anvendelse af homogene kontrolmaterialer I denne retningslinie refereres der gentagne gange til anvendelsen af homogene kontrolmaterialer som udgangspunkt for fastlæggelse af analysemetodens korrekthed, præcision m.v. Afhængig af om der i den givne fase af valideringsarbejdet skal dokumenteres sporbarhed, kan laboratoriet i princippet vælge mellem flere typer (niveauer) af kontrolmaterialer. Ved bestemmelse af korrekthed, skal højeste grad af sporbarhed af det anvendte kontrolmateriale altid være tilstræbt. De homogene kontrolmaterialer har traditionelt været beskrevet som følger (stigende grad af sporbarhed): I Kontrolmateriale på brugerniveau dvs. erfaringsmæssigt et stabilt og homogent prøvemateriale (ikke nødvendigvis kontrolleret systematisk for stabilitet og homogenitet) med en eller flere egenskaber, som har en tilstrækkelig veldefineret sammensætning, der svarer til prøvens. Kontrolmaterialer er egnede til den løbende kontrol af apparatur eller analysemetodens karakteristiske parametre til sikring og dokumentation af, at fastlagte kvalitetskrav overholdes. Anvendes alene til bestemmelse af repeterbarhed og reproducerbarhed og ikke til kalibrering. II Kommercielt tilgængeligt kontrolmateriale, som er kontrolleret for homogenitet og stabilitet evt. med opgivet tillagt værdi, som dog ikke er bestemt ved en procedure, som berettiger til betegnelsen referencemateriale. Sådanne materialer kan benyttes i den interne kvalitetskontrol i stedet for materialerne beskrevet under I, endvidere kan forskellige laboratorier sammenligne analyseresultater på disse materialer, dvs. sammenlignende prøvninger mellem laboratorier, men uden sporbarhed.

14 Side : 14 af 25 Sådanne materialer betegnes ofte referencematerialer, hvilket i henhold til internationale standarder ikke er korrekt, se under III. III Referencematerialer er stabile og homogene materialer med en eller flere egenskaber, som er tilstrækkeligt veldefinerede til at kunne anvendes til kalibrering af et apparatur, vurdering af en analysemetode eller sikring af sporbarhed på kontrolmaterialer. IV Certificerede referencematerialer er referencematerialer med en eller flere egenskaber, hvis værdier er bestemt ved hjælp af teknisk gyldige måleprocedurer, og som er ledsaget af - eller er sporbart til - et certifikat eller anden dokumentation udgivet af en anerkendt, certificerende organisation. Disse certificerede referencematerialer kan anvendes til kalibrering af udstyr, til kontrol af analysemetoder, til kontrol af laboratoriepersonalets kompetence eller når to eller flere analysemetoder skal sammenlignes. (Definitionerne af III og IV er i overensstemmelse med de officielle definitioner i ISO Guide 30 [14]. Formuleringen under I og II, stammer hovedsageligt fra Handlingsplan for det metrologiske hovedområde: Kemi fra 1992) Laboratoriet bør have gjort sig overvejelser omkring anvendelse af homogene kontrolmaterialer på et relevant niveau i forbindelse med deres valideringsarbejde, idet der i videst muligt omfang er taget højde for behov for at anvende et kontrolmateriale med relevant matrice samt krav til sporbarhed. 5.7 Vurdering af omfang DANAK s assessorer skal vurdere, om laboratoriet fyldestgørende har afdækket krav til analysemetoden (f.eks. myndighedskrav eller andre almindeligt gældende krav i forbindelse med rutineanalyser; er der tale om nye eller reviderede analysemetoder i forbindelse med udvidelse af akkrediteringen under et såkaldt flexible scope, skal laboratoriet kunne dokumentere en tæt dialog med rekvirenten med henblik på afdækning af det aktuelle behov (gælder også for andre metoder); vurdere, om det opstillede valideringsprogram (protokol) og det udførte eksperimentelle arbejde kan anses for tilstrækkeligt til at dokumentere overholdelse af de opstillede krav og behov; vurdere, om resultatet af valideringen har vist, at de opstillede krav og behov er blevet opfyldt. Hvis DANAK s assessorer herefter skønner, at der må stilles krav om yderligere dokumentation for den pågældende analysemetode (dvs. gives som en afvigelse), bør et sådant krav underbygges med en begrundelse fra den ledende eller den tekniske assessor. Begrundelsen skal fremgå af besøgsrapporten. 6. Gennemgang af de karakteristiske parametre for en analysemetode I det følgende gennemgås de parametre, som karakteriserer en analysemetode, og som således skal gøres til genstand for en vurdering af analysemetodens egnethed i en given prøvningssituation. Det drejer sig om følgende karakteristiske parametre: selektivitet, måleområde, linearitet, følsomhed, detektionsgrænse, kvantifikationsgrænse, robusthed, korrekthed (udtrykt ved bias), præcision, måleusikkerhed og nøjagtighed.

15 Side : 15 af Selektivitet Definition Se punkt 4.27 (inkl. omtalen af begrebet specificitet ) Indhold Valideringsprogrammet for selektivitet/specificitet bør omfatte undersøgelse af mulige interferenser. Disse bør som minimum omfatte: undersøgelse af den rene (aktuelle) matrice eller en naturlig prøve med et så lavt indhold som muligt; undersøgelse af en opløsning af de relevante analyseparametre i et simpelt medium; undersøgelse af matrice spiket med rene analyseparametre. Evt. kendskab til potentielle interferenser afdækkes ved spikning med de pågældende interferensstoffer Omfang 1) I tilfælde af en anerkendt analysemetode (jf. afsnit 5.3), hvor specifikke interferensproblemer er omtalt, og hvor der ikke er begrundet mistanke om yderligere interferenser, skal der ikke være foretaget noget fra laboratoriets side (heller ingen verificering). I de tilfælde, hvor det drejer sig om anvendelse af laboratoriets egen-udviklede analysemetode, skal forventelige interferensproblemer være undersøgt og dokumenteret, jvf. beskrivelsen under indhold ovenfor. 2) Kunne en konkret anvendelsessituation give anledning til mistanke om yderligere interferensproblemer, skal disse være afklaret ved supplerende validering, inden analysemetoden er taget i anvendelse. 3) I laboratoriets erklæring vedrørende det valgte omfang af validering for den pågældende analysemetode, skal indgå overvejelser vedr. mulige interferenser - f.eks. kemiske spektrale chromatografiske detektionsmæssige ekstraktionsmæssige destillationsmæssige m.fl. interferenser, idet disse er vurderet i forhold til (så vidt muligt) specifikt beskrevne prøvematricer, og (om relevant) ved lave koncentrationer af de(n) aktuelle analyseparameter(tre). 6.2 Måleområde Definition Se pkt Indhold Til fastlæggelse af måleområdet bestemmes korrekthed og præcision med prøver, hvis koncentrationer repræsenterer det ønskede måleområde. En analysemetodes måleområde inkluderer evt. fortyndings-trin Omfang Laboratoriet skal have opstillet et valideringsprogram (protokol) med angivelse af, hvordan validering af analysemetodens måleområde kan fastlægges. Dette omfatter dokumentation af linearitet, korrekthed og præcision, jf. punkterne 6.3 (Linearitet), 6.8 (Korrekthed) og 6.9 (Præcision).

16 Side : 16 af 25 Korrekthed og præcision skal som minimum være dokumenteret ved måleområdets laveste og højeste koncentrationsniveau. Ofte vil det være relevant, at laboratoriet også har foretaget supplerende bestemmelser ved et antal niveauer inden for måleområdet. Anvender laboratoriet analysemetoden på matricer, hvis indhold af analyseparameter ligger over måleområdet, og som laboratoriet som følge deraf ønsker at fortynde, skal der foretages yderligere validering/verificering. Alternativt kan laboratoriet undtagelsesvist rapportere resultatet som over øvre grænse for valideret måleområde. 6.3 Linearitet / ikke-linearitet Definition Se pkt og Indhold Evaluering af linearitet kan ske på forskellige trin af en analysemetode: Linearitet kan undersøges for kalibreringsfunktionen og dermed alene dække den instrumentelle måling, eller lineariteten kan undersøges for metoden som helhed og dermed være en undersøgelse af korrekthed som funktion af prøvens koncentration. De her beskrevne undersøgelser er rettede mod fastlæggelse af kalibreringsfunktionens forløb. Principperne kan dog i vid udstrækning også anvendes ved vurdering af linearitet for metoden som helhed Det grafiske forløb af kalibreringskurver (linearitet/ikke-linearitet) fastlægges ved at analysere en række kalibreringsstandarder, som dækker hele det ønskede, instrumentelle måleområde. Kalibreringsstandarder kan være referencematerialer, som indeholder de aktuelle analyseparametre i det rette koncentrationsområde i relevante matricer. Oftest anvendes in-house kalibreringsstandarder i det ønskede koncentrationsniveau, helst bestående af den rette matrice. I tilfælde af at der anvendes rene opløsninger som kalibreringsstandarder, er der risiko for, at der er matrice effekter, som der ikke tages højde for. I dette tilfælde skal der ofres særlig omhu ved bestemmelse af metodens korrekthed Omfang Kalibreringsfunktionen er grundlaget for alle efterfølgende kvantitative bestemmelser, og laboratoriet må derfor have udvist særlig omhu ved validering af forløbet. Erfaringerne viser, at ukendskab til kalibreringskurvens præcise forløb er en udbredt kilde til fejlagtige resultater ved den efterfølgende rutinemæssige anvendelse af analysemetoden. Det er vigtigt, at linearitetsundersøgelsen er gennemført med kalibreringsstandarder af samme type, som senere anvendes ved rutineanalyse. Der eksisterer mange metoder til kalibrering og vurdering af linearitet, til dels dikteret af de forskellige analyseteknikker og deres konkrete anvendelse. Denne retningslinie udstikker derfor ikke generelt gældende, detaljerede retningslinier, som det vil være relevant at kræve i alle tilfælde.alle laboratorier skal dog have gjort sig detaljerede overvejelser over, hvordan validiteten af den anvendte kalibreringsfunktion og dennes grafiske forløb undersøges og dokumenteres. Som minimum bør disse overvejelser være baseret på følgende fremgangsmåde: 1. Måling på minimum 6 kalibreringsstandarder jævnt fordelt over måleområdet. Målingerne bør så

17 Side : 17 af 25 vidt muligt være foretaget i én serie med minimum dobbelt-bestemmelser (evt. triple-) på hvert koncentrationsniveau og i tilfældig orden. Skal analysemetoden især anvendes ved lave koncentrationer, bør målingerne yderligere omfatte supplerende koncentrationsniveauer i dette område. 2. Grafisk afbildning af respons som funktion af koncentration - både for enkeltværdier og for gennemsnit. 3. Vurdering af om der er (rimelig) varianshomogenitet over hele måleområdet (ud fra spredning på enkeltpunkter) 4. Gennemførelse af lineær regression. Regressionsberegningen bør være vægtet, hvis vurderingen af varianshomogeniteten under pkt. 3., peger på relevansen heraf. 5. Plotning af residualværdier i forhold til regressionslinien. 6. Vurdering af evt. outliere. Efter evt. forkastelse eller erstatning af ét eller flere datapunkter, skal pkt være gentaget. (Bemærk at forkastelse normalt kun bør have fundet sted, hvis laboratoriet har kunnet påvise en årsag til den ekstreme værdi, og hvis det i øvrigt efterlader tilstrækkeligt med punkter til gennemførelse af denne fremgangsmåde jf. pkt. 1.) 7. Vurdering af linearitet (ud fra plot af gennemsnit jvf. pkt. 2) samt residualplot) 8. Hvis en lineær sammenhæng ikke kan underbygges, kan laboratoriet have valgt én af flere fremgangsmåder: a. Indskrænkning af det anvendte måleområde og efterfølgende dokumentation af linearitet jf. pkt b. Beskrivelse af en stykkevis lineær sammenhæng, idet forskellen i hældningskoefficienter vurderes. c. Fastlæggelse af en polynomie-funktion af 2. eller 3. grad (OBS: kræver normalt min. hhv. 9 eller 12 datapunkter; 4.-grads polynomier og derover vil normalt være urealistiske) - og efterfølgende vurdering af residualer Da mange laboratorier erfaringsmæssigt vurderer graden af lineær sammenhæng udelukkende ved at se på korrelations- (r) eller determinations-koefficienten (r 2 ) for det aktuelle datasæt, skal det understreges, at det ikke er tilstrækkelig dokumentation af linearitet. Laboratoriet skal som minimum også have foretaget en visuel vurdering af plots jf. ovennævnte fremgangsmåde, men derudover kan r eller r 2 godt være anvendt som en supplerende parameter i vurderingerne. En goodness of fit- eller lack of fit test kan underbygge den visuelle vurdering. De af laboratoriet anvendte kalibreringsstandarder skal være af samme type, som efterfølgende anvendes ved rutine analyse. For visse metodetyper kan laboratoriet hensigtsmæssigt have vurderet metodens kalibreringsfunktion ved at studere en grafisk afbildning af responsfaktorer på forskellige niveauer. Ved responsfaktor forstås i denne sammenhæng forholdet mellem respons for en given analyseparameter og det reelle indhold af analyseparameteren (f.eks. indhold i certificeret referencemateriale eller spiket indhold i naturlige prøver). Hvis laboratoriet har anvendt f.eks. instrument-integreret software til automatisk beregning af regression, bør man som minimum have sikret sig, at diverse plots egner sig for en visuel vurdering, og at anvendte algoritmer i øvrigt er i overensstemmelse med ovenstående principper. De gennemførte undersøgelser (jf. det ovenstående) dokumenterer kalibreringsfunktionens kurveform, men ikke nødvendigvis at kalibreringen fører til et korrekt resultat. Dette vil først fremgå ved undersøgelse af metodens korrekthed (se afsnit 6.8). Har laboratoriet på baggrund af ovenstående dokumenteret og beskrevet en lineær sammenhæng indenfor måleområdet, kan den efterfølgende rutinemæssige kalibrering af udstyr ofte være enklere (f.eks. 2-punkts kalibrering), idet laboratoriet dog skal have taget hensyn til evt. manglende varianshomogenitet i måleområ-

18 Side : 18 af 25 det. Undersøgelser til validering af metoden skal hereefter være udført med den kalibreringsprocedure, der er valgt til rutinebrug. 6.4 Følsomhed Definition Se pkt Indhold Følsomheden beregnes ved hjælp af hældningen på kalibreringskurven under bestemmelse af det lineære område. Følsomheden vil være afhængig af apparaturet og dets optimering Omfang I det omfang følsomheden har indflydelse på én eller flere af de andre karakteristiske parametre, skal den være fastlagt med tilhørende acceptgrænse. Det skal være dokumenteret i hvor høj grad følsomheden har indflydelse på andre karakteristiske parametre. 6.5 Detektionsgrænse Definition Se pkt. 4.5 Laboratoriet skal følge den definition, der er almindeligt gældende på det pågældende prøvningsområde Indhold Detektionsgrænsen baseres primært på standardafvigelsen for naturlige prøver uden - eller med et meget lavt - indhold af analyseparameteren. Alternativt kan anvendes blindprøver eller naturlige prøver eller homogene kontrolmaterialer med et meget lavt indhold af analyseparameteren, hvor der med lavt indhold menes et indhold, der er så tæt som muligt på den forventede detektionsgrænse. Disse kan dog give lavere værdier for detektionsgrænsen. Ved bestemmelse af detektionsgrænsen skal hver prøve have gennemgået hele analysemetoden. Anvendes en definition af detektionsgrænse baseret på ønsket om at undgå falsk positive eller falsk negative resultater skal den anvendte standardafvigelse være baseret på metodens repeterbarhed. Anvendes en definition af detektionsgrænse baseret på ønsket om at begrænse usikkerheden på målingen bør standardafvigelsen være baseret på metodens laboratoriereproducerbarhed, det vil sige en standardafvigelse, som indeholder både variation indenfor en dag og dag-til-dag variation. Inden for visse prøvningsområder er der imidlertid en tradition for eller ligefrem et krav om at anvende repeterbarhedsstandardafvigelsen i stedet for den totale standardafvigelse. Valget af mål for variation må derfor afstemmes efter hvad der er gængs standard eller krævet for prøvningsområdet. Laboratoriet skal begrunde valget af definition af detektionsgrænse og valget af mål for variation til beregning heraf. Bestemmelse af standardafvigelse foretages på samme måde, som beskrevet i afsnit 6.9, Præcision. Hvis detektionsgrænsen (DL) er baseret på ønsket om at undgå falsk positive eller falsk negative resultater, så bør beregningen være foretaget således:

19 Side : 19 af 25 DL = 2 t 1 α ( f ) s r hvor 2 skyldes ønsket om at have en risiko for falsk negative resultater på α. Dette (α) er tillige risikoen for falsk positive resultater ved en koncentration lig med 1 t 1 α ( f ) sr. Ved en koncentration lig med detektionsgrænsen er risikoen for falsk positive resultater mindst 10 gange mindre end α. t 1-α tabelværdien i Student s t-fordeling med accepteret risiko α for falsk negative resultater og f frihedsgrader f antallet af frihedsgrader ved bestemmelsen af s r, s r, repeterbarhedsstandardafvigelsen for naturlig prøve uden indhold eller prøve med indhold af analyseparameteren så tæt som muligt på forventet detektionsgrænse Hvis der i beregning af analyseresultatet fratrækkes en blindværdi bør følgende udtryk være anvendt til beregning: 2 2 DL = 2 t α ( f ) s + s 1 n, 1 r r, blind + 1 hvor: s r,blind repeterbarhedsstandardafvigelsen for en blindprøve, og n antallet af blindprøver i en serie ved rutineanalyse. Hvis detektionsgrænsen (DL) er baseret på ønsket om at begrænse usikkerheden på målingen, så bør beregningen være foretaget således: DL = blindværdien + k s hvor k s en faktor som ganges på standardafvigelsen for at beregne usikkerheden. Traditionelt anvendes i denne sammenhæng 3. standardafvigelse for naturlig prøve uden indhold, for prøve med meget lavt indhold af analyseparameteren eller for blindprøve. Standardafvigelsen bør være laboratoriereproducerbarheden med mindre laboratoriet med faglig begrundelse har argumenteret for anvendelse af repeterbarhedsstandardafvigelsen. I de fleste tilfælde trækkes blindværdien fra måleresultatet inden endelig beregning af analyseresultatet. Er dette tilfældet kan den også fratrækkes detektionsgrænsen, som derved alene bliver k. s. Laboratoriet bør være opmærksom på branchespecifikke krav for bestemmelse af detektionsgrænse Omfang Laboratoriet skal have valideret/verificeret detektionsgrænsen i alle tilfælde, hvor en analysemetode anvendes ved lave koncentrationer, hvorved i denne sammenhæng forstås koncentrationer mindre end 5 gange den forventede detektionsgrænse. Standardafvigelsen, som lægges til grund for beregning af en detektionsgrænse skal være bestemt med mindst 6 frihedsgrader. Det kan f.eks. være sket ved gennemførelse af 7 bestemmelser i én analyseserie eller ved dobbeltbestemmelser i hver af 6 analyseserier.

20 Side : 20 af Kvantifikationsgrænse Definition Se pkt Indhold Kvantifikationsgrænsen bør så vidt muligt baseres på laboratoriereproducerbarheden for naturlige prøver uden indhold af analyseparameteren, blindprøver eller naturlige prøver eller homogene kontrolmaterialer med et meget lavt indhold af analyseparameteren, hvilket vil sige de samme prøver, som anvendes ved bestemmelse af detektionsgrænsen. Standardafvigelsen bestemmes som beskrevet i afsnit 6.9 Præcision. Kvantifikationsgrænsen beregnes traditionelt som blindværdien plus 10 gange repeterbarhedsstandardafvigelsen, eller i nogle sammenhænge anvendes 3 gange detektionsgrænsen, hvilket giver stort set samme tal. Andre faktorer kan anvendes inden for visse prøvningsområder og laboratoriet må i så tilfælde referere til den faktor, som er gængs indenfor det aktuelle prøvningsområde. I de fleste tilfælde trækkes blindværdien fra måleresultatet inden endelig beregning af analyseresultatet. Er dette tilfældet kan den også fratrækkes kvantifikationsgrænsen, som derved alene bliver en faktor gange s Omfang Mange prøvningsområder opererer ikke med kvantifikationsgrænsen. Kvantifikationsgrænsen skal derfor alene indgå i validering såfremt det er krævet for det aktuelle prøvningsområde. 6.7 Robusthed Definition Se pkt Indhold Ændringer i de eksperimentelle betingelser for en analysemetode, som f.eks. kilde og alder af reagenser, ph, prøvens sammensætning og temperatur m.v., kan evt. have indflydelse på metodens resultater. Specielt vil disse betingelser måske ændres, hvis andre laboratorier anvender samme analysemetode. Det er muligt systematisk at undersøge om små ændringer i proceduren giver signifikante ændringer i analyseresultatet ved en robusthedstest. Herved undersøges effekterne på den analytiske metode, når der sker små ændringer i enten omgivelser og/eller i metodeproceduren - i forhold til præcision og/eller nøjagtighed. For en nærmere beskrivelse af en forsøgsopstilling til robusthedstest henvises der til Statistical Manual of the AOAC [11] Omfang De betingelser, som kan have en signifikant effekt på analysemetodens resultater, skal være identificeret. Der skal være foretaget forsøg ved hjælp af blindprøver, (certificerede) reference materiale, prøver med kendt sammensætning m.m., hvor man har foretaget en til flere ændringer i proceduren og vurderet effekten på analyseresultatet. I tilfælde af en anerkendt analysemetode, hvor specifikke robusthedsproblemer er omtalt, og hvor der ikke er begrundet mistanke om andre problemer, anses robusthedstest for tilstrækkelige.