Veterinært specialeprojekt 27 ECTS point Morten Brøgger V9030

Transkript

1 Undersøgelse af Lawsonia intracellularis smittedynamik i en besætning, samt forekomst i miljøet Assesment of infection dynamics of Lawsonia intracellularis in a herd and occurrence in the environment Veterinært specialeprojekt 27 ECTS point Morten Brøgger V9030 Vejledere: Lektor Helle Stege, institut for produktionsdyr og heste, Biovidenskabelige Fakultet for fødevarer, veterinærmedicin og naturrecurcer. Københavns Universitet. Professor Jens Peter Nielsen, Institut for produktionsdyr og heste, Biovidenskabelige Fakultet for fødevarer, veterinærmedicin og naturrecurcer. Københavns Universitet. Dyrlæge Markku Johanssen, Danish Meat association. Seniorforsker Peter Ahrens, Peter Ahrens Veterinærinstituttet, DTU.

2 Resumé I en tidligere undersøgelse af smittedynamik, i besætninger inficeret med Lawsonia intracellularis, sås i en besætning et anderledes forløb af infektionen, hvor grisene serokonverterede allerede ved fravænning. Omstændighederne ved denne specielle smittedynamik ønskedes belyst, og nærværende undersøgelse blev iværksat, med arbejdshypotesen: Grise der serokonverterer tidligt har anderledes tilvækst end grise der serokonverterer sent. Undersøgelsen omfattede 78 grise (8 kuld), der blev fulgt fra 2-4 dage efter fødsel og 84 dage frem, med prøveudtagning ca. hver 14. dag. Følgende prøver blev udtaget: blodprøve, der blev analyseret for IgG ved ELISA, rectalsvaber der blev analyseret for levende LI ved hjælp af RT-PCR. Desuden blev der udtaget miljøprøver til undersøgelse af grisenes nærmiljø. Disse prøver blev ligeledes undersøgt for LI ved hjælp af RT-PCR. Derudover blev grisene vejet. Alle kuld serokonverterede samtidigt, og derfor kunne der ikke undersøges for forskelle i tilvækst ved henholdsvis tidlig og sen serokonvertering. Der fandtes en god sammenhæng mellem LI-udskillelse fra grisene og forekomsten målt i miljøet, ved de målinger hvor 100 % af grisene udskilte bakterier. Der fandtes også en tendens til lavere udskillelse af bakterier hos grise med højt maternelt antistofniveau. Desuden fandtes en tendens til at grise med højt antistofniveau har større udskillelse i fæces.

3 Abstract: In an previous infection dynamics survey, one herd had a an increase in the number of sero-positive piglets indicating an active infection at weaning. The objective of this study was to investigate weather pigs with an early seroconversion had a different weight gain than pigs with an late seroconversion. 78 pigs (8 litters) were included in the study when they were between 2-4 days of age and followed for 84 days. Every second week the pigs were weighed and fecal as well as blood samples were collected. Fecal shedding of L.intracellularis was assessed by real time-pcr and sero-conversion by ELISA. Furthermore a samples from the environment was collected. All litters seroconverted at the same time, and the investigation weather pigs with an early seroconversion had a different weight gain, was not possible. A relationship between fecal shedding and occurrence of bacteria in the environment was found. Furthermore there was found a tendency to a lower shedding of bacteria from pigs with high maternal antibodies, and a tendency to higher fecal shedding among pigs with high antibody level.

4 Forord Nærværende projekt er mit bud på et veterinært specialeprojekt på 27 ECTS point. Dette projekt er afsluttende for dyrlægeuddannelsen. Projektet består af 2 dele, et litteraturstudie og en undersøgelse. Specialeprojektet er en del af en større undersøgelse, iværksat af DFVF og Danish Meat Association. Emnet har jeg valgt, da jeg anser Lawsonia intracellularis som et af de vigtigste patogener i den danske svineproduktion. Målgruppen for dette speciale er dyrlæger og veterinærstuderende. Tak til: Mine vejledere: For tålmodighed og svar på spørgsmål, også på underlige tidspunkter af døgnet. Henrik Frandsen: Som lagde besætning og personale til. Ulrik O. Bech: For kritisk gennemgang, mange diskussioner, og gode forslag. Kristian M. Kamstrup: For teknisk hjælp og kritisk gennemgang. Maiken L. Brøgger: For stor tålmodighed og forståelse under udarbejdelsen af dette projekt. København, den 1/ Morten Brøgger

5 Indholdsfortegnelse Forkortelser:...1 Indledning:...2 Litteraturstudiet...3 Historik:...3 Specielle danske forhold...4 Karakteristik af patogenet, Lawsonia intracellularis...5 Værtsspektrum...7 Epidemiologi...7 Risikofaktorer...8 Smittedynamik...8 Smittespredning...9 Forebyggelse...9 Behandling...11 Patologi...11 Kliniske symptomer...11 Patogenese...13 Immunologiske forhold...15 Humoral immunitet...15 Mucosal immunitet...16 Celle medieret immunrespons...17 Diagnostik...17 Ante mortem...17 PCR...17 Immunoperoxidase farvning (IPX)...18 Immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens...19 Serologiske tests...19 Post mortem...19 Differential diagnoser...20 Økonomiske forhold...20 Fodring...21 Tilvækst...21 Undersøgelse af Lawsonia intracellularis smittedynamik i en besætning, samt forekomst i miljøet23 Introduktion...23 Formål...23 Materialer og metoder...24 Undersøgelsens design...24 Stikprøvestørrelser og selektion...24 Undersøgelses procedure...25 Laboratoriemetoder...25 Epidemiologiske metoder...25 Sektion...26 Miljøprøver...27 Resultater...28 Undersøgelse af betydning af tidlig serokonvertering...29 Undersøgelser med kuld...31

6 Undersøgelser med paritet...33 Maternelt antistofniveau...33 Betydning af maternelle antistoffer...34 Sammenhæng mellem OD-værdier og CT-værdier...35 Betydning af høj/lav fødselsvægt...36 CT-værdi hos grise med diarré...37 Prøver fra farestalden...38 Miljøprøver...38 Obduktion...41 Diskussion...42 Konklusion...46 Perspektivering...46 Litteraturliste...47

7 Forkortelser: PIA PHE LI PCR rrna cdna RNA DNA RT-PCR CT ELISA PPE PE OD VNTR RI NE Porcin Intestinal adenomatose Porcin Hæmorrhagisk enteropati Lawsonia intracellularis Polymerase chain reaction Ribosomalt RNA copy-dna Ribonucleic acid Deoxyribonucleic acid Reverse transcriptace PCR Cycle threshold Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Porcin Proliferativ Enteropati Proliferativ enteropati Optisk densitet Viable-number tandem repeats Regional ileitis Nekrotisk enteritis 1

8 Indledning: Nærværende opgave omhandler Lawsonia intracellularis (LI), som er agens ved Porcin Proliferativ Enteropati (PPE). Undersøgelser har vist, at op imod 100 % af alle danske svinebesætninger er inficeret med LI. (Hardge et al., 2006). LI er af væsentlig økonomisk betydning for producenten, både i form af nedsat tilvækst, dårligere foderudnyttelse, forstyrrelser i flow i slagtesvinestalden og udgifter til medicinering og ekstra arbejde. På baggrund af den høje prævalens samt den store økonomiske betydning, er det relevant at undersøge, hvorvidt tidlig infektion med LI har en betydning for tilvæksten. Opgaven består af 2 dele, et litteraturstudie af LI samt en kohorteundersøgelse af betydningen af tidlig serokonvertering for LI. I litteraturstudiet redegøres for patogenet, LI, epidemiologi omkring infektionen, patogenese og patologi, immunologiske forhold, diagnostiske muligheder, samt kort omkring økonomisk betydning af patogenet. I den anden del af opgaven behandles data fra serologiske prøver, fæcesprøver og prøver udtaget fra miljøet, særligt med henblik på at belyse betydningen af LI-infektion og grisenes tilvækst samt forekomsten i miljøet. 2

9 Litteraturstudiet Historik: Læsionerne i forbindelse med en Lawsonia-infektion blev først beskrevet i 1931 af Biester og Schwarte i Ames, Iowa, USA (Biester og Schwarte, 1931). I forbindelse med et større udbrud i 1972, blev sygdommens patoanatomiske forandringer beskrevet. Man kunne dog ikke på dette tidspunkt påvise noget patogen, men der var indicier på at der var tale om et infektiøst agens, idet det blev antydet af smittemønstret i besætningen. (Rowland og Rowntree, 1972). Det skulle med tiden vise sig at agens var særdeles vanskelig at isolere. I 1973 blev læsionerne igen beskrevet af Alan Rowland og Gordon Lawson, og i forbindelse med denne forskning, fandt man, i de afficerede celler, s-formige intracellulære bakterier beliggende frit i enterocytternes cytoplasma. Bakterierne kunne påvises både ultrastrukturelt og ved immunoflourcens (Rowland et al., 1973; Rowland og Lawson, 1974). Ved et bakteriologisk studie i 1974 blev bakterien klassificeret som Campylobacter sputorum ssp. mucosalis, primært på grundlag af morfologiske ligheder, selvom der var visse ting der ikke passede ind i denne klassifikation, eksempelvis manglende dyrkningsresultater og det faktum at bakterien er intracellulær (Lawson og Rowland, 1974). I det næste årti blev der gentagne gange isoleret forskellige Campylobacter stammer fra læsionerne, men det lykkedes ikke at reproducere sygdommen ved hjælp af disse isolater (Gebhart et al., 1985; Kroll et al., 2005). Til trods for at Campylobacter tidligere jævnligt blev isoleret i forbindelse med proliferativ enteritis var de ofte ikke tilstede ved infektionerne (Lawson og Gebhart, 2000). I 1977 lykkedes det for Roberts et al. at reproducere intestinal adenomatose og nekrotiserende enteritis ved hjælp af inficeret mucosa (Roberts et al., 1977). I 1985 lykkedes det for Lawson et al. at fremstille polyklonale antistoffer mod agens, selvom resultaterne dog blev beskrevet som svage. Det viste sig at de antistoffer der blev produceret var rettet mod de intracellulære organismer og ikke mod de Campylobacter spp. de blev testet imod (Lawson et al., 1985). Dermed blev det klart at det ikke var Campylobacter der var agens og man kaldte derfor agens for Campylobacter-like organisms (CLO).. I 1987 lykkedes det for McOrist et al., at fremstille monoklonale antistoffer mod agens. Samtidig blev agens påvist i fæces (McOrist et al., 1987). 3

10 I 1991 blev agens for første gang dyrket i en cellekultur som en del af et forsøg udført af Stills. Endvidere lykkedes det for ham at reproducere sygdommen hos hamster, ud fra de bakterier der var blevet dyrket. I forsøget blev der ligeledes fremstillet polyklonale antistoffer, der bekræftede resultatet. Dog var mange af isolaterne kontamineret med Chlamydia spp., som skabte nogen tvivl om resultatet(stills, 1991). Det store forskningsgennembrud kom omkring 1993 hvor Lawson et al. beskrev in vitro dyrkningen af intracellulære organismer i en rotte enterocyt cellekultur. Isolatet stammede fra tarmepitelceller fra grise fra fire forskellige besætninger, og bakterierne blev dyrket over 20 passager. Det lykkedes for Lawson et al. at beskrive bakterierne og deres vækstbetingelser, samt at holde cellekulturerne fri for andre bakterier (Lawson et al., 1993). Senere samme år lykkedes det for McOrist et al. at reproducere sygdommen ved hjælp af et isolat af ileal symboint intracellularis, som var det trivialnavn der blev foreslået af Gebhart et al. (1993) og det blev derved vist at dette intracellulære patogen kunne forårsage sygdommen. I en artikel fra 1995 af McOrist et al. blev bakteriens taksonomiske placering bestemt, som en ny genus og ny species. Navnet Lawsonia intracellularis blev foreslået for at ære Lawson, der havde været en pioner i Lawsonia forskningen siden starten af 1970erne (McOrist et al., 1993). I 1995 udviklede Knittel et al. en brugbar serologisk test til detektion af infektionens udbredelse i eks. en besætning (Knittel et al., 1998). I 2005 blev genomet for Lawsonia kortlagt af Kaur et al. (ExPASy Proteomics, 2007). Specielle danske forhold Op gennem 1990erne observeredes en stigning af brugen af totalt antibiotika i landbruget (til forebyggelse, vækstfremmere og behandling) (Wegener, 2006). Samtidig var der stor bekymring omkring udviklingen af antibiotikaresistens blandt diverse patogener, både animale og humane. Dette førte i 1995 til at brugen af avoparcin til vækstfremmer blev forbudt. Dette forbud blev i 1998 udvidet til også at omfatte virginiamycin (WHO report, 2003). I februar 1998 besluttede de danske svineproducenter frivilligt at stoppe brugen af antibiotiske vækstfremmere (sub-terapeutiske doser af antibiotika) til slagtesvin, og fra december 1999 at stoppe med brugen af antibiotiske vækstfremmere til fravænningsgrise (WHO report, 2003). I tiden der fulgte, viste Lawsonia intracellularis (LI) sig at blive et mere betydende problem i de danske besætninger, end før ophøret med de antibiotiske vækstfremmere (Jensen, 2006). Prævalensen for LI er stort set uændret (Stege et al., 2000; Hardge et al., 2006), men infektionen viser et mere klinisk forløb (Jensen, 2006). At vækstfremmere har en effekt overfor LI, er påvist gennem forsøg (McOrist et al., 1996b; McOrist et al., 1997b; Kroll et 4

11 al., 2005). Da andelen af LI smittede besætninger i Danmark er i omegnen af 100 %, står det klart at PPE er af stor betydning (Stege et al., 2000; Hardge et al., 2006). Karakteristik af patogenet, Lawsonia intracellularis LI tilhører sit eget genus; de nærmeste slægtninge, målt på 16s underenheden, er det humane fritlevende patogen Bilophila wadsworthia med 92 % homologi (Lawson og Gebhart, 2000) og Desulfovibrio desulfuricans med 91 % homologi, mens slægtsskabet med Campylobacter species kun er på ca. 80 % (Gebhart et al., 1993). LI adskiller sig fra andre sulfatreducerende bakterier i desulfovibrionaceae familien ved ikke at være sulfatreducerende, være obligat intracellulær, samt at være patogen (Gebhart, 2006). Bakterien er en mikrofil Gram-negativ stavbakterie, svagt S-formet, og måler i længden ca. 1,25 1,75 µm og 0,25 0,43µm i bredden. Den har afrundede ender og en bølget ydre membran. Bakterien er ikke sporedannende og formerer sig ved deling (Gebhart et al., 1993). Der er ikke observeret pili eller fimbriae, men det angives at en lang flagel er observeret i bakterier dyrket i cellekultur, dog kun når bakterien har været lokaliseret ekstracellulært (Lawson og Gebhart, 2000; McOrist og Gebhart, 2006). Bakterien viser tegn på bevægelse, en darting motility, idet den frigiver sig fra den inficerede celle (Gebhart, 2006). Der er ingen vækst på traditionelle medier, idet bakterien ikke kan dyrkes ekstracellulært, sikkert på grund af et behov for præformerede trifosfater fra værtscellens mitochondrier. Det betyder at en dyrkning kræver en cellekultur med delende eukariotiske celler (Gebhart, 2006). Man har haft held til at dyrke bakterien i følgende cellekulturer: Rat intestinal cells (IEC-18) (Lawson et al., 1993), Human fetal intestinal celles (Int 407) (Lawson et al., 1993), Rat colonic adenocarcinoma celles (CRL 1677) (Lawson et al., 1993), pig kidney cells (PK-15) (Lawson et al., 1993), piglet intestinal epithelial cells (IPEC-J2) (McOrist et al., 1995a), guinea pig colonic adenocarcinoma cells (CPC-16) (Stills, 1991) samt mouse fibroblast cells (McCoy) (Knittel og Roof, 1999; Wattanaphansak et al., 2005). Taksonomisk placering (Gebhart et al., 1993): Rige: Bacteria Phylum: Proteobacteria Subphylum: Delta/epsilon subdivitions Klasse: Delta proteobacteria Orden: Desulfovibrionales Familie: Desulfovibrionaceae Genus: Lawsonia Species: Lawsonia intracellularis 5

12 Ved en nyere metode kan man dyrke cellerne i en suspension (Knittel og Roof, 1999). Dette åbner mulighed for at fremstille en stor mængde LI, f.eks. til fremstilling af vaccine. Da man i 1993 reproducerede sygdommen, brugte man både gnotobiotiske (kimfrie) grise, samt grise fra en SPF-besætning, hvor der ikke tidligere havde været tegn på PPE. Imidlertid var det kun SPF-grisene der udviklede sygdommen (McOrist et al., 1993). Dette gav anledning til undren, og forsøget blev gentaget; dog blev der denne gang tilsat en bakteriekultur af apatogene bakterier til de gnotobiotiske grise. Ved dette andet forsøg lykkedes det at reproducere sygdommen i de gnotobiotiske grise. Man mener at årsagen var at disse synergistiske bakterier ændrer nærmiljøet i tarmen (med hensyn til ph, oxidation-reduktions potentiale), således at Lawsonia kan trives bedre (McOrist et al., 1994). Kultiveringen af LI i cellekultur stiller da også særlige krav til omgivelserne, nemlig: % N 2, 4-10 % CO 2, 0-10 % O 2, en temperatur på 37 C og en høj luftfugtighed (Lawson et al., 1993; Kroll et al., 2005). Lawsonia intracellularis (LI) er en obligat intracellulær bakterie, der vokser i enterocytter, primært i ileum. LI er primært lokaliseret i den apikale del af cytoplasma, lige under brushborderen. Den ligger frit i cytoplasma, altså ikke i vacuoler, bundet til membraner eller lign. LI har et lille cirkulært genom ( bp) og 3 plasmider (henholdsvis , og bp) (GIB, 2007). Der er stor homologi mellem genomerne af de forskellige typer af stammer, således er det angivet at der er >98 % homologi mellem stammer fra hamster og svin (Cooper et al., 1997). En kilde angiver europæiske og amerikanske isolater ligner hinanden. Dette er dog baseret på det faktum at de begge kan forårsage ens sygdomsbilleder, ikke på en egentlig sammenligning af genomerne (Knittel et al., 1996). Ny teknik baseret på viable-number tandem repeats (VNTR) har vist stor variation blandt forskellige isolater og kan måske i fremtiden bruges til at adskille de forskellige isolater og dermed yderligere belyse epidemiologien omkring PPE (Gebhart, 2006). Det er muligt at anvende Variable-number tandem repeats (VNTRs) til at give et unikt fingeraftryk af en bakterie(beckler og Gebhart, 2006). VNTRs er korte DNA sekvenser der gentages et forskelligt antal gange i kromosomet i cellen. Ved hjælp af primere, som bindes uden for disse sekvenser, kan man ved hjælp af PCR opformere dette stykke. Længden af det udklippede stykke, varierer efter antallet af VNTRs. En efterfølgende elektroforese kan derfor give et fingeraftryk af den pågældende celle (Beckler og Gebhart, 2006). 6

13 VNTRs har vist sig at være en unik markør for forskellige isolater fundet i epidemiologiske urelaterede LI udbrud. Ved hjælp af denne metode åbnes der måske mulighed for at opspore smittekilden til en nyinficeret besætning (Beckler og Gebhart, 2006). Værtsspektrum LI forårsager enteritis primært hos hamster (Frisk og Wagner, 1977) og svin, men kan også inficere følgende dyrearter: Makakaber (Klein et al., 1999), marsvin (Elwell et al., 1981), hest (Williams et al., 1996), rotte (Vandenberghe et al., 1985), fritte (Fox og Lawson, 1988), ræv (Eriksen og Landsverk, 1990), hund (Leblanc et al., 1993), kanin (Hotchkiss et al., 1996), hjort (Cooper et al., 1997), struds (Cooper et al., 1997) og mus (Smith et al., 2000; Bednar, 2006). Trods menneskers nære slægtskab med makakaber er bakterien aldrig påvist hos mennesker, og LI betragtes derfor ikke som en zoonose (McOrist og Gebhart, 2006; Jacobson et al., 2006). En sammenhæng med humane sygdomme som Crohns sygdom og ulcerativ colitis er også udelukket (Michalski et al., 2006). Epidemiologi Porcin proliferativ enteropati (PPE) er en sygdom, der medfører et betydeligt økonomisk tab (Kroll et al., 2005), og er vidt udbredt i både indendørs og udendørs svinebesætninger over hele af verden (McOrist et al., 2003). Andelen af smittede besætninger svinger de forskellige lande imellem fra 57 % i Portugal til 100 % i lande som Sverige, Schweiz, Grækenland, Italien, Tjekkiet og Danmark, undersøgt ved hjælp af serologiske tests (McOrist et al., 2003; Hardge et al., 2006). Der er en tendens til at sygdommen har større betydning i USA og Nordeuropa. Der kan være mange årsager til denne forskel i udbredelsen af PPE. En kan være forskellen i de racer der benyttes i de forskellige regioner idet der er tegn på at hvide racer er mere følsomme for bakterien end de farvede racer, som f.eks. duroc (McOrist et al., 2003). En anden årsag kan være at nogle lande stadig tillader anvendelsen af antibiotiske vækstfremmere (McOrist et al., 2003). I en artikel af McOrist et al. (2003) forklares årsagssammenhængen i den intensivering, svineproduktionen har været udsat for i disse lande, gennem de seneste årtier. Tidligere var svineproduktionen præget af små familiebrug, hvor grisene fik lov til at gå hos soen i mange uger. Kravet om en effektivisering af landbruget satte svineproduktionen mere i system, således at dyr i en specifik aldersgruppe blev opstaldet i separate stalde, og eventuelt andre lokalisationer ( sites ). Ligeledes blev fodringen optimeret, tætheden i staldene blev forøget og fravænningsalderen blev nedsat. 7

14 Den begrænsede kontakt mellem so og afkom, sammen med at disse småpopulationer af grise med varierende immunstatus blev dannet, gav anledning til at komplekse ændringer i sygdomstransmissionen og -manifestationerne. Sygdomsagenser som Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae og Lawsonia intracellularis har forøget virulens overfor grise der smittes senere end grise der smittes tidligt (McOrist et al., 2003). Hele denne omlægning af svineproduktionen gav da også anledning til problemer med PPE, i hvert fald gav det anledning til kliniske symptomer med diarré (McOrist et al., 2003). Det faktum at grisene smittes senere, kan også give anledning til udvikling af den hæmorrhagiske form for sygdommen, frem for den kroniske (McOrist et al., 2003). Ved smitte med Lawsonia intracellularis hos grise der er under ca. 12 uger, ses udvikling af den kroniske form, Porcin intestinal adenomatose, (PIA) for sygdommen, mens hos grise ældre end det, udvikles den hæmorrhagiske form Porcin hæmorrhagisk enteropati, (PHE) af sygdommen (McOrist et al., 1993). Man må dog erindre at der tidligere var et andet mønster af andre patogener der huserede i besætningerne, såsom Salmonella, dysenteri og diverse parasitter. Disse patogener kan have sløret de kliniske tegn fra en LI infektion(mcorist et al., 2003). Tillige bør det nævnes at det først er relativt for nyligt at man har haft adgang til pålidelige ante mortem tests. I tiden før det blev muligt at dyrke bakterien, og dermed fremstille antigen til serologiske tests, var det kun muligt at stille diagnosen post mortem ved histologi (McOrist et al., 2003). Det er først med udviklingen af de nye ante mortem tests at man har fået et reelt overblik over LIs udbredelse (McOrist et al., 2003). Risikofaktorer Ud fra en undersøgelse af managementfaktorers betydning for LI seropostivebesætninger, kunne man fastslå følgende risikofaktorer for seropositive sobesætninger (Bronsvoort et al., 2001): Kontinuerlig drevet farestald uden vask, lav paritet i besætningen (Stor andel af unge søer), samt LI seropositive slagtesvin på samme ejendom. For slagtesvinebesætningen kunne man fastslå følgende risikofaktorer(bronsvoort et al., 2001): LI seropositiv sobesætning, antal dyr i tilgang til besætningen, samt fuldspaltegulv. Andre forfattere nævner derudover følgende risikofaktorer: Gamle bygninger (modsat nye stalde) (Bane et al., 2001), kontinuerlig drift, indkøbt/pelleteret foder (Stege et al., 2001) og temperatursvingninger (Guedes, 2006). Smittedynamik Generelt ses to forskellige mønstre i smittedynamikken, der afhænger af grisenes alder, samt om infektionen er til stede hos søerne. 8

15 Det ene mønster er karakteriseret af en tidlig infektion i 4-7 ugers alderen og ses i kontinuert drevne besætninger. Nogle af søerne kan udskille LI med fæces, og dermed holde en subklinisk infektion i gang i soholdet, og via fæces smitte grisene allerede i farestalden. Dette ses især i besætninger, hvor de drægtige dyr går i løsdrift (McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003). I en undersøgelse af forekomsten af LI i de forskellige staldafsnit, sås da også fækal LI udskillelse fra 7,9 % af søerne i farestalden og hos 11,9 % af de drægtige dyr (Pozo et al., 2002). Der sker antageligt en infektion af grisene efterhånden som koncentrationen af maternelle antistoffer aftager af i 4-7 ugers alderen, og grisene samtidigt udsættes for fækal smitte, hvorefter de hurtigt smitter hinanden (McOrist og Gebhart, 2006). Det andet mønster er karakteriseret af en senere infektion hvor dyrene er uger gamle, og ses i besætninger der har en høj grad af sektionering. I soholdet ses der ikke LI infektion. Det er typisk at besætningen arbejder med en høj grad af sektionering eller multisite (Bronsvoort et al., 2001; McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003; McOrist og Gebhart, 2006). Smittespredning I et studie blev det vist at udskillelsen af bakterien starter 1-2 uger efter og kan vare i op til 12 uger efter infektionen (Guedes et al., 2002a). Disse resultater viser at der sker en intermitterende udskillelse af bakterier i dyr der ikke nødvendigvis viser kliniske tegn på sygdommen. I samme forsøg blev det vist at gylte der overlevede et udbrud med PHE var seropositive ved immunoperoxidase monolayer assay test(ipma) i op til 12 uger efter infektionen (Guedes og Gebhart, 2003). En dansk undersøgelse viste at grisene typisk starter med udskillelse i leveuge, og udskiller bakterier i 2-6 uger. Serokonvertering sker typisk 2 uger efter grisen begynder udskillelsen af bakterier og i denne undersøgelse var 92 % af grisene seropositive indtil slagtning. De serologiske prøver blev testet med en immunoflourcens antibody test (IFAT) (Stege et al., 2004). Ved forsøg er det vist at udskillelsen af bakterier begynder ca. 6 dage efter eksponeringen (McOrist et al., 1995a). Den infektive dosis af Lawsonia er meget lav. Mellem 1000 og bakterier er nok til at inducere infektion og fækal udskillelse 2-3 uger efter(guedes, 2006). Dog er der flere undersøgelser der bekræfter at jo større mængde LI grisen eksponeres for, desto mere syg bliver den (Guedes et al., 2003; Collins og Love, 2006). Forebyggelse Omgivelserne spiller også en rolle for smittespredningen. LIs overlevelsesevne i omgivelserne er i et forsøg fundet at være ret god, til trods for at bakterien er intracellulær. I forsøget blev det vist at 9

16 LI i cellefrie suspensioner kan henligge i luften i 6 dage ved 5 C, og stadig forblive infektiv. Dog faldt antallet af dage hvor bakterierne forblev infektive hurtigt ved en temperatur på 20 C, til 1 dag. LI-inficeret fæces med 1x10 6 til 1x10 7 bakterier / gram kan ligge i op til 2 uger, og stadig forblive infektiv. Ved efterfølgende eksponering for seronegative grise efter at fæces havde henligget i henholdsvis 1 og to uger, viste begge prøver sig at være infektive. Dog var antallet af infektive bakterier reduceret, og der observeredes en forskel i tiden fra inokulering til positiv PCR og serokonvertering. Således var gruppen, der var inokuleret med fæces, der var 2 uger gammelt, 5-12 dage længere om at vise en positiv PCR og 7 dage længere om at serokonvertere (Collins et al., 2000). Dette kunne indikere at der sker en reduktion i antallet af infektive bakterier over tid; i hvert fald stemmer dette fint overens med et forsøg hvor grise blev inokuleret med LI i 3 forskellige fortyndinger. Der observeredes ligeledes en forsinkelse i infektionen ved faldende fortynding (Guedes et al., 2003). LIs følsomhed overfor visse desinfektionsmidler er undersøgt. Effekten af desinfektionsmiddelgrupper som natrium hypoclorit, hydrogenperoxid og pereddikesyre kunne ikke undersøges, idet de ødelægger cellekulturen, som lawsonia efterfølgende dyrkes i (Collins et al., 2000). Kvaternære ammoniumforbindelser har vist sig 100 % effektive for 2 forskellige stammer fra hhv. PIA og PHE (Collins et al., 2000). Dog er de kvaternære ammoniumforbindelser ekstremt følsomme overfor organisk materiale, og er ikke anvendelige til stalddesinfektion (Barfod et al., 2002). Jodoforer har også vist sig at være meget effektive; i forsøget var der kun 1 % af prøverne der ikke var følsomme (Collins et al., 2000). Jodoforer er følsomme for organisk materiale, dog i mindre grad end de kvaternære ammoniumforbindelser. Desuden inaktiveres de hvis de kommer i forbindelse med metaller, dog ikke rustfrit stål (Barfod et al., 2002). Fenolderivater er mindre effektive; i forsøget viste 18 % af prøverne sig stadig at være infektive (Collins et al., 2000). Fenolderivater er også ret følsomme for organisk materiale. Desuden er de ret sundhedsskadelige i koncentreret form (Barfod et al., 2002). Kaliumperoxymonosulfat var i forsøget 100 % effektivt for det ene isolat fra en gris med PHE, men kun 89 % effektivt for det andet isolat fra en gris med PIA (Collins et al., 2000). Disse midler har udover et bredt virkningsspektrum en god effekt ved en temperatur ned til 5 C. De er moderat følsomme for tilstedeværelsen af organisk materiale (Barfod et al., 2002). 10

17 Da de undersøgte desinfektionsmidler generelt er så følsomme for organisk materiale, er det af stor vigtighed at der først foregår en grundig rengøring af stalden inden desinfektion, for at opnå en tilstrækkelig virkning af desinfektionsmidlet. Behandling Til behandling af LI infektioner har følgende antibiotika ved forsøg vist sig effektive (McOrist et al., 1995b): Meget lav MIC: Penicillin, erythromycin, difloxacin, virginiamycin og chlortetracyclin. Moderat MIC: Tilmicosin og tiamulin Fødevarestyrelsen anbefaler at der anvendes Tiamulin eller valnemulin som 1. prioritet, eller tetracycliner som andet valg (Fødevarestyrelsen, 2007). Patologi LI forårsager 4 forskellige symptombilleder, der kan opdeles efter hosstående model (Rowland og Lawson, 1975): Proliferativ enteropati (PPE) Porcin intestinal adenomatose (PIA) o Nekrotisk enteritis (NE) o Regional ileitis (RI) Proliferativ hæmorrhagisk enteropati (PHE) Kliniske symptomer De kliniske symptomer for PIA opdeles ikke i NE og RI ved beskrivelse af de kliniske symptomer. De typiske tilfælde er svage eller subkliniske. Oftest er det grise i alderen 6-20 uger der afficeres. Ofte ses uændret ædelyst, men nedsat tilvækst og foderudnyttelse. I andre tilfælde ses anorexi og letargi samt generel utrivelighed. Der ses ofte stor uensartethed blandt grisene i et hold. I nogle tilfælde ses diarré, som kan betegnes som løs, grålig til grønlig fæces. Blod- eller mucustilblanding ses ikke ved denne form for diarré. Hos nogle grise ses en kraftig inflammatorisk reaktion i den afficerede mucosa, evt. efterfulgt af nekrose. Disse grise er ofte hårdt ramt og ender som utrivelige grise (skravlgrise) der ikke kommer sig (McOrist og Gebhart, 2006) 11

18 Ved den hæmorrhagiske form (PHE) er det hyppigst de lidt ældre dyr (4-12 Mdr.) der afficeres, og det medfører ofte en ret høj mortalitet, op til ca. 50 %. De grise der overlever har kraftig nedsat tilvækst, og vil indirekte medføre et tab for producenten. Der ses initielt sort, tjærefarvet fæces, der efterhånden bliver vandig og blodtilblandet. Desuden ses tegn på akut hæmorrhagisk anæmi. Enkelte dyr kan også dø uden forudgående tegn på diarré eller anæmi (McOrist og Gebhart, 2006). Denne hæmorrhagiske form kan f.eks. ses hvis nye avlsdyr, fra en inficeret besætning, introduceres til en besætning, hvor dyrene er seronegative, eller hvor LI negative avlsdyr introduceres til en LI inficeret besætning (Kroll et al., 2005). De forskellige symptombilleder manifesterer sig alle som følge af forandringer i tarmen. Det er primært 50 cm af den distale del af tyndtarmen og 1/3 af den proximale del af colon der afficeres af PPE forandringer. I sværere tilfælde kan jejunum, caecum og resten af colon dog også afficeres (McOrist og Gebhart, 2006). En dansk undersøgelse af grise indsendt til obduktion for colitis viste at Lawsonia intracellularis er den hyppigste årsag til colitis, nemlig i ca. 79,6 % at de undersøgte dyr (Jensen et al., 2006). I en dansk undersøgelse er der fundet Lawsonia i tonsillerne, der dog ikke giver anledning til patologiske forandringer, men måske kan fungere som reservoir for bakterien (Jensen et al., 2000). Dog kunne det i undersøgelsen ikke påvises om bakterierne i tonsillerne var dræbte eller levende, men de mentes ikke at spille nogen rolle i patogenesen. Tilstedeværelsen i tonsillerne, kan være som følge af en oral smitte, men kan ligeledes være et resultat af en septikæmi (Jensen et al., 2000). Desuden er der påvist bakterier intracellulært i makrofager og i lamina propria i tilfælde med PHE og NE (Jensen et al., 1997). Endvidere er bakterielt antigen påvist i Peyerske pletter samt i subcorticale sinuser i de mesenterielle lymfeknuder (Smith og Lawson, 2001). De patoanatomiske forandringer ved de forskellige lidelser beskrives herunder (McOrist og Gebhart, 2006): Porcin intestinal adenomatose (PIA): Omfanget af læsionerne varierer en del, men et typisk billede er, at tarmvægen er kraftigt fortykket og rynket. Ved mindre læsioner er det mest sandsynlige sted for infektion ved ileocaecalklappen og ca. 10 cm proximalt. Der er ofte ødem i subserosa og i mesenteriet, som kan være med til at tarmen virker ekstra foldet. Mucosa er fugtig, men ikke slimet, og der kan evt. ses inflammatorisk eksudat. (McOrist og Gebhart, 2006) Histopatologisk ses typisk en adenomatøs proliferation af kryptepitelet i tyndtarmen og i 12

19 mucosal glands i tyktarmen med 5-10 epitelcellelag mod normalt et cellelag (McOrist og Gebhart, 2006). Desuden også tilstedeværelsen af S-formige intracellulære bakterier i disse enterocytter (Rowland og Lawson, 1974). Krypterne er forlængede og forstørrede, og der ses typisk en mitotiske celler. Bægerceller mangler i afficerede områder, og der er ikke nødvendigvis tilstedeværelse af inflammatoriske celler (Kroll et al., 2005). Nekrotiserende enteritis (NE): ved denne type ses, ud over læsionerne beskrevet ved PIA, en koagulationsnekrose med kraftig inflammatorisk eksudation til tarmlumen. Dette ses som gulgrå casts af nekrotoisk materiale der adhærerer kraftigt til mucosaen. Histologisk ses endvidere fibrinaflejringer og degenerative inflammatoriske celler (McOrist og Gebhart, 2006). Regional ileitis (RI): Dette er den kroniske form for PIA og ses som en næsten stift stykke af tyndtarmen, også benævnt Hose pipe eller garden hose gut (Kroll et al., 2005). I nogle tilfælde ses ulcerationer med granulationsvævsdannelse i mucosa, og i andre områder er vævet normalt (McOrist og Gebhart, 2006). Proliferativ hæmorrhagisk enteropati (PHE): Læsionerne findes primært i terminale ileum og colon. Tarmvæggen er dilateret og fortykket. I tarmlumen findes ofte store blodkoagler og rectum kan indeholde sortfarvet fæces. Tarmvæggen er kraftigt fortykket, men ellers ses ikke hverken blødningssteder, ulcera eller erosioner. Patogenese I et typisk infektionsforsøg, kan de proliferative forandringer i tarmen erkendes 1-3 uger efter inokulation, frigivelsen af bakterier til tarmlumen starter efter ca. 6 døgn, og infektionen er aftaget og afhelet efter ca. 4 uger (Gebhart, 2006). Der er følgende hovedbegivenheder i patogenesen: 1. Inokulation af bakterien i værtsdyret. 2. Optagelse i enterocytter ved endocytose. 3. Bakterien slipper ud af vakuolen. 4. Bakterien deler sig og inducerer deling af værtscellen. 13

20 5. Bakterien frigives til lumen. 6. Læsionerne afheles. Ad 1: Efter oral optagelse/inokulation føres bakterien hurtigt til den aborale del af tyndtarmen, samt til caecum. Ad 2: Når bakterien befinder sig i tarmlumen, sker der en interaktion mellem enterocytten og bakterien, der initierer til at Lawsonia intracellularis optages i cellen ved hjælp af endocytose (McOrist et al., 1997a). I forsøg med cellekultur er det vist at bakterien kan findes i cellen allerede efter 10 minutter efter inokulationen (McOrist et al., 1995a). Infektionen af Lawsonia intracellularis er afhængig af cellen og ikke af bakterien. Ved forsøg er det nemlig vist at både vitale og dræbte bakterier kan inficere tarmceller (Lawson et al., 1995). Forsøg har vist at allerede efter 12 timer kan Lawsonia intracellularis findes i tyndtarmen, både intracellulært i enterocytterne, samt ekstracellulært og intracellulært i lamina propria. Dette fund af bakterier i lamina propria indikerer at bakterien muligvis kan smitte fra krypt til krypt gennem lamina propria (Boutrup et al., 2006). Tidligere mente man at bakterien ikke spredtes fra celle til celle, men kun blev spredt med de mitotisk aktive celler (Lawson et al., 1993), men nye forsøg har vist at den inficerer både de immature og de fuldt differentierede epithelceller (Boutrup et al., 2006). Ad 3: Relativt hurtigt herefter (under 3 timer) frigives bakterien fra den endocytotiske vakuole, og bakterien befinder sig frit i cytoplasma (McOrist et al., 1995a). Lawsonia intracellularis udtrykker et hæmolysin, LhyA, som menes at være medvirkende til at bakterien kan undslippe hurtigt fra vakuolen (Smith, 2001). Ved at vacuolen brydes så hurtigt, undgår bakterien fusionen mellem lysosom og endosom, og dermed en proteolytisk nedbrydning af bakterien (Kroll et al., 2005). Ad 4: Bakterierne inde i cellen begynder at dele sig omkring 12 timer efter infektionen (Boutrup et al., 2006), og bakterien deler sig ca. hver 8. time (Smith og Lawson, 2001). Inde i cellen befinder bakterierne sig primært i cellens apikale del og ofte tæt på mitochondrierne og det ru endoplasmatiske retikulum. Dette kunne indikere at bakterierne benytter sig af mitochondriernes ATP produktion (McOrist et al., 1995a). Efter optagelse i cellen inducerer bakterien en dysregulering af den normale celle proliferation / differentiering der gør at inficerede celler deler sig op til 3 gange så hurtigt som ikke inficerede celler. Denne effekt på cellerne ophører dog, når læsionen er fuldt udviklet, 14

21 normalt efter ca dage (Smith og Lawson, 2001). Den præcise mekanisme er ukendt, men en af nedenstående mekanismer er sandsynlige (McOrist et al., 1996a): Bakteriel regulering af gener involveret i celledifferentiering eller apoptose Bakteriel produktion af en mitotisk agent Bakteriel skade af cellen, der udløser et sårhelende proliferations respons Bakteriel ændring af receptorsignalering mekanismer relateret til normale vækstfaktorer Ad 5: Omkring 6 dage efter inokulationen kan der observeres cellulære udposninger med et indhold af bakterier der senere afsnøres til tarmlumen (McOrist et al., 1995a). Herefter kan der evt. ske en spredning til de mere distale dele af tarmsystemet, som colon og rectum (Gebhart, 2006). Mikroskopisk kan de proliferative læsioner erkendes omkring dag 11, og makroskopisk erkendes omkring dag 12 efter infektionen (Gebhart, 2006). Evt. sker der en spredning til colon, som hyppigst sker ca. 2 uger senere (McOrist og Gebhart, 2006). I en dansk undersøgelse fandt man, at 69 % af smittede dyr var positive for Lawsonia intracellularis i colon (Jensen et al., 2006). Ad 6: Afhelingen af læsionerne begynder ca. 4 uger efter infektionens start(gebhart, 2006) og sker ved eliminering af de inficerede celler til tarmlumen. Ikke inficerede celler begynder at opbygge den normale krypt-villus struktur (McOrist et al., 1996a). Normalt vil en celle der er inficeret af intracellulære organismer bruge apoptose til en eliminering af infektionen, men i tilfældet med LI, kan bakterien hæmme denne evne til apoptose, hvilket er en vigtig virulens faktor for bakterien (Smith og Lawson, 2001). Immunologiske forhold Humoral immunitet Det typiske immunrespons er et initielt IgM respons, efterfulgt af et senere IgG respons, der langsomt aftager. Lokalt i tarmen ses et IgA respons på infektionen (Kroll et al., 2004). Ved eksperimentelle infektioner er der set en stigning i IgG allerede 9-14 dage efter smitten (Guedes og Gebhart, 2003). Det høje niveau holder sig normalt kun i et par uger inden det begynder at aftage igen (Gebhart, 2006). I nogle forsøg kan IgG dog ses i op til 13 uger efter infektionen (Guedes og Gebhart, 2003). Disse titre er dog lavere end ved naturlige infektioner (Gebhart, 2006). Ved naturlig infektion, ses et lidt andet forløb, idet grisene ofte er beskyttet af maternelle antistoffer i de første 3-4 uger. Disse maternelle antistoffer kan være af betydning for tidspunktet af Lawsonia 15

22 smitte (Gebhart, 2006). I et forsøg er der ved Immunoflourescens antistof test (IFAT) fundet maternelt IgG hos grise i 5-6 ugers alderen. Disse dyr var signifikant beskyttet ved eksponering for virulent LI (Kroll et al., 2005). Desuden er der fundet et højt indhold af IgA og IgG og et lidt lavere indhold af IgM i råmælken hos hyperimmuniserede søer (Kroll et al., 2005). Der er altså tegn på at den passive immunitet giver en vis beskyttelse mod infektionen. Ved PHE infektioner ses der en langt højere titer end ved PIA. Her er der i nogle undersøgelser set titre på optil 1:1920(Gebhart, 2006). Gylte der har overlevet et udbrud af PHE kan have antistoffer i op til 12 uger efter infektionen (Guedes et al., 2002a). I et Re-challenge forsøg med en patogen LI stamme er det vist at en tidligere eksponering for LI giver fuld beskyttelse mod en ny eksponering for LI. Det blev ligeledes vist at inokulationsdosis har en stor sammenhæng med udviklingen af klinisk sygdom, men der er ikke nogen sammenhæng med inokulationsdosis og beskyttelse mod re-infektion. Det vil sige at en lav eksponering giver lige så stor beskyttelse ved et senere udbrud, som en høj eksponering 1. gang. I forsøget blev der desværre ikke målt på aktivering af T-lymfocyt aktivering eller indhold af IgA i tarmmucosaen, kun IgG, hvor der hurtigt påvistes en stigning (Collins og Love, 2006). Forsøget viste desuden at en priming med patogen LI giver en bedre beskyttelse end ved priming med vaccine (Enterisol Ileitis, Boehringer Ingelheim). I Collins og Loves forsøg kunne ikke påvises nogen fækal udskillelse af LI hos de dyr der har været eksponeret tidligere, mens der i et forsøg af Guedes og Gebhart kunne påvises en intermitterende fækal udskillelse i op til 9 uger efter inokulation af patogen LI hos vaccinerede dyr. Statistisk set, var disse dyr dog signifikant beskyttede for patologiske forandringer (Guedes og Gebhart, 2003). Mucosal immunitet Et forsøg med en vaccinestamme viste, at den beskyttende immunitet mod LI ikke kun beror på det humorale respons, idet grisene i dette forsøg ikke havde målelige IgG antistoffer i op til 5 uger efter eksponeringen. Dette til trods for at de var signifikant beskyttet ved eksponering af LI (Kroll et al., 2004). Man mener at immuniteten i større grad beror på tilstedeværelsen af sekretorisk IgA i tarmen, samt det cellulære immunrespons (Kroll et al., 2005). Lokalt i tarmen findes også antistoffer i form af IgA. Immunohistokemiske studier har påvist store mængder IgA i vacuoler i det apicale cytoplasma i de inficerede proliferative enterocytter. Vacuolerne var lokaliseret i umiddelbar nærhed af LI (McOrist et al., 1992). 16

23 Celle medieret immunrespons Det inflammatoriske respons ved LI infektioner er minimalt (Rowland og Lawson, 1974) modsat mange andre infektioner med enteroinvasive bakterier (Lawson og Gebhart, 2000). Resultater fra et forsøg i 2003 indikerer at der er en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af LI og et reduceret antal B og T celler. Disse resultater tyder på at LI har en immunosuppresiv effekt (MacIntyre et al., 2003). Der sker desuden en produktion af interferon gamma (IFN-γ) i leukocytterne, som begynder ca. 2 uger efter infektionen, topper 3 uger efter, for derefter at falde igen. Dette svar varer længere end det humorale immunsvar, således var det i et forsøg stadig muligt at erkende IFN-γ 13 uger efter infektionen (Smith et al., 2000). IFN-γ er et cytokin produceret af Th-1 celler og involveret i det cellulære immunrespons. Man mener de kan være med til at begrænse infektionen. Forsøg med IFN-γ receptor knockout mus viste at disse var langt mere modtagelige for infektionen end wildtype mus (Smith et al., 2000). Diagnostik Da de kliniske tegn er uspecifikke eller slet ikke tilstede, kan en LI infektion let forveksles med andre patogener der samtidig er tilstede i besætningen. Derfor kan man ikke alene på det kliniske grundlag stille en sikker diagnose. Et typisk kendetegn er dog en stor vægtmæssig variation mellem grisene i samme aldersgruppe (Gebhart, 2006). Der er følgende diagnostiske muligheder: Ante mortem Da bakterien, som tidligere nævnt er obligat intracellulær, er det ikke umiddelbart muligt at påvise den ved dyrkning. Derimod kan bakterien på vises ved PCR, immunoperoxidase farvning eller immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens fra fæces eller via indirekte immunofluorscens antibody test (IFAT), immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) samt enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fra serum (Kroll et al., 2005). PCR PCR metoden påviser bakterielt DNA ved hjælp af specifikke primere. Testen skelner ikke om bakterien er levende eller død. Denne metode giver generelt en høj specificitet og en varierende sensitivitet, idet den varierer med kvaliteten af prøveudtagningen og tilstedeværelsen af inhibitoriske fak- 17

24 torer i fæces, eksempelvis urea, hæmoglobin og heparin, der eksempelvis kan inaktivere DNA polymerase, opløse nukleinsyrer eller interfererer med cellelysis under ekstraktionsprocessen (Lantz et al., 1997). Ved PCR finder man normalt bakterien ved klinisk afficerede dyr, men ved subklinisk inficerede dyr er testen ikke sensitiv nok til at blive brugt rutinemæssigt, idet det kræver en udskillelse af bakterier til tarmen, før prøven bliver positiv (Gebhart, 2006). Ved en PCR test fra fæces er specificiteten meget høj, op mod 100 % (Kroll et al., 2005), mens sensitiviteten varierer fra 37,5 til 71,1 % (Guedes et al., 2002c). Der kan også anvendes en Real-Time PCR test på grundlag af en Reverse Transcriptase PCR (RT- PCR). RT-PCR er en metode der detekterer bakterielt ribosomalt RNA. Ved at oprense denne RNA, og ved brug af enzymet Reverse transcriptase laves RNA om til cdna (Copy DNA). cdna mærkes med et flourcerende molekyle, og i en thermo cycler opformeres cdna. Når der er sket en vis opformering af cdna, udsendes lys som registreres i maskinen, og antallet af cycler maskinen har kørt inden lyset udsendes, registreres. Derved fremkommer en CT-værdi (Cycle Threshold), som beskriver mængden af RNA. Det vil sige at en lav CT-værdi indikerer en høj forekomst af RNA. Se eventuelt yderligere beskrivelse af metoden i bilag 4. Metoden har den fordel at den er semikvantitativ og kan aflæses maskinelt. Desuden er den hurtig og det er muligt at køre et større antal prøver i hver batch. Metoden er formenligt mere sensitiv, idet den anvender ribosomalt RNA (rrna), der findes i mange kopier ( ) i hver bakterie. RT-PCR detekterer levende bakterier, modsat en almindelig PCR, der ikke kan skelne om bakterien er levende eller død. Dette skyldes at der er RNAse tilstede stort set overalt (også i fæces), og dette vil hurtigt nedbryde det rrna der er i lyserede døde bakterier (Ahrens, 2006). Der er endnu ikke lavet undersøgelser der bekræfter ovennævnte udsagn, ligeledes er sensitivitet og specificitet endnu ikke bestemt. Immunoperoxidase farvning (IPX) Ved hjælp af denne metode hvor der laves immunoperoxidase farvning (ved hjælp af monoklonale antistoffer) på et smear fra fæces, opnås der højere sensitivitet end ved PCR, især når udskillelsen af bakterier falder. Denne test er ikke påvirket af inhibitoriske faktorer i fæces. Omvendt er specificiteten heller ikke helt så stor som ved PCR. Sensitiviteten angives til 59,4-89,5 % (Guedes et al., 2002c). 18

25 Immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens Ven en ny metode med immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens, er det muligt at påvise bakterien i fæces (Watarai et al., 2005). Princippet for udførelsen af testen er en immunologisk mærkning af helcelle bakterie med en magnetisk kilde. Ved hjælp af passende hardware, kan testen aflæses elektronisk. Denne testmetode er forholdsvis ny og uafprøvet, derfor er sensitiviteten og specificiteten ukendte. Serologiske tests Disse tests er alle baseret på detektion af LI antistoffer på baggrund af tests udviklet ud fra renkulturer af LI, enten som helcelle antigen på slides eller i brønde eller som opløseligt antigen. Farvningen/mærkningen er enten med immunofluorscens (IFAT) eller med immunoperioxidase labeled monolayer assay (IPMA). For disse tests angives en sensitivitet på 91,2 % for IFAT (Guedes et al., 2002c) og for IPMA en sensitivitet på 89 % og en specificitet på 100 % (Guedes et al., 2002b). I et senere dansk forsøg er sensitiviteten for IFAT angivet til 73 % ved naturligt inficerede dyr (Jensen et al., 2005). Derudover er der en række forskellige ELISA tests til rådighed, baseret på forskellige antigener. Ved fremstillingen af ovennævnte tests kræves at man kan dyrke Lawsonia for at fremstille det nødvendige antigen; derfor er det et meget begrænset antal laboratorier der kan tilbyde disse tests (Gebhart, 2006). DFVF er et af disse laboratorier. Her har man udviklet en ELISA med en rapporteret sensitivitet på 98 % og en specificitet på 99,3 % (Boesen et al., 2005). Værdien af disse serologiske tests er generelt god, men ved meget svage infektioner som PIA samt ved subklinisk inficerede dyr, er det serologiske respons ofte svagt og kortvarigt. Desuden er det serologiske respons noget forsinket i forhold til infektionen, idet det tager 2-3 uger inden grisene serokonverterer. ELISA testen har endvidere den fordel at den har en stor kapacitet, er hurtig at aflæse og kan aflæses maskinelt (Gebhart, 2006). Post mortem Der ses der ofte et meget varieret billede ved obduktion. De svære tilfælde er lette at erkende, mens de mere subkliniske kan være svære overhovedet at diagnosticere. Post mortelt er der følgende diagnostiske muligheder: Histologisk påvisning af proliferative forandringer i ileum, eksempelvis med HE farvning. 19

26 Histologisk påvisning af bakterier med modificeret Ziehl-Neelsen farvning eller sølvfarvning. Bakterien kan påvises ved sølvfarvning, immunofarvning med mono- eller polyklonale antistoffer eller farvning med modificeret Ziehl-Neelsen farvning (Gebhart et al., 1993; Lawson og Gebhart, 2000). Histologisk påvisning ved immunohistokemi. Denne metode er mere sensitiv end den kemiske påvisning, da denne også påviser organismerne i makrofagerne i lamina propria under ophelingsfasen. I et sammenligningsforsøg kunne man med immunohistokemi påvise omkring dobbelt så mange bakterier end med sølvfarvning (Guedes et al., 2002c). PCR. Ved at lave PCR på mucosa fra ileum, kan der opnås en specificitet der er på højde med immunohistokemi (Guedes et al., 2002c). Direkte påvisning med elektronmikroskop. For HE farvning angives en sensitivitet på 36,8 %, for sølvfarvning på 50 % og for immunohistokemi på 86,8 % (Guedes et al., 2002c). Differential diagnoser Der er en række differential diagnoser der bør overvejes i forbindelse med diagnostik af lawsonia, nemlig: Ulcus ventriculi, tarmtorsion, spirochætal colitis, porcin salmonellose, svinepest, TGE, Trichuris suis (Piskeorm), samt PCV-2. Økonomiske forhold Der er foretaget en beregning baseret på danske forhold, der viste at en ubehandlet LI infektion hos en fravænningsgris koster 19,- DKR. Estimatet er baseret på at den daglige tilvækst nedsættes med 49 gram og at foderudnyttelsen forringes med 0,36 kg foder/ kg tilvækst (Johansen, 2006). En anden betydelig faktor er, at LI forårsager en stor variation i størrelsen af grisene i den samme aldersgruppe (Gebhart, 2006). Dette kan have betydning for dyreflowet i en slagtesvinestald, idet den store variation i størrelsen gør at det vil kræve længere tid at levere dyr i det optimale vægtinterval til slagteriet. Dermed vil stalden komme til at stå halvtom i en periode og evt. forhindrer dette at der kan anvendes en alt ind / alt ud produktionsform. Den uens størrelse af grisene i slagtesvineperioden vil også medvirke til vanskelighed med fodersammensætningen. Da grisenes næringsstofbehov ændres i forhold til deres størrelse, vil det være svært at optimere en foderblanding der passer til hele holdet. Det vil være således at de mindste grise i holdet får et foder der er ringere end deres behov, hvilket medfører yderligere nedsat til- 20