Veterinært specialeprojekt 27 ECTS point Morten Brøgger V9030

Transkript

1 Undersøgelse af Lawsonia intracellularis smittedynamik i en besætning, samt forekomst i miljøet Assesment of infection dynamics of Lawsonia intracellularis in a herd and occurrence in the environment Veterinært specialeprojekt 27 ECTS point Morten Brøgger V9030 Vejledere: Lektor Helle Stege, institut for produktionsdyr og heste, Biovidenskabelige Fakultet for fødevarer, veterinærmedicin og naturrecurcer. Københavns Universitet. Professor Jens Peter Nielsen, Institut for produktionsdyr og heste, Biovidenskabelige Fakultet for fødevarer, veterinærmedicin og naturrecurcer. Københavns Universitet. Dyrlæge Markku Johanssen, Danish Meat association. Seniorforsker Peter Ahrens, Peter Ahrens Veterinærinstituttet, DTU.

2 Resumé I en tidligere undersøgelse af smittedynamik, i besætninger inficeret med Lawsonia intracellularis, sås i en besætning et anderledes forløb af infektionen, hvor grisene serokonverterede allerede ved fravænning. Omstændighederne ved denne specielle smittedynamik ønskedes belyst, og nærværende undersøgelse blev iværksat, med arbejdshypotesen: Grise der serokonverterer tidligt har anderledes tilvækst end grise der serokonverterer sent. Undersøgelsen omfattede 78 grise (8 kuld), der blev fulgt fra 2-4 dage efter fødsel og 84 dage frem, med prøveudtagning ca. hver 14. dag. Følgende prøver blev udtaget: blodprøve, der blev analyseret for IgG ved ELISA, rectalsvaber der blev analyseret for levende LI ved hjælp af RT-PCR. Desuden blev der udtaget miljøprøver til undersøgelse af grisenes nærmiljø. Disse prøver blev ligeledes undersøgt for LI ved hjælp af RT-PCR. Derudover blev grisene vejet. Alle kuld serokonverterede samtidigt, og derfor kunne der ikke undersøges for forskelle i tilvækst ved henholdsvis tidlig og sen serokonvertering. Der fandtes en god sammenhæng mellem LI-udskillelse fra grisene og forekomsten målt i miljøet, ved de målinger hvor 100 % af grisene udskilte bakterier. Der fandtes også en tendens til lavere udskillelse af bakterier hos grise med højt maternelt antistofniveau. Desuden fandtes en tendens til at grise med højt antistofniveau har større udskillelse i fæces.

3 Abstract: In an previous infection dynamics survey, one herd had a an increase in the number of sero-positive piglets indicating an active infection at weaning. The objective of this study was to investigate weather pigs with an early seroconversion had a different weight gain than pigs with an late seroconversion. 78 pigs (8 litters) were included in the study when they were between 2-4 days of age and followed for 84 days. Every second week the pigs were weighed and fecal as well as blood samples were collected. Fecal shedding of L.intracellularis was assessed by real time-pcr and sero-conversion by ELISA. Furthermore a samples from the environment was collected. All litters seroconverted at the same time, and the investigation weather pigs with an early seroconversion had a different weight gain, was not possible. A relationship between fecal shedding and occurrence of bacteria in the environment was found. Furthermore there was found a tendency to a lower shedding of bacteria from pigs with high maternal antibodies, and a tendency to higher fecal shedding among pigs with high antibody level.

4 Forord Nærværende projekt er mit bud på et veterinært specialeprojekt på 27 ECTS point. Dette projekt er afsluttende for dyrlægeuddannelsen. Projektet består af 2 dele, et litteraturstudie og en undersøgelse. Specialeprojektet er en del af en større undersøgelse, iværksat af DFVF og Danish Meat Association. Emnet har jeg valgt, da jeg anser Lawsonia intracellularis som et af de vigtigste patogener i den danske svineproduktion. Målgruppen for dette speciale er dyrlæger og veterinærstuderende. Tak til: Mine vejledere: For tålmodighed og svar på spørgsmål, også på underlige tidspunkter af døgnet. Henrik Frandsen: Som lagde besætning og personale til. Ulrik O. Bech: For kritisk gennemgang, mange diskussioner, og gode forslag. Kristian M. Kamstrup: For teknisk hjælp og kritisk gennemgang. Maiken L. Brøgger: For stor tålmodighed og forståelse under udarbejdelsen af dette projekt. København, den 1/ Morten Brøgger

5 Indholdsfortegnelse Forkortelser:...1 Indledning:...2 Litteraturstudiet...3 Historik:...3 Specielle danske forhold...4 Karakteristik af patogenet, Lawsonia intracellularis...5 Værtsspektrum...7 Epidemiologi...7 Risikofaktorer...8 Smittedynamik...8 Smittespredning...9 Forebyggelse...9 Behandling...11 Patologi...11 Kliniske symptomer...11 Patogenese...13 Immunologiske forhold...15 Humoral immunitet...15 Mucosal immunitet...16 Celle medieret immunrespons...17 Diagnostik...17 Ante mortem...17 PCR...17 Immunoperoxidase farvning (IPX)...18 Immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens...19 Serologiske tests...19 Post mortem...19 Differential diagnoser...20 Økonomiske forhold...20 Fodring...21 Tilvækst...21 Undersøgelse af Lawsonia intracellularis smittedynamik i en besætning, samt forekomst i miljøet23 Introduktion...23 Formål...23 Materialer og metoder...24 Undersøgelsens design...24 Stikprøvestørrelser og selektion...24 Undersøgelses procedure...25 Laboratoriemetoder...25 Epidemiologiske metoder...25 Sektion...26 Miljøprøver...27 Resultater...28 Undersøgelse af betydning af tidlig serokonvertering...29 Undersøgelser med kuld...31

6 Undersøgelser med paritet...33 Maternelt antistofniveau...33 Betydning af maternelle antistoffer...34 Sammenhæng mellem OD-værdier og CT-værdier...35 Betydning af høj/lav fødselsvægt...36 CT-værdi hos grise med diarré...37 Prøver fra farestalden...38 Miljøprøver...38 Obduktion...41 Diskussion...42 Konklusion...46 Perspektivering...46 Litteraturliste...47

7 Forkortelser: PIA PHE LI PCR rrna cdna RNA DNA RT-PCR CT ELISA PPE PE OD VNTR RI NE Porcin Intestinal adenomatose Porcin Hæmorrhagisk enteropati Lawsonia intracellularis Polymerase chain reaction Ribosomalt RNA copy-dna Ribonucleic acid Deoxyribonucleic acid Reverse transcriptace PCR Cycle threshold Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Porcin Proliferativ Enteropati Proliferativ enteropati Optisk densitet Viable-number tandem repeats Regional ileitis Nekrotisk enteritis 1

8 Indledning: Nærværende opgave omhandler Lawsonia intracellularis (LI), som er agens ved Porcin Proliferativ Enteropati (PPE). Undersøgelser har vist, at op imod 100 % af alle danske svinebesætninger er inficeret med LI. (Hardge et al., 2006). LI er af væsentlig økonomisk betydning for producenten, både i form af nedsat tilvækst, dårligere foderudnyttelse, forstyrrelser i flow i slagtesvinestalden og udgifter til medicinering og ekstra arbejde. På baggrund af den høje prævalens samt den store økonomiske betydning, er det relevant at undersøge, hvorvidt tidlig infektion med LI har en betydning for tilvæksten. Opgaven består af 2 dele, et litteraturstudie af LI samt en kohorteundersøgelse af betydningen af tidlig serokonvertering for LI. I litteraturstudiet redegøres for patogenet, LI, epidemiologi omkring infektionen, patogenese og patologi, immunologiske forhold, diagnostiske muligheder, samt kort omkring økonomisk betydning af patogenet. I den anden del af opgaven behandles data fra serologiske prøver, fæcesprøver og prøver udtaget fra miljøet, særligt med henblik på at belyse betydningen af LI-infektion og grisenes tilvækst samt forekomsten i miljøet. 2

9 Litteraturstudiet Historik: Læsionerne i forbindelse med en Lawsonia-infektion blev først beskrevet i 1931 af Biester og Schwarte i Ames, Iowa, USA (Biester og Schwarte, 1931). I forbindelse med et større udbrud i 1972, blev sygdommens patoanatomiske forandringer beskrevet. Man kunne dog ikke på dette tidspunkt påvise noget patogen, men der var indicier på at der var tale om et infektiøst agens, idet det blev antydet af smittemønstret i besætningen. (Rowland og Rowntree, 1972). Det skulle med tiden vise sig at agens var særdeles vanskelig at isolere. I 1973 blev læsionerne igen beskrevet af Alan Rowland og Gordon Lawson, og i forbindelse med denne forskning, fandt man, i de afficerede celler, s-formige intracellulære bakterier beliggende frit i enterocytternes cytoplasma. Bakterierne kunne påvises både ultrastrukturelt og ved immunoflourcens (Rowland et al., 1973; Rowland og Lawson, 1974). Ved et bakteriologisk studie i 1974 blev bakterien klassificeret som Campylobacter sputorum ssp. mucosalis, primært på grundlag af morfologiske ligheder, selvom der var visse ting der ikke passede ind i denne klassifikation, eksempelvis manglende dyrkningsresultater og det faktum at bakterien er intracellulær (Lawson og Rowland, 1974). I det næste årti blev der gentagne gange isoleret forskellige Campylobacter stammer fra læsionerne, men det lykkedes ikke at reproducere sygdommen ved hjælp af disse isolater (Gebhart et al., 1985; Kroll et al., 2005). Til trods for at Campylobacter tidligere jævnligt blev isoleret i forbindelse med proliferativ enteritis var de ofte ikke tilstede ved infektionerne (Lawson og Gebhart, 2000). I 1977 lykkedes det for Roberts et al. at reproducere intestinal adenomatose og nekrotiserende enteritis ved hjælp af inficeret mucosa (Roberts et al., 1977). I 1985 lykkedes det for Lawson et al. at fremstille polyklonale antistoffer mod agens, selvom resultaterne dog blev beskrevet som svage. Det viste sig at de antistoffer der blev produceret var rettet mod de intracellulære organismer og ikke mod de Campylobacter spp. de blev testet imod (Lawson et al., 1985). Dermed blev det klart at det ikke var Campylobacter der var agens og man kaldte derfor agens for Campylobacter-like organisms (CLO).. I 1987 lykkedes det for McOrist et al., at fremstille monoklonale antistoffer mod agens. Samtidig blev agens påvist i fæces (McOrist et al., 1987). 3

10 I 1991 blev agens for første gang dyrket i en cellekultur som en del af et forsøg udført af Stills. Endvidere lykkedes det for ham at reproducere sygdommen hos hamster, ud fra de bakterier der var blevet dyrket. I forsøget blev der ligeledes fremstillet polyklonale antistoffer, der bekræftede resultatet. Dog var mange af isolaterne kontamineret med Chlamydia spp., som skabte nogen tvivl om resultatet(stills, 1991). Det store forskningsgennembrud kom omkring 1993 hvor Lawson et al. beskrev in vitro dyrkningen af intracellulære organismer i en rotte enterocyt cellekultur. Isolatet stammede fra tarmepitelceller fra grise fra fire forskellige besætninger, og bakterierne blev dyrket over 20 passager. Det lykkedes for Lawson et al. at beskrive bakterierne og deres vækstbetingelser, samt at holde cellekulturerne fri for andre bakterier (Lawson et al., 1993). Senere samme år lykkedes det for McOrist et al. at reproducere sygdommen ved hjælp af et isolat af ileal symboint intracellularis, som var det trivialnavn der blev foreslået af Gebhart et al. (1993) og det blev derved vist at dette intracellulære patogen kunne forårsage sygdommen. I en artikel fra 1995 af McOrist et al. blev bakteriens taksonomiske placering bestemt, som en ny genus og ny species. Navnet Lawsonia intracellularis blev foreslået for at ære Lawson, der havde været en pioner i Lawsonia forskningen siden starten af 1970erne (McOrist et al., 1993). I 1995 udviklede Knittel et al. en brugbar serologisk test til detektion af infektionens udbredelse i eks. en besætning (Knittel et al., 1998). I 2005 blev genomet for Lawsonia kortlagt af Kaur et al. (ExPASy Proteomics, 2007). Specielle danske forhold Op gennem 1990erne observeredes en stigning af brugen af totalt antibiotika i landbruget (til forebyggelse, vækstfremmere og behandling) (Wegener, 2006). Samtidig var der stor bekymring omkring udviklingen af antibiotikaresistens blandt diverse patogener, både animale og humane. Dette førte i 1995 til at brugen af avoparcin til vækstfremmer blev forbudt. Dette forbud blev i 1998 udvidet til også at omfatte virginiamycin (WHO report, 2003). I februar 1998 besluttede de danske svineproducenter frivilligt at stoppe brugen af antibiotiske vækstfremmere (sub-terapeutiske doser af antibiotika) til slagtesvin, og fra december 1999 at stoppe med brugen af antibiotiske vækstfremmere til fravænningsgrise (WHO report, 2003). I tiden der fulgte, viste Lawsonia intracellularis (LI) sig at blive et mere betydende problem i de danske besætninger, end før ophøret med de antibiotiske vækstfremmere (Jensen, 2006). Prævalensen for LI er stort set uændret (Stege et al., 2000; Hardge et al., 2006), men infektionen viser et mere klinisk forløb (Jensen, 2006). At vækstfremmere har en effekt overfor LI, er påvist gennem forsøg (McOrist et al., 1996b; McOrist et al., 1997b; Kroll et 4

11 al., 2005). Da andelen af LI smittede besætninger i Danmark er i omegnen af 100 %, står det klart at PPE er af stor betydning (Stege et al., 2000; Hardge et al., 2006). Karakteristik af patogenet, Lawsonia intracellularis LI tilhører sit eget genus; de nærmeste slægtninge, målt på 16s underenheden, er det humane fritlevende patogen Bilophila wadsworthia med 92 % homologi (Lawson og Gebhart, 2000) og Desulfovibrio desulfuricans med 91 % homologi, mens slægtsskabet med Campylobacter species kun er på ca. 80 % (Gebhart et al., 1993). LI adskiller sig fra andre sulfatreducerende bakterier i desulfovibrionaceae familien ved ikke at være sulfatreducerende, være obligat intracellulær, samt at være patogen (Gebhart, 2006). Bakterien er en mikrofil Gram-negativ stavbakterie, svagt S-formet, og måler i længden ca. 1,25 1,75 µm og 0,25 0,43µm i bredden. Den har afrundede ender og en bølget ydre membran. Bakterien er ikke sporedannende og formerer sig ved deling (Gebhart et al., 1993). Der er ikke observeret pili eller fimbriae, men det angives at en lang flagel er observeret i bakterier dyrket i cellekultur, dog kun når bakterien har været lokaliseret ekstracellulært (Lawson og Gebhart, 2000; McOrist og Gebhart, 2006). Bakterien viser tegn på bevægelse, en darting motility, idet den frigiver sig fra den inficerede celle (Gebhart, 2006). Der er ingen vækst på traditionelle medier, idet bakterien ikke kan dyrkes ekstracellulært, sikkert på grund af et behov for præformerede trifosfater fra værtscellens mitochondrier. Det betyder at en dyrkning kræver en cellekultur med delende eukariotiske celler (Gebhart, 2006). Man har haft held til at dyrke bakterien i følgende cellekulturer: Rat intestinal cells (IEC-18) (Lawson et al., 1993), Human fetal intestinal celles (Int 407) (Lawson et al., 1993), Rat colonic adenocarcinoma celles (CRL 1677) (Lawson et al., 1993), pig kidney cells (PK-15) (Lawson et al., 1993), piglet intestinal epithelial cells (IPEC-J2) (McOrist et al., 1995a), guinea pig colonic adenocarcinoma cells (CPC-16) (Stills, 1991) samt mouse fibroblast cells (McCoy) (Knittel og Roof, 1999; Wattanaphansak et al., 2005). Taksonomisk placering (Gebhart et al., 1993): Rige: Bacteria Phylum: Proteobacteria Subphylum: Delta/epsilon subdivitions Klasse: Delta proteobacteria Orden: Desulfovibrionales Familie: Desulfovibrionaceae Genus: Lawsonia Species: Lawsonia intracellularis 5

12 Ved en nyere metode kan man dyrke cellerne i en suspension (Knittel og Roof, 1999). Dette åbner mulighed for at fremstille en stor mængde LI, f.eks. til fremstilling af vaccine. Da man i 1993 reproducerede sygdommen, brugte man både gnotobiotiske (kimfrie) grise, samt grise fra en SPF-besætning, hvor der ikke tidligere havde været tegn på PPE. Imidlertid var det kun SPF-grisene der udviklede sygdommen (McOrist et al., 1993). Dette gav anledning til undren, og forsøget blev gentaget; dog blev der denne gang tilsat en bakteriekultur af apatogene bakterier til de gnotobiotiske grise. Ved dette andet forsøg lykkedes det at reproducere sygdommen i de gnotobiotiske grise. Man mener at årsagen var at disse synergistiske bakterier ændrer nærmiljøet i tarmen (med hensyn til ph, oxidation-reduktions potentiale), således at Lawsonia kan trives bedre (McOrist et al., 1994). Kultiveringen af LI i cellekultur stiller da også særlige krav til omgivelserne, nemlig: % N 2, 4-10 % CO 2, 0-10 % O 2, en temperatur på 37 C og en høj luftfugtighed (Lawson et al., 1993; Kroll et al., 2005). Lawsonia intracellularis (LI) er en obligat intracellulær bakterie, der vokser i enterocytter, primært i ileum. LI er primært lokaliseret i den apikale del af cytoplasma, lige under brushborderen. Den ligger frit i cytoplasma, altså ikke i vacuoler, bundet til membraner eller lign. LI har et lille cirkulært genom ( bp) og 3 plasmider (henholdsvis , og bp) (GIB, 2007). Der er stor homologi mellem genomerne af de forskellige typer af stammer, således er det angivet at der er >98 % homologi mellem stammer fra hamster og svin (Cooper et al., 1997). En kilde angiver europæiske og amerikanske isolater ligner hinanden. Dette er dog baseret på det faktum at de begge kan forårsage ens sygdomsbilleder, ikke på en egentlig sammenligning af genomerne (Knittel et al., 1996). Ny teknik baseret på viable-number tandem repeats (VNTR) har vist stor variation blandt forskellige isolater og kan måske i fremtiden bruges til at adskille de forskellige isolater og dermed yderligere belyse epidemiologien omkring PPE (Gebhart, 2006). Det er muligt at anvende Variable-number tandem repeats (VNTRs) til at give et unikt fingeraftryk af en bakterie(beckler og Gebhart, 2006). VNTRs er korte DNA sekvenser der gentages et forskelligt antal gange i kromosomet i cellen. Ved hjælp af primere, som bindes uden for disse sekvenser, kan man ved hjælp af PCR opformere dette stykke. Længden af det udklippede stykke, varierer efter antallet af VNTRs. En efterfølgende elektroforese kan derfor give et fingeraftryk af den pågældende celle (Beckler og Gebhart, 2006). 6

13 VNTRs har vist sig at være en unik markør for forskellige isolater fundet i epidemiologiske urelaterede LI udbrud. Ved hjælp af denne metode åbnes der måske mulighed for at opspore smittekilden til en nyinficeret besætning (Beckler og Gebhart, 2006). Værtsspektrum LI forårsager enteritis primært hos hamster (Frisk og Wagner, 1977) og svin, men kan også inficere følgende dyrearter: Makakaber (Klein et al., 1999), marsvin (Elwell et al., 1981), hest (Williams et al., 1996), rotte (Vandenberghe et al., 1985), fritte (Fox og Lawson, 1988), ræv (Eriksen og Landsverk, 1990), hund (Leblanc et al., 1993), kanin (Hotchkiss et al., 1996), hjort (Cooper et al., 1997), struds (Cooper et al., 1997) og mus (Smith et al., 2000; Bednar, 2006). Trods menneskers nære slægtskab med makakaber er bakterien aldrig påvist hos mennesker, og LI betragtes derfor ikke som en zoonose (McOrist og Gebhart, 2006; Jacobson et al., 2006). En sammenhæng med humane sygdomme som Crohns sygdom og ulcerativ colitis er også udelukket (Michalski et al., 2006). Epidemiologi Porcin proliferativ enteropati (PPE) er en sygdom, der medfører et betydeligt økonomisk tab (Kroll et al., 2005), og er vidt udbredt i både indendørs og udendørs svinebesætninger over hele af verden (McOrist et al., 2003). Andelen af smittede besætninger svinger de forskellige lande imellem fra 57 % i Portugal til 100 % i lande som Sverige, Schweiz, Grækenland, Italien, Tjekkiet og Danmark, undersøgt ved hjælp af serologiske tests (McOrist et al., 2003; Hardge et al., 2006). Der er en tendens til at sygdommen har større betydning i USA og Nordeuropa. Der kan være mange årsager til denne forskel i udbredelsen af PPE. En kan være forskellen i de racer der benyttes i de forskellige regioner idet der er tegn på at hvide racer er mere følsomme for bakterien end de farvede racer, som f.eks. duroc (McOrist et al., 2003). En anden årsag kan være at nogle lande stadig tillader anvendelsen af antibiotiske vækstfremmere (McOrist et al., 2003). I en artikel af McOrist et al. (2003) forklares årsagssammenhængen i den intensivering, svineproduktionen har været udsat for i disse lande, gennem de seneste årtier. Tidligere var svineproduktionen præget af små familiebrug, hvor grisene fik lov til at gå hos soen i mange uger. Kravet om en effektivisering af landbruget satte svineproduktionen mere i system, således at dyr i en specifik aldersgruppe blev opstaldet i separate stalde, og eventuelt andre lokalisationer ( sites ). Ligeledes blev fodringen optimeret, tætheden i staldene blev forøget og fravænningsalderen blev nedsat. 7

14 Den begrænsede kontakt mellem so og afkom, sammen med at disse småpopulationer af grise med varierende immunstatus blev dannet, gav anledning til at komplekse ændringer i sygdomstransmissionen og -manifestationerne. Sygdomsagenser som Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae og Lawsonia intracellularis har forøget virulens overfor grise der smittes senere end grise der smittes tidligt (McOrist et al., 2003). Hele denne omlægning af svineproduktionen gav da også anledning til problemer med PPE, i hvert fald gav det anledning til kliniske symptomer med diarré (McOrist et al., 2003). Det faktum at grisene smittes senere, kan også give anledning til udvikling af den hæmorrhagiske form for sygdommen, frem for den kroniske (McOrist et al., 2003). Ved smitte med Lawsonia intracellularis hos grise der er under ca. 12 uger, ses udvikling af den kroniske form, Porcin intestinal adenomatose, (PIA) for sygdommen, mens hos grise ældre end det, udvikles den hæmorrhagiske form Porcin hæmorrhagisk enteropati, (PHE) af sygdommen (McOrist et al., 1993). Man må dog erindre at der tidligere var et andet mønster af andre patogener der huserede i besætningerne, såsom Salmonella, dysenteri og diverse parasitter. Disse patogener kan have sløret de kliniske tegn fra en LI infektion(mcorist et al., 2003). Tillige bør det nævnes at det først er relativt for nyligt at man har haft adgang til pålidelige ante mortem tests. I tiden før det blev muligt at dyrke bakterien, og dermed fremstille antigen til serologiske tests, var det kun muligt at stille diagnosen post mortem ved histologi (McOrist et al., 2003). Det er først med udviklingen af de nye ante mortem tests at man har fået et reelt overblik over LIs udbredelse (McOrist et al., 2003). Risikofaktorer Ud fra en undersøgelse af managementfaktorers betydning for LI seropostivebesætninger, kunne man fastslå følgende risikofaktorer for seropositive sobesætninger (Bronsvoort et al., 2001): Kontinuerlig drevet farestald uden vask, lav paritet i besætningen (Stor andel af unge søer), samt LI seropositive slagtesvin på samme ejendom. For slagtesvinebesætningen kunne man fastslå følgende risikofaktorer(bronsvoort et al., 2001): LI seropositiv sobesætning, antal dyr i tilgang til besætningen, samt fuldspaltegulv. Andre forfattere nævner derudover følgende risikofaktorer: Gamle bygninger (modsat nye stalde) (Bane et al., 2001), kontinuerlig drift, indkøbt/pelleteret foder (Stege et al., 2001) og temperatursvingninger (Guedes, 2006). Smittedynamik Generelt ses to forskellige mønstre i smittedynamikken, der afhænger af grisenes alder, samt om infektionen er til stede hos søerne. 8

15 Det ene mønster er karakteriseret af en tidlig infektion i 4-7 ugers alderen og ses i kontinuert drevne besætninger. Nogle af søerne kan udskille LI med fæces, og dermed holde en subklinisk infektion i gang i soholdet, og via fæces smitte grisene allerede i farestalden. Dette ses især i besætninger, hvor de drægtige dyr går i løsdrift (McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003). I en undersøgelse af forekomsten af LI i de forskellige staldafsnit, sås da også fækal LI udskillelse fra 7,9 % af søerne i farestalden og hos 11,9 % af de drægtige dyr (Pozo et al., 2002). Der sker antageligt en infektion af grisene efterhånden som koncentrationen af maternelle antistoffer aftager af i 4-7 ugers alderen, og grisene samtidigt udsættes for fækal smitte, hvorefter de hurtigt smitter hinanden (McOrist og Gebhart, 2006). Det andet mønster er karakteriseret af en senere infektion hvor dyrene er uger gamle, og ses i besætninger der har en høj grad af sektionering. I soholdet ses der ikke LI infektion. Det er typisk at besætningen arbejder med en høj grad af sektionering eller multisite (Bronsvoort et al., 2001; McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003; McOrist og Gebhart, 2006). Smittespredning I et studie blev det vist at udskillelsen af bakterien starter 1-2 uger efter og kan vare i op til 12 uger efter infektionen (Guedes et al., 2002a). Disse resultater viser at der sker en intermitterende udskillelse af bakterier i dyr der ikke nødvendigvis viser kliniske tegn på sygdommen. I samme forsøg blev det vist at gylte der overlevede et udbrud med PHE var seropositive ved immunoperoxidase monolayer assay test(ipma) i op til 12 uger efter infektionen (Guedes og Gebhart, 2003). En dansk undersøgelse viste at grisene typisk starter med udskillelse i leveuge, og udskiller bakterier i 2-6 uger. Serokonvertering sker typisk 2 uger efter grisen begynder udskillelsen af bakterier og i denne undersøgelse var 92 % af grisene seropositive indtil slagtning. De serologiske prøver blev testet med en immunoflourcens antibody test (IFAT) (Stege et al., 2004). Ved forsøg er det vist at udskillelsen af bakterier begynder ca. 6 dage efter eksponeringen (McOrist et al., 1995a). Den infektive dosis af Lawsonia er meget lav. Mellem 1000 og bakterier er nok til at inducere infektion og fækal udskillelse 2-3 uger efter(guedes, 2006). Dog er der flere undersøgelser der bekræfter at jo større mængde LI grisen eksponeres for, desto mere syg bliver den (Guedes et al., 2003; Collins og Love, 2006). Forebyggelse Omgivelserne spiller også en rolle for smittespredningen. LIs overlevelsesevne i omgivelserne er i et forsøg fundet at være ret god, til trods for at bakterien er intracellulær. I forsøget blev det vist at 9

16 LI i cellefrie suspensioner kan henligge i luften i 6 dage ved 5 C, og stadig forblive infektiv. Dog faldt antallet af dage hvor bakterierne forblev infektive hurtigt ved en temperatur på 20 C, til 1 dag. LI-inficeret fæces med 1x10 6 til 1x10 7 bakterier / gram kan ligge i op til 2 uger, og stadig forblive infektiv. Ved efterfølgende eksponering for seronegative grise efter at fæces havde henligget i henholdsvis 1 og to uger, viste begge prøver sig at være infektive. Dog var antallet af infektive bakterier reduceret, og der observeredes en forskel i tiden fra inokulering til positiv PCR og serokonvertering. Således var gruppen, der var inokuleret med fæces, der var 2 uger gammelt, 5-12 dage længere om at vise en positiv PCR og 7 dage længere om at serokonvertere (Collins et al., 2000). Dette kunne indikere at der sker en reduktion i antallet af infektive bakterier over tid; i hvert fald stemmer dette fint overens med et forsøg hvor grise blev inokuleret med LI i 3 forskellige fortyndinger. Der observeredes ligeledes en forsinkelse i infektionen ved faldende fortynding (Guedes et al., 2003). LIs følsomhed overfor visse desinfektionsmidler er undersøgt. Effekten af desinfektionsmiddelgrupper som natrium hypoclorit, hydrogenperoxid og pereddikesyre kunne ikke undersøges, idet de ødelægger cellekulturen, som lawsonia efterfølgende dyrkes i (Collins et al., 2000). Kvaternære ammoniumforbindelser har vist sig 100 % effektive for 2 forskellige stammer fra hhv. PIA og PHE (Collins et al., 2000). Dog er de kvaternære ammoniumforbindelser ekstremt følsomme overfor organisk materiale, og er ikke anvendelige til stalddesinfektion (Barfod et al., 2002). Jodoforer har også vist sig at være meget effektive; i forsøget var der kun 1 % af prøverne der ikke var følsomme (Collins et al., 2000). Jodoforer er følsomme for organisk materiale, dog i mindre grad end de kvaternære ammoniumforbindelser. Desuden inaktiveres de hvis de kommer i forbindelse med metaller, dog ikke rustfrit stål (Barfod et al., 2002). Fenolderivater er mindre effektive; i forsøget viste 18 % af prøverne sig stadig at være infektive (Collins et al., 2000). Fenolderivater er også ret følsomme for organisk materiale. Desuden er de ret sundhedsskadelige i koncentreret form (Barfod et al., 2002). Kaliumperoxymonosulfat var i forsøget 100 % effektivt for det ene isolat fra en gris med PHE, men kun 89 % effektivt for det andet isolat fra en gris med PIA (Collins et al., 2000). Disse midler har udover et bredt virkningsspektrum en god effekt ved en temperatur ned til 5 C. De er moderat følsomme for tilstedeværelsen af organisk materiale (Barfod et al., 2002). 10

17 Da de undersøgte desinfektionsmidler generelt er så følsomme for organisk materiale, er det af stor vigtighed at der først foregår en grundig rengøring af stalden inden desinfektion, for at opnå en tilstrækkelig virkning af desinfektionsmidlet. Behandling Til behandling af LI infektioner har følgende antibiotika ved forsøg vist sig effektive (McOrist et al., 1995b): Meget lav MIC: Penicillin, erythromycin, difloxacin, virginiamycin og chlortetracyclin. Moderat MIC: Tilmicosin og tiamulin Fødevarestyrelsen anbefaler at der anvendes Tiamulin eller valnemulin som 1. prioritet, eller tetracycliner som andet valg (Fødevarestyrelsen, 2007). Patologi LI forårsager 4 forskellige symptombilleder, der kan opdeles efter hosstående model (Rowland og Lawson, 1975): Proliferativ enteropati (PPE) Porcin intestinal adenomatose (PIA) o Nekrotisk enteritis (NE) o Regional ileitis (RI) Proliferativ hæmorrhagisk enteropati (PHE) Kliniske symptomer De kliniske symptomer for PIA opdeles ikke i NE og RI ved beskrivelse af de kliniske symptomer. De typiske tilfælde er svage eller subkliniske. Oftest er det grise i alderen 6-20 uger der afficeres. Ofte ses uændret ædelyst, men nedsat tilvækst og foderudnyttelse. I andre tilfælde ses anorexi og letargi samt generel utrivelighed. Der ses ofte stor uensartethed blandt grisene i et hold. I nogle tilfælde ses diarré, som kan betegnes som løs, grålig til grønlig fæces. Blod- eller mucustilblanding ses ikke ved denne form for diarré. Hos nogle grise ses en kraftig inflammatorisk reaktion i den afficerede mucosa, evt. efterfulgt af nekrose. Disse grise er ofte hårdt ramt og ender som utrivelige grise (skravlgrise) der ikke kommer sig (McOrist og Gebhart, 2006) 11

18 Ved den hæmorrhagiske form (PHE) er det hyppigst de lidt ældre dyr (4-12 Mdr.) der afficeres, og det medfører ofte en ret høj mortalitet, op til ca. 50 %. De grise der overlever har kraftig nedsat tilvækst, og vil indirekte medføre et tab for producenten. Der ses initielt sort, tjærefarvet fæces, der efterhånden bliver vandig og blodtilblandet. Desuden ses tegn på akut hæmorrhagisk anæmi. Enkelte dyr kan også dø uden forudgående tegn på diarré eller anæmi (McOrist og Gebhart, 2006). Denne hæmorrhagiske form kan f.eks. ses hvis nye avlsdyr, fra en inficeret besætning, introduceres til en besætning, hvor dyrene er seronegative, eller hvor LI negative avlsdyr introduceres til en LI inficeret besætning (Kroll et al., 2005). De forskellige symptombilleder manifesterer sig alle som følge af forandringer i tarmen. Det er primært 50 cm af den distale del af tyndtarmen og 1/3 af den proximale del af colon der afficeres af PPE forandringer. I sværere tilfælde kan jejunum, caecum og resten af colon dog også afficeres (McOrist og Gebhart, 2006). En dansk undersøgelse af grise indsendt til obduktion for colitis viste at Lawsonia intracellularis er den hyppigste årsag til colitis, nemlig i ca. 79,6 % at de undersøgte dyr (Jensen et al., 2006). I en dansk undersøgelse er der fundet Lawsonia i tonsillerne, der dog ikke giver anledning til patologiske forandringer, men måske kan fungere som reservoir for bakterien (Jensen et al., 2000). Dog kunne det i undersøgelsen ikke påvises om bakterierne i tonsillerne var dræbte eller levende, men de mentes ikke at spille nogen rolle i patogenesen. Tilstedeværelsen i tonsillerne, kan være som følge af en oral smitte, men kan ligeledes være et resultat af en septikæmi (Jensen et al., 2000). Desuden er der påvist bakterier intracellulært i makrofager og i lamina propria i tilfælde med PHE og NE (Jensen et al., 1997). Endvidere er bakterielt antigen påvist i Peyerske pletter samt i subcorticale sinuser i de mesenterielle lymfeknuder (Smith og Lawson, 2001). De patoanatomiske forandringer ved de forskellige lidelser beskrives herunder (McOrist og Gebhart, 2006): Porcin intestinal adenomatose (PIA): Omfanget af læsionerne varierer en del, men et typisk billede er, at tarmvægen er kraftigt fortykket og rynket. Ved mindre læsioner er det mest sandsynlige sted for infektion ved ileocaecalklappen og ca. 10 cm proximalt. Der er ofte ødem i subserosa og i mesenteriet, som kan være med til at tarmen virker ekstra foldet. Mucosa er fugtig, men ikke slimet, og der kan evt. ses inflammatorisk eksudat. (McOrist og Gebhart, 2006) Histopatologisk ses typisk en adenomatøs proliferation af kryptepitelet i tyndtarmen og i 12

19 mucosal glands i tyktarmen med 5-10 epitelcellelag mod normalt et cellelag (McOrist og Gebhart, 2006). Desuden også tilstedeværelsen af S-formige intracellulære bakterier i disse enterocytter (Rowland og Lawson, 1974). Krypterne er forlængede og forstørrede, og der ses typisk en mitotiske celler. Bægerceller mangler i afficerede områder, og der er ikke nødvendigvis tilstedeværelse af inflammatoriske celler (Kroll et al., 2005). Nekrotiserende enteritis (NE): ved denne type ses, ud over læsionerne beskrevet ved PIA, en koagulationsnekrose med kraftig inflammatorisk eksudation til tarmlumen. Dette ses som gulgrå casts af nekrotoisk materiale der adhærerer kraftigt til mucosaen. Histologisk ses endvidere fibrinaflejringer og degenerative inflammatoriske celler (McOrist og Gebhart, 2006). Regional ileitis (RI): Dette er den kroniske form for PIA og ses som en næsten stift stykke af tyndtarmen, også benævnt Hose pipe eller garden hose gut (Kroll et al., 2005). I nogle tilfælde ses ulcerationer med granulationsvævsdannelse i mucosa, og i andre områder er vævet normalt (McOrist og Gebhart, 2006). Proliferativ hæmorrhagisk enteropati (PHE): Læsionerne findes primært i terminale ileum og colon. Tarmvæggen er dilateret og fortykket. I tarmlumen findes ofte store blodkoagler og rectum kan indeholde sortfarvet fæces. Tarmvæggen er kraftigt fortykket, men ellers ses ikke hverken blødningssteder, ulcera eller erosioner. Patogenese I et typisk infektionsforsøg, kan de proliferative forandringer i tarmen erkendes 1-3 uger efter inokulation, frigivelsen af bakterier til tarmlumen starter efter ca. 6 døgn, og infektionen er aftaget og afhelet efter ca. 4 uger (Gebhart, 2006). Der er følgende hovedbegivenheder i patogenesen: 1. Inokulation af bakterien i værtsdyret. 2. Optagelse i enterocytter ved endocytose. 3. Bakterien slipper ud af vakuolen. 4. Bakterien deler sig og inducerer deling af værtscellen. 13

20 5. Bakterien frigives til lumen. 6. Læsionerne afheles. Ad 1: Efter oral optagelse/inokulation føres bakterien hurtigt til den aborale del af tyndtarmen, samt til caecum. Ad 2: Når bakterien befinder sig i tarmlumen, sker der en interaktion mellem enterocytten og bakterien, der initierer til at Lawsonia intracellularis optages i cellen ved hjælp af endocytose (McOrist et al., 1997a). I forsøg med cellekultur er det vist at bakterien kan findes i cellen allerede efter 10 minutter efter inokulationen (McOrist et al., 1995a). Infektionen af Lawsonia intracellularis er afhængig af cellen og ikke af bakterien. Ved forsøg er det nemlig vist at både vitale og dræbte bakterier kan inficere tarmceller (Lawson et al., 1995). Forsøg har vist at allerede efter 12 timer kan Lawsonia intracellularis findes i tyndtarmen, både intracellulært i enterocytterne, samt ekstracellulært og intracellulært i lamina propria. Dette fund af bakterier i lamina propria indikerer at bakterien muligvis kan smitte fra krypt til krypt gennem lamina propria (Boutrup et al., 2006). Tidligere mente man at bakterien ikke spredtes fra celle til celle, men kun blev spredt med de mitotisk aktive celler (Lawson et al., 1993), men nye forsøg har vist at den inficerer både de immature og de fuldt differentierede epithelceller (Boutrup et al., 2006). Ad 3: Relativt hurtigt herefter (under 3 timer) frigives bakterien fra den endocytotiske vakuole, og bakterien befinder sig frit i cytoplasma (McOrist et al., 1995a). Lawsonia intracellularis udtrykker et hæmolysin, LhyA, som menes at være medvirkende til at bakterien kan undslippe hurtigt fra vakuolen (Smith, 2001). Ved at vacuolen brydes så hurtigt, undgår bakterien fusionen mellem lysosom og endosom, og dermed en proteolytisk nedbrydning af bakterien (Kroll et al., 2005). Ad 4: Bakterierne inde i cellen begynder at dele sig omkring 12 timer efter infektionen (Boutrup et al., 2006), og bakterien deler sig ca. hver 8. time (Smith og Lawson, 2001). Inde i cellen befinder bakterierne sig primært i cellens apikale del og ofte tæt på mitochondrierne og det ru endoplasmatiske retikulum. Dette kunne indikere at bakterierne benytter sig af mitochondriernes ATP produktion (McOrist et al., 1995a). Efter optagelse i cellen inducerer bakterien en dysregulering af den normale celle proliferation / differentiering der gør at inficerede celler deler sig op til 3 gange så hurtigt som ikke inficerede celler. Denne effekt på cellerne ophører dog, når læsionen er fuldt udviklet, 14

21 normalt efter ca dage (Smith og Lawson, 2001). Den præcise mekanisme er ukendt, men en af nedenstående mekanismer er sandsynlige (McOrist et al., 1996a): Bakteriel regulering af gener involveret i celledifferentiering eller apoptose Bakteriel produktion af en mitotisk agent Bakteriel skade af cellen, der udløser et sårhelende proliferations respons Bakteriel ændring af receptorsignalering mekanismer relateret til normale vækstfaktorer Ad 5: Omkring 6 dage efter inokulationen kan der observeres cellulære udposninger med et indhold af bakterier der senere afsnøres til tarmlumen (McOrist et al., 1995a). Herefter kan der evt. ske en spredning til de mere distale dele af tarmsystemet, som colon og rectum (Gebhart, 2006). Mikroskopisk kan de proliferative læsioner erkendes omkring dag 11, og makroskopisk erkendes omkring dag 12 efter infektionen (Gebhart, 2006). Evt. sker der en spredning til colon, som hyppigst sker ca. 2 uger senere (McOrist og Gebhart, 2006). I en dansk undersøgelse fandt man, at 69 % af smittede dyr var positive for Lawsonia intracellularis i colon (Jensen et al., 2006). Ad 6: Afhelingen af læsionerne begynder ca. 4 uger efter infektionens start(gebhart, 2006) og sker ved eliminering af de inficerede celler til tarmlumen. Ikke inficerede celler begynder at opbygge den normale krypt-villus struktur (McOrist et al., 1996a). Normalt vil en celle der er inficeret af intracellulære organismer bruge apoptose til en eliminering af infektionen, men i tilfældet med LI, kan bakterien hæmme denne evne til apoptose, hvilket er en vigtig virulens faktor for bakterien (Smith og Lawson, 2001). Immunologiske forhold Humoral immunitet Det typiske immunrespons er et initielt IgM respons, efterfulgt af et senere IgG respons, der langsomt aftager. Lokalt i tarmen ses et IgA respons på infektionen (Kroll et al., 2004). Ved eksperimentelle infektioner er der set en stigning i IgG allerede 9-14 dage efter smitten (Guedes og Gebhart, 2003). Det høje niveau holder sig normalt kun i et par uger inden det begynder at aftage igen (Gebhart, 2006). I nogle forsøg kan IgG dog ses i op til 13 uger efter infektionen (Guedes og Gebhart, 2003). Disse titre er dog lavere end ved naturlige infektioner (Gebhart, 2006). Ved naturlig infektion, ses et lidt andet forløb, idet grisene ofte er beskyttet af maternelle antistoffer i de første 3-4 uger. Disse maternelle antistoffer kan være af betydning for tidspunktet af Lawsonia 15

22 smitte (Gebhart, 2006). I et forsøg er der ved Immunoflourescens antistof test (IFAT) fundet maternelt IgG hos grise i 5-6 ugers alderen. Disse dyr var signifikant beskyttet ved eksponering for virulent LI (Kroll et al., 2005). Desuden er der fundet et højt indhold af IgA og IgG og et lidt lavere indhold af IgM i råmælken hos hyperimmuniserede søer (Kroll et al., 2005). Der er altså tegn på at den passive immunitet giver en vis beskyttelse mod infektionen. Ved PHE infektioner ses der en langt højere titer end ved PIA. Her er der i nogle undersøgelser set titre på optil 1:1920(Gebhart, 2006). Gylte der har overlevet et udbrud af PHE kan have antistoffer i op til 12 uger efter infektionen (Guedes et al., 2002a). I et Re-challenge forsøg med en patogen LI stamme er det vist at en tidligere eksponering for LI giver fuld beskyttelse mod en ny eksponering for LI. Det blev ligeledes vist at inokulationsdosis har en stor sammenhæng med udviklingen af klinisk sygdom, men der er ikke nogen sammenhæng med inokulationsdosis og beskyttelse mod re-infektion. Det vil sige at en lav eksponering giver lige så stor beskyttelse ved et senere udbrud, som en høj eksponering 1. gang. I forsøget blev der desværre ikke målt på aktivering af T-lymfocyt aktivering eller indhold af IgA i tarmmucosaen, kun IgG, hvor der hurtigt påvistes en stigning (Collins og Love, 2006). Forsøget viste desuden at en priming med patogen LI giver en bedre beskyttelse end ved priming med vaccine (Enterisol Ileitis, Boehringer Ingelheim). I Collins og Loves forsøg kunne ikke påvises nogen fækal udskillelse af LI hos de dyr der har været eksponeret tidligere, mens der i et forsøg af Guedes og Gebhart kunne påvises en intermitterende fækal udskillelse i op til 9 uger efter inokulation af patogen LI hos vaccinerede dyr. Statistisk set, var disse dyr dog signifikant beskyttede for patologiske forandringer (Guedes og Gebhart, 2003). Mucosal immunitet Et forsøg med en vaccinestamme viste, at den beskyttende immunitet mod LI ikke kun beror på det humorale respons, idet grisene i dette forsøg ikke havde målelige IgG antistoffer i op til 5 uger efter eksponeringen. Dette til trods for at de var signifikant beskyttet ved eksponering af LI (Kroll et al., 2004). Man mener at immuniteten i større grad beror på tilstedeværelsen af sekretorisk IgA i tarmen, samt det cellulære immunrespons (Kroll et al., 2005). Lokalt i tarmen findes også antistoffer i form af IgA. Immunohistokemiske studier har påvist store mængder IgA i vacuoler i det apicale cytoplasma i de inficerede proliferative enterocytter. Vacuolerne var lokaliseret i umiddelbar nærhed af LI (McOrist et al., 1992). 16

23 Celle medieret immunrespons Det inflammatoriske respons ved LI infektioner er minimalt (Rowland og Lawson, 1974) modsat mange andre infektioner med enteroinvasive bakterier (Lawson og Gebhart, 2000). Resultater fra et forsøg i 2003 indikerer at der er en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af LI og et reduceret antal B og T celler. Disse resultater tyder på at LI har en immunosuppresiv effekt (MacIntyre et al., 2003). Der sker desuden en produktion af interferon gamma (IFN-γ) i leukocytterne, som begynder ca. 2 uger efter infektionen, topper 3 uger efter, for derefter at falde igen. Dette svar varer længere end det humorale immunsvar, således var det i et forsøg stadig muligt at erkende IFN-γ 13 uger efter infektionen (Smith et al., 2000). IFN-γ er et cytokin produceret af Th-1 celler og involveret i det cellulære immunrespons. Man mener de kan være med til at begrænse infektionen. Forsøg med IFN-γ receptor knockout mus viste at disse var langt mere modtagelige for infektionen end wildtype mus (Smith et al., 2000). Diagnostik Da de kliniske tegn er uspecifikke eller slet ikke tilstede, kan en LI infektion let forveksles med andre patogener der samtidig er tilstede i besætningen. Derfor kan man ikke alene på det kliniske grundlag stille en sikker diagnose. Et typisk kendetegn er dog en stor vægtmæssig variation mellem grisene i samme aldersgruppe (Gebhart, 2006). Der er følgende diagnostiske muligheder: Ante mortem Da bakterien, som tidligere nævnt er obligat intracellulær, er det ikke umiddelbart muligt at påvise den ved dyrkning. Derimod kan bakterien på vises ved PCR, immunoperoxidase farvning eller immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens fra fæces eller via indirekte immunofluorscens antibody test (IFAT), immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) samt enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fra serum (Kroll et al., 2005). PCR PCR metoden påviser bakterielt DNA ved hjælp af specifikke primere. Testen skelner ikke om bakterien er levende eller død. Denne metode giver generelt en høj specificitet og en varierende sensitivitet, idet den varierer med kvaliteten af prøveudtagningen og tilstedeværelsen af inhibitoriske fak- 17

24 torer i fæces, eksempelvis urea, hæmoglobin og heparin, der eksempelvis kan inaktivere DNA polymerase, opløse nukleinsyrer eller interfererer med cellelysis under ekstraktionsprocessen (Lantz et al., 1997). Ved PCR finder man normalt bakterien ved klinisk afficerede dyr, men ved subklinisk inficerede dyr er testen ikke sensitiv nok til at blive brugt rutinemæssigt, idet det kræver en udskillelse af bakterier til tarmen, før prøven bliver positiv (Gebhart, 2006). Ved en PCR test fra fæces er specificiteten meget høj, op mod 100 % (Kroll et al., 2005), mens sensitiviteten varierer fra 37,5 til 71,1 % (Guedes et al., 2002c). Der kan også anvendes en Real-Time PCR test på grundlag af en Reverse Transcriptase PCR (RT- PCR). RT-PCR er en metode der detekterer bakterielt ribosomalt RNA. Ved at oprense denne RNA, og ved brug af enzymet Reverse transcriptase laves RNA om til cdna (Copy DNA). cdna mærkes med et flourcerende molekyle, og i en thermo cycler opformeres cdna. Når der er sket en vis opformering af cdna, udsendes lys som registreres i maskinen, og antallet af cycler maskinen har kørt inden lyset udsendes, registreres. Derved fremkommer en CT-værdi (Cycle Threshold), som beskriver mængden af RNA. Det vil sige at en lav CT-værdi indikerer en høj forekomst af RNA. Se eventuelt yderligere beskrivelse af metoden i bilag 4. Metoden har den fordel at den er semikvantitativ og kan aflæses maskinelt. Desuden er den hurtig og det er muligt at køre et større antal prøver i hver batch. Metoden er formenligt mere sensitiv, idet den anvender ribosomalt RNA (rrna), der findes i mange kopier ( ) i hver bakterie. RT-PCR detekterer levende bakterier, modsat en almindelig PCR, der ikke kan skelne om bakterien er levende eller død. Dette skyldes at der er RNAse tilstede stort set overalt (også i fæces), og dette vil hurtigt nedbryde det rrna der er i lyserede døde bakterier (Ahrens, 2006). Der er endnu ikke lavet undersøgelser der bekræfter ovennævnte udsagn, ligeledes er sensitivitet og specificitet endnu ikke bestemt. Immunoperoxidase farvning (IPX) Ved hjælp af denne metode hvor der laves immunoperoxidase farvning (ved hjælp af monoklonale antistoffer) på et smear fra fæces, opnås der højere sensitivitet end ved PCR, især når udskillelsen af bakterier falder. Denne test er ikke påvirket af inhibitoriske faktorer i fæces. Omvendt er specificiteten heller ikke helt så stor som ved PCR. Sensitiviteten angives til 59,4-89,5 % (Guedes et al., 2002c). 18

25 Immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens Ven en ny metode med immunomagnetisk separation og ATP bioluminiscens, er det muligt at påvise bakterien i fæces (Watarai et al., 2005). Princippet for udførelsen af testen er en immunologisk mærkning af helcelle bakterie med en magnetisk kilde. Ved hjælp af passende hardware, kan testen aflæses elektronisk. Denne testmetode er forholdsvis ny og uafprøvet, derfor er sensitiviteten og specificiteten ukendte. Serologiske tests Disse tests er alle baseret på detektion af LI antistoffer på baggrund af tests udviklet ud fra renkulturer af LI, enten som helcelle antigen på slides eller i brønde eller som opløseligt antigen. Farvningen/mærkningen er enten med immunofluorscens (IFAT) eller med immunoperioxidase labeled monolayer assay (IPMA). For disse tests angives en sensitivitet på 91,2 % for IFAT (Guedes et al., 2002c) og for IPMA en sensitivitet på 89 % og en specificitet på 100 % (Guedes et al., 2002b). I et senere dansk forsøg er sensitiviteten for IFAT angivet til 73 % ved naturligt inficerede dyr (Jensen et al., 2005). Derudover er der en række forskellige ELISA tests til rådighed, baseret på forskellige antigener. Ved fremstillingen af ovennævnte tests kræves at man kan dyrke Lawsonia for at fremstille det nødvendige antigen; derfor er det et meget begrænset antal laboratorier der kan tilbyde disse tests (Gebhart, 2006). DFVF er et af disse laboratorier. Her har man udviklet en ELISA med en rapporteret sensitivitet på 98 % og en specificitet på 99,3 % (Boesen et al., 2005). Værdien af disse serologiske tests er generelt god, men ved meget svage infektioner som PIA samt ved subklinisk inficerede dyr, er det serologiske respons ofte svagt og kortvarigt. Desuden er det serologiske respons noget forsinket i forhold til infektionen, idet det tager 2-3 uger inden grisene serokonverterer. ELISA testen har endvidere den fordel at den har en stor kapacitet, er hurtig at aflæse og kan aflæses maskinelt (Gebhart, 2006). Post mortem Der ses der ofte et meget varieret billede ved obduktion. De svære tilfælde er lette at erkende, mens de mere subkliniske kan være svære overhovedet at diagnosticere. Post mortelt er der følgende diagnostiske muligheder: Histologisk påvisning af proliferative forandringer i ileum, eksempelvis med HE farvning. 19

26 Histologisk påvisning af bakterier med modificeret Ziehl-Neelsen farvning eller sølvfarvning. Bakterien kan påvises ved sølvfarvning, immunofarvning med mono- eller polyklonale antistoffer eller farvning med modificeret Ziehl-Neelsen farvning (Gebhart et al., 1993; Lawson og Gebhart, 2000). Histologisk påvisning ved immunohistokemi. Denne metode er mere sensitiv end den kemiske påvisning, da denne også påviser organismerne i makrofagerne i lamina propria under ophelingsfasen. I et sammenligningsforsøg kunne man med immunohistokemi påvise omkring dobbelt så mange bakterier end med sølvfarvning (Guedes et al., 2002c). PCR. Ved at lave PCR på mucosa fra ileum, kan der opnås en specificitet der er på højde med immunohistokemi (Guedes et al., 2002c). Direkte påvisning med elektronmikroskop. For HE farvning angives en sensitivitet på 36,8 %, for sølvfarvning på 50 % og for immunohistokemi på 86,8 % (Guedes et al., 2002c). Differential diagnoser Der er en række differential diagnoser der bør overvejes i forbindelse med diagnostik af lawsonia, nemlig: Ulcus ventriculi, tarmtorsion, spirochætal colitis, porcin salmonellose, svinepest, TGE, Trichuris suis (Piskeorm), samt PCV-2. Økonomiske forhold Der er foretaget en beregning baseret på danske forhold, der viste at en ubehandlet LI infektion hos en fravænningsgris koster 19,- DKR. Estimatet er baseret på at den daglige tilvækst nedsættes med 49 gram og at foderudnyttelsen forringes med 0,36 kg foder/ kg tilvækst (Johansen, 2006). En anden betydelig faktor er, at LI forårsager en stor variation i størrelsen af grisene i den samme aldersgruppe (Gebhart, 2006). Dette kan have betydning for dyreflowet i en slagtesvinestald, idet den store variation i størrelsen gør at det vil kræve længere tid at levere dyr i det optimale vægtinterval til slagteriet. Dermed vil stalden komme til at stå halvtom i en periode og evt. forhindrer dette at der kan anvendes en alt ind / alt ud produktionsform. Den uens størrelse af grisene i slagtesvineperioden vil også medvirke til vanskelighed med fodersammensætningen. Da grisenes næringsstofbehov ændres i forhold til deres størrelse, vil det være svært at optimere en foderblanding der passer til hele holdet. Det vil være således at de mindste grise i holdet får et foder der er ringere end deres behov, hvilket medfører yderligere nedsat til- 20

27 vækst, og de største grise i holdet får et foder der er bedre end deres behov, hvilket medfører dårligere foderudnyttelse og økonomi. Fodring I en undersøgelse af melfoder kontra pelleteret foder, er det vist at brugen af melfoder giver en signifikant lavere antal behandlingsdage for diarré. Desuden var der en tendens til lavere dødelighed, samt mindre udskillelse af LI i fæces (Johansen et al., 2003). Desværre viste det sig også at tilvæksten på melfoder var betydelig lavere end ved pelleteret foder. En anden undersøgelse bekræftede disse resultater (Johansen et al., 2005), og en tredje undersøgelse viste at ikke varmebehandlet, ikke pelleteret hjemmeblandet foder sammenlignet med pelleteret, varmebehandlet indkøbt foder nedsætter sandsynligheden for påvisning af LI hos slagtesvin i fæces (Stege et al., 2001). Fermenteret korn i vådfoder til tungsvin har også vist tendens til effekt mod LI, sammenlignet med vådfoder med ikke-fermenteret korn (Jørgensen, 2006). Ligeledes er der også set en effekt ved tilsætning af organiske syrer til foderet (Pedersen et al., 2002). I et helt nyt forsøg er der set tendens til at organiske syrer (1 % mælkesyre, 1 % myresyre og ½ % benzoesyre) i hele smågriseperioden, samt 2500 ppm zink i de første 14 dage efter fravænning, har en effekt på forekomsten af diarré i hele smågriseperioden (Johansen et al., 2007). Tilvækst Det er vanskeligt at estimere den præcise betydning af en LI-infektion på tilvæksten. Der kan være mange ukendte faktorer der spiller ind, såsom mængden af LI, som grisen er blevet eksponeret for, tilstedeværelsen af andre mere eller mindre virulente patogener, forskellige managementfaktorer, fodring, mortalitet og morbiditet, subkliniske infektioner o.s.v. Lawsonia intracellularis er i en artikel blevet sidestillet epidemiologisk med Mycoplasma hyopneumoniae, som et patogen der næsten altid er til stede (McOrist et al., 2003). Johansen (2006) angiver betydningen af LI infektion til en nedsat daglig tilvækst på 49g og en forringet foderudnyttelse på 0,36 kg foder/kg tilvækst. Der har i de senere år været forskellige forsøg på at sanere for LI, især i forbindelse med totalsaneringer af besætninger, men også delvis depopulation har været forsøgt (Nielsen, 2006). Ved disse saneringer, der er blevet gennemført under meget streng biosecurity, er der set en stor gevinst i form af høj daglig tilvækst (>600 g fra 7-30 kg, og >1000 g fra kg) samt en god foderudnyttelse på ca. 2,42 2,57 FE/kg tilvækst (Conradsen, 2006). En sidegevinst ved saneringen 21

28 har været at alle de involverede besætninger er sluppet for problemer omkring fravænningsdiarré (Conradsen, 2006). En sammenligning med de 25 % bedste danske besætninger i 2004 ses herunder (Hundrup, 2007a; Hundrup, 2007b). Sammenligningen med de 25 % bedste danske besætninger er valgt, idet de sanerede besætninger formentlig har et meget højt sundhedsstatus, da de jo er nyligt opstartet på grundlag af en totalsanering. Tabel 1: Tabellen viser en sammenligning af Lawsonia-frie besætninger sammenlignet med landsgennemsnittet Lawsonia fri Gennemsnit af de 25 % bedste danske besætninger i 2004 Daglig Tilvækst fra 7-30 kg g 429 g Tilvækst fra kg g 888 g Foderudnyttelse (antal FE/kg tilvækst) 2,42-2,57 2,68 Desværre har det vist sig vanskeligt at holde disse besætninger fri for LI. De fleste er blevet reinficeret inden for 1½-2 år, undtagen to besætninger der har været fri for LI i over 5 år (Conradsen, 2006). Da LI jo er så udbredt i de danske svinebesætninger, og forekomsten i miljøet er dårligt belyst, finder jeg det interessant at belyse forekomsten af bakterien i miljøet. I den efterfølgende undersøgelse vil jeg forsøge at belyse betydningen af LI i miljøet. 22

29 Undersøgelse af Lawsonia intracellularis smittedynamik i en besætning, samt forekomst i miljøet Introduktion Lawsonia intracellularis er særdeles hyppigt forekommende i den danske svineproduktion. En dansk undersøgelse viste at LI var tilstede i 93,7 % af 80 undersøgte besætninger(stege et al., 2000). En anden undersøgelse har vist at LI er tilstede i 100 % af 20 undersøgte besætninger (Hardge et al., 2006). LI er agens ved porcin proliferative enteropathy, der er af væsentlig økonomisk betydning for effektiviteten i svineproduktionen. Den økonomiske betydning af en LI-infektion er opgjort til 19 kr. pr. fravænningsgris baseret på en nedsat daglig tilvækst på 49 gram og et forøget foderforbrug på 0,36 FEs pr. kg tilvækst. Der er i de senere år observeret en stigning i anvendelse af antibiotika til gastrointestinale lidelser i den danske svineproduktion (Heuer og Jensen, 2005). Derfor er det oplagt at foretage undersøgelser til kortlægning af infektionsforløbet i svineproduktionen, som måske engang i fremtiden kan medvirke til at nedbringe brugen af antibiotika til LI. Almindeligvis smittes smågrisene kort tid efter fravænning, hvilket viser sig klinisk i form af diarre og utrivelighed (McOrist og Gebhart, 2006). Formål Undersøgelsens primære formål var at belyse betydningen af en serokonvertering allerede ved fravænning, herunder grisenes daglige tilvækst og udskillelse af bakterier til miljøet. Endvidere ønskes forekomsten af LI i miljøet belyst under normale staldforhold, samt betydningen af LI-infektionen på grisenes udskillelse af bakterier samt tilvækst. Arbejdshypotesen i undersøgelsen var: H A = Grise der serokonverterer tidligt har anderledes tilvækst i smågriseperioden end grise der serokonverterer senere. 23

30 Materialer og metoder Undersøgelsens design Besætningen blev valgt på baggrund af en tidligere undersøgelse, hvor den ene besætning der medvirkede i undersøgelsen viste et anderledes infektionsforløb i farestalden (Johansen et al., 2006). Ved blodprøveundersøgelser af søer og grise i denne besætning blev der observeret en titerstigning LI-antigen hos 60 % af grisene ved fravænning. Dette kunne indikere at smitten var aktiv allerede i farestalden. Dette billede var anderledes end i de andre besætninger, der deltog i undersøgelsen, hvor der blev observeret serokonvertering ca. 3 uger efter fravænning. Dette forløb adskiller sig også fra den tidligere beskrevne smittedynamik, hvor der ses to overordnede billeder af smittedynamik i LI-inficerede besætninger. Det ene mønster er karakteriseret af en tidlig infektion i 4-7 ugers alderen og ses i kontinuert drevne besætninger (McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003). Det andet mønster er karakteriseret af en senere infektion hvor dyrene er uger gamle, og ses i besætninger der har en høj grad af sektionering. Det er typisk at besætningen arbejder med en høj grad af sektionering eller multisite (Bronsvoort et al., 2001; McOrist et al., 2003; Chouet et al., 2003; McOrist og Gebhart, 2006). En dansk undersøgelse i 5 besætninger viste serokonvertering ved ugers alderen (Stege et al., 2004). Dette billede er nok typisk for de danske besætninger der kører med en høj grad af sektionering. Besætningen var på 500 søer med sundhedsstatus SPF+Myc+Ap-12. Besætningen er i Salmonellaniveau 1, men konstateredes inficeret med Salmonella derby, den 31/ , altså i undersøgelsesperioden. Farestalden var delvis sektioneret og indrettet med traditionelle kassestier. Ved fravænning blev der af staldpersonalet estimeret en vægt for grisene, som derefter blev drevet hen til to ens klimastalde. Klimastaldene var flatdeck stalde uden overdækning, med 3 gyllekummer og fast gulv i midten. Ved indgangen til stalden var der placeret 3 foderautomater (Figur 1). Projektets design var et kohortestudie. Der blev udvalgt et antal grise, der blev fulgt fra fødsel til ca. 30 kg. Det forventedes at ca. 50 % serokonverterede inden for denne periode. Stikprøvestørrelser og selektion Stikprøvestørrelse: Der forventes en negativ afvigelse på ca. 20 gram daglig tilvækst fra den normale daglige tilvækst på ca. 400 gram daglig tilvækst for smågrise der ikke er smittet med Lawsonia 24

31 intracellularis. Beregningen baseres på en standardafvigelse på 35 og et konfidensinterval på 95 %. På grundlag af ovenstående parametre er stikprøvestørrelsen beregnet til 99 dyr, svarende til 8-9 kuld med grise pr. kuld. (Bilag 3) Ved første besøg blev der tilfældigt udvalgt 8 søer i farestalden, hvorfra grisene skulle indgå i undersøgelsen. De blev udvalgt som ca. hver 4. so i det ugehold. Undersøgelses procedure Besætningen blev besøgt 7 gange og besøgene blev foretaget i efteråret 2006 som vist i Tabel 3. Grisene, der var 1-4 dage gamle ved 1. besøg, fik indsat øremærke, blev vejet, og køn, evt. utrivelighed og diarré blev noteret. Desuden blev der udtaget en rectalsvaber, samt en blodprøve fra hver gris. Moderens paritet blev ligeledes noteret. Skema til vurdering af utrivelighed og diarré er indsat i bilag 2. Ved besøg blev grisene vejet og der blev noteret om de havde diarré eller var utrivelige, og der blev udtaget en rectalsvaber og en blodprøve fra hver gris. Ved besøget i besætningen den 23/8 og 20/9 blev der udtaget prøver af stibunden af farestien. Prøverne blev undersøgt ved RT-PCR metoden. Procedure for udtagning af svaberprøve: Umiddelbart inden prøven blev udtaget, dyppedes svaberen ned i transportmediet. Svaberprøven udtoges fra grisens endetarm med en steril svaber, som blev klippet/knækket over og overførtes til et glas med transportmedie. Transportmediet bestod af ammoniumsulfat, TRIS-buffer og Natriumcitrat, som havde til formål at forhindre proteinudfældning, samt at hæmme RNAse aktiviteten. Blodprøven blev udtaget fra vena cava cranialis, i et ustabiliseret prøveglas. Begge prøver blev sendt til analyse hos DFVF i København. I forbindelse med fravænning blev grisene flyttet til klimastaldene den 23/9, og tilfældigt fordelt i de to ens stalde. Laboratoriemetoder ELISA testen blev udført efter beskrivelserne i Evaluation of a novel enzyme-linked immunosorbent assay for serological diagnosis of porcine proliferative enteropathy (Boesen et al., 2005). RT-PCR testen blev udført som i beskrivelsen i bilag 4. Epidemiologiske metoder Statistiske metoder: Data præsenteres ved deskriptiv statistik. 25

32 Data som vægt, køn, utrivelighed og diarré er manuelt indtastet, korrekturlæst og indført i, og behandlet med Microsoft Excel Data fra ELISA og PCR testen er automatisk overført til Microsoft Excel Grupper af data blev testet med t-test, samt f-test til beskrivelse af spredning. Sektion Ved undersøgelsens afslutning blev der udvalgt 10 grise, som blev kørt til DFVF i København og aflivet og obduceret. Grisene blev udvalgt på grundlag af størrelse, lav CT-værdi (stor udskillelse af bakterier), og umiddelbar tilvækst ved sidste vejning. Den primære årsag til obduktionerne var grisenes deltagelse i en anden undersøgelse. Ved obduktionen blev der udtaget materiale fra ileum, colon og tyndtarm til videre immunohistokemisk undersøgelse. Obduktionsrapporten for grisene kan ses i bilag 5 26

33 Miljøprøver Den 20/9 blev der udtaget svaberprøver fra de to ens nyvaskede klimastalde, som grisene skulle indsættes i. En visuel bedømmelse af rengøringen må karakteriseres som noget mangelfuld, idet der midt på gulvet lå der en stor (2x3 cm) klat fæces i stald 3. Der blev udtaget en svaberprøve fra denne klat. Ved de efterfølgende vejninger blev der udtaget 10 miljøprøver i hver af de 2 stalde efter følgende mønster (se endvidere Figur 1): Tabel 2: Skema med beskrivelse af steder i klimastaldene hvor der blev udtaget miljø prøver. Se også Figur 1. Prøve nr. Beskrivelse af sted: 1 Væg: 20 cm fra hjørne i venstre side gang-ende og 20 cm over gulv. 2 Væg: 20 cm fra hjørne i venstre side vindue-ende og 20 cm over gulv. 3 Væg: Huller i endevæg. 20 cm over gulv. 4 Væg: 20 cm fra hjørne i højre side vindue-ende og 20 cm over gulv. 5 Væg: 20 cm fra hjørne i højre side gang-ende og 20 cm over gulv. 6 Gyllekanal: Underside af krybbe i venstre side. 7 Gyllekanal: Underside af spalter midt i venstre side. 8 Gyllekanal: Underside af spalter midt i midterste kumme. 9 Gyllekanal: Underside af spalter midt i højre side. 10 Gyllekanal: Underside af krybbe i højre side Figur 1: Skitse over fravænningsstalden. De røde cirkler angiver hvor der blev udtaget miljøprøver. 27

34 Resultater Resultater af de enkelte vejninger, blodprøvesvar og RT-PCR svar er indsat i bilag 1. Tabel 3: Tabellen viser datoer for besøg i besætningen, intervallet i dage til næste besøg, samt hvilke prøver der blev udtaget ved det pågældende besøg. 1. vejning 2. vejning 3. vejning 4. vejning 5. vejning 6. vejning 7. vejning Dato Dage til næste vejning Øremærke X Vejning X X X X X X X Blodprøve X X X X X X X Fæcesprøve X X X X X X X Miljøprøve i klimastald X X X X X Blodprøve fra moder X X Miljøprøve i farestald X X Tabellen herover viser hvilke dage besætningen blev besøgt, samt hvilke prøver der blev udtaget ved de enkelte besøg. Bemærk at der er en forskel i intervallet mellem besøgene. Grisene blev fulgt fra dag ca. 4 og 84 dage frem. Ved starten af undersøgelsen var der 92 grise. Dette antal blev efterhånden reduceret til 78 grise af nedenstående årsager: 5 grise faldt fra i farestalden og blev af velfærdsmæssige grunde flyttet til en anden so. (nr.857, 900, 865, 882 og 894) 4 grise manglede i løbet af undersøgelsen (nr. 858, 880, 883 og 923) 2 grise klemt under soen. (nr. 890 og 891) 1 gris død under blodprøvetagningen. Obduktion og klinisk observation gav indikation for at nervus vagus var blevet læderet. (gris nr. 928) 1 gris død. Obduktion i stalden indikerede PPE og en svabreprøve fra ileums mucosa viste en CT værdi på 9,69. Obduktionsrapport i bilag 6. (nr. 892). 1 gris død. Ukendt årsag På grund af mangel på søer til løbning i besætningen, blev nogle af kuldene fravænnet tidligere. I forbindelse med fravænningen blev grisenes vægt estimeret af staldpersonalet. 28

35 Tabel 4: viser fravænningsdatoerne for søerne. Kuld nr. So nr. Fravænningsdato Antal grise Antal kg (estimeret) / / / / / / Død (15/9) / Undersøgelse af betydning af tidlig serokonvertering Undersøgelsens primære formål var at undersøge betydningen af tidlig serokonvertering. I nedenstående figur er CT-værdierne og OD-værdierne for de enkelte kuld præsenteret. Bemærk at der er anvendt en reciprok værdi af CT-værdierne for at illustrere en stigning i udskillelsen. 0, Reciprok RT-PCR 0,045 0,04 0,035 0, OD-værdi 0, Dato Figur 2: Plot af forløbet af antistofniveau og LI-udskillelse for de enkelte kuld over den samlede undersøgelsesperiode. 29

36 Som det ses på Figur 2, er stigningen i udskillelse samt stigningen i antistofniveau sket over samme periode, nemlig fra den 18/10 til den 9/11. Da der således ikke var nogen forskel grupperne imellem, har det ikke været muligt at undersøge betydningen af tidlig serokonvertering. Der var dog 11 grise, som først serokonverterede den 9/11. Den gennemsnitlige daglige tilvækst for disse 11 grise var på 445g mens den var på 436g for resten. En t-test returnerer en p-værdi på 0,76. Der kan altså ikke på dette grundlag konkluderes noget om betydningen af tidlig serokonvertering. Ved vejningen den 18/10 (5. vejning) var der 24 grise, som stadig havde et højt maternelt antistofniveau, det vil sige en OD-værdi over 7. For at illustrere dette er de indsat i figuren herunder. 200 OD-værdi Vejning nr Figur 3: Plot at OD-værdier for 24 grise som stadig var seropositive ved vejningen den 18/10 (5. vejning) Som det fremgår af Figur 3 har disse grise haft et konstant faldende niveau af antistoffer over en periode på næsten 2 måneder. For at belyse en eventuel sammenhæng mellem daglig tilvækst og sent fald i maternelle antistoffer er den daglige tilvækst og OD-værdierne plottet i figuren herunder. 30

37 Dgl. tilvækst i gram OD-værdi Seronegative grise den 18/10 Seropositive grise den 18/10 Figur 4: Plot af daglig tilvækst og OD-værdier den 18/10 hos henholdsvis seropositive og seronegative grise. På Figur 4 er plottet den daglige tilvækst og OD-værdierne aflæst den 18/10. Sammenhængen mellem de to grupper er undersøgt på grundlag af en gennemsnitlig daglig tilvækst på 418 gram i den seropositive gruppe og 444 g i den seronegative gruppe. T-testen returnerer en værdi på 0,27. Der er altså ingen sammenhæng mellem sent indhold af maternelle antistoffer og daglig tilvækst. Undersøgelser med kuld Tabel 5: Tabellen viser den gennemsnitlige startvægt, slutvægt og tilvækst for de kuld der indgik i undersøgelsen. Kuld nr. Mor Antal Paritet Startvægt kg. Slutvægt kg. Gns. Dgl. tilvækst ,96 41, ,51 36, ,26 43, ,79 40, ,95 35, ,11 39, ,94 38, ,82 34, I Tabel 5 ses en oversigt over startvægt og slutvægt ved de kuld der indgik i undersøgelsen. For at belyse betydningen af tilvæksten på et stigende antistofniveau i blodet, er der lavet et plot, for de sidste 2 målinger. Der er kun anvendt de sidste 2 målinger, idet der kun var 2 kuld, hvor den 31

38 gennemsnitlige OD-værdi var over 7, på den 3. sidste måling. En OD-værdi på 7 betegnes som positiv ved den anvendte ELISA-test. Daglig tilvækst i gram ,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 OD-værdi Daglig tilvækst fra 5-6 vejning Lineær (Daglig tilvækst fra 5-6 vejning) Daglig tilvækst fra 6-7 vejning Lineær (Daglig tilvækst fra 6-7 vejning) Figur 5: Plot af den gennemsnitlige tilvækst og gennemsnitlige OD-værdi pr. kuld ved de sidste 2 målinger. Som det fremgår af Figur 5 ses der på tendenslinien ved målingen fra 6-7 vejning en tendens til faldende daglig tilvækst ved en stigende OD-værdi. Ved en opdeling af kuldene i 2 grupper, med de 4 kuld, der har den laveste værdi i den ene gruppe, og de 4 kuld med højest OD-værdi i den anden gruppe, er denne tendens undersøgt. Den gennemsnitlige daglige tilvækst i den lave gruppe var på 956 gram og 906 gram i den høje gruppe. En t-test returnerede en p-værdi på 0,61. Der kunne derfor ikke påvises nogen statistisk sammenhæng mellem kuldenes OD-værdi og den aktuelle tilvækst. Med samme metode er der undersøgt for sammenhængen af udskillelsen af bakterier i fæces og den aktuelle tilvækst. 28,00 26,00 24,00 22, ,00 Gram dgl. tilvækst CT-værdi 5-6 vejning 6-7 vejning Lineær (5-6 vejning) Lineær (6-7 vejning) Figur 6: Plot af gennemsnitlig CT-værdi og gennemsnitlig daglig tilvækst pr kuld ved de sidste 2 målinger. Bemærk at x-aksen er omvendt. 32

39 Som det fremgår af Figur 6 herover, er der en tendens til lavere tilvækst med højere udskillelse ved den sidste måling. Denne tendens er undersøgt ved opdeling i to grupper i henholdsvis høj og lav udskillelse. Den gennemsnitlige daglige tilvækst for den lave gruppe var på 866 mod 995 i den høje gruppe. En t-test returnerer en p-værdi på 0,16. Der er således heller ikke nogen statistisk sammenhæng mellem udskillelse af bakterier og aktuel daglig tilvækst på de kuld der indgik i undersøgelsen. Undersøgelser med paritet For at undersøge om moderens paritet har indflydelse på kuldenes tilvækst er kuldenes tilvækst plottet i et skema sammen med moderens paritet. Gram dgl. Tilvælst 490,00 450,00 410,00 370, Paritet Figur 7: Plot af den kuldvise gennemsnitlige daglige tilvækst sammenlignet med moderens paritet Som det fremgår af tendenslinien indsat i Figur 7 herover, ses en tendens til lavere tilvækst ved en højere paritet hos moderen. Figuren er for overskuelighedens skyld afbilledet pr. kuld. Denne sammenhæng er undersøgt for de individuelle resultater ved at dichotomisere søerne i yngre (under 4 læg) og ældre (4 læg eller derover). Den gennemsnitlige daglige tilvækst hos de yngre søer var på 455 g mod 426 gram hos afkommet efter de ældre søer. En t-test returnerer en p-værdi på 0,15, så der er ikke nogen statistisk sammenhæng mellem daglig tilvækst og paritet i denne undersøgelse. Maternelt antistofniveau For at belyse for en eventuel sammenhæng mellem indholdet af maternelle antistoffer og paritet, er disse værdier plottet i en figur. 33

40 OD-værdi Læg nr Figur 8: Plot af maternelt antistofniveau og moderens paritet Som det fremgår af tendenslinien i Figur 8 er der en tendens til at det maternelle antistofniveau følger pariteten. Ved at dichotomisere efter moderens paritet i henholdsvis yngre (2-3 læg) og ældre (4-6 læg), er der udført en t-test på baggrund af en gennemsnitlig OD-værdi på 42,5 i gruppen med de yngre søer og en OD-værdi på 99,2 i gruppen med de ældre søer. En t-test returnerede en p-værdi på <0,00001, altså en klar statistisk signifikant sammenhæng. Betydning af maternelle antistoffer For at belyse sammenhængen mellem maternelle antistoffer og henholdsvis LI udskillelse i fæces og daglig tilvækst, er der lavet et plot på grundlag af 2 grupper med 34 grise i hver gruppe. Grupperne er opdelt efter de 34 grise med de laveste maternelle OD-værdier og de 34 grise med de højeste maternelle antistoffer. Resultatet ses i figurerne herunder. Dgl.tilvækst i gram OD-værdi 34 grise med højest OD-værdi 34 Grise med lavest OD-værdi Figur 9: Figuren viser et plot af daglig tilvækst og indhold af maternelle antistoffer Som det fremgår af Figur 9 er der ingen sammenhæng mellem indholdet af maternelle antistoffer og daglig tilvækst. En t-test på baggrund af en gennemsnitlig OD-værdi på henholdsvis 366 og 369, returnerede en p-værdi på 0,87. Altså ingen sammenhæng. 34

41 40 CT-værdi OD-værdi 34 grise med højeste mat. AB 34 grise med laveste mat. AB Figur 10: Figuren viser et plot af CT-værdierne fra den 9/11 og indhold af maternelle antistoffer På Figur 10 ses et lignende billede. Der er anvendt CT-værdierne fra den 9/11, da udskillelsen fra grisene var højest denne dato. En af målingerne i den lave gruppe skiller sig ud med en CT-værdi på 35,31, som betyder en ca 128 gange lavere udskillelse i forhold til gennemsnittet. Da data fra analysen er aflæst via en computer og direkte indført i regneark er der efter undersøgelse af data ikke fundet anledning til at udelukke denne måling fra undersøgelsen. Ved en analyse af data på grundlag af gennemsnitlige CT-værdier på 24,84 for den lave gruppe og 25,53 for den høje gruppe, returneres ved en t-test en p-værdi på 0,09. Der er altså en tendens til at grise med et højt maternelt antistofniveau har en lavere udskillelse af LI i fæces. Sammenhæng mellem OD-værdier og CT-værdier Et plot af disse værdier for de sidste 3 målinger, afslørede at der muligvis kunne være en sammenhæng mellem dem (Figur 11). Der er kun anvendt de sidste 3 målinger, idet antallet af dyr hvor begge resultater var til rådighed, var for lille ved de 4 første målinger. 40,00 35,00 30,00 CT-værdi 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0, OD-værdi Lav OD-gruppe Høj OD gruppe Lav OD-gruppe Høj OD-gruppe Lav OD-gruppe Høj OD-gruppe Figur 11: Plot af sammenhængen mellem OD-værdier og CT-værdier ved de sidste 3 målinger. Inddelingen i grupper er sket efter en grænseværdi på

42 For at undersøge en evt. sammenhæng blev grisene inddelt i 6 grupper med 2 grupper for henholdsvis høj og lav udskillelse for hver dato. Der blev anvendt en cut-off værdi på 7 for at fjerne dyr der ikke har serokonverteret. Opdelingen i henholdsvis høj og lav gruppe skete ved værdien 65. Den lave gruppe repræsenterede således grise med en OD-værdi mellem 7 og 65 og den høje gruppe repræsenterede dyr med en OD værdi over 66. Høj gruppe Antallet af dyr i de forskellige grupper ses i skemaet herunder. Tabel 6: Oversigt over de gennemsnitlige værdier for antistofniveau, udskillelse samt forekomst i miljøet fordelt på klimastalde. Lav gruppe Høj gruppe Lav gruppe Høj gruppe Lav gruppe Høj gruppe Antal dyr Gns OD Gns CT 32,97 35,84 23,84 23,12 26,02 24,66 p-værdi ved t-test for forskel i CT-værdi Ikke udført 0,418 0,107 Som det fremgår af Tabel 6, kan der ikke påvises nogen statistisk signifikant sammenhæng mellem antistofniveau og udskillelse af LI. Med en p-værdi på 0,107, den 15/11, ses en tendens til at grise med et højt antistofniveau har en højere udskillelse af LI i fæces. Betydning af høj/lav fødselsvægt Betydning af lav startvægt i forhold til daglig tilvækst er undersøgt. Som det fremgår af Figur 12 herunder, er der en sammenhæng mellem fødselsvægt og daglig tilvækst. 700 Daglig tilvækst i gram ,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 Fødselsvægt i kg Grise med høj fødselsvægt Grise med lav fødselsvægt Figur 12: Sammenligning af fødselsvægten og den daglige tilvækst. Der skelnes mellem henholdsvis over og under 1,9 kg. 36

43 Værdierne i figuren er dichotomiserede efter en høj eller lav fødselsvægt med en cut off værdi på 1,9 kg. Gennemsnittet i den lave gruppe er på 391 g daglig tilvækst mens den høje gruppe har en daglig tilvækst på 470 g. En t-test returnerer en p-værdi på 0,00032; altså en stærk statistisk signifikant sammenhæng. Som det fremgår af Figur 13 var der en stor spredning på grisenes slutvægt. 60,0 50,0 Vægt i kg 40,0 30,0 20,0 25 percentil min median max 75 percentil 10,0 0, Kuld nr. Figur 13: Boksplot af slutvægten for grisene i de enkelte kuld. CT-værdi hos grise med diarré Det er undersøgt om grise med diarré har en lavere CT-værdi (og dermed højere udskillelse) end grise uden diarré. Et plot af disse data (Figur 14) indikerer ikke umiddelbart nogen sammenhæng, og en t-test med en p-værdi på 0,27 bekræfter da også denne antagelse. Det skal bemærkes at registreringen diarré / ikke diarré er forbundet med nogen usikkerhed, idet det ikke altid var muligt at konstatere om grisen havde diarré eller ej, ved udtagningen af svaberprøven. 37

44 ct-værdi gris id Gris med diarré Grise uden diarré Figur 14: Plot af CT-værdi hos grise med / uden diarré. Prøver fra farestalden Ved besøget i besætningen 23/8 og 20/9 blev der udtaget svaberprøver fra stibunden af farestalden. Resultater fra RT-PCR viste at so nr og 1514 den 23/8 havde en CT-værdi på henholdsvis 35,32 og 31,83. Alle andre prøver var negative. Miljøprøver Ved prøveudtagningen den 20/9, før grisenes indsættelse i klimastalden, blev der ud over de planlagte prøver, taget en prøve fra en klat fæces der lå på gulvet i klimastald 3. RT-PCR analysen viste en CT-værdi på 30,32. Figur 15 viser resultatet af miljøprøverne i de to klimastalde. Som det fremgår af figuren stiger udskillelsen af bakterier hen imod slutningen af undersøgelsen. Bemærk at der gennem hele undersøgelsesperioden har kunnet konstateres LI i miljøprøverne. 38

45 35 CT-værdi Dato Gennemsnit stald 3 Gennemsnit stald 7 Figur 15: Udviklingen i gennemsnitlig CT værdi for miljøprøverne udtaget i de to stalde. For at illustrere sammenhængen mellem grisenes udskillelse af bakterier og forekomsten i miljøet, er der lavet nedenstående figur. 40,00 120,0 35,00 100,0 ct-værdi 30,00 25,00 80,0 60,0 40,0 OD-værdi 20,00 20,0 15, Prøveudtagnings dato 0,0 Gns ct-værdi for grise i stald 3 Gns ct-værdi for grise i stald 7 Gns ct-værdi for miljøprøver i stald 3 Gns ct-værdi for miljøprøver i stald 7 Gns. Od-værdi for grise i stald 3 Gns OD-værdi for grise i stald 7 Figur 16: Figuren viser udviklingen i gennemsnitlig antistofniveau, udskillelse, samt forekomst i miljøet i de to stalde. Som det fremgår af Figur 16 har grisene der gik i stald 7 over hele perioden haft en lavere udskillelse af LI i fæces (lilla søjle). Ligeledes har grisene i stald 7 også haft det laveste antistofniveau over hele perioden. Omvendt var der ved de 3 første miljømålinger et ens eller lidt højere niveau i stald 3 39

46 end i stald 7, men ved de sidste 2 målinger ændrer dette forhold sig drastisk, således at LI forekomsten i miljøprøverne i stald 7 er signifikant højere end i stald 3. Ligeledes er det interessant at grisene placeret i stald 3 gennem hele perioden har haft et højere niveau af antistoffer. Dette gælder både maternelle antistoffer samt egne antistoffer. I tabellen herunder, ses en sammenligning af udskillelsen i de to stalde med resultatet af miljøprøverne. Ved analysen af miljøprøverne ved den sidste vejning, udgik der to prøver fra hver stald. Tabel 7: Oversigt over de gennemsnitlige værdier for antistofniveau, udskillelse samt forekomst i miljøet fordelt på klimastalde. Dato Antal grise i stald Antal grise i stald Antal RT-PCR positive grise i stald Antal RT-PCR positive grise i stald Prævalens af RT-PCR positive grise i stald 3 2,5 2,5 27,5 20,0 40,0 100,0 100,0 Prævalens af RT-PCR positive grise i stald 7 2,6 13,2 21,1 2,6 42,1 100,0 100,0 Gns CT-værdi for grise i stald 3 37,08 35,02 30,96 30,19 32,80 22,69 24,24 Gns CT-værdi for grise i stald 7 38,03 36,37 35,66 37,72 35,57 24,91 26,36 Antal ELISA positive grise i stald Antal ELISA positive grise i stald Prævalens af ELISA pos. grise i stald 3 100,0 90,0 87,5 82,5 42,5 95,0 97,5 Prævalens af ELISA pos. grise i stald 7 94,7 65,8 44,7 31,6 18,4 71,1 97,4 Gns. OD-værdi hos ELISA pos. i stald 3 97,4 64,2 46,8 34,4 23,9 60,2 64,4 Gns. OD-værdi hos ELISA pos. i stald 7 59,2 39,0 31,9 24,1 11,3 52,0 55,4 Antal miljøprøver stald Antal miljøprøver stald Antal positive miljøprøver stald Antal positive miljøprøver stald Prævalens af positive prøver stald Prævalens af positive prøver stald Gns CT-værdi for miljøprøver i stald 3 33,89 34,15 33,87 19,45 21,35 Gns CT-værdi for miljøprøver i stald 7 33,59 34,21 33,80 22,30 25,30 T-test for forskel i RT-PCR grise Ikke udført Ikke udført 0,222 Ikke udført 0,243 0,002 0,012 T-test for forskel i OD-værdi 0,001 0,003 0,114 0,211 0,018 0,202 0,099 T-test for forskel i miljø 0,893 0,981 0,670 0,002 0,006 Som det fremgår Tabel 7 af ovenfor udskiller grisene i stald 3 signifikant mere end grisene i stald 7 ved målingerne den 9/11 samt den 15/11. Samtidig er forekomsten i miljøet i stald 3 også signifikant større i denne periode. Ved de to første målinger, den 23/8 og den 20/9, er der også signifikant forskel på grisenes ODværdi. Det skal bemærkes at grisene på dette tidspunkt endnu ikke er flyttet til klimastalden. Prævalensen af positive fæcesprøver bør bemærkes, idet den først når op omkring 40 ved vejningen den 18/10. Bemærk også prævalensen af seropositive dyr den 18/10, hvor der i stald 3 er over 40 % positive dyr. Se evt. Figur 3. 40

47 Obduktion Resultaterne for obduktionen af de 10 grise er gengivet i figuren herunder Vurdering af forekomst CT-værdi IHC colon IHC Ileum IHC Tyndtarm B. pilosicoli B. innocens / murdochii CT-værdi 0 872* * 902* 914* 910* * 889* Gris ID 0 Figur 17: Resultatet af obduktionsfund. Vurdering af forekomsten i de forskellige væv, refererer til forklaringen i teksten. Forekomst af Brachyspira spp. er angivet som 1 for positiv eller 0 for negativ. CT-værdien er den måling der blev registreret den 15/11. En markering med stjerne efter grisens ID markerer at grisen havde diarré ved vejningen den 15/11. I obduktionssvaret fra DFVF var LI forekomsten i colon, ileum og tyndtarm angivet som: ikke påvist (0), lavgradig forekomst (1), moderat forekomst (2) og massiv forekomst(3). Tallene i parentes henviser til den score der er anvendt i Figur 17. Prøverne er undersøgt ved Immunohistokemi (IHC). Forekomsten af Brachyspira spp. er angivet som 0 for negative prøver og 1 for positive prøver. Den gennemsnitlige CT-værdi for de grise der blev obduceret var på 21,29 og gennemsnittet blandt resten af grisene ved denne vejning var på 25,84. En T-test returnerer en p-værdi på 0,017, så de grise der blev obduceret havde altså en signifikant større udskillelse end resten. Som det fremgår af Figur 17 er der sammenhæng mellem den immunohistokemiske metode, og resultaterne fra fæcesprøven. Især grisene 905, 870 og 889 bekræfter dette idet de har en massiv forekomst ved immunohistokemi, og en CT-værdi der ligger ca. 6 under gennemsnittet. Gris nr. 902 skiller sig ud ved at have en lav CT-værdi, men kun svage fund ved IHC. 41

48 Diskussion Som tidligere nævnt blev besætningen valgt på baggrund af en tidligere undersøgelse hvor en stor del af grisene havde serokonverteret allerede ved fravænning. Desværre kunne det allerede inden undersøgelsens start konstateres at smitte dynamikken i den pågældende besætning havde ændret sig, og at grisene ikke længere serokonverterede i farestalden. Da det serologiske mønster kan ændre sig igen, blev det besluttet at gennemføre undersøgelsen alligevel fordi denne specielle smittedynamik ikke tidligere er observeret i andre danske besætninger (Ahrens, 2006). Figur 18: Grafisk fremstilling af infektionsforløbet i besætningen. Tidspunktet for smitte antages at ca. 3 uger før den 6. vejning hvor de havde serokonverteret. Desværre var der heller ikke nogen grise der havde en tidlig serokonvertering under nærværende undersøgelse. Som det fremgår af Figur 18 viste forløbet af serokonvertering ved grisene i undersøgelsen samme mønster som det kendes fra litteraturen, hvor grisene serokonverterer i uge (Stege et al., 2004). Da serokonverteringen og faldet i CT-værdi er sket i samme periode, var det i undersøgelsen ikke muligt at skelne tidspunktet for serokonvertering og starttidspunktet for udskillelse fra hinanden. I et typisk infektionsforløb vil den fækale udskillelse af bakterier begynde omkring 1 uge efter inoku- 42

49 lationen og serokonverteringen finder typisk sted 2-3 uger efter inokulationen (Guedes og Gebhart, 2003). Både stigningen i OD værdierne, samt faldet i CT-værdierne er sket over en 3 ugers periode fra den 18/10 til den 9/11. I hele denne periode blev der desværre ikke foretaget prøveudtagning i besætningen. Tidspunktet for smitte antages at ligge i perioden fra ca. 11/10 til 25/10. Det var oprindeligt planlagt at der skulle være 7 besøg med 14 dages interval, men forskellige omstændigheder gjorde at dette desværre ikke var muligt at gennemføre. Der var dog 11 grise, som først serokonverterede ved vejningen den 15/11. Men da forskellen mellem tilvæksten af disse grise og tilvæksten af de andre grise kun var på 9 gram, var disse 11 grise slet ikke nok til at detektere en eventuel forskel. I dette tilfælde havde det været nødvendigt med en stikprøvestørrelse på 238 dyr. 24 grise var seropositive ved vejningen den 18/10. Ud fra forløbet af kurverne i Figur 3, tolkes dette indhold af IgG som maternelle antistoffer. I litteraturen nævnes at de maternelle antistoffer kan findes i op til 5-6 ugers alderen, undersøgt ved IFAT(Kroll et al., 2005). Grisene i nærværende undersøgelse var den 18/10 8 uger gamle, dog er disse prøver undersøgt ved ELISA. Sensitiviteten for IFAT-testen ved naturligt inficerede dyr er angivet til 73 % (Jensen et al., 2005); for ELISA-testen er sensitiviteten angivet til 98 % (Boesen et al., 2005). Den forøgede sensitivitet af den anvendte test kan være forklaringen på hvorfor disse grise har maternelle antistoffer 8 uger efter fødsel. Hos de 24 grise kunne der ikke påvises nogen statistisk effekt af den lange tid med maternelle antistoffer. I undersøgelsen var der en klar statistisk sammenhæng mellem moderens paritet og indholdet af maternelle antistoffer hos grisene. Der kunne ikke påvises nogen sammenhæng mellem tilvækst og mængde af maternelle antistoffer, men der var en tendens (p=0,09) til en højere CT-værdi, og dermed lavere udskillelse, hvis grisen havde et højere indhold af maternelle antistoffer. Således bidrager grise fra ældre søer mindre til kontaminering af miljøet end grise fra yngre søer. Resultatet af miljøprøverne viste at der kunne detekteres lawsonia-infektion i begge klimastalde allerede ved indsættelse i de rene stalde, den 23/9. Endvidere var der en CT-værdi på 30,32 i det fæces hvorfra der blev udtaget prøve før indsættelse af grisene. RT-PCR testen tester for bakterielt rrna, og derfor for levende bakterier. I den døde bakterie vil rrna hurtigt blive nedbrudt af RNase der er allestedsnærværende i miljøet (Ahrens, 2006). 43

50 Fra litteraturen vides det at LIs holdbarhed i miljøet begrænser sig til nogle få uger, samt at den bedste overlevelse i miljøet er mellem 5 og 15º C (Collins et al., 2000). Inden udtagningen af de første miljøprøver, havde klimastaldene stået tomme i ca. 1 uge; så bakterierne havde formentlig kun kort levetid igen på tidspunktet for grisenes indsættelse. Dog kunne der den 20/9, 3 dage før indsættelse i klimastaldene, konstateres udskillelse af bakterier hos 6 ud af 78 grise (7,7 %). Grisene var ved indsættelse, i nogen grad, beskyttet af maternelle antistoffer, men en hypotese kunne være at en eller flere grise er blevet lavgradigt inficeret i den første tid efter indsættelse i klimastalden. Fra infektionsforsøg vides det at jo lavere inokulationsmængde grisen modtager, desto længere tid går der inden udviklingen af klinisk sygdom(guedes et al., 2003). Dermed kunne der godt være nogle subklinisk inficerede dyr der var med til at vedligeholde bakterien i miljøet. Da den infektive dosis for LI er meget lav, i området fra 1000 til bakterier (Guedes, 2006), er den ovenstående hypotese om subklinisk inficerede dyr sandsynlig, da den infektive dosis har betydning for tidspunktet for udskillelse og serokonvertering (Guedes et al., 2003). En anden kilde til smitte, kunne være personalets gummistøvler, som ikke blev skiftet ved trafik mellem staldene. Jævnfør en artikel af Guedes (2006) er dette aldrig bevist at kunne finde sted, men med LIs holdbarhed i miljøet og den lave infektive dosis i mente, er dette også en sandsynlig kilde til infektion. Andre kilder til infektionen kunne være mus, som er beskrevet som mulig vektor(bednar, 2006), insekter eller småfugle. Det er interessant at grisene i stald 7 over hele perioden har haft en lavere udskillelse selvom 5 af de 6 grise der udskilte bakterier den 20/9, blev indsat i stald nr. 7. Samtidigt var der et lavere antistofniveau blandt grisene i stald 7 end grisene i stald 3. Forekomsten i miljøet har også været mindre i stald 7. Det er altså ikke nogen tegn på at grisene i stald 3 har været bedre beskyttet af antistofferne. Ved målingen den 29/9 var der sket en ændring i forholdet mellem prævalensen af grise der udskilte bakterier i de to stalde, således at prævalensen af grise der udskilte bakterier i stald 3 var stærkt forøget. So nr trådte gennem ristene i farestalden og so og alle grise røg ned i gyllekanalen. Ingen dyr kom dog noget til ved hændelsen. De fleste af grisene fra 1202 blev placeret i stald 7, men de har tilsyneladende ikke været nogen væsentlig kilde til at øge infektionspresset. En mulig forklaring på dette skift kan være den klat fæces der lå på gulvet ved indsættelsen af grisene. Der blev jo fundet 44

51 levende bakterier i denne klat fæces og det er ikke utænkeligt at det har været med til at inficere nogle grise. Fra litteraturen er det kendt at en fækal udskillelse af bakterier kan forekomme allerede 6 dage efter inokulationen (McOrist et al., 1995a). Der er i undersøgelsen fundet en meget stærk sammenhæng mellem fødselsvægt og tilvækst. En del af forklaringen på denne sammenhæng kan forklares ved at det var aftalt med besætningsejeren at alle grise skulle følge kuldene, og at der derfor ikke måtte kuldudjævnes. Dermed har der været en uensartethed blandt grisene, som er blevet flyttet i klimastaldene. Denne størrelsesforskel kan yderligere forøges ved fodringen i klimastaldene, hvor den det kan være svært at optimere en foderblanding der passer til hele holdet. Derved får de mindste et foder der er for dårligt i forhold til deres næringsstofbehov og de største får et foder er for godt (dyrt!). Som det ses på Figur 13 var der en meget stor spredning på grisenes størrelse ved afslutning af undersøgelsen. Registreringerne for utrivelighed er udeladt i databehandlingen, idet der samlet kun var 9 registreringer i denne kategori, og kun en af disse havde en CT-værdi. Desuden var 8 af de 9 registreringer foretaget i farestalden, hvor LI ikke tillægges nogen betydning. Registreringerne for diarré er nedprioriteret i databehandlingen, idet de skønnes forbundet med for stor usikkerhed. Dels fordi der ved udtagning af svaber prøven ikke med sikkerhed kunne fastslås om grisen havde diarré eller ej, idet det kunne konstateres flere gange under prøveudtagningerne, hvor en gris observeredes at have diarré bagefter at prøven var udtaget, selvom dette ikke kunne konstateres ved udtagningen af rectalsvaberen. Og dels fordi besætningen den 31/10 er blevet konstateret inficeret med Salmonella derby, og der ikke blev lavet nogle undersøgelser for dette. Der blev ikke lavet andre supplerende bakteriologiske undersøgelser, der kunne udelukke interferens af andre patogener i denne undersøgelse, udover de bakteriologiske prøver ved obduktionen af de 10 grise ved undersøgelsens afslutning.. I Figur 17 ses resultaterne af obduktionen sammenlignet med CT-værdierne fra svaberprøverne udtaget dagen i forvejen. Grisene nr. 872, 927 og 863, må konstateres udvalgt til obduktion med en forkert diagnose, idet det eneste fund ved disse grise var Brachyspira pilosicoli. Dette understreger betydningen af spirokæter som differentialdiagnose til LI samt betydningen af at få sendt de rigtige dyr ind til obduktion. 45

52 Konklusion Den fremsatte hypotese om at tidlig serokonvertering giver anderledes tilvækst end sen serokonvertering kan ikke testes, idet alle kuld i undersøgelsen har serokonverteret samtidigt, som det fremgår af Figur grise serokonverterede dog senere, men der kunne ikke vises nogen sammenhæng mellem tidspunkt for serokonvertering og tilvækst. Der var en god sammenhæng mellem målingerne af bakteriel forekomst i miljøet, tidspunkt for udskillelse af bakterier i fæces, samt serokonvertering. Ved undersøgelsen sås ligeledes en god sammenhæng mellem udskillelsen af bakterier fra grisene og forekomsten målt i miljøet, ved de målinger hvor 100 % af grisene udskilte bakterier i fæces. RT-PCR er et udmærket værktøj til detektion af LI i miljøet, samt i fæces. Det er en testmetode der ud over hurtig test af store batch samt elektronisk aflæsning af prøveresultater at åbner mulighed for at kvantificere forekomsten af LI i miljøet. Perspektivering Ved eventuelle fremtidige studier af smittedynamikken for LI i kunne man med stor fordel anvende samme setup med både måling i fæces, serum og miljø. Det bør tilstræbes at holde ekstra øje med tidspunktet for nedgangen i de maternelle antistoffer, og i tiden herefter indtil der observeres en stigning i LI udskillelsen, og i denne periode øge hyppigheden af prøveudtagningerne i besætningen. Herved kan det sikres at man ikke mister det præcise tidspunkt for serokonvertering. RT-PCR har vist sig at være en udmærket metode til detektion og kvantificering af levende bakterier i miljøet. Denne metode kan med fordel anvendes til rengøringstjek i forbindelse med fremtidige LI-saneringer. 46

53 Litteraturliste Ahrens, P., Personlig kommunikation. Seniorforsker. Veterinærinstituttet, DTU, Bülowsvej 27, 1790 København V. Telefon Bane, D.P., Neumann, E., Gebhart, C.J., Gardner, I.A., Norby, B., Porcine proliferative enteropathy: a case-control study in swine herds in the United States. Journal of Swine Health and Production 9, Barfod, K., Nielsen, P., Lykkesfeldt, J., Nielsen, N.C., Jensen, A.M., Gradel, K.O., Enemark, E., Kai, P., Desinfektion i husdyrbruget [Online]: Landsudvalget for svin. Beckler, D.C., Gebhart, C., Molecular epidemiology of Lawsonia intracellularis [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Bednar, V., Detection of Lawsonia intracellularis in mice captured in pig farms with the occurrence of porcine proliferative enteropathy. Proceedings of the 19th IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p Biester, H.E., Schwarte, L.H., Intestinal Adenoma in Swine. American Journal of Pathology 7, Boesen, H.T., Jensen, T.K., Møller, K., Nielsen, L.H., Jungersen, G., Evaluation of a novel enzyme-linked immunosorbent assay for serological diagnosis of porcine proliferative enteropathy. Vet. Microbiol. 109, Boutrup, T.S., Boesen, H.T., Agerholm, J.S., Jensen, T.K., Early lesions in pigs infected with Lawsonia intracellularis [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Bronsvoort, M., Norby, B., Bane, D.P., Gardner, I.A., Management factors associated with seropositivity to Lawsonia intracellularis in US swine herds. Journal of Swine Health and Production 9, Chouet, S., Prieto, C., Mieli, L., Veenhuizen, M.F., McOrist, S., Patterns of exposure to Lawsonia intracellularis infection on European pig farms. Veterinary Record 152, Collins, A., Love, R.J., Pozo, J., Smith, S.H., McOrist, S., Studies on the ex vivo survival of Lawsonia intracellularis. Swine Health and Production 8, Collins, A.M., Love, R.J., Re-challenge of pigs following recovery from proliferative enteropathy. Vet. Microbiol., doi: /j.vetmic (in press). Conradsen, P.C., Elimination of Lawsonia intracellularis; The way to high preformance and low usage of antibiotic. Proceedings of the 19th IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p

54 Cooper, D.M., Swanson, D.L., Barns, S.M., Gebhart, C.J., Comparison of the 16S ribosomal DNA sequences from the intracellular agents of proliferative enteritis in a hamster, deer, and ostrich with the sequence of a porcine isolate of Lawsonia intracellularis. International Journal of Systematic Bacteriology 47, Elwell, M.R., Chapman, A.L., Frenkel, J.K., Duodenal Hyperplasia in A Guinea-Pig. Veterinary Pathology 18, Eriksen, K., Landsverk, T., Electron microscopy of intestinal adenomatosis in the blue fox, Alopex lagopus. J. Comp Pathol. 102, ExPASy Proteomics, Lawsonia intracellularis (strain PHE/MN1-00) complete proteome [Online]: Fødevarestyrelsen, Behandlingsvejledning til dyrlæger ved behandling af visse sygdomme. [Online] ehu3fl7xyhlkoolgm2wjt225jdwl4q6e2o2ia22mohzjvld/behandlingsvejledningantibiotikasvinskema. pdf. Fox, J.G., Lawson, G.H.K., Campylobacter-Like Omega Intracellular Antigen in Proliferative Colitis of Ferrets. Laboratory Animal Science 38, Frisk, C.S., Wagner, J.E., Hamster enteritis: a review. Lab Anim 11, Gebhart, C., Lawsonia Intracellularis infections. Proceedings of the 19th IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. pp Gebhart, C.J., Barns, S.M., McOrist, S., Lin, G.F., Lawson, G.H., Ileal symbiont intracellularis, an obligate intracellular bacterium of porcine intestines showing a relationship to Desulfovibrio species. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, Gebhart, C.J., Edmonds, P., Ward, G.E., Kurtz, H.J., Brenner, D.J., Campylobacter- Hyointestinalis Sp-Nov - A New Species of Campylobacter Found in the Intestines of Pigs and Other Animals. Journal of Clinical Microbiology 21, GIB, Genome Information Broker [Online]: Guedes, R.M.C., Porcine proliferative enteropathy: Epidemiology and diagnostics [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Guedes, R.M.C., Gebhart, C.J., Onset and duration of fecal shedding, cell-mediated and humoral immune responses in pigs after challenge with a pathogenic isolate or attenuated vaccine strain of Lawsonia intracellularis. Veterinary Microbiology 91, Guedes, R.M.C., Gebhart, C.J., Armbruster, G.A., Roggow, B.D., 2002a. Serologic follow-up of a repopulated swine herd after an outbreak of proliferative hemorrhagic enteropathy. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire 66,

55 Guedes, R.M.C., Gebhart, C.J., Deen, J., Winkelman, N.L., 2002b. Validation of an immunoperoxidase monolayer assay as a serologic test for porcine proliferative enteropathy. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 14, Guedes, R.M.C., Gebhart, C.J., Winkelman, N.L., kie-nuss, R.A.C., Marsteller, T.A., Deen, J., 2002c. Comparison of different methods for diagnosis of porcine proliferative enteropathy. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire 66, Guedes, R.M.C., Winkelman, N.L., Gebhart, C.J., Relationship between the severity of porcine proliferative enteropathy and the infectious dose of Lawsonia intracellularis. Veterinary Record 153, Hardge, T., Keller, C.H., Steinheuer, R., Tessier, P.H., Salleras, J.M., Rubio, P., Vestergaard, K., Cluydts, G., Ceccarelli, V., Bugliesi, R., Schippers, R., Johnson, K., Papatas, I., Eiching, E., Rigat, J., Trela, T., Serological prevalence of Lawsonia intracellularis across european pig herds. Proceedings of the 19th IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p. 77. Heuer, O.E., Jensen, V.F., Antibiotika til dyr i Danmark. Dansk Veterinærtidsskrift 88, Hotchkiss, C.E., Shames, B., Perkins, S.E., Fox, J.G., Proliferative enteropathy of rabbits: The intracellular Campylobacter-like organism is closely related to Lawsonia intracellularis. Laboratory Animal Science 46, Hundrup, H., 2007a. P-kontrol slagtesvin. [Online] Hundrup, H., 2007b. P-kontrol sohold. [Online] Jacobson, M., Rasback, T., Floistrup, H., Benz, M., Braun-Fahrlander, C., Riedler, J., Schram- Bijkerk, D., Fellstrom, C., Survey on the occurrence of Brachyspira species and Lawsonia intracellularis in children living on pig farms. Epidemiol. Infect Jensen, H.M., Health management with reduced antibiotic use - Experiences of a Danish pig vet. Animal Biotechnology 17, Jensen, T.K., Christensen, B.B., Boye, M., Lawsonia intracellularis infection in the large intestines of pigs. Apmis 114, Jensen, T.K., Møller, K., Leser, T.D., Jorsal, S.E., Comparison of histology, immunohistochemistry and polymerase chain reaction for detection of Lawsonia intracellularis in natural porcine proliferative enteropathy. European Journal of Veterinary Pathology 3, Jensen, T.K., Møller, K., Lindecrona, R., Jorsal, S.E., Detection of Lawsonia intracellularis in the tonsils of pigs with proliferative enteropathy. Research in Veterinary Science 68, Jensen, T.K., Vigre, H., Sorensen, V., Møller, K., Naturally acquired Lawsonia intracellularis infection in pigs studied from weaning to slaughter by indirect immunofluorescence antibody test and polymerase chain reaction on faeces. Research in Veterinary Science 79,

56 Johansen, M., Attempt to estimate the economic impact of Lawsonia Intracellularis infections in the real world [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Johansen, M., Bækbo, P., Boesen, H.T., Jensen, T.K., Ahrens, P., Infection dynamics of Lawsonia intarcellularis in sows and suckling pigs: Preliminary results. Proceedings of the 19th IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p. 74. Johansen, M., Jørgensen, L., Bækbo, P., Wachmann, H., Møller, K., Melfoders effekt på regional tarmbetændelse (Lawsonia), diarré og produktivitet (7-100 kg). Dansk Svineproduktion, Meddelse nr Johansen, M., Jørgensen, L., Bækbo, P., Wachmann, H., Møller, K., Melfoders effekt på Lawsonia, diarré og produktivitet. Dansk Svineproduktion, Meddelse nr Johansen, M., Jørgensen, L., Schultz, M.S., Effekt af zink og organiske syrer på diarréer i smågriseperioden. Dansk Svineproduktion, Meddelse nr Jørgensen, L., Controlling ileitis through feed [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Klein, E.C., Gebhart, C.J., Duhamel, G.E., Fatal outbreaks of proliferative enteritis caused by Lawsonia intracellularis in young colony-raised rhesus macaques. Journal of Medical Primatology 28, Knittel, J.P., Jordan, D.M., Schwartz, K.J., Janke, B.H., Roof, M.B., McOrist, S., Harris, D.L., Evaluation of antemortem polymerase chain reaction and serologic methods for detection of Lawsonia intracellularis-exposed pigs. American Journal of Veterinary Research 59, Knittel, J.P., Larson, D.I., Harris, D.L., Roof, M.B., McOrist, S., United States isolates of Lawsonia intracellularis from porcine proliferative enteropathy resemble European isolates. Swine- Health-and-Production 4, Knittel, J.P., Roof, M.B., Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents. In: NOBL Laboratories, I. (Ed.), United States Patent. Kroll, J.J., Roof, M.B., Hoffman, L.J., Dickson, J.S., Harris, D.L., Proliferative enteropathy: a global enteric disease of pigs caused by Lawsonia intracellularis. Anim Health Res. Rev. 6, Kroll, J.J., Roof, M.B., McOrist, S., Evaluation of protective immunity in pigs following oral administration of an avirulent live vaccine of Lawsonia intracellularis. American Journal of Veterinary Research 65, Lantz, P.G., Matsson, M., Wadstrom, T., Radstrom, P., Removal of PCR inhibitors from human faecal samples through the use of an aqueous two-phase system for sample preparation prior to PCR. Journal of Microbiological Methods 28,

57 Lawson, G.H.K., Gebhart, C.J., Proliferative enteropathy. Journal of Comparative Pathology 122, Lawson, G.H.K., Mackie, R.A., Smith, D.G.E., McOrist, S., Infection of Cultured Rat Enterocytes by Ileal Symbiont Intracellularis Depends on Host-Cell Function and Actin Polymerization. Veterinary Microbiology 45, Lawson, G.H.K., McOrist, S., Jasni, S., Mackie, R.A., Intracellular Bacteria of Porcine Proliferative Enteropathy - Cultivation and Maintenance Invitro. Journal of Clinical Microbiology 31, Lawson, G.H.K., Rowland, A.C., Intestinal Adenomatosis in Pig - Bacteriological Study. Research in Veterinary Science 17, Lawson, G.H.K., Rowland, A.C., MacIntyre, N., Demonstration of A New Intracellular Antigen in Porcine Intestinal Adenomatosis and Hamster Proliferative Ileitis. Veterinary Microbiology 10, Leblanc, B., Fox, J.G., Lenet, J.L., Masson, M.T., Picard, A., Hyperplastic Gastritis with Intraepithelial Campylobacter-Like Organisms in A Beagle Dog. Veterinary Pathology 30, MacIntyre, N., Smith, D.G.E., Shaw, D.J., Thomson, J.R., Rhind, S.M., Immunopathogenesis of experimentally induced proliferative enteropathy in pigs. Veterinary Pathology 40, McOrist, S., Barcellos, D.E., Wilson, R.J., Global patterns of porcine proliferative enteropathy. Pig-Journal McOrist, S., Boid, R., Lawson, G.H.K., Mcconnell, I., Monoclonal-Antibodies to Intracellular Campylobacter-Like Organisms of the Porcine Proliferative Enteropathies. Veterinary Record 121, McOrist, S., Gebhart, C.J., Proliferative Enteropathies. In: Straw, B.E., Zimmermann, J.J., D'Allaire, S., Taylor, D.J. (Eds.), Diseases of Swine, 9th edition. Blackwell Publishing, Ames, Iowa, pp McOrist, S., Jasni, S., Mackie, R.A., Berschneider, H.M., Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., 1995a. Entry of the Bacterium Ileal Symbiont Intracellularis Into Cultured Enterocytes and Its Subsequent Release. Research in Veterinary Science 59, McOrist, S., Jasni, S., Mackie, R.A., MacIntyre, N., Neef, N., Lawson, G.H.K., Reproduction of Porcine Proliferative Enteropathy with Pure Cultures of Ileal Symbiont Intracellularis. Infection and Immunity 61, McOrist, S., MacIntyre, N., Stokes, C.R., Lawson, G.H.K., Immunocytological Responses in Porcine Proliferative Enteropathies. Infection and Immunity 60, McOrist, S., Mackie, R.A., Lawson, G.H.K., 1995b. Antimicrobial Susceptibility of Ileal Symbiont Intracellularis Isolated from Pigs with Proliferative Enteropathy. Journal of Clinical Microbiology 33,

58 McOrist, S., Mackie, R.A., Lawson, G.H.K., Smith, D.G.E., 1997a. In-vitro interactions of Lawsonia intracellularis with cultured enterocytes. Veterinary Microbiology 54, McOrist, S., Mackie, R.A., Neef, N., Aitken, I., Lawson, G.H.K., Synergism of Ileal Symbiont Intracellularis and Gut Bacteria in the Reproduction of Porcine Proliferative Enteropathy. Veterinary Record 134, McOrist, S., Morgan, J., Veenhuizen, M.F., Lawrence, K., Kroger, H.W., 1997b. Oral administration of tylosin phosphate for treatment and prevention of proliferative enteropathy in pigs. American Journal of Veterinary Research 58, McOrist, S., Roberts, L., Jasni, S., Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., Gebhart, C.J., Bosworth, B., 1996a. Developed and resolving lesions in porcine proliferative enteropathy: Possible pathogenetic mechanisms. Journal of Comparative Pathology 115, McOrist, S., Smith, S.H., Shearn, M.F.H., Carr, M.M., Miller, D.J.S., 1996b. Treatment and prevention of porcine proliferative enteropathy with oral tiamulin. Veterinary Record 139, Michalski, C.W., Di Mola, F.F., Kummel, K., Wendt, M., Koninger, J.S., Giese, T., Giese, N.A., Friess, H., Human inflammatory bowel disease does not associate with Lawsonia intracellularis infection. Bmc Microbiology 6. Nielsen, E., Attempt to eliminate Lawsonia intracellularis [online]: Elanco's internationale ileitis symposium 2006, Silkeborg, Denmark. pp Pedersen, A.Ø., Maribo, H., Jensen, B.B., Hansen, I.D., Aaslyng, M.D., Fermenteret korn i vådfoder til tungsvin. Dansk Svineproduktion, Meddelelse nr Pozo, J., Vidal, A.B., Arriba, M.L.d., Carvajal, A., Gutiérrez, A., Rubio, P., Monitoring Lawsonia intracellularis infection in a PPE-affected farm. Proceedings of the 17th IPVS Congress, Ames, Iowa USA. p Roberts, L., Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., Experimental Reproduction of Porcine Intestinal Adenomatosis and Necrotic Enteritis. Veterinary Record 100, 12. Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., Intestinal Adenomatosis in Pig - Immunofluorescent and Electron-Microscopic Studies. Research in Veterinary Science 17, Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., Porcine Intestinal Adenomatosis - Possible Relationship with Necrotic Enteritis, Regional Ileitis and Proliferative Hemorrhagic Enteropathy. Veterinary Record 97, Rowland, A.C., Lawson, G.H.K., Maxwell, A., Intestinal Adenomatosis in Pig - Occurrence of A Bacterium in Affected Cells. Nature 243, 417. Rowland, A.C., Rowntree, P.G., Hemorrhagic Bowel Syndrome Associated with Intestinal Adenomatosis in Pig. Veterinary Record 91, 235-&. 52

59 Smith, D.G.E., Lawson, G.H.K., Lawsonia intracellularis: getting inside the pathogenesis of proliferative enteropathy. Veterinary Microbiology 82, Smith, D.G.E., Mitchell, S.C., Nash, T., Rhind, S., Gamma interferon influences intestinal epithelial hyperplasia caused by Lawsonia intracellularis infection in mice. Infection and Immunity 68, Smith, D.-G.E., Characteristics of Lawsonia intracellularis pathogenesis: recent research and potential benefits. The Pig Journal Stege, H., Jensen, T.K., Møller, K., Bækbo, P., Jorsal, S.E., Prevalence of intestinal pathogens in Danish finishing pig herds. Preventive Veterinary Medicine 46, Stege, H., Jensen, T.K., Møller, K., Bækbo, P., Jorsal, S.E., Risk factors for intestinal pathogens in Danish finishing pig herds. Preventive Veterinary Medicine 50, Stege, H., Jensen, T.K., Møller, K., Vestergaard, K., Bækbo, P., Jorsal, S.E., Infection dynamics of Lawsonia intracellularis in pig herds. Veterinary Microbiology 104, Stills, H.F., Isolation of An Intracellular Bacterium from Hamsters (Mesocricetus-Auratus) with Proliferative Ileitis and Reproduction of the Disease with A Pure Culture. Infection and Immunity 59, Vandenberghe, J., Verheyen, A., Lauwers, S., Geboes, K., Spontaneous Adenocarcinoma of the Ascending Colon in Wistar Rats - the Intracytoplasmic Presence of A Campylobacter-Like Bacterium. Journal of Comparative Pathology 95, Watarai, M., Yamato, Y., Murakata, K., Kim, S., Omata, Y., Furuoka, H., Detection of Lawsonia intracellularis using immunomagnetic beads and ATP bioluminescence. Journal of Veterinary Medical Science 67, Wattanaphansak, S., Gebhart, C., Olin, M., Deen, J., Measurement of the viability of Lawsonia intracellularis. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire 69, Wegener, H.C., Risk management for the limitation of antibiotic resistance? experience of Denmark. International Journal of Medical Microbiology 296, WHO report, Impacts of antimicrobial growth promoter termination in Denmark [Online]: Williams, N.M., Harrison, L.R., Gebhart, C.J., Proliferative enteropathy in a foal caused by Lawsonia intracellularis-like bacterium. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 8,

60 Bilag 1: Resultat af miljøprøver: dato Prøve nr stald 3 gødning 30,32 3 væg h g-e 1 36,97 18,38 19,43 3 væg h v-e 2 32,76 18,82 24,75 3 huller 3 36,07 34,76 32,02 20,24 18,36 3 væg v v-e 4 33,58 17,64 m 3 væg v-v-e 5 30,95 19,91 21,69 3 gyllekanal 6 29,87 34,21 21,13 22,82 3 gyllekanal 7 35,73 35,68 32,56 19,58 m 3 gyllekanal 8 30,45 32,01 29,62 18,6 20,56 3 gyllekanal 9 33,44 20,32 21,83 3 gyllekanal 10 37,34 35,76 19,92 21,34 7 væg h g-e 11 35,67 34,91 22,67 m 7 væg h v-e 12 28,35 24,12 m 7 huller 13 23,48 26,16 7 væg v v-e 14 34,32 33,67 25,21 24,95 7 væg v-v-e 15 35,14 24,34 23,13 7 gyllekanal 16 35,73 19,46 26,94 7 gyllekanal 17 36,32 35,89 18,62 22,31 7 gyllekanal 18 27,69 30,4 30,06 20,21 23,88 7 gyllekanal 19 33,88 36,55 31,88 22,47 23,94 7 gyllekanal 20 40,49 22,38 31,1 pos kontrol 15,36 15,25 17,23 16,81 17,21

61 Resultat af RT-PCR: dato Gris ,06 25, ,72 26, ,47 21, ,31 25, ,77 21, ,08 32,44 22,52 18, na na na na na na 858 na na na ,45 35,82 36,07 20,74 17, ,95 na , , ,08 25, ,93 23, ,75 26,96 25,23 33, na na na na na na ,16 24, ,05 35,28 25,78 21, ,6 23,29 24, ,34 24,22 28, ,96 14, ,3 22,18 19, ,21 24,82 28, ,84 28,12 27, ,02 36,2 35,14 29,34 24, ,19 34,91 32,26 24,01 24, ,41 20,89 27, ,92 26,8 25, ,81 25, ,52 25,42 28, na na na ,73 22,02 26, na na na na na na 883 na na na na ,7 21,72 30, ,2 23, ,37 31, ,96 21, ,33 31,31 21,46 25, ,56 37,7 18,17 16,25

62 890 na na na na na na 891 na na na na na na ,53 na na ,45 22, na na na na na na ,87 na 25,73 24, ,14 35,91 19,79 24, na 22,08 26, , ,74 24,83 25, na na na na na na ,78 36,71 37,72 34,83 26,55 26, ,34 19,43 17, ,26 22,7 32, ,21 27, ,03 21,32 17, ,87 22,99 27, ,32 24,9 27, ,52 36,26 26,58 25, ,21 17,09 24, ,96 21,65 19, ,64 24, ,14 17,54 23, ,51 25,29 28, ,04 27, ,42 22, ,18 21, ,89 28, ,96 33,99 18,72 24, ,97 23,43 30, ,75 28, ,7 18,47 24, ,95 25,11 29, na na na na ,86 28, ,3 25, ,54 24, ,59 35,18 26,87 25, ,41 na na ,8 20,72 26, ,87 28, ,68 26,29 27,32

63 932 26,64 27, ,67 27,81 21, ,49 22,11 28, ,22 26,32 22, ,54 37,56 27,32 26, ,22 26,25 29, ,84 26,51 25, ,31 27, ,89 38,11 26,95 25, ,25 32, ,03 26,62 28,06 So 1121 na So ,32 na So 1226 na So 1334 na So 1339 na So 1394 na So 1421 na So ,83 na pos ,47 15,21 14,63 17,18 15,3 14,73 neg 892 ileum 9,69 Resultat for ELISA prøver fra søerne, udtaget i farestalden. OD værdier for søer so nr. paritet OD 1 Vejn OD 3 vejn

64 Resultat af ELISA: GrisID GA_OD G1_OD G2_OD G3_OD G4_OD G5_OD G6_OD Dato

65

66

67 Samlede data fra undersøgelsen: ID Vejning_nr Mor køn foeddato laegnr vaegt Diarre Utriv OD PCR klimast bem , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,9 1 20, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,6 5 3

68 , , , , , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , UDGÅET UDGÅET , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , , , , ,6 3 36, , , , , , UDGÅET , UDGÅET , UDGÅET , UDGÅET ,9 5 3 UDGÅET , ,95 3 UDGÅET UDGÅET , , , , , , , , , , , , ,9 25 7

69 ,6 5 26, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , , , , , , , , , , borgal , , , , , , , , , , , , , , , ,2 31 3

70 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,5 2 14, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,8 1 36, ,5 1 35, ,7 0 3

71 , , , , , ,7 0 34, ,3 0 34, ,2 0 32, , , , , , , , , , , ,4 1 20, , , , , , , ,1 0 34, ,1 1 26, ,7 1 25, , , , , , , , , , , , , , ,9 2 31, ,7 8 25, , , , UDGÅET ,5 2 7 UDGÅET , UDGÅET UDGÅET UDGÅET

72 UDGÅET UDGÅET , , borgal , , ,6 1 34, ,5 0 22, , ,76 7 UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET ,58 7 UDGÅET ,68 1 UDGÅET ,9 1 0 UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , , ,1 0 35, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4 17 3

73 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , UDGÅET ,48 88 UDGÅET ,53 UDGÅET , UDGÅET ,7 13 UDGÅET

74 UDGÅET UDGÅET , , , , , , , , , , UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,2 7 7

75 , , , , , , , ,4 7 35, , , , , ,78 7 UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET UDGÅET , , , , , , , , , ,1 5 26, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4 8 7

76 , , , , , , , , , ,4 9 21, , , , , , , , , , , , , , , , , ,1 6 38, , , , , , , , , ,2 *** 7 mangler ,1 6 36, , , , , , , , , ,7 7 28, , , , , , , , ,5 5 36,96 3

77 , , , , , , , , , , , , , , , , ,7 3 37, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,8 3 3

78 , , , , , , , , , , , , , , , , ,8 9 33, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,1 0 35, , , , , , , , , , ,4 1 7

79 , , , , , UDGÅR , UDGÅR UDGÅR UDGÅR UDGÅR UDGÅR UDGÅR , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,9 0 35, ,3 0 26, , , , UDGÅET , UDGÅET , ,41 7 UDGÅET ,5 0 7 UDGÅET ,7 0 7 UDGÅET

80 UDGÅET UDGÅET , , , , ,4 0 34, , , , , , , , , , , , , , , , , ,6 0 36, , , , , , , , , , ,8 1 26, , , , , , , ,7 0 36, , , , , , , , , , ,9 0 7

81 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,2 1 37, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,9 0 38, , , , , , , , , , , , , , , ,8 3 35, , ,6 0 38,11 7

82 , , , , , , , , , , , , , , , , , ,5 0 33, , , ,7 *** 28,06 7 Mangler

83 Bilag 2 Beskrivelse, anvendt ved score af diarré og utrivelighed: Diarré: Det angives om grisen har diarré: 1: Grisen HAR diarre 0: Grisen har IKKE diarré Utrivelighed: Det angives om grisen er utrivelig. Der benyttes skema (efter Høgedal) til huldvurdering hos søer. Utrivelighed defineres som: Ikke tegn på utrivelighed (huld >3) Score=0 Let utrivelig (Huld 2) Score =1 Svær utrivelig (Huld 1) Score=2 Huldvurdering af søer Huld 1: Mager Indfaldent haleparti halerod stikker tydeligt frem. Skarp ryg, hvor torntappene tydeligt kan både ses og føles. Bækkenknogler kan palperes tydeligt. Ribbenene kan tydeligt ses og føles. Huld 2: Tynd Halerod stikker stadig frem. Ryggen stadig markeret. Torntappen kan ikke ses, men palperes. Ribben er dækkede kan tydeligt udpalperes. Huld 3: Tilpas Soen "rund". Ribben og torntappe kan lige akkurat anes ved palpation Huld 4: Kraftig Soen "rund". Ribben og torntappe kan ikke tydeligt palperes. Huld 5: Fed Ribben og torntappe kan ikke palperes. Der hænger fedtansamlinger mellem bagben på soen. Figur: Huldvurdering af søer og gylte på en 5-trinsskala. Kilde: Lis Eriksen (1991):Klinisk undersøgelsesmetodik og journalskrivning. Samfundslitteratur 1991.

84 Bilag 3 Beregning af stikprøvestørrelse: Stikprøvestørrelsen er beregner ved hjælp af regnearket sample-sizes.xls, som han hentes online på internetadressen: Som det fremgår af regnearket herover, kræves der en stikprøvestørrelse på ca. 50 dyr for at detektere en forskel på 20 gram daglig tilvækst.

85 Bilag 4 Analyse af svaberprøver ved hjælp af RT-PCR. Prøverne der indgik i undersøgelsen blev hos DFVF analyseret efter nedenstående principper. På laboratoriet beskyttes miljøet mod RNAse, som er allestedsnærværende i miljøet, enten ved hjælp af NaOH eller ved at udføre arbejdet i en flowbænk. Til oprensning af RNA anvendes et kit Rneasy fra firmaet Qiagen. Prøven centrifugeres Der udtages 500 µl til et Eppendorfrør. Hertil sættes 500 µl PBS for at fortynde prøven samt for at muliggøre dannelsen af en pellet ved den efterfølgende centrifugering ved G i 5 minutter. Supernatanten afpipetteres og der arbejdes videre med pelleten. Lysis af bakterierne ved hjælp af TES (Tris, EDTA, salt) samt lysosym. Prøven overføres til et nyt eppendorfrør med en silikonemembran som binder RNA. Herefter vaskes søjlen med de forskellige reagenser der følger med kittet. Efter hver vask centrifugeres prøven. Eluering: Der tilsættes rent vand der får RNA til at slippe silikonemembranen og RNA centrifugeres med ned. Det oprensede RNA tilsættes en 16S Lawsoniaspecifik primer, blandes og opvarmes til 70º C i 3 min. Ved hjælp af Reverse transcriptase laves RNA om til cdna. Til analyse ved hjælp af Real Time PCR, anvendtes systemet fra firmaet Applied Biosystems. Fordelen ved at anvende Real Time PCR kontra traditionel PCR er at man har muligheden for at indhente resultater under selve PCR processen. Data opsamles under reaktionen og man opnår således et overblik over hvor mange cykler reaktionen skal gennemløbe for at få en positiv reaktion. Det vil sige: Jo højere startkoncentration af RNA, desto færre cykler skal gennemføres for et positivt resultat. Resultatet bliver således også semikvantitativt. En anden fordel ved real time PCR er at testen er meget mere følsom end traditionel PCR. Ved den traditionelle PCR, på agarosegel kan man kun vanskeligt erkende forskelle i koncentrationen, mens man ved hjælp af real time PCR kan erkende en 2 folds forskel. Desuden kan de opsamlede data behandles elektronisk, hvilket giver en større ensartethed i resultaterne. Princippet for Real Time PCR fra Applied Biosystems er angivet herunder: Der anvendtes TaqMan systemet. TaqMan bruger en flourgen probe til at detektere specifik PCR-produkt som akkumuleres under PCR processen. Der tilsættes en specifik TaqMan probe, som binder til cdna mellem forward og reverse primerne. Proben indeholder en Reporter farve og en Quencher farve. Når molekylet er intakt, hæmmer Quencheren Reporteren. Men når molekylet spaltes under transskriptionen, udsendes reporterens lys. Ved hjælp af et apparat der måler lysintensiteten, samt et passende stykke software kan der grafisk afbilledes en kurve over forløbet af PCR reaktionen.

86 Figur 19: Skematisk fremstilling af princippet for aflæsning af de forskellige faser. Eksponentielfasen: Her sker en næsten 100 % fordobling i hver cyklus. Lineærfasen: De enkelte komponenter i blandingen er ved at være opbrugt, og PCR ydelsen begynder at aftage. Plateaufasen: Reaktionen er stoppet. Denne fase svarer til resultatet af den traditionelle PCRmetode. Ved at fastsætte en grænseværdi ud fra kurvens forløb ved de forskellige målinger kan der aflæses en Ct-værdi (Cycle Threshold). Grænseværdien aflæses i den eksponentielle fase, da det giver det mest præcise resultat. Der køres 50 cykler. Ct-værdien skal tolkes således at jo lavere værdi, desto højere startkoncentration af cdna. Figur 20:Når resultatet plottes i computeren fremkommer der et billede som dette. Anvendt litteratur: QIAGEN (2001): RNeasy Mini handbook, 3.ed. pp Applied Biosystems (2006): Essentials of Real Time PCR. Artikel nr Applied Biosystems (2006): Real-Time PCR vs. Traditional PCR. Artikel nr

87 Bilag 5

88

89

90 Bilag 6 Obduktion af gris nr. 892 Anamnese: Diarre d. 6/11. Behandlet med Teralon IM d. 6/11, 7/11 og 8/11. Selvdød den 8/11 Obduktion udført den 9/ i besætningen, af Morten Brøgger. Obduktionsfund: Grisen var i nogen grad præget af kadaverose! ileum: Let hypertrofisk, og petecchiale blødninger i slimhinden. Let hypertrofisk reaktion i tarmkrøsets lymfeknuder. Colon: Status efter ødem i colonspiralen. Lymfknuder: Lnn ing. Superf.: IAB Ingen tegn på ascites, hydrothorax og hydropericardium Ingen tegn på affektion af lunger eller nyrer Grisen havde desuden en navleabsces på 2x3x4 cm. Der blev udtaget svaberprøve fra ileum til undersøgelse for Lawsonia intracellularis ved RT-PCR.