Nye(re) metoder til karakterisering af den potentielle mikrobiologiske eksponering i svinestalde

Transkript

1 P r æ s e n t a t i Nye(re) metoder til karakterisering af den potentielle mikrobiologiske eksponering i svinestalde John Kerr White-Ph.D. studerende

2 Introduktion Eksponering for støv med mikroorganismer i svinestalde kan være høj, og arbejde i svinestalde kan være forbundet med forskellige luftvejsproblemer (fx. astma, ODTS, inflammation, landmandslunge, mm.) Næsten ingen forskning om, hvilke arter af luftbårne mikroorganismer der findes i svinestalde udover nogle bestemte patogener, som LA-MRSA og VRE Tidligere metoder har enten brugt dyrkning eller sekventering, men ikke en kombination Andre studier har haft stort fokus på bakterier, men ikke på svampe 2

3 Hvilke bakterier og svampe er til stede? Hvilke bakterielle og svampe arter findes i støv fra svinebedrifter? Opnå viden om, hvilke patogener deres findes og i hvilke koncentrationer Findes der en bestemt mikrobiel samfundsstruktur? Varierer dette samfund mest imellem gårde eller imellem staldtyper? 3

4 Prøvetagning Elektrostatiske støvsamlingsklude (EDC) blev brugt til passiv sampling af sedimenterende støv Støv blev samlet fra seks forskellige gårde fra Sjælland, Fyn og Jylland. Dyrkbare aerotolerante og anaerobiske bakterie Nutrient Agar (NA) plader MALDI-TOF MS Dyrkbare svampe Dichloran Glycerol (DG18) plader MALDI-TOF MS Gård Stald type og prøve navne A Fare A1-A3 Klima A4-A6 B Klima B1-B3 Slagte B4-B6 C Fare C1-C3 Klima C4-C6 D Klima D1-D3 Syge D4-D6 E Klima E1-E4 - F Klima F1-F3 - Sekventering af den bakterielle 16S rrna V4 gen og ITS1 regionen hos svampe 4

5 Nye(re) metoder til identificering af bakterier og svampe Dyrkning vs. DNA sekventering Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of- Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) Illumina s Miseq platform 5

6 MALDI-TOF MS Fordele og ulemper Fordele: Hurtigt identifikation af bakterier og svampe fra en agarplade (cirka 5 minutter fra plade til artsniveau identifikation) Udviklet til sygedomsfremkalden bakterier og svampe Kan lave sub-typing analyser Kan risikovurdere Ulemper: Er begrænset til de bakterier og svampe, som vi kan dyrke på agarplader. Databasen, som man bruger til identifikation, er ikke fuldstændig Nogle bakterier og svampe har spektre, som er næsten 100% ens, og derfor kan man ikke adskille arterne fra hinanden (fx Streptococcus mitis komplekset). Skimmelsvamp kan give problemer Kræver en ren kultur 6

7 Miseq sekventering Fordele og ulemper Fordele: Kan identificere alle de bakterie og svampe, som er i en prøve Er uafhængig af dyrkning (undgå dyrkningsbias) Kan køre mange prøver samtidig Ulemper: DNA-ekstraheringsbias Bias med de valgte primers Sekventerer både levende cellers DNA og dødt DNA Kort sekvens længde betyder at man kun kan komme ned på slægts niveau Ingen information om, hvorvidt de arter, som er i vores prøve, er patogene eller kommensale Valg af databaser kan påvirke resultaterne 7

8 En kombination af metoder Skarpe detaljer med sløret syn En kombination af både de molekylære og de dyrknings baserede metoder betyder, at vi kan få flere detaljer omkring, hvilke bakterier og svampe der findes i luften og i støv Præsentationstitel 8

9 Multidimensionel plotting Hvad er det, og hvorfor bruger vi det? Store datasæt er komplekse og med mere end 3 dimensioner (ordinater), fx over 100 Vi arrangerer vores datapunkter (hver prøv) langs mange forskellige akser (ordinater). Her kan vi grafisk vise nogle komplekse forbindelser, så man kan se de dominerende mønstre fra et uendeligt antal mønstre Constrained Redundancy Analysis (RDA) er én måde, man kan visualisere multi-dimensionale data, hvor data bliver grupperet baseret på en værdi i ens metadata β-diversitet handler om alle de arter og slægter, som man ser i en prøve relativ til, når man sammenligner den med andre prøver 9

10 Mikrobiel sedimentation/dag Bakterier Svampe Fare Slagte Syge Klima Fare Slagte Syge Klima 10

11 Bakterier og svampe identificeret med MALDI-TOF Over 100 bakteriearter Aerococcus viridans, Staphylococcus simulans, S. equorum, S. saprophyticus, S. aureus, S. xylosus, Bacillus subtilis, B. lichenformis, B. cereus, Corynebacterium confusum, C. stationis, C. glutamicum, C. casei, Enterococcus faecium, E. casseliflavis, E. avium, E. hirae, E. gallinarum, Leuconostoc mesenteroides, L. citreum, Clostridium perfringens, C. sporogenes, C. cadaveris, C. baratii, Lactobacillus johnsonii, L. plantarum, Streptococcus lutetiensis og andre 29 svampearter Filobasidum uniguttulatum, Penicillium commune, Aspergillus glaucus, Cladosporium herbarum, Scopulariopsis brevicaulis, C. cladosporiodes, A. versicolor, A. oryzae, A. candidius, Candida catenulata, C. famata, og flere 11

12 Risikogruppe 2 Bakterier/Svampe Organisme Aerococcus viridans Bacillus cereus Clostridium perfringens/bifermentans/ cadaveris/baratii Enterococcus avium/casseliflavus/durans/ faecalis/villorum/gallinarum/hirae/faecium Filobasidium uniguttulatum Leuconostoc mesenteroides sp. Pantoea agglomerans Serratia marcescens Staphylococcus aureus/saprophyticus/pasteuri/ haemolyticus/hominis/hyicus/pettenkoferi/epidermidis Streptococcus parauberis/lutetiensis Vagococcus fluvialis Sygdomme Urinvejsinfektion, endokarditis Diarré, bakteriæmi Tarmbetændelse, diarré, gas gangrene, nekrotisk enteritis, bakteriæmi, nektrotiserende endometritis, botulisme, lungebetændelse Bakteriæmi, urinvejsinfektioner, bakteriel endokarditis, og blødtvævsinfektion Kryptokokse meningitis Blødtvævsinfektioner og andre hospital relateret sygedomme Blødtvævs-og knogle-infektioner Urinvejsinfektioner, Urinvejsinfektioner, bakteriæmi, sepsis, og andre hospital relateret sygedomme Bakteriæmi Bakteriæmi, bakteriel peritonitis 12

13 β-diversitet af aerotolerante, dyrkbare bakterier Gård Stald Fare Slagte Syge Klima 13

14 β-diversitet af aerotolerante, dyrkbare svampe Gård Stald Fare Slagte Syge Klima 14

15 β-diversitet af anaerobiske, dyrkbare bakterier Gård Stald Fare Slagte Syge Klima 15

16 Sekventering af 16S rrna V4 hos bakterier Operational Taxonomic Unit (OTU) 16

17 Bakteriel β-diversitet-16s V4 (Gård vs. stald) Gård Stald Fare Slagte Syge Klima 17

18 ITS sekventering af svampe 18

19 β-diversitet hos svampe Gård Stald Fare Slagte Syge Klima 19

20 Konklusioner Mennesker i en svinestald er eksponeret for ekstremt høje koncentrationer af bakterier og svampe. Mange af de bakterier vi finder i støv er tarmflora relateret bakterier, som sandsynligvis kommer fra fæces, mens de svampe vi finder sandsynligt kommer fra svinenes foder og fæces. Der findes mange forskellige bakterier og svampe som kan være patogene for mennesker og give alvorlige sygdomme (fx. endocarditis, infektioner i blødt væv og diarré) Hver gård har sin egen, unikke bakteriel samfundsstruktur MALDI-TOF MS og NGS har begge deres fordele og ulemper, men viser de samme trends i data med hensyn til, hvilke faktorer påvirker den diversitet, vi finder i støv fra de forskellige svinegårde og stalde. NGS giver os en sløret overblik over hvad deres findes, mens MALDI-TOF giver os et begrænset, men skarpt, indblik i hvilke arter, der findes. 20

21 Spørgsmål?